光合产物在木薯贮藏根中的有效积累主要是由韧皮部的共质体卸载来维持的(GydF4y2Ba木薯耐GydF4y2Ba克兰茨）GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

木薯(GydF4y2Ba木薯耐GydF4y2BaCrantz）在其存储根部有效地积累淀粉。然而，光合素是如何从叶子运输到韧皮的（特别是它们如何卸载到储存根的实质细胞）仍然不清楚。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这里，我们研究了使用微观结构和生理分析的蔗糖卸载模式及其对木薯储存根系发展的影响，即羧基荧光素（CF）和C.GydF4y2Ba^14.GydF4y2Ba同位素示踪。对参与共质体和质外体转运的基因进行了表达谱分析，包括酶活性分析、蛋白质凝胶印迹分析和转录组测序分析。这些结果表明，碳水化合物主要以蔗糖的形式运输，54.6%以上的碳水化合物存在于茎韧皮部。蔗糖主要从韧皮部向贮藏根释放；此外，伴随着根肿胀的发生，有从质外体向共质体卸载的转变。显微结构的统计数据表明，在一个品种正在发育的贮藏根中，胞间连丝在筛细胞、伴细胞和薄壁组织细胞中富集，而在野生祖先中则没有。CF示踪试验证实了共质性通道的存在[GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC] Suc结果表明，蔗糖能迅速从韧皮部细胞向根薄壁细胞扩散。蔗糖合成酶和相关蛋白基因的高表达在贮藏根的中晚期出现，而不是在初生纤维根或次生纤维根中。蔗糖转运蛋白、细胞壁酸性转化酶和可溶性酸性转化酶在这些相应器官中的反向表达模式支持共质体蔗糖卸载途径的存在。在群体水平上，共质体卸载相关基因的转录谱及其与淀粉产量的显著正相关证实了共质体蔗糖转运在木薯贮藏根发育中的重要作用。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

在这项研究中，我们透露，木薯储存根验素蔗糖卸载图案主要是一个相反的卸载图案。与低产野生祖先相比，这种模式对于高产品种的高效淀粉积累至关重要。GydF4y2Ba

碳水化合物的光合作用及其运输和积累是任何经济上重要作物的产量形成的三个必要生理过程[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．然而，在物种之间意外不同地传输到叶子源到储存槽的方法。在叶片中加载叶片和卸载水槽的两个限制步骤在这个过程中发挥着关键作用，可以显着影响作物产量和植物生产力[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．迄今为止，已经在植物中鉴定了三种一般蔗糖卸料模型，即互补性，妊娠和混合模型。互补验卸液卸载，其中蔗糖通过验磷脂伴细胞（CCS）和实质细胞（PCS）之间的血浆，并进入水槽组织是大多数植物物种的主要途径[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．转录组学已经报道了一系列与胞间连丝形成相关的基因[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．蔗糖合酶(SuSy)催化蔗糖向果糖的可逆转化，尿苷二磷酸葡萄糖作为载体，维持实质细胞中蔗糖的生理低浓度。与INV相比，SuSy是共塑后卸载的组成部分，对淀粉和蛋白质的合成更为重要[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．胞间连丝变化对共体运输的调控已在许多植物中得到了广泛的研究[GydF4y2Ba4GydF4y2Ba，GydF4y2Ba5GydF4y2Ba，GydF4y2Ba6GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

痉挛卸载取决于蔗糖转运蛋白（Suts）将蔗糖从Phloem中占据储存根部的实质细胞。此过程伴随着卸载后转换酶。倒置是有希望的候选候选者，因为它们催化了蔗糖的不可逆裂解到葡萄糖和果糖。妊娠复转酶（细胞壁结合的酸转化酶），其与妊娠卸载相关[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，GydF4y2Ba7GydF4y2Ba]，使渗透性活性溶质的储存抵抗浓度梯度[GydF4y2Ba8GydF4y2Ba］．或者，可以通过位于质膜上的蔗糖转运蛋白（Suts）来运输细胞之间的胎板空间中的蔗糖[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba，GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

