GA下游₄，PBCYP78A6参与调控梨细胞周期相关基因和孤雌生殖(Pyrus bretshneideri雷德。）

背景

单性结实的结果是具有对消费者和育种者都有吸引力的性状，它克服了园艺作物如梨(梨)．然而，关于调节孤雌生殖的遗传和分子机制的知识有限。

结果

在这里，在传粉依赖的果实和GA之间的转录比较₄诱导的普罗纳诺卡维，PBCYP78A6被鉴定为单性结实的候选基因。PBCYP78A6类似于拟南芥CYP78A6在梨柄花中高表达。增加PBCYP78A6通过RT-qPCR检测，通过传粉和GA诱导表达₄接触。异位过度表达PBCYP78A6促进番茄疗效果实生产。的PBCYP78A6通过细胞学观察和RT-qPCR检测，结果表明，与果实发育相关基因的表达与受精和单性果实发育相一致。PBCYP78A6对梨愈伤组织的RNA干扰和过表达表明，该基因是梨果实发育相关特定基因的上游调控基因。

结论

我们的研究结果表明PBCYP78A6在果实形成中起着关键作用，并为控制单性结实提供了见解。

被子植物已经进化出双重受精过程，需要配子体和孢子体组织之间的协调沟通，果实发育是其生存和扩散策略的关键步骤[1，2］．果实起始需要成功的授粉和受精，但单性结实解除这种同步联结，并触发果实发育[3.]. 植物激素被认为是由受精引起的。许多生产处女果的策略包括外源应用或植物激素的过量生产，特别是生长素和赤霉素（GAs）[4，5，6]，以及这两种植物激素信号通路中特定基因的突变[7，8］．植物连体部分在诱导水果套装中的上游起作用[9]. 复杂的机制涉及不同的激素已被揭示，但有有限的知识，有关机制的基础上单性结实。

单性结实具有对消费者和育种者都有吸引力的特性。它还克服了园艺作物的自交不亲和障碍，包括梨(Pyrus Bretschneideri.REHD。）[3.]. 梨的肉质果实来自托杯，被称为副果。由于多年生果树的特性，对梨单性结实机理的认识还很有限。近年来，研究主要集中在外源植物激素诱导梨单性结实方面[10.，11.，12.，13.，14.]，而稗子底皮下面的遗传机制很少研究。

过表达CYP78A9，通过转移DNA活化标记筛网鉴定的细胞色素P450 78A亚类的细胞色素P450 78A亚家族的成员产生占疗法表型拟南芥［15.］．AtCYP78A6与AtCYP78A9共同调控生殖器官的发育[16.]. 到目前为止，CYP78A酶的催化功能仍不清楚，但相关基因的表达模式和作用已被广泛阐明[15.，17.，18.]. CYP78A家族成员的过度表达增加了非自主细胞增殖和大器官的顺序形成[19.，20］．多细胞生物的生长由细胞周期进展控制，该细胞周期进展是通过含有细胞周期蛋白（Cycs）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的复合物的周期性活化介导的[21］．CYP78A家族成员的功能及其在疗法中的作用尚未报告，它们在梨中表达水平和细胞增殖之间具有相关性。

在这项工作中，我们提供了详细描述PBCYP78A6在梨幼儿发生中的功能。我们从授粉依赖和GA生产成熟的水果₄-诱导的‘砀山苏’单性果实。通过比较转录组和qRT-PCR分析，我们确定PBCYP78A6表达与坐果和发育密切相关。番茄中稳定转基因的贡献PBCYP78A6孤雌生殖。的过表达和RNA干扰PBCYP78A6在Pear Calli中揭示了该基因是细胞增殖的上游活化剂。因此,PBCYP78A6，由GA引起₄，调节梨中均来和细胞增殖。

转录分析鉴定了一种细胞色素P450基因，PBCYP78A6，可能负责稗皮

ga₄治疗率为93.2％的果实设定率为93.2％，与种子水果相比，重量减少和果实指数和硬度水平增加的无籽水果，而GA_3.处理诱导的坐果率相对较低，为56.8%，没有诱导成熟果实的形成（表1）1；额外的文件1：图S1）。

