鹰嘴豆在土壤氮素环境和根系抗病性方面表现出基因型特异性结瘤反应

背景

鹰嘴豆通过其共生关系获得充足氮的能力菊苣中根瘤菌对支持生长和粮食生产至关重要。许多因素可以影响这种共生关系，包括非生物条件、植物基因型和宿主信号/感知网络的中断。为了支持鹰嘴豆根瘤的形成，我们研究了植物基因型和土壤养分有效性如何影响鹰嘴豆根瘤的形成和固氮。此外，利用转录组分析，我们试图确定高结瘤基因型的基因表达模式。

结果

对6个鹰嘴豆品种的研究表明，土壤氮互作对结瘤的影响具有大基因型，并进一步确定了与高结瘤相关的基因型农艺性状(如地上部重)。我们扩大了研究范围，考虑了29个品种和育种系，以研究土壤病害抗性与结核分枝数和实时固氮之间的关系。这项大型研究的结果支持了早期的基因型特异性发现，然而，疾病抗性并不能解释不同基因型结核的差异。六种鹰嘴豆基因型的转录谱分析表明，与传统结瘤途径相关的基因相比，与信号传导、N运输和细胞定位相关的基因更有可能预测给定的基因型是否会表现出高水平的结瘤形成。

结论

该研究确定了一些影响鹰嘴豆结节发育和氮固定的关键非生物和遗传因素。这些发现表明，改善对影响鹰嘴豆结节诱导和功能的基因型特异性因素的了解是在鹰嘴豆中提高根瘤菌共生的益处所必需的关键研究领域。

豆类和脉冲作物主要通过与固氮根瘤菌形成共生关系来补充自身的氮营养。农民利用这种与根瘤菌的共生关系来对抗土壤中的营养限制，因为这些细菌可以提供高达97%的植物总氮需求[1.］．此外，由于这些共生的责任负责全球农业土壤的重要性[2.)，它们减少了昂贵的化肥施用需求。与其他自由生活在土壤中的重氮营养细菌不同，根瘤菌必须首先在植物的根部定居，形成专门的根茎，称为根瘤。这些结核的形成受一系列非生物线索和细菌与植物宿主之间的一些重要信号事件的控制。鹰嘴豆(中投arietinum)鹰嘴豆是一种对粮食生产具有重要经济价值的豆类作物，鹰嘴豆一直是世界第二或第三大豆类作物，产量近1100万公顷[3.］．尽管鹰嘴豆和根瘤菌之间形成了一种功能共生关系菊苣中根瘤菌，与其他脉冲相比，鹰嘴豆中的N-固定是有限的。实地研究表明鹰嘴豆 -M西塞里共生通常只修复足够的n，以支持植物生长，几乎没有或没有加强收获后的土壤n浓度[4.,5.］．此外，接种者与地方病之间的竞争效率较低Mesorhizobium菌株以及土壤环境效应都会影响鹰嘴豆的成功共生[6.］．因此，更好地了解可以提高这种共生关联的益处的因素将是有利的。

已经鉴定了土壤水分，pH和植物养分可用性如土壤水分，pH和植物营养可用性，从而影响结节形成和N-固定。关于土壤营养素，鹰嘴豆瘤瘤和N-固定响应高度依赖于土壤中的植物N浓度。例如，鹰嘴豆瓦。Tyson，其在20-90 kg硝酸盐/公顷的土壤硝酸盐浓度下的60-80％的氮素中的要求，显示对数下降至其细菌伴侣的依赖性低于25％> 125 kg硝酸盐/公顷[7.］．本研究表明，如果鹰嘴豆作物种植在中度至高氮的农业土壤中，则氮对N-固定的这种负反馈将导致对土壤的影响更大。这将限制鹰嘴豆增强土壤的能力在作物之后，减少农业旋转中这种特殊豆类的可持续性。因此，越来越希望识别或培育对土壤中高水平的植物可用N不太敏感的基因型，以维持从根茎共生中形成和获取n的能力。

