菠菜叶片相关性状的QTL分析(菠菜l .)

背景

菠菜(菠菜叶长、叶宽、叶柄长等叶片相关性状是重要的经济性状。然而，潜在的基因仍然不清楚。对菠菜叶片相关性状进行QTL定位。

结果

八国派团_1.利用群体构建2015年和2019年叶片长度、叶宽、叶柄长、叶宽比的连锁图谱，并进行QTL定位。利用特异性位点扩增片段测序(SLAF-seq)和竞争性等位基因特异性PCR (KASP)技术，分别构建了两种遗传连锁图谱_1.人口在2015年。根据2015年的结果，使用BC生成检测到的特异连锁群(LG)_1.共检测到13个与叶相关性状的qtl，只有5个qtl在多年或连锁图谱中被重复检测。有趣的是，叶长、叶柄长和叶长宽比的主要qtl与相同的SNP标记（KM3102838、KM1360385和KM2191098）高度相关。从41.470出发，在1号染色体上定位了叶宽的主效QTL−42.045兆。共鉴定出44个基因。GO分析结果表明，这些基因在核糖核酸酶、裂解酶活性、磷酸二酯键水解过程和细胞壁成分等方面都有显著的富集，从而可能通过改变细胞大小来决定叶片的形状。

结论

重复检测到叶叶相关性状的五个QTL至少两年或联系地图。叶片长度，叶柄长度和叶片长度与宽度的比例的主要QTL映射在同一基点上。和三个基因（SPO10792，SPO21018,Spo21019型)被鉴定为叶宽的重要候选基因。

菠菜(菠菜L.)是一种经济意义重大的叶菜，在世界各地种植。它也被认为是最有营养的蔬菜之一，因为它含有大量对人体健康有益的物质，包括维生素A、E、C、K、叶黄素、叶酸、草酸、钙、铁、磷和钾[1.,2.,3.］．菠菜起源于中东(可能是伊朗)，已经种植了两千多年。中国早在七世纪就开始种植菠菜，比欧美早[4.］．中国是最大的生产国，其次是美国和日本[2.]. 2014年，全球菠菜产量估计约为2430万吨，91 % 其中一种是在中国生产的[5.］．

菠菜是一个属于苋菜科家族的二倍体物种，通常被定义为巨型，但偶尔是单一的物种[6.,7.］．叶片特征，如叶片类型（萨沃伊，半浮雕，平滑型），叶子长度和宽度，叶片直立，叶柄长度和颜色，边缘形状被认为是重要的农艺特征，对菠菜育种产生重大影响。例如，直立的叶子更有可能适应高密度菠菜生产和机械收获。此外，Savoy和Semi-Savoy叶片类型的菠菜通常适用于新鲜市场消耗，而平滑类型对于冻结产品和沙拉普遍存存[3.,8.]. 这些性状是典型的由多基因控制的数量性状，同时也受到环境条件的显著影响[9］．到目前为止，只有少数报告已在菠菜中公布与分子标志物相关的叶相关性状。马等人。（2016）[3.]利用测序（GBS）技术对菠菜的表面结构、边缘形状和叶柄颜色进行关联图谱分析，发现5、7和14个单核苷酸多态性（SNP）标记分别与表面结构、边缘形状和叶柄颜色相关。最近，蔡等人（2018）[5.]利用GBS技术和叶片颜色(红/绿)的QTL定位。结果表明，一个主效QTL占表型变异的69.3%。但叶片类型(长、宽)和叶柄长度的qtl仍不清楚。因此，qtl的定位对菠菜的改良具有重要的影响。