为了进一步分析单性结实的分子机制，我们采用RNA-seq分析来鉴定潜在的相关基因。PBCYP78A6(LOC103964254)在授粉和赤霉素中普遍上调₄-Treatment组（附加文件2：图。S2;额外的文件3.：补充表S1）。系统发育分析证明了PBCYP78A6P勃列茨奈德向ATCYP78A9和ATCYP78A6显示非常高的相似性级别（图。1)．PBCYP78A6在萼片中高度表达，这是梨果的重要组成部分（图。2A).在果座的早期过程中，PBCYP78A6在有效的治疗组中，表达水平显着增加，包括手工授粉和GA₄治疗(无花果。2B） 是的。我们将发育中的果实分为托杯、子房壁和胚珠（图。2C） 是的。相对较高的PBCYP78A6与子房壁和胚珠相比，在托杯中检测到表达水平（图。2d）。我们推测了这一点PBCYP78A6表达与梨果实发育和单性发生相关。

PBCYP78A6过度表达导致番茄中的疗效果实发育

确定…的潜在作用PBCYP78A6在果实发育和孤雌生殖过程中，转基因番茄系过度表达PBCYP78A6基因(附加文件4：图S3A）。在自然授粉条件下，转基因番茄过度表达PBCYP78A6每个果实的种子数量显著减少，而且果实大部分是无核的(图。3.A） 是的。在成熟期，转基因果实中有少量大粒种子和未发育种子的痕迹（图1）。3.B） 是的。番茄线PBCYP78A6过表达产生的果实比野生型行更大(附加文件4:图S3B)。对种子的统计分析决定了过表达PBCYP78A6减少每个果实的种子数量（图。3.C）。种子果实通过野生型（WT）系的授粉卵巢产生（图。3.D)PBCYP78A6-过表达(OE)系在去势后仍能单性结实(图1)。3.D、 E），而野生型系在没有授粉的情况下不能产生果实。与授粉子房的果皮相似，去雄子房的果皮过度表达PBCYP78A6与去阉割卵巢相比，卵巢细胞分裂和扩张明显增多(图1)。3.F)，其细胞层数和果皮厚度略低于授粉果实果皮，而远高于去势子房果皮(附锉4:图S3)。因此,PBCYP78A6参与了果实发育和单性结实的调控。

GA诱导细胞分裂和增殖₄以及传粉PBCYP78A6表达增加

CYP78A6过度表达由于细胞增殖增加而导致大果实的产生[15.，16.]. 探索细胞随时间的变化PBCYP78A6表达高度诱导，果实嵌入石蜡中并切断。记录结果部分的表型观察结果（图。4)．传粉植物和赤霉素的子房₄- 治疗的群体大于未授粉和GA的组_3.治疗组(无花果。4广告）。Ga的萼厚度₄- 治疗和授粉样品明显大于未授粉和GA的样品_3.治疗组(无花果。4E–K）。与未授粉处理相比，人工授粉和GA₄暴露增加了细胞层的产生和细胞面积的扩大(图。4J、 K）。因此，我们推测PBCYP78A6可能是单性果实生长的关键调控因子。

单性生殖过程中果实发育相关基因的表达被激活

为了进一步了解单性生殖的分子机制，本研究在“党山苏”小果实早期观察了其生长动态及细胞扩张和分裂相关基因的转录水平。值得注意的是,遗传算法₄-处理和授粉的果实生长迅速，而GA_3.处理过和未授粉的小果没有表现出显著的生长相关变化(图。5A） 是的。在我们之前研究的基础上[10.，11.，12.],expansin-A4（EXPA4),细胞周期素2-4，G2 /有丝分裂特异性细胞周期蛋白-2（CCNB2L公司),细胞周期蛋白依赖性激酶B2-2（CDKB22型),Pbcyclin依赖性激酶B2-2样（CDKB22L)以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂6状（CDKI6L型）被筛选，它们的表达水平在水果发育中发挥了重要作用。RT-QPCR结果表明，随着形态变化发生，这些基因的表达水平在授粉和GA中诱导显着更大₄-处理的小果比未授粉和GA的小果多_3.-处理过的小果（图。5B） 是的。这个CDKI6L型GA对表达量的抑制作用更强₄而不是ga_3.（图。5B） 是的。有趣的是PBCYP78A6表达模式与小果发育相关基因的表达模式基本一致。2和5)．我们推测了这一点PBCYP78A6可能作用于细胞增殖相关基因上游，调控梨果实生长。