了解Genotype支持豆蔻染色和N-固定的方法也很重要，以最大限度地提高N-固定的益处，减少对含氮肥料的依赖。令人惊讶的是，在多种基因型中比较了鹰嘴豆瘤染色和氮素产量的大规模研究，最近关于这一主题的综述仅引用两项研究[8.]. 一项研究比较了三个美国鹰嘴豆品种和三个中东鹰嘴豆品种，而第二项研究比较了美国农业部收集的39个鹰嘴豆品系[9,10.］．后一项研究表明，以植物总生物量表示的基因型活力是影响n固氮的最重要因素之一，占了所有品种n固氮变化的三分之一[10.］．这种活力被认为与提供更强大的N水槽的植物生物质有关[10.］．育种表现出增加的抗病性的基因型也可能影响鹰嘴豆中的根瘤菌共生。Chickpea作物的生产率和盈利能力每年被一系列根疾病（包括植物）根腐腐（PRR;引起的Phytophthora Medicaginis.)枯萎病尖孢镰刀菌F.SP.西塞里斯)．虽然精英抗病品种的繁殖是用于打击疾病的最有效手段之一，特别是根疾病[11.,12.]， PRR敏感鹰嘴豆和中抗鹰嘴豆品种间结瘤率和固结植株氮比例存在基因型差异[13.]. 这些差异归因于中等抗性品种的一般基础防御过程的增加，无意中也损害了互惠共生[13.］．因此，支持鹰嘴豆根瘤菌共生的植物基因型有待进一步研究。

直到最近，在鹰嘴豆中还没有足够的遗传工具来完善我们对结瘤分子基础的理解，但是鹰嘴豆的1个完整的和29个重新测序的基因组的释放[14.]有助于识别与结瘤形成相关的基因，并有助于了解这些基因如何与抗病反应途径、氮的感知和转运相互作用。根瘤形成的初始步骤在模式豆科植物中得到了很好的研究，例如截形苜蓿和莲花japonicus.[15.］．从这些系统，一般模型是，在根瘤菌的感知时，由黄酮化合物支配的植物次级代谢物由宿主根系分泌并被根瘤菌造成，导致分泌细菌NOD系数的产生[16.,17.］．这些细菌信号被宿主植物溶质受体样激酶感知，该激酶诱导植物根部的信号级联称为常见的共生信号传导途径（CSSP）和植物激素途径的诱导，包括细胞素和植物蛋白[18.,19.］．这些信号传递步骤的中断会降低结瘤的效率或使其完全停止。豆科植物也有一个控制结瘤的反馈信号环路，虽然增加的结瘤数量可能改善寄主植物的N，但过多的结瘤数量由于结瘤形成和维护的能量成本而对植物健康产生负面影响。被称为结节的自动调节(AON)反馈机制(由Ferguson等人回顾[20.]），该途径由植物的内部因素以及非生物因子，特别是土壤植物（可用）21.,22.,23.］．随着我们研究豆科模型系统的数量的增加，可能会发现更多支持结瘤的遗传因素，因此，影响这些信号事件的因素是全球正在积极研究的一个领域。

在目前的研究中，我们试图进一步了解菊苣中根瘤菌(CC1192 [24.]）接种鹰嘴豆基因型在旋转瘤和结节函数中不同。首先，我们考虑外部因素（即植物可用的N）与基因型相互作用，以及定量和定性疾病抗性等内在因素可以改变瘤瘤潜力。使用核心型高和低调的鹰嘴豆基因型的转录组分析，我们试图了解差异基因转录支持高调的差异。完全，本研究的结果可通知我们对宿主基因型和基因调控如何影响共生结节形成和功能，并且是鉴定什么遗传因素使鹰嘴豆受益于根治症的重要一步。