卸载过程会根据库类型、发育阶段和相关基因的功能而有所不同[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．两个卸载途径之间的过渡与可溶性糖含量和转化酶活性密切相关[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．蔗糖利用是在相关器官内由SuSy和转化酶催化的切割启动的;这种分裂反过来通过两个不同的韧皮部卸载途径调节卸载速率[GydF4y2Ba8GydF4y2Ba，GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．已发现可溶性酸转化酶（SAI）和SASY编码基因的mRNA表达与SAAY和SAI介导的Sucrolytic途径之间的平衡决定了马铃薯块茎的卸载途径和淀粉积累的类型[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

为了提高植物产量，需要了解韧皮部卸载的细胞路线[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]，但由于与此过程相关的实质性技术挑战，开发一个用于复杂sink器官的直接实验模型是困难的。迄今为止，韧皮部脱落的机理研究只集中在肉质水果上，如葡萄[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]，中国枣[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]，桃子[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]，蓝莓[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba，猕猴桃[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]，很少有人致力于植物贮藏库。木薯(GydF4y2Ba木薯耐GydF4y2BaCrantz）是每年收获的热带多年生根系种植物种，增长周期约为12个月。木薯排名为全球第五个最重要的食物作物，大约十亿人依赖于富含淀粉的根源[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．高效的光合作用，对流动的耐受性，以及其存储根部的耐旱性，是Cassava的基本生物学特性[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba］．此外，木薯有三种根类型：初级和二级纤维根和储存根[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］．贮藏根由主要须根(PFRs)按照一种独特的次生生长模式生长而成，淀粉可占贮藏根干重的85% [GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］．然而，如此大量的碳水化合物是如何在叶片中装入韧皮部，并在贮藏根中装入实质细胞的，目前尚不清楚。GydF4y2Ba

在本研究中，我们确定了木薯碳水化合物的一般运输模式，阐明了蔗糖是主要的运输成分，发现了一个主要的共同韧皮部卸载系统在贮藏根中，研究发现，在须根膨胀初期，淀粉的转运由外质体转运向共质体转运转变，这是木薯高效积累淀粉的必要条件。这些发现是基于对贮藏根发育的结构、生理和生化实验，包括对酶活性和参与运输和运输后事件的基因mrna表达的测量。GydF4y2Ba

蔗糖是光合产物在木薯韧皮部运输的主要成分GydF4y2Ba

木薯被盆栽在温室里。三个生长阶段的生物量积累曲线、贮藏根的解剖结构、韧皮部汁液收集结果和韧皮部组成如图所示。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．在储存根部开发期间从植物杆收集验素SAP（植物出苗（DAPE）后约60天）。高效液相色谱（HPLC）的检查显示，蔗糖具有最大的峰，占磷脂液的约79％，其次是葡萄糖和果糖（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bae）。Phloem Sap中蔗糖，葡萄糖和果糖的浓度分别构成54.6,22.7和22.5％（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．这些结果表明，蔗糖是碳水化合物从叶片运输到木薯地下贮藏根的主要形式。GydF4y2Ba