PBCYP78A6参与了水果发育相关基因的调节

为了进一步描述两者之间的相关性PBCYP78A6以及孤雌生殖相关基因，转基因PbCYP78A6型-产生OE和-RNA干扰（RNAi）Calli。检测到绿色荧光蛋白（GFP）信号PBCYP78A6-OE和-RNAi线（图。6A） 是的。RT-qPCR用于确认肿瘤细胞的变化PBCYP78A6表达式（图。6B、C)。PBCYP78A6-rnai calli，PBEXPA4和PbCDKI6L表达水平急剧增加（图。6B),PbCDKB22型，PbCDKB22L型，pbccnb2l.和Pbcyclina24.不抑制转录水平（图。6B附加文件5:图S4)，与小WT相比PBCYP78A6-oe calli，细胞增殖的正调节因子，包括PBEXPA4，PbCDKB22型，PbCDKB22L型和Pbcyclina24.，显著上调，而细胞增殖的负调控因子，PbCDKI6L，与WT相比，表达下调(图。6C;额外的文件5：图。S4）。因此,PBCYP78A6通过特异基因调控细胞增殖，可能是梨受精和单性结实的关键。

在高等植物中，子房既可以受精后长成果实，也可以由于受精失败而进入脱落过程。外源施用多种激素模拟受精功能和不依赖于受精的坐果，导致单性结实[9，22］．在党山苏梨，GA₄对单性结实的诱导是有效的[10.，11.，12.，23]，而GA_3.不诱导单性结实。这里，GA和₄和遗传算法_3.- 评估梨中的抑制，探讨了与疗效相关的下游激素的机制。

传粉依赖型和单性结实型坐果的转录组比较，PBCYP78A6被鉴定为参与孤雌生殖调控的候选基因。cypyp78a6类似于AtCYP78A6和AtCYP78A9(图)。1）但其表达模式与那些不同的表达模式不同ATCYP78A6和ATCYP78A9.［16.，20］．PBCYP78A6被确定在生殖器官中广泛表达，但它在萼片中高度表达（图。2A)，部分发展成为梨的附属水果。PBCYP78A6GA显著激活了表达₄和授粉，随着水果集和发育过程的继续增加，表达水平增加（图。2B） ，这与ATCYP78A9.受精后在发育中的种子、隔、索和胎盘组织中检测到激活[20］．过度表达ATCYP78A6或者ATCYP78A9.促进不仅种子的生长，还促进生殖组织，包括萼片和单片机[16.，20，这表明ATCYP78A6和ATCYP78A9.控制他们的发展。在梨中，Exocarp的细胞能够进行细胞分裂，其中由于蠕虫细胞分裂而产生新的细胞层。在我们的研究中，PBCYP78A6在胚珠中很少检测到表达，但在果皮和托杯中出现高水平表达，其中细胞分裂活跃（图。2C，D）。这表明了PBCYP78A6可能与梨果实发育有关。因此，不同的结构之间的水果和西力克暗示了一个重要的作用PBCYP78A6在单性发生中。

在正常授粉条件下PBCYP78A6-OE转基因植物产生的果实种子数量减少，甚至出现一些无核果实。3.这一生殖器官表型与在拟南芥过表达中看到的相似ATCYP78A6［16.]. 胚珠生长素的产生和GA介导的反应依赖于引发果实发育的授粉事件[24］．在有少量甚至没有种子的转基因株系中，果实发育正常。3.A-C），这表明果实产生独立于受精信号PbCYP78A6型-OE植物。进一步的去雄实验表明，转基因植物的花具有不依赖授粉的果实发育能力，并产生单性果实。3.D-F)。在拟南芥中，CYP78A9的过表达也可以诱导大的无核果实[15.]. 在这里，我们这样报道ATCYP78A9.，PBCYP78A6能诱导番茄单性结实和发育。

沉默的拟南芥CYP78A6 / EOD3同族体PaCYP78A6型通过影响细胞增殖减少水果的大小[18.]，表明这一点PaCYP78A6型作用于细胞分裂和扩张的上游。在这里，通过过度表达而产生的单性结实PBCYP78A6维持细胞分裂和扩张的激活，类似于授粉果实(图。3.F）。差异表达PBCYP78A6与未授粉组相比，含组织花萼和成熟子房的细胞分裂和扩张明显增加(图1)。2)．坐果的过程伴随着细胞的分裂和膨胀[25]，表明这一点PBCYP78A6在果实形成中起重要作用。