鹰嘴豆中的结节形成与种基因型的土壤条件不同

鸡豆（Sonali，PBA Hattrick，Jimbour，Moti，Kyabra和Yorker）的六种基因型在土壤中生长在具有不同的植物氮气（n）：粉碎土壤，含有硝酸盐的肥料（最高植物可用N; HN），围场没有N肥料的土壤（适度植物可用N; Mn）和围围土壤用沙子切割（2份砂至1部分土壤;最低植物可用N; LN）。我们发现鹰嘴豆基因型显着与土壤n治疗有显着相互作用，用于结节形成（P < 0.001; 表1.a） 是的。基因型对土壤氮处理如何影响结瘤的差异影响在PBA-HatTrick等品种中可见，这些品种在氮处理中的结瘤数量没有显著变化，而其他品种如Moti和Yorker的锰结瘤数量明显多于HN土壤。基因型根系干重值与土壤氮素处理也有显著的交互作用(P < 0.001). PBA HatTrick had a higher root dry weight than Yorker in both LN and HN soil, but in the MN soil Yorker had a higher root dry weight than PBA HatTrick (Table1.b）。类似地，观察到通过土壤N相互作用的基因型进行标准化为根系干重的差异（P< 0.05;表格1.c）所有基因型在HN到Mn土壤中的结节/ mg根的数量显着增加。相反，除了Jimbour和Sonali之外，Nodule Numbers / Mg根从Mn到LN土壤处理显着降低到所有基因型的所有基因型，表明在鹰嘴豆中支持最佳染色的土壤植物的基因型特异性阈值。

测量植物度量（根和芽干重，总植物重量和根部：芽比）的关系和结节的数量显示出干燥重量的最强相关系数（0.640）（补充表SM1.)．然而，进一步的回归评价显示，单是茎干重并不是根瘤数(r^2.(39.5)，但地上部干重和土壤氮作为因子对根瘤数(r^2.71.9;如图。1.). 坡度最小的N处理为HN处理，表明在肥力良好的条件下，根瘤数量对植株干重的影响较小，而MN处理坡度最大。

基因型依赖性结节在鸡眼中形成与根疾病抗性等级没有显着相关

鉴于鹰嘴豆基因型对结节形成的显着效果和先前的研究表明，抗根疾病抗性的育种可能会影响染色瘤[13.], we expanded our study to a set of 29 chickpea genotypes sourced from either Australia or India with differing root disease resistance levels and type (i.e. quantitative for PRR vs. qualitative for FW) and grown at a single N level, results for all genotypes and the corresponding root disease resistance categories are presented in Supplemental Table SM2.．与品种较少的早期实验类似，鹰嘴豆基因型中每株植物的平均结节数显着不同（图。2.a).根据各自的FW或PRR疾病抗性类别进行基因型比较，FW抗性类别比较(即基于定性抗性)在结瘤参数和结瘤性能方面没有显著差异(P > 0.05; Fig.2.b,表2.一种）。类似地，对于PRR电阻类别比较（即，基于定量抗性），没有证据表明染色参数和结节性能的显着差异（P但值得注意的是，PRR中耐药组的根瘤/g根值低于其他两类P < 0.10级（表2.b).两种基因型地理来源的比较显示出了不同的趋势(表2.c).在植物结瘤参数方面，印度基因型作为一个群体的单株结瘤数显著高于澳大利亚基因型(P < 0.01), but for the nodule performance results the Australian bred genotypes had significantly higher real-time N-fixation values per nodule than the Indian sourced genotypes (P < 0.01). To allow comparison of the range of genotype values in each geographic source group to previous studies, the ratio between the largest and smallest value (L:S ratio) was calculated for each group (Supplemental Table SM2.)．澳大利亚和印度企业有类似的L:年代比结节的数量每植物(值分别为3.3和4.7)和结节/ g根(值分别为4.1和4.2),但对于射击和根重量印度组双L:这家澳大利亚集团的比率。在29个基因型中，结瘤与植物生长相关变量的相关性最强(0.568，P< 0.05)，地上部DW与单株结瘤数之间存在显著差异(表SM3.)．