遗传联系地图是一种强大的基因组工具，已广泛用于QTL映射，基因映射，全基因组组装和标记辅助选择（MAS）[10.]. 迄今为止，已有5个菠菜遗传连锁图谱被报道。第一张遗传图谱包含101个扩增片段长度多态性（AFLP）和9个简单序列重复序列（SSR），它们是用PCR标记生成的[11.］．将该地图分为七个连杆组，跨越585厘米，相邻标记平均为5.18厘米，用于分析性别判定基因座的位置[11.]. 第二张遗传图谱为433.6cm，由283个SNP标记组成[12.]. 将该图谱分为6个连锁群，与菠菜染色体数目一致，利用该连锁图谱鉴定了39个与菠菜氮素利用效率相关的qtl[12.］．利用特异性位点扩增片段测序(SLAF-seq)技术和4,080个SNP标记构建了第三张遗传图谱，长度为11,125.97 cM，相邻标记间平均距离为0.31 cM [13.］．第四个遗传图谱由Xu等人构成。（2017）[14.]并且它含有六个连杆基团，发现463 MB菠菜基因组支架用870个SNP标记锚定到遗传图谱。最近，Cai等人。（2018）[5.]构建更新的高密度遗传图谱，以映射叶子颜色（Ref / Green）。如使用GBS技术测量的，地图含有六个跨越1539.96cm的连杆组，并且平均标记间隔为0.4cm。

多态性DNA标记的类型和数量在构建高密度遗传连锁图谱中起着重要作用。迄今为止，已经发现了多种DNA标记，包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、AFLP、SSR和SNP[15.,16.］．SNP是最常见的DNA标记类型，具有高丰度，可支持成本效益和快速筛选处理[17.]. KASP是一种基于PCR的同质荧光SNP基因分型技术，可以区分不同荧光（如FAM和HEX荧光）的等位基因[18.］．随着成本效益，适应性和效率的优点，该技术广泛应用于许多物种，包括小麦[19.,番茄20.]和玉米[21.］．

在研究中，高密度菠菜遗传图[13.用于映射叶片长度（LL），叶片宽度（LW），叶柄长度（PL）的QTL，以及叶长度与宽度（LR）的比率。此外，为了验证SLAF标记的真实性，我们使用基于KASP技术的SLAF标记构建了遗传联系地图，并试图使用联动地图来映射四个特征。我们的目标是为菠菜中的MAS开发DNA分子标记，可用于改善菠菜的作物和未来研究。

鉴定SNP标记和基因分型

为了验证SLAF-seq技术4080个SLAF标记的准确性（表S1.）[13.[我们均匀地从六个高密度连杆组中选择了300个SLAF标记，以构建基于KASP技术的均匀分布标记的连杆图。标记用于基因型BC_1.个人。在这300个标记中，有119个标记由于缺少分离、扭曲分离或信号而无法获得。因此，利用剩余的181个有效标记生成连锁图谱(图1)。1.)．

施工联系地图

为了建立一个基于SNP的遗传连锁图谱，我们选择了181个信息性SNP标记和147个BC_1.来自2015年的个人用于使用JoinMap4.0软件进行联系分析。将所有标记物映射到分为六个连杆基团（LG1至LG6）的遗传映射上，这与菠菜染色体的数量一致（图。1.和表S.2.)．连锁图谱总大小为585.45 cM，平均区间为3.23 cM。标记数量最多的连锁群为LG1，共68个SNP标记，跨越96.29 cM。LG4的长度为109.911 cM，包含18个标记，是6个连锁群中标记数量最少的。由于缺乏足够的均匀分布标记，LG1、LG4和LG5存在一定的缺口，但也存在具有均匀分布标记的连锁群，如LG2和LG3。根据qtl的结果，利用BC_1.从2015年起(图。2.和3.)，利用位于LG3和LG5上的标记生成遗传图谱，并尝试利用BC对4个性状进行定位_1.(表S3.)．

BC表型资料分析_1.人口

BC的叶子相关性状_1.线条总结在表格中1.. 至于2015年的个体，LL差异很大，从9.80到18.25 cm不等，平均为13.85 cm。LW范围为5.00～9.45cm，平均6.80cm。PL值为2.45～6.50cm，平均4.45cm。不列颠哥伦比亚省_1.2019年的线路在2015年相对于个人的LL，LW和PL分享了更高的价值（表S.4.)．LL、LW、PL、LR在BC的频率分布_1.2015年至2019年的人口持续分布（图。4.A、b、c、d;无花果。1.A, b, c, d)，代表由多个基因控制的四种性状。此外，LL与PL呈显著正相关(R= 0.82)_1.2015年人口，但2019年与LW（r = 0.73）相关（表2.），可能受到环境的影响。