果实的发育在很大程度上依赖于细胞的分裂和扩展，细胞分裂受两个基因家族的控制，CDKs和CYC公司年代(26］．另外两个家庭，的扩张和EXPB，具有通过延长细胞壁来调节细胞扩张的能力[27］．CDKBs、CYCAs和EXPAs参与调控果实发育[28，29，30］．根据我们以前的研究[10.，12.]，分析了选定的细胞分裂和扩张相关基因在坐果早期的表达水平(图1)。5)．其中,PBEXPA4，细胞周期素2-4，pbccnb2l.，PbCDKB22型和PbCDKB22类表达模式上调，与组织学观察结果一致(图。4)．此外，CDK抑制剂基因，CDKI6L型，其在GA中的表达降低₄治疗小果实。然而,遗传算法_3.治疗未能抑制基因的表达CDKI6L型．ICK1和ICK2表达减少CDK活性并影响细胞分裂A.拟南芥［31]，表明CDKI6L的抑制也在果实发育中起着重要作用。因此，这些基因对梨果发育很重要。有趣的，PBCYP78A6表达方式与表达模式基本一致PbEXPA4，细胞周期素2-4，pbccnb2l.，PbCDKB22型和PbCDKB22类，与抑制因子的表达呈负相关CDKI6L型(无花果。2乐队4b）。

PaCYP78A9型对植物器官大小的影响是由细胞周期相关基因调控的[18.]， 然而PBCYP78A6对果实发育的影响可能是梨中特定的果实发育相关基因介导的。在PBCYP78A6-RNAi梨愈伤组织，沉默PBCYP78A6没有停止细胞增殖（图。6B附加文件5：无花果S4a）。过度表达PBCYP78A6促进了果实生长相关基因的表达，特别是压抑PbCDKI6L在梨愈伤组织中的表达(图。6C;额外的文件5:无花果S4B)。的PbCDKB22型，PbCDKB22类，细胞周期素2-4和pbccnb2l.表达水平与细胞凋亡呈负相关PBCYP78A6表达水平。同样的,沉默PaCYP78A6型或者PaCYP78A9型不能完全抑制所有细胞增殖相关基因的表达[18.，32］．证据表明，可能有其他因素参与控制细胞增殖。我们还发现了一种CDK阻遏物，PbCDKI6L，其表达上调为PBCYP78A6表达降低(图。6). CDK活性的降低归因于抑制细胞分裂的ICK1表达的增加[31］．因此,PbCDKI6L在规范中发挥关键作用PBCYP78A6在果实发育中的表达。细胞壁松动是细胞快速分裂的关键，它通常由EXPs控制[33］．沉默和过度表达PBCYP78A6显著提升PBEXPA4表达，可能是由于细胞增殖的后果。虽然PBCYP78A6经细胞周期相关基因和孤雌生殖的证实，PbCYP78A6的催化功能，甚至是CYP78A在拟南芥中的成员，酶的作用仍基本未知。据预测，AtCYP78A9位于苯丙烷途径的类黄酮分支[20］．ATCYP78A6没有可用的预测。在该基因家族中突变体之间的代谢物差异的表征暂时进行，在突变体中检测到黄酮化生物合成途径的扰动，表明苯丙基丙酮途径和幼稚病之间的关系[20］．令人兴趣的是，与弱间母梨品种相比，在高度寄生虫基团中表现出几种苯丙烷类相关基因的表达较高[34］．这意味着pcyp78a6参与了某些未知类型的植物生长调节剂的生物合成。PbCYP78A6的代谢物及其在单性结实中的作用机制有待进一步研究。我们的研究结果表明PBCYP78A6能够调节孤雌生殖并作为果实发育的上游调节器（图。7)．

PBCYP78A6被授粉和ga诱发₄处理后，其过度表达导致孤雌性番茄。的影响PBCYP78A6在水果发育中可能由细胞循环相关基因介导。通过果树和其在水果中的改变表达的利用可以提供一种生产无籽水果和增强作物产量的方法（图。7)．进一步阐明与植物生长有关的未知物质可能有助于利用它们调控果实发育。