鹰嘴豆基因型在根瘤菌暴露之前表现出类似的转录组曲线

基于上述数据，选择六种鸡肝基因型在高（ICC9002，ICC1510，ICC2072）和低（ICC11664，Jimbour，PBA边界）的促进水平中，研究了对共生前相对基因表达的差异。所有表达基因的计数数据的原理成分分析（PCA）来自无根瘤菌不存在的根系生长的根系（归一化和RLog转化）证明，除了从该组部分分离的ICC1510外，所有测试的鹰嘴豆基因型都具有类似的基因表达谱，在基因型之间的可变性与在复制内相似（图。3.一种）。Similarly, relative gene expression in three different pathways associated with host rhizobial signalling and the initiation of nodulation—the CSSP, N-sensing/transport pathways, and flavonoid production pathways—was relatively consistent across all genotypes, regardless of each genotype’s nodulation potential (Fig.3.罪犯)。然而，这种一般观察有一些例外情况。形成更多结节的基因型也具有较低水平的硫酮合酶基因（CA_13666，CA_2255，CA_22256和CA_22257;图。3.d） 位于类黄酮生物合成途径的顶端，以及类黄酮甲基转移酶（Ca24494；图。3.d).类黄酮虽然是根瘤菌的化学引诱剂，但也参与植物防御途径[25.］．CSSP的一部分DMI1同源基因(Ca_02780)在结瘤最少的两个品种中表达量最高(图1)。3.b）。高亲和力硝酸盐进口商CA_18399和CA_19740（分别NRT2.1和NRT1.2同源物分别）在基因型中也可变（图。3.c） 是的。

转录途径转录的变化M西塞里曝光不会镜像在鹰嘴豆中观察到的染色潜力

接触M西塞里接种3天后，鹰嘴豆根中的一些基因受到差异调控。一般来说，ICC1510是对根瘤菌最敏感的基因型，2383个基因受到显著差异调节（log2FC） > 1.P> 0.05)与无菌对照组比较(补充图1.). 豆科植物根系对根瘤菌的早期反应已经在模型系统中得到了很好的研究（图。4.a).利用鹰嘴豆CSSP和AON途径、细胞分裂素和生长素响应途径以及类黄酮途径中的特定基因，我们考虑了接种根瘤菌后高结瘤或低结瘤基因型与模拟接种对照基因表达的变化(图5)。4.罪犯)。高结瘤形成ICC1510和ICC2072的基因表达变化最为显著，尤其是在CSSP和AON通路中，然而，基因表达模式在基因型间表现出高变异性，与结瘤潜能的联系很少或没有联系。例如，结瘤因子感知5 (NFR5)的同源基因Ca_22860在ICC2072中表达上调，但在另外两个高结瘤形成基因型ICC1510和ICC9002中表达下调。结节《盗梦空间》(NIN;Ca_03225)，它是一个重要的转录调控因子，同时控制着结节的发育和AON通路(图)。4.a)，在基因型间也存在不一致的差异调控，ICC2072、ICC16644和Jimbour基因型中表达上调，而其他基因型中表达不变或下调。因此，在经典结瘤途径中并没有明确的转录模式来区分高结瘤鹰嘴豆基因型和低结瘤鹰嘴豆基因型此时对根瘤菌的响应。

在信号传导中改变基因的表达，细胞定位和N复合转运表征高调鹰嘴豆品种

鉴于古典染色途径中缺乏基因清楚地区分高或低结节形成品种对根瘤菌的响应，我们使用了监督方法（PLS-DA）来确定表达最划定两种染色表型的那些基因（图。5.)．这导致533个基因与高调染色品种相关，并且平均显示与低调基因型相比高调基因型中的表达增加。另外的861个基因与低调品种有关（补充表SM4.)．对这两组基因组的致富集分析导致与低调染色的那些基因没有显着富集的术语，然而，在与高染色中相关的基因中显着富集了42个术语（P < 0.01). These enriched GO terms generally fall under the categories of signalling, cellular localization, N compound transport and macromolecule or cellular component assembly (Table3.)．