SE-CC复合体通过存储根的PlasmodeMata符合围绕PCGydF4y2Ba

三种木薯根的微观结构（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba详细研究了A-C），包括控制纤维根（见附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图。S1）。根据生物质（新鲜干重）储存根的积累曲线，我们将开发的储存根部分为三个阶段：早期（60 Dape，初始储存根），中期（180个Dape，储存根的快速生长）和晚期（270 Dape，成熟的储存根）（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bad).我们的观察主要集中在韧皮部筛单元(SEs)、CCs和PCs之间的胞间连丝(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．在纤维状根中很少观察到纤维状斑块（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa-c)，特别是SE-CC复合体和pc之间(表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba). 然而，在SEs和CCs之间观察到大量胞间连丝（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bae，g，j），se-cc复合物和pcs（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad)， pc之间(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baf，i，l）在三个发展阶段的存储根中。在扩展SES中，一组始终伴随两个中间或晚期CCS（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bah，k），并且大多数血浆在早期阶段是单侧的（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad，e，f）。然而，中期和晚期阶段出现了许多简单的（非外侧）浆瘤（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba(g, j, i, l)。在发育后期，有时会出现厚壁SEs(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bak） 与CCs或PCs相连的孔内胞间连丝（PD）单元（PPU）（见附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S2）。计算了含有几种细胞类型的横截面上的胞间连丝密度（表1）GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．3种类型的贮藏根细胞中PD数量在3个发育阶段均有增加的趋势，但在须根中却很少，尤其是在PFRs中，PD多出现在SE-CC复合体的界面上。在相邻的两个pc之间的界面处，pd的数量比其他界面之间增加，甚至在次级纤维根(SFRs)中，淀粉存储容量有限。木薯贮藏根发育过程中韧皮部的超微结构以及SE-CC、SE-CC复合体、PCs和相邻PCs之间的胞间连丝的分布，表明了木薯贮藏根的共塑运输和通讯特性的通道可能性。GydF4y2Ba

Carboxyfluorescein（CF）的快速横向扩散强烈支持对称验卸卸载在开发储存根部GydF4y2Ba

进入细胞后，膜透性非荧光6(5)-羧基荧光素二乙酸酯(CFDA)被分解为6(5)羧基荧光素(CF)，这是一种膜不透性荧光染料。CF常被用作韧皮部运输和共同韧皮部卸载的荧光标记[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．在这项研究中，它被注射到靠近木薯植株基部的茎在早期、中期和后期发育阶段。72h后，通过显微切片在三个阶段的根中立即检测到CF绿色荧光信号(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa、b). CF分子广泛分布于贮藏根三个发育阶段的韧皮部(SPH)和木质部(SXY)区域。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaD-F5），CF的最高密度主要出现在早期和中间阶段（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba相反，CFs沿皮层被限制释放，但在PFRs的初生韧皮部(PPH)和初生木质部(PXY)中不可见(图8)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac, c1)。在明场显微镜下，PFRs中没有CF绿色荧光的分布。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC2）或405nm的激发（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC3）。该CF追踪实验清楚地说明了允许与蔗糖类似的分子的CFS通过电池膜在储存根部的哑瘤细胞中移动快速扩散，特别是在中间发育阶段。我们进一步利用了[GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC .利用Suc示踪技术检测不同发育阶段蔗糖分子的扩散强度差异。在这个实验阶段，[GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC]在植物碱中喂入茎秆，在72小时后，我们研究了三个阶段的根部的分布和密度（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bah)。GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC在发育中的贮藏根的韧皮部和木质部组织中迅速积累。(GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC] Suc信号在贮藏中期强于贮藏后期，贮藏初期信号较弱。这个GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC在三个关键发展阶段的根部卸载趋势与木薯植物的生长和生物质积累特性的需求一致（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bad).蔗糖的快速卸载和动态变化[GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC] Suc证明了维管束具有碳水化合物运输功能，由CF运输确定的共质体空间的存在有力地支持了木薯贮藏根中存在一条共质体韧皮部卸载途径的观点。GydF4y2Ba

蛋白转运中涉及的基因的差异表达水平及其编码酶的相关活性进一步支持Cassava储存根系中的互补卸载GydF4y2Ba

在共质体卸载后，蔗糖分子立即被SuSy分解，外质体卸载时则被INV分解。蔗糖转运体SUT是蔗糖外质体转运的主要调控因子[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］．我们比较了编码Suts，Susy和细胞壁酸转化酶（CWI）的基因的表达水平及其在三个发育阶段的植物中的植物中的酶水平和它们的酶水平。GydF4y2Ba