植物材料和生长条件

治疗的'Dangshansu'梨树（梨Rehd）在中国陕西省梅县西北农林大学梨树实验基地（34.28°N，108.22°E）种植；562米）。年平均降水量574.6mm，年平均气温12.7℃。16年生党山酥梨树嫁接Pyrus betulifolia.以Bge砧木为试验材料。已获得此体验中使用的所有材料的权限。

微型汤姆(Solanum lycopersicum.L.）选择在该实验中转化。从杨凌西北A＆F大学的湘强詹的礼物收到种子。对于转基因实验，将种子用无菌水浸泡并用2％次氯酸钠溶液灭菌。灭菌的种子萌发并在玻璃罐中生长，含有透明嘴唇的玻璃瓶，含有30ml培养基[Murashige和Skoog（1/2毫秒）盐，1.5％（w / v）蔗糖和0.74％（w / v）琼脂]，然后在25℃下在16-H / 8-H光/暗条件下放入培养室6-8天，直至子叶完全延伸，其用于下一个转化实验。

实验处理和样品

在开花前两天，所有的治疗和对照都被袋装避免授粉。为避免由天然授粉引起的令人不安的水果套，除去开放的花朵和弱芽，以确保每种梨花在应用外源激素时保持一致和未开封。遗传算法_3.解决方案50 mg l⁻¹和遗传算法₄50 mg l的解决方案⁻¹独立地喷洒在开花内的“Dangshansu”梨的个体未授粉的花朵上。1：1水：将乙醇混合物喷洒在未授粉的未授粉的花束上。每种治疗的三个分支用作三个重复。随机取样，具有完全结构的水果。为形态学观察和其他实验分别收获0,3,4,6,9,30和145 da的果实。去除茎秆后，在开花（DAA）后4和6天在花序中留下的萼片，雄蕊，在开花（DAA）的4和6天中分别用于RNA测序并立即固定在甲醛 - 乙酸中用于石蜡切片。在0,3,6,9Daa处的果实用于分析与上述相同处理的基因表达模式。在3Daa的用手授粉的水果被细分为水果茎，萼片，花瓣，雄蕊，耻辱，卵巢和胚珠，用于组织特异性表达。30 daa的果实细分成果皮，胚泽，卵巢壁和胚珠，用于表达位置PBCYP78A6在水果里。每个样品从12个小果中采集，汇集，直接冷冻在液氮中，并储存在室温下 − 80摄氏度。

坐果率的测定

每三个枝条上共有30朵花在处理后立即贴上标签并装袋。在20日，袋子被移走。计算坐果率的公式如下：

石蜡切片和数据统计

为了进行组织学观察，当观察到显着的变化时，在6Daa中收集了在“当andshansu”梨中的四种处理的水果样品，立即固定在甲醛 - 乙酸 - 醇固定中[35]在4°C下储存。卵巢以乙醇/二甲苯系列脱水，石蜡包埋。然后将它们切成8μm厚的薄片，干燥后用藏红和固绿染色。解剖图像用显微成像系统（BX51）观察 + 第72页 + IX71，奥林巴斯，日本）。用imagej软件计算细胞面积和花萼厚度(https://imagej.net/welcome.），用于每个测量的三个果蝇的三个部分。细胞区域计算方法如下：首先，随机圈出某个区域，计算总细胞面积;其次，计算细胞总数;第三，计算单个电池的代表细胞面积，因为总细胞面积分为分为细胞总数。每个计算都以三个以上的重复执行。