豆科作物如鹰嘴豆中根瘤菌的生物固氮作用对植物营养和减少对氮肥的依赖非常重要。然而，正如我们的研究重申的，根瘤形成的程度既取决于植物的基因型，也取决于其非生物环境[8.,26.］．我们在这里证明，29个鹰嘴豆基因型的结瘤不同，以基因型依赖的方式，在一个较小的6个品种的实验中证明了基因型对氮利用率的特异性反应。我们表明，虽然根瘤数与植物生长性状(如地上生物量)有关，但并不一致地与基因型的抗病性相关。后一种观察结果在已知对单一病原菌进行定性抗性编码的植物中最为显著。最后，利用根瘤菌定植早期阶段的转录组学分析，我们发现，结瘤形成水平相反的基因型，虽然通常具有重叠的基因表达谱，显示出一组参与信号传导和运输途径的基因亚组，随着结瘤水平的不同而不同。提示这些基因可能在鹰嘴豆根瘤菌共生中发挥作用。

众所周知，地方病Mesorhizobium物种可以影响接种物种固氮的程度，土壤环境影响根瘤菌种群[6.,27.］．因此，我们在无菌的非田间环境中进行了基于基因型的研究，以控制潜在的混杂因素。这些实验表明，尽管植物有效氮对豆科植物结瘤有很强的影响，但并非所有植物基因型对土壤中氮水平的变化都有相同的响应。在6个基因型中，结瘤数在不同基因型间和不同施氮水平下均有显著差异。在考虑限制鹰嘴豆基因型时，以前曾报道过结瘤和氮固定的相似基因型特异性差异(N < 7) [9,28.]. 鉴于这种共生关系在补充植物氮方面的作用，可以假设土壤中植物有效氮的最低浓度最有利于根瘤菌与植物寄主建立相互作用。然而，在我们的研究和其他研究中发现，结瘤数量在中等氮水平下最高，在低氮或高氮水平下最低[29.]. 由于结核的形成对植物来说是一项非常昂贵的投资，因此在土壤氮浓度非常低的情况下，植物可能缺乏形成大量结核的资源。植物寄主对氮素状况和有效性的感知依赖于许多感觉系统和信号途径，而这些系统和信号途径又反过来影响结瘤所必需的途径[30.］．例如，土壤中硝酸盐的存在可以诱导豆科植物根系中CLE肽的表达，触发AON通路，从而抑制结瘤[22.,23.]. 虽然我们无法测试这些机制，鹰嘴豆基因型对土壤植物有效氮的敏感性差异解释了我们观察到的基因型对土壤氮的结果。对这些途径的进一步研究可能导致鉴定出预测植物对硝酸盐敏感性较低的基因型标记，因此，可能促进具有高植物有效氮残留水平的农田的高结瘤水平。

在我们以前的工作中，我们分析了一小部分中度抗PRR的品种，我们证明了PRR的数量抗性、较低的根瘤数和固氮之间的可能联系[13.］．这与某些植物基因型如何同时影响致病性和互相融合的其他报告一致[31.,32.,33.,34.,35.,36.,37.］．然而，本研究中，中抗PBA hatrick的结瘤量再次低于感PRR的Sonali，而PBA Boundary等其他感/中感PRR品种结瘤量再次减少。当我们考虑不同基因型的FW抗性类别时，我们发现在每个抗性类别中，就根系上形成的根瘤数量而言，特定基因型的表现既异常，也很差。FW基因型中抗病性和结瘤之间缺乏一致的趋势可能是由于对尖孢镰刀菌F.SP.西塞里斯是基于少数疾病特异性基因的定性研究[12.］．因此，这些基因中有一个也可能对有益的根瘤菌产生负面影响的可能性很低，因此在FW抗性和抑制结瘤潜能之间不存在一致模式的发现并不意外。总之，这些发现表明，尽管抗病能力可能影响结瘤，但它不是结瘤潜力的唯一指标。