叶子相关性状的QTL映射

基于L1（2.8），LW（2.6），PL（2.8）和LR（3.4），检测到的四种性状的13个QTL的LOD阈值，发现使用三个联系地图在LG3和LG5上分布：由SLAF-SEQ产生的高密度遗传图（Qian等人2017），由BC构建的遗传地图_1.2015 - 2019年分别使用KASP技术。(表3.）（图。2.和3.)．

LL基因共鉴定出4个qtl (qLL5.1、qLL5.2、1LL5.3和qLL3.1)，分布在LG5和LG3上。只有qLL5.3在3个连锁图谱上重复检测到，LOD值在6.61 ~ 24.58之间，能够解释14.2 ~ 50.7%的表型变异。根据3个连锁图谱的分析结果，3个最接近的标记Marker3102838、KM2191098和KM1360385位于76.692 ~ 77.340 cM区域，与qLL5.3显著相关(图3)。3.)．

找到了三个QTL用于LW：QLW3.1，QLW3.2和QLW3.3。QLW3.3是一个主要的QTL，在2015年的两个联动地图上反复检测到，而在三张连杆地图上反复发现次要QTL QLW3.1。QLW3.3，靠近两个相邻标记Marker3677664和KM41831444，LOD评分为3.9-4.434，并解释了9-9.3％的表型变异。较小的LW QTL，靠近标记KM3309304（Marker3309304）的LOD评分为2.02-3.72，并解释了5.7-6.9％的表型变异。

在3个连锁图谱上均发现2个qtl (qPL5.1和qPL5.2)，其中qPL5.2在3个连锁图谱上重复鉴定，LOD值为5.06 ~ 12.14。该QTL (qPL5.2)在LG5上检测到，在邻近的两个标记KM2191098和KM3102838 (Marker3102838)上有一个峰值，可解释16.5 ~ 31.6%的表型变异和0.67 ~ 1.84的加性效应。

对于LR，发现了四个QTL（QLR5.1，QLR5.2，QLR3.1和QLR3.2）。QLR5.2被发现是一个主要的QTL，LOD得分为8.53-14.76，并在三张联系地图上反复检测到。有趣的是，QLL5.3，QPL5.2和QLR5.2在三个联系地图上检测到，并在LG5的相同轨迹上映射，接近三个相邻标记KM1360385，KM2191098和KM3102838。

3个主要qtl (qLL5.3、qPL5.2和qLR5.2)与KM1360385、KM2191098和KM3102838高度相关，分别位于3个scaffold (SpoScf_00704 (321,888 bp)、SpoScf_01046 (226,571 bp)和SpoScf_24795 (1428 bp)上。主效QTL qLW3.3在41.470−42.045 Mb，次效QTL qLW3.1在46.712−48.141 Mb。5.). 以上菠菜参考数据库来自菠菜基地(http://www.spinachbase.org.)．

候选基因的预测与分析

基于基于基因组注释信息，可以识别QTL置信区间内的基因。对于LL，LR和PL基因座，分别在支架SPOSCF_01046和SPOSCF_00704中鉴定出两个基因和九个基因，而在SPOSCF_24795中没有发现基因（表S.5.)．所有基因编码编码BNR / ASP箱重复家庭蛋白质，富含亮氨酸的重复，蛋白激酶等（表S5.)．至于LW，发现44个基因的主要QTL QLW3.3基因座，其位于染色体1至42.045 MB（表S.6.)．在GO分析中，44个基因中27个富集于分子功能(MF)类，25个富集于生物过程(BP)类，只有7个富集于细胞成分(CC)类(P值< 0.05)。在MF类中，大部分基因与核糖核酸酶T2活性、裂解酶活性、内切酶活性等相关(图1)。6.). 在BP类中，大多数基因参与RNA磷酸二酯键水解、核内裂解、RNA分解代谢和核酸磷酸二酯键水解。在CC类中，这7个基因与细胞壁有关（图。6.)．基于菠菜参考的注释信息，三个基因（SPO10792，SPO21018,Spo21019型)，因为它们参与细胞扩张(表4.)．