转录分析

为了进一步了解占疗子下的潜在分子机制，来自未加长的，手授粉，GA的样品_3.-treated（没有授粉）和ga₄- 在4Daa下使用4DAA的治疗（无授粉）进行RNA测序。发生显着的形态学变化从3到6 DAA发生，所以4 DAA的果蝇被选择进行RNA-SEQ实验。测序并分析了三种独立的生物学复制。12个样品（未授粉，手授粉，GA_3.和遗传算法₄以4 DAA处理过的砀山梨为样品，分别添加3个生物重复)进行总RNA提取和Illumina HiSeq TM测序。在每个库中生成至少4013 - 6270万次原始读取，然后进行过滤处理。在此之后，3977 - 6199万次的干净读取保持了Q30 %(错误概率低于0.1%)在90.77 - 95.17%之间。接受的干净读取被映射到引用pear (P. Bretschneideri.rehd。）基因组通过使用Hisat软件。占总读数的72.35-80.15％的范围被映射到参考基因组（附加文件6:补充表S2)。95.9%的测序reads被定位到基因组外显子区。FPKM(期望的每千碱基对转录序列的片段数/百万碱基对)用于评估基因表达水平。FPKM > 1作为基因表达的标准。选择12个基因，用qRT-PCR验证转录数据的可靠性(附加文件7:图S5)。未授粉子房的RNA-Seq数据作为对照。以padj < 0.05和|log2 (ratio)|> 1为阈值，判断DEGs的显著性。通过对HP、UP、GA 4个文库的两两比较，确定了基因的差异₄与GA_3.在梨上。生物学重复间的Pearson相关性范围为0.974 ~ 0.987。基因注释用“党山苏里”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=pyrus）数据库作为参考。Venn图分析用于进行差异表达分析。基因和基因组的京都百科全书（KEGG）功能注释基于对公共数据库的序列同源物（www.genome.jp/kegg/). 在TB工具上检测DEGs的表达谱[36］．

基因表达水平的实时定量PCR（RT-QPCR）验证

qRT-PCR使用TB Green预混试剂在Step One + Real-Time PCR仪(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)上进行Taq.II套件(中国大连Takara)。约0.3 g样品称重后，在液氮中快速研磨成粉末。总RNA提取使用多糖和多酚丰富的RNAprep纯植物试剂盒(中国北京天根)。采用Thermo Scientific Microplate Reader(多扫描氧化石墨烯)分光光度法和电泳仪(DYY-6D)聚丙烯凝胶电泳法分别评价RNA浓度和质量。将1 μg总RNA用PrimeScript逆转录试剂盒与gDNA Eraser (Takara, Dalian, China)反转录合成cDNA。目的基因引物采用Primer Premier 5.0软件(Premier Biosoft)和NCBI Primer- blast工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)．Actin 7基因作为基因表达分析的内参。用于验证转录数据的引物在附加文件中描述8:补充表S3。底漆PBCYP78A6（LOM103964254），Pbcyclin依赖性激酶B2-2(LOC103961775),细胞周期蛋白依赖激酶B2-2样(LOC103952922),PBExpansin-A4（位置103951053），G2 /有丝分裂特异性细胞周期蛋白-2（CCNB2L公司）（LOM103962422），细胞周期素2-4（位置103931294），类PbCDKI6（LOC103964480）列于其他文件中8:补充表S3。PCR反应首先在95°C孵育30 s，然后在95°C孵育5 s和60°C孵育30 s的条件下进行40个循环。所有反应均在3个生物重复和3个技术重复上进行。使用周期阈值(Ct) 2对特异性mRNA水平进行相对定量^-ΔΔct方法[37］．

系统发育分析

的全长cdPBCYP78A6（LOM103964254）与'Dangshansu'梨（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term= pyrus)。利用ClustalW对其他植物的cypyp78a6和其他CYP78A亚群成员的氨基酸序列进行了比对[38］．应用Mega5.10用邻近加入统计方法构建系统发育树。此外，对系统发生测试进行了1000个引导复制[39］．

梨转基因愈伤组织的质粒构建及产生

生成转基因梨Calli，编码区PBCYP78A6使用引物克隆PBCYP78A6-OE F/R，并引入基于网关重组技术(Invitrogen)的载体pGWB414，构建过表达载体。以载体pHellsgate2和pK7WIWG2D作为rna介导的沉默载体PBCYP78A6如上所述[40，41］．这些向量被变换成根癌农杆菌EHA105用于渗透。

对梨愈伤组织的诱导及其转化进行了综述[42］．简单地说，将EHA105的预制悬浮液与15天生的梨愈伤组织孵育15分钟，在含有1.0 mg·L的MS培养基上共培养⁻¹2，4-D和0.25 mg·L⁻¹在24°C时6-Ba 2天。随后，用含300mg·L的无菌水洗涤愈伤组织三次⁻¹头孢噻肟钠，转移至补充300 mg·L的MS培养基中⁻¹头孢噻肟和50毫克·升⁻¹硫酸卡那霉素在转基因筛选中的应用。