需要改进的高调豆类的选择方法。这association between nodulation, or nodule N-fixation, and agronomic traits such as root weight and shoot weight has led to suggestions that breeders can use these in-direct indicators of N associated traits, to achieve ‘simultaneous improvement’ within a particular legume crop [8.,38.］．同时改善，定义为选择一种植物性状与多重有价值的农艺表型相关的一种植物特征，作为品种发展的方法无疑是非常重要的，并且可以提高育种计划的效率。然而，在育种过程中可以容易地采用更多靶向选择技术，需要改善对结节形成和在更广泛的豆科作物中的N-固定的遗传基础的改进理解。鹰嘴豆犬，已知具有相对有限的基因组多样性[39,40(图。4.)，似乎不太可能在建立根瘤菌共生关系方面显示出足够的差异，使之成为可以实现这种共生关系的候选作物。然而，我们的研究使用的是推定基因相似的FW抗性基因型，以及Biabani等人的另一项研究[10.]，使用来自12个国家的遗传多样性鹰嘴豆基因型，均发现了基于衍生的大型基因型差异。

考虑到高或低结瘤潜力基因型在已知结瘤途径中的基因表达，在没有根瘤菌的情况下，大多数基因在基因型之间的表达一致，但高结瘤基因型和低结瘤基因型之间存在显著差异。例如，在无根瘤菌存在的情况下，结瘤数量最多的基因型中查尔酮合成酶基因表达量较低。查尔酮位于类黄酮途径的顶端，在植物防御和作为根瘤菌的化学引诱剂中发挥作用[25.]查尔酮合酶活性的平衡是结瘤的必要条件[41,42,43］．在添加根瘤菌后，已知结瘤途径中的基因表达没有以一种与结瘤潜力一致的方式发生改变。虽然这可能在一定程度上源于使用的早期时间点，但早期的研究表明，鹰嘴豆在接种该系统3天后就已经通过改变基因转录对根瘤菌做出了响应[13.,44]. 在两个高结瘤基因型中，根瘤起始（NIN）的表达下调，尽管在其他模式豆科植物系统中，根瘤菌的表达通常上调[45］．这种转录因子，同时对结节器官发生，也坐在AON途径的头部，其活性可以抑制结节引发[46,47]. 其活性也具有组织特异性，在根表皮和皮层中具有不同的功能[45因此，在某些基因型中通常对该基因的表达通常在一些基因型中进行调节时，它仍然可以在特定组织中局部积累。然而，总体而言，在模型豆类中看到的基因表达模式并不一致地反映在此测试的鹰嘴豆根中。因此，而不是跨差异基因调节的一个关键途径描述了基因型之间的结论的差异，基于一小组基因的差异之间的多个信号通路之间的交叉谈话可以共同解释观察到的染色模式。进一步检查随机血症接种后的基因表达导致一组与高染色表型相关的533个基因。虽然我们目前不知道，但是，当这些时间都集成到支持Rhizobial共生的已知途径中，但它们为未来的研究提供了新的途径，并且可以提供在鸡眼繁殖期间同时改善的必要标志物。

总之，本文的结果为在鹰嘴豆等非模式作物上利用基因型筛选识别影响结瘤形成和功能的新因素提供了可能的空间。尽管基因库比较狭窄，但我们强调了鹰嘴豆基因型和转录谱影响根瘤菌共生的具体、离散的方面。在今后的研究中，我们可能会考虑到高结瘤鹰嘴豆品种和低结瘤鹰嘴豆品种产生的类黄酮谱的差异，以确定与结瘤数相关的特定化合物。此外，被鉴定出的高结瘤相关基因所控制的通路应该用更大的一组基因型加以细化，并考虑它们的易驯化性作为结瘤潜力的稳健标记。总之，本文所述工作的结果以及这些拟议的研究将生成同时改良非模式脉冲作物所需的遗传框架。