叶片相关性状连锁标记的研究进展

在本研究中，与4个主效qtl qLL5.3、qPL5.2、qLR5.2和qLW3.3紧密连锁的snp可以开发出MAS的KASP标记。例如，公元前90年_1.在2020年种植的个体用于检查标记KM2191098的准确性，与LL，PL和LR相关联。如图1所示。7.A，KASP基因型测定分析（参见“材料和方法”）表明，90线可以明显分离两组：T：G和T：T基因型，表明KM2191098是可用标记。和基因型和表型的详细信息总结在表S中7.．在表S中总结了标记KM2191098的引物序列8.．另外，LL、PL和LR中T:G与T:G表型比较，两个基因型在三个性状上具有显著差异(图1)。7.以T:G基因型的个体为例，与T:T基因型的个体相比，具有更长的叶长。因此，这些结果表明，与LL、PL和LR相关的标记KM2191098可用于MAS。

叶状性状非常重要，因为它们会影响叶子如何捕获光合作用[22.]. 迄今为止，有关菠菜叶片和叶柄性状的研究还不多[3.,9,23.］．然而，菠菜中与LL，LW和PL相关联的QTL保持未报告。

在研究中，由Qian等人构建的高密度遗传图谱。使用KASP基因分型测定产生的两种遗传贴图用于映射L1，LW，PL和LR的QTL。我们确定了与LL（QL15.1，QLL5.2,10015.3和QLL3.1）相关的四个QTL，与LW相关的三个QTL（QLW3.1，QLW3.2和QLW3.3），两个QTL相关PL（QPL5.1和QPL5.2），以及LR的四个QTL（QLR5.1，QLR5.2，QLR3.1和QLR3.2）。有趣的是，QLL5.3位于与主要QTLS QPL5.2和QLR5.2和QLR5.2的相同区域，建议LL与PL或LR相关，这与表中的相关性一致2.. 其中，只有5个QTL（qLL5.3、qPL5.2、qLR5.2、qLW3.3和qLW3.1）在至少两个连锁图谱上被重复检测到（图。2.和3.). 有两个原因可以解释只有少数qtl能够在不同的连锁图谱上检测到。一方面，QTL数目、位置的差异可能与环境效应有关。另一方面，不同的群体、不同的连锁图谱甚至不同的标记数目也会影响qtl[24.,25.］．例如，QTL qLR5.1只在高密度连锁图谱上被检测到，而qLR5.2接近qLR5.1，在三种不同的连锁图谱上都能被重复检测到(图1)。2.和3.）因此我们推测，两个QTL可能是相同的。因此，这些QTL不能在多年或联系地图中重复检测到。

到目前为止，已经报道了许多与决定叶子形状和大小有关的基因。例如,在拟南芥蒂利亚纳，油菜素类固醇反应环-H2(BRH1）基因，含有高度保守的环形手指结构域，能够改变叶子形状[26.］．大哥（BB型）能够大大减少叶子尺寸[27.］．WOX5型，与wuschell相关的同源盒家族之一，可以起到多余的作用WOX1型和WOX3型控制叶形[28.]. 对水稻叶片的形状和大小也进行了许多研究。窄叶7(NAL7)编码一种含有黄素的单加氧酶，并导致由生长素介导的叶宽减小[29.］．窄卷叶1 (nrl1.)编码纤维素合成酶样蛋白D4，Hu等人（2010）鉴定了三个隐性突变体(Nrl1-1, nrl1-2和nrl1-3)具有窄卷叶表型[30.］．Qi等人(2008)研究了一个名为narrow leaf1的突变体(纳尔1.），通过影响静脉图案化和极性助线传输来减少叶宽[31.］．窄卷曲基因NAL2和NAL3编码一个WUSCHEL相关同源盒转录激活子并控制水稻叶片宽度[9］．