番茄转基因株系的生产

全长度PBCYP78A6（LOM103964254）使用带适配器的引物（附加文件）从'Dangshansu'cDNA中分离编码序列（CDS）（附加文件9：补充表S4）由Snap Gene软件1.1.3设计，然后克隆到BamH我和萨奇限制性内切酶位点花椰菜马赛克病毒（CAMV）35S在PBI121载体中启动子以产生使用克隆表达一步克隆试剂盒（南京，中国）产生过表达构建体。将重组vect转化为根癌农杆菌LBA4404经热休克法检测，单克隆阳性农杆菌属在含有适当抗生素（卡那霉素和利福平）的Luria-Bertani（LB）固体培养基中，在28℃，200rpm，黑暗中增殖的细胞。孵化适当的时间后，农杆菌属细胞浓度达到OD₆₀₀≈以600 rpm离心0.5–0.8，收集在管中，然后悬浮在MS-isopyknic-to-LB溶液中。将该菌悬浮液用于番茄转化。

转化分析如前所述进行[43］．简而言之，生长灭菌的番茄种子，直到其子叶饱和在玻璃罐中伸展。将子叶切成切片并置于含有凝固的MS1培养基的培养皿上，在黑暗中浸入2天，然后将它们浸入上面制备的细菌悬浮液中10分钟。用滤纸浸渍有细菌悬浮液的外植体，然后在MS1培养基中在黑暗中培养2天。然后将外植体转移至MS2凝固培养基。在外植体产生抗性Calli产生的芽后，切除1-2厘米的芽并置于玻璃罐中的MS3培养基上。曾根扎根后，用根的外植体在含有蛭石的盆中培养，与Hoagland的溶液浇水，并在转移到温室之前在生长室中调节。通过在受控条件下自行实现转基因植物的后代。

上面使用的培养基如下：悬浮液包括补充0.4mg L的MS盐⁻¹盐酸噻嗪，100毫克L.⁻¹肌醇肌醇，2％（w / v）蔗糖和200μm丙酮糖酮。MS1含有补充维生素的MS盐，3％（w / v）蔗糖，100 mg l^-1肌醇，4毫克/升^-1吲哚乙酸(IAA)， 4mg l^-1激动素，0.8%琼脂。MS2中含有MS1，添加1mg l^-1Zeatin，300毫克L.^-1头孢托辛，100毫克^-1卡那霉素。MS3由MS盐、2%（w/v）蔗糖、100mg l^-1肌醇，1毫克1升^-1硫胺素，0.1 mg l^-1IAA和0.8%（w/v）琼脂。

已获得此体验中使用的所有材料的权限。因此不需要进一步的许可。本研究中产生和分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。额外的数据已附加为补充表。所有基因的序列和信息都可以在国家生物技术信息中心获得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)．

遗传算法₄：

赤霉素A4

遗传算法_3.：

赤霉素A3

惠普:

人工授粉

:

无授粉

OE:

过表达

expa4：

Expansin-A4

CCNB2L公司：

G2 /有丝分裂特异性细胞周期蛋白-2

CDKB22:

细胞周期蛋白依赖性激酶B2-2

CDKB22L:

PbCyclin依赖激酶B2-2样

CDKI6L型：

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂6状

RNAi:

RNA干扰

SD:

标准差

我们感谢来自中国杨凌西北农林大学的青美冠教授提供PK7WWG2D质粒。我们感谢来自中国杨凌西北农林大学的向强占教授，一般提供番茄种子和转基因方法。感谢乐天集团中国有限公司李文卞吉博士Lesley Benyon(www.liwenbianji.cn/ac.），编辑本手稿草稿的英文文本。

该研究由中国国家重点研发计划（2019YFD1001400）和西北A＆F大学的Weinan实验站基金会资助。除了提供财政支持之外，资助机构在研究的设计，数据的设计中没有作用，以及数据的写作。

从属关系

1. 西北农林科技大学园艺学院，干旱地区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌太城路3号，712100

   海奇张，魏汉，辉汉王，刘聪，瑞斋，成泉杨，王塘王玲飞徐

贡献

HQZ进行了实验，并撰写了手稿初稿。LFX、ZGW、RZ、CQY设计实验。HQZ、HBW、WH进行了实验，并对数据进行了分析。LFX，ZGW，RZ，CQY修改了手稿。所有作者都参与了这项研究，并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应到凌飞徐．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

出版商说明

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