鹰嘴豆生长实验

6个鹰嘴豆品种，Sonali, PBA hatrick, Jimbour, Moti, Kyabra和Yorker，根据Plett等人的方法在三种不同的土壤类型中种植。13.］．所有实验种子的来源是新南威尔士州第一产业部领导的脉冲育种澳大利亚鹰嘴豆育种项目(塔姆沃思，新南威尔士州，澳大利亚)。简单地说，每个品种的种子在播种前用10%的漂白剂进行表面消毒。在移栽到试验土壤之前，种子被允许发芽和生长2周。每株移栽后接种10,000 CFUM西塞里(CC1192)，在生长室内(18/10°C昼夜温度;12小时光循环;BioChambers,萨斯喀彻温省,加拿大)。试验所用土壤在使用前均经γ辐照灭菌，包括鹰嘴豆围场土壤施氮(HN;71.8毫克/公斤_3.+ 7.5 mg/kg NH_4.），鹰嘴豆肉围堆土壤没有氮肥（Mn; 65 mg / kg no_3.+ 7.5 mg/kg NH_4.）和围堆土壤用沙子切两次（LN; 21.7 mg / kg no_3.+ 2.5 mg/kg NH_4.)．根据PLETT等人使用KCl提取，在收获时测定植物N.[13.]. 植株移栽后施3次无氮肥，HN处理加施氮肥（3） × 1 mL 0.1 M KNO_3.)．

在第二系列实验中，选自22种DESI系列从国际作物研究所的半干旱热带地区（ICRISAT）迷你核心收集211种。选择基于疾病阻力信息，种子颜色和大小，以及来自Pande等人的原始信息。[48］．为了减少潜在的产地变异，ICRISAT的所有品系都选择产自印度。此外，只选择了Desi系和种子颜色不分离的系。最终的选择标准为抗枯萎病，无症状株系6个，中等抗性株系6个，抗枯萎病株系6个，抗FW株系4个，抗多病株系如表SM-所示1.．为了与ICRISAT枯萎病株系进行比较，从澳大利亚筛选了7个不同PRR抗性等级的Desi品种，其中2个感病(Sonali, PBA Boundary)， 3个中感病(Kyabra, Moti, Jimbour)， 2个中抗性(PBA hatrick, Yorker)。将鹰嘴豆种植在同一土壤类型(沙土:围场土壤1:1，γ辐照灭菌，NO 16 mg/kg_3.+ 1.2 mg/kg NH_4.）仅给予N游离肥料。

鹰嘴豆实验收获与分析

在两个试验收获时，鹰嘴豆根系冲洗土壤，并计算每个根系的结瘤数。根据Plett等人的研究，从根系中小心地取出约10-20个结节，称重并放置在一个密封的20毫升GC小瓶中用于乙炔还原测定，以通过乙烯生产评估结节活性。[13.］．将植物分离并在40℃下分离并干燥⁰C在称量生物量之前。

RNA测序和分析

三种低结瘤基因型(Jimbour, Boundary, ICC11664)和三种高结瘤基因型(ICC9002, ICC2072, ICC1510)的鹰嘴豆种子在10%漂白剂中灭菌，无菌水冲洗后按上述方法种植于蛭石中2周。将幼苗移栽到无菌土壤(与29基因型试验相同)，接种前一天对新土壤进行适应。积极发展的文化M西塞里（〜10,000只CFU）施加到一半的鹰嘴豆，而没有根茎的模拟溶液被施加到另一半。在加入生活后3天在液氮中收获并在液氮中收获并冷冻M西塞里文化或模拟控件。