总之，参与器官生长、发育或激素运输的基因可能会改变叶片的形状。本研究以菠菜基因组组装不完全为特征，将LL、PL和LR的主效qtl定位在3个支架(SpoScf_00704、SpoScf_24795和SpoScf_01046)上。三个支架共鉴定了11个基因，详细信息列于表S5.．此外，主要QTL QLW3.3位于染色体1的41.470-42.045mb，44个基因在该地区内鉴定出来（表S.6.)．根据去分析，主要富集核糖核酸酶，裂解酶活性，磷酸二酯键水解和细胞壁（图。6.)因此，我们假设叶片宽度可能会因细胞膨胀而改变，如前所述，细胞膨胀可以决定叶片基本形状确定后的最终大小和形状[32.］．此外，基于菠菜参考基因组的注释(http://www.spinachbase.org.），三个基因（SPO10792.,Spo21018型,Spo21019型（参与细胞膨胀）被选为潜在的候选基因（表4.)．需要进一步的工作来验证此结果。

近年来，分子标记技术因其能提高育种效率、加速育种进程而在许多作物育种项目中得到广泛应用。因此，MAS是一种有效的育种方法[33.］．本研究基于qLL5.3、qPL5.2、qLR5.2和qLW3.3这4个主效qtl，开发了MAS的有效KASP标记。例如KASP标记KM2191098，它与LL、PL和LR相关(图。7.)．因此，与四个特征紧密相关的SNP对于筛选菠菜中的兴趣叶形和尺寸是有价值的。

利用SLAF-seq和KASP技术对13个菠菜叶片相关性状的qtl进行了鉴定。在多年或连锁群中，只有5个qtl被重复检测到。qLW3.3主效QTL定位于1号染色体41.470～42.045mb。在候选区内鉴定出44个基因和3个基因(SPO10792，SPO21018,Spo21019型）被认为是潜在的候选基因，其参与生长调控或细胞膨胀。有趣的是，三个主要的QTLS QLL5.3，QPL5.2和QLR5.2与KM1360385，KM2191098和KM3102838高度相关。基于结果，开发了一种Kasp标记，其与LL，PL和LR显着相关。本研究中的研究结果对于叶叶相关的特征育种计划具有重要价值，进一步精细地映射菠菜中的特征。

植物材料与DNA提取

公元前147年_1.作图群体由自交系12S3、一个复发母本和一个父本(自交系12S4)杂交而来。所有植物材料均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所(IVF)菠菜课课组生产。与自交系12S3比较(图。8.a） 12S4叶片和叶柄长较大，叶宽较小（图1）。8.b）。整个BC_1.人口（图。8.C−e） 亲本分别于2015年春季和2019年春季在体外受精（IVF）实验场和CAAS实验场进行自然环境培养。另外，公元前90年_1.用于验证与叶相关性状紧密相关的标记的个体也被种植在2020年春季IVF的实验领域。所有上述单个植物分开0.3米，并在图中排列0.5米。否则，在研究中使用和收集的植物材料符合中国的指导方针和立法。

BC的鲜叶_1.收集个体和两个父母（直到6个真正的叶子）被收集，然后在液氮中冷冻直至DNA提取。使用Murray和Thompson（1980）所述的甲基三甲基溴化铵（CTAB）方法提取总基因组DNA [34］．采用1.0 %琼脂糖凝胶电泳和ND-2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)检测DNA质量和浓度。

SNP分子标记的发现及基因分型

通过Qian等人来说，通过SLAF-SEQ鉴定了4,080个多态性SLAF标记物，使用如先前描述的方法。（2017）。为了验证使用KASP技术的SLAF标记的准确性，选择了300个SLAF标记，重命名为“km”，然后选择SLAF标记号，以设计KASP测定底漆，并由LGC公司（中国上海）设计了底漆。Kasp在体积5μl中进行，包括2.5μL2×kasp母混合物，0.07μlkasp测定混合物，0.07μlkasp测定混合物，2.5μldna，稀释至20-30ng /μl。将Kasp基因分型混合物排成384孔PCR板。每个板上都包含无模板控件（NTC）。

所有扩增均在Veriti 384 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, US)上进行，使用以下热循环条件:15分钟在94°C紧随其后的热循环94°C的20年代和60年代在61°C(每周期降低0.6°C), 26个周期94°C的20年代和60年代在55°C下,下面的板是读40°C QuantStudio 12 K Flex实时PCR系统(应用生物系统公司,促进城市、钙、美国)。如果在初始KASP热循环后没有获得充分定义的基因型簇，则需要进行额外的热循环(在94°C下进行3次20秒和在57°C下进行60秒)。进行额外的热循环和平板读数，直到获得确定的基因型簇。