根据制造商的说明，使用分离物II RNA植物试剂盒（Bioline，London，U.K）从鹰嘴豆根（每种条件下的3个生物学重复）中提取RNA。使用RNA-SEQ Library预备套件（Lexoolog，维也纳，奥地利）和Novaseq测序在Ramaciotti Centrs（澳大利亚新南威尔士大学）进行了RNA文库。从RNA测序中修整并映射到的原始读数C. arietinum.基因组(desi type-ICC4958;[49]）使用CLC Workbench V.10。从数据集中消除了未表达或低表达或低于每组3个重复的平均值的基因）。使用R中的DESEQ2包（DESEQ2 V.1.24.0; LOVE等人，原始基因计数数据被标准化。[50];R v.1.2.1335;[51]）。对于差异基因表达分析，与未诱导的对照根相比，计算RONIZOBIA接种鹰嘴豆根的LOG2折叠变化。调整P-使用Benjamini–Hochberg FDR校正计算值。基因上调或下调超过2倍P < 0.05 were considered significantly differentially regulated. Gene annotations were assigned based on the desi-type chickpea annotation [52］．

通过直接搜索特异性黄酮产生的鉴定，染色剂或氮气运输途径是完成的C. arietinum.基因组注释，或通过BLAST分析模式豆科植物相应的蛋白序列M. Truncatula.或者答:芥对C. arietinum.（ICC4958）蛋白质组【参考文献同上】（补充表SM）5.). 类黄酮生物合成酶的测定基于Gifford等人的研究[16.］．M. Truncatula.和答:芥从开放的公共数据库获得蛋白质序列[53］．

统计分析

从两个鹰嘴豆控制环境实验的数据进行方差分析，在分析前使用适当的转换，以稳定方差。均值比较检验采用Fisher 's LSD方法。完成两项研究中所有变量之间的相关性，并对所选变量进行线性回归比较。29-基因型实验中，印度和澳大利亚基因型组间的数值采用各变量各组最高与最低值的比值进行额外比较，称为最大最小(L:S)比值。所有分析均在Genstat中进行。

主要成分分析（PCA）和偏最小二乘鉴别分析（PLS-DA）在r使用混合体包进行[54]. 首先对输入的转录组数据进行标准化，并使用R DeSEQ2包对rlog进行转换。绘制了PLS-DA分析中所有基因的装载数据，并且认为那些从起源处落在半径0.013之外的基因有助于高结瘤表型和低结瘤表型的分离。使用topGO软件包在R中进行GO富集分析[55]基于的注释C. arietinum.（ICC4958）基因组。根据经典的Fisher检验，GO术语被指定为显著丰富(P < 0.01). Heat maps of normalized count data and log2 fold change data were generated using the Morpheus online tool [56］．

在当前研究期间以及计数数据表中生成和分析的转录组数据集可在Geo提交编号GSE162321中获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE162321．

AON：

标注的自动调节

CFU：

集落形成单位

CSSP公司：

共同的共生信号通路

DW：

净重

FW：

枯萎病

开始：

基因本体论

迷幻药：

最小显著性差异

n：

氮气

PCA：

主要成分分析

PLS-DA公司：

偏最小二乘判别分析

PRR：

疫霉根腐病

对话:

差的标准误差

作者承认新南威尔士大学的Ramaciotti Cents，用于RNA测序和N.Plett和B. Laugesen，用于技术援助。

我们谨无众理为NSW DPI和谷物研究和开发公司（GRDC）在项目DAN00213下支持SLB的共同资助的研究。我们还承认从授权农业，渔业和林业部到JMP的资助支持，从科学和创新授予。

作者笔记

1. Krista L. Plett和Sean L. Bithell在这项工作中同样地贡献。

隶属关系

1. Hawkesbury环境研究所，西悉尼大学，北面北面，澳大利亚

   克丽斯塔L。艾德里安·丹多和乔纳森·M·普莱特。普勒特

2. 新南威尔士州德维思，南威尔士州的主要工业部

   肖恩L。该死的

3. 新南威尔士州南威尔士麦克阿瑟农业学院，澳大利亚Meangle

   阿德里安丹托

贡献

KLP，SLB和JMP设计了研究，KLP，AD和JMP所执行的实验，所有作者都参与了数据分析。KLP和SLB编写了稿件和所有作者阅读并批准了最终版本。

通讯作者

对应于Jonathan M. Plett.．

道德认可和参与同意

不适用。

出版许可

不适用。

相互竞争的利益

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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