施工联系地图

在偏析变形下滤出标记，然后使用BC进行可用的SNP标记进行连杆分析和地图结构_1.2015年通过JoinMap 4.0软件的人口[35］．采用回归作图法计算各连锁群，对标记进行排序。独立LOD的起始值更改为0.5，所有其他设置都设置为默认值。至于公元前_1.从2019年开始的人口，位于连杆组上的SNP标记与2015年和高密度遗传图谱鉴定的QTLS鉴定，以构建遗传图以进一步映射四个特征。

表型评估

表型数据收集自BC_1.2015年，2019年和2020年的个人。一旦个体含有六个真实的叶子，使用尺子测量外部两片叶的LL，LW和PL。使用R软件（3.5.1版）绘制LL，LW，PL和LR的频率分布和相关性。

QTL分析和候选基因识别

利用SLAF-seq构建的高密度遗传图谱，对4个叶片相关性状进行qtl分析[13.]由BC构建的遗传图谱_1.分别为2015年至2019年。用mapqtl6.0进行QTL分析[36]使用间隔映射(IM)和多个QTL模型(MQM)方法。(1)在P < 0.05 (n = 1000)的全基因组显著性水平下，采用排列试验计算QTL的基本参数LOD阈值;(2)采用IM方法进行QTL定位，设置步长为1;(3)根据IM作图结果，得到最接近LOD峰且高于阈值的标记作为辅助因子，进行MQM作图分析;(4)检测最接近LOD峰的标记，并对辅助因子进行相应的调整。在第四步之后，我们重复MOM映射。(5)以LOD值最高的标记为QTL，选取峰值两侧LOD值降低1.5 LOD的区域，构造一个1.5 LOD支持区间作为置信区间。我们采用标准的QTL命名法:首先是“q”和性状的首字母，然后是连锁群的名称，然后是同一连锁群上的QTL的数量(例如，在连锁群3上的第二个叶宽QTL为qLW3.2)。

将QTL重复检测到至少两个连杆地图被定义为有价值的QTL。合并三个联系地图的置信区间，然后被认为是最终的置信区间。候选基因通过簇预防器通过基因本体学（GO）分析来分类[37］．Boxplots使用BMK云平台进行（http://www.biocloud.net/)．

在当前研究期间生成和分析的数据集可在补充表中获得。

AFLP公司：

：扩增片段长度多态性

国标：

Genotyping-by-sequencing

卡斯普：

竞争性等位基因特异性PCR

噢,

叶子长度

左后：

叶长宽比

长波：

叶宽

MAS:

分子标记辅助选择

PL:

叶柄长度

RAPD：

随机扩增多态DNA

RFLP:

限制片段长度多态性

SLAF-SEQ：

特异性位点扩增片段测序

SNP:

单核苷酸多态性

SSR：

简单的序列重复

作者感谢所有支持我们的实验室伙伴。

本研究在中国北京农业重点实验室进行，获得了中国自然科学基金（31872102）、中国农业科学院创新工程（CAAS-ASTIP-IVFCAAS）、北京市科学技术委员会（Z1711001515014）的科学计划资助。国家重点研究发展计划（2018YFD0100805），中央公益性科研机构基础研究基金（Y2019XK12），农业部园艺作物生物学与遗传改良重点实验室，北京。这些资助机构在研究设计、收集、分析和解释数据或撰写手稿方面没有任何作用。

作者笔记

1. 刘志远和红兵对这项工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京

   刘志远，佘红兵，徐兆生，张和龙，李国亮，张世凡，钱伟

贡献

WQ、SZ和ZX设计了本研究。ZL和HS进行了实验。HS和ZL对数据进行分析。他写了手稿。WQ、SZ、ZX对稿件进行了修改。WQ、HZ、GL分别制备并采集样品。所有作者均已阅读并批准稿件。

相应的作者

通信张世文张或魏倩．

道德认可和同意参与．

不适用。

出版许可

不适用。

相互竞争的利益

我们声明，我们没有任何商业或联合会利益，这些利益与提交的工作有关的利益冲突。

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斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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