SuSy在三个发育阶段的植物贮藏根中高表达，而在PFRs和SFRs中表达较少（图。GydF4y2Ba4GydF4y2Baa），而PFRS表达较高，而SFR在三个发育阶段的植物的储存根中较高（图。GydF4y2Ba4GydF4y2Bab）。在三种发育阶段的植物中储存根中的CWI和SUT编码基因更高度表达SASY编码基因，包括SUSY1，SUSY3和SUSY4（图。GydF4y2Ba4GydF4y2BaC）。尽管Suts在存储根中表达（图。GydF4y2Ba4GydF4y2Bac） SUT成员SUT1、SUT2和SUT4在叶片中的表达更高，但在植物发育早期的须根中除外（图。GydF4y2Ba4GydF4y2Bad).通过蛋白凝胶印迹分析，测定了SuSy、CWI和SAI在不同根和贮藏根关键发育阶段的蛋白表达水平(图)。GydF4y2Ba4GydF4y2Bae)(完整长度的凝胶印迹见附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:图S3)。贮藏根早期、中期、后期SuSy蛋白表达量显著高于PFRs和SFRs，而CWI蛋白表达量显著低于PFRs和SFRs。SAI蛋白含量始终较低，不同根型间差异不明显。CWI在PFRs和SFRs中具有显著的活性，但在贮藏根中被SuSy取代(图1)。GydF4y2Ba4GydF4y2BaF）。上述量化结果表明，SUTS和CWI在显影储存根中的高表达和低表达以及初级纤维根和二次纤维根中的相反表达是木薯储存中蔗糖互补途径的所有指标根源从木薯植物生长早期从原发性纤维根部开发的根源。GydF4y2Ba

免疫偶数标记测定显示，CWI分子是蔗糖的妊娠塑料输送的生物标志物，富含早期纤维根，但不在显影储存根部。标记的CWI蛋白主要在SES和PCS，CC和PCS和SES和CC之间的细胞壁上可见（图。GydF4y2Ba5GydF4y2Baa-d)的PFRs。然而，在CCs与pc之间、se与CCs之间以及pc与pc之间的细胞壁间隙中发现的CWI蛋白很少(图1)。GydF4y2Ba5GydF4y2BaE-H）在中间或晚期发展阶段的存储根部。在没有抗血清的任何对照中没有观察到CWI分子或预先发生的血清（未示出的数据），表明抗血清是高度特异性的并且非特异性标记可忽略不计。总之，结果还提出了在开发木薯存储根中有主要的互相稳定性卸载途径。GydF4y2Ba

木薯(GydF4y2Ba木薯耐GydF4y2BaCrantz），被称为最重要的块茎种植物种之一，是一种典型的热带作物种类，具有高淀粉积累的潜力。它具有高光合作用容量，C3和C4植物之间的光合作用特性，这表明大量的碳水化合物从来源运输到下面的下沉组织。野生木薯祖先种类的加入W14，淀粉产量非常低，呈现出非常低数量的储存根部（未发表的数据）。帕特里克和offler [GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba)发现，主要的共塑卸载与高运输能力和低阻力有关。在高等植物中，胞间连丝提供了大多数相邻细胞之间的共塑连续性，因此极大地促进了韧皮部向库组织的卸载[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba］．结果表明:随着贮藏根的扩大，贮藏根的胞间连丝数量增加，SEs与CCs之间单侧胞间连丝多，PCs之间单侧胞间连丝多，占韧皮部卸荷细胞的大部分。单侧胞间连是“开放的”，单侧胞间连与低电导率有关[GydF4y2Ba5GydF4y2Ba，GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］．在晚期增厚的木薯储存根部的细胞壁（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bak） 贮藏期间胞间连丝数量变化不大。这与苹果的情况不同[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba和枣[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]，其中在卸载途径的偏移期间被阻断了偏离的。GydF4y2Ba

贮藏根无疑是在某些条件下由木薯特殊的须根发育而来[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]. 这导致地下根系随着结构的剧烈变化而成为营养汇。质外体卸载的能量代价被更有效的质外体卸载代价所取代。蔗糖是木薯韧皮部分泌物中的主要光合产物，碳水化合物（主要是淀粉）在木薯根系发育的早、中期积累迅速，而在发育后期积累缓慢。这与肉质果实中的机制不同，在肉质果实中，高浓度可溶性糖的积累依赖于质外体韧皮部的卸载[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．在其他块茎或根部作物种类，如马铃薯[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]， 萝卜 [GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]和萝卜[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]在膨胀根的发育过程中，发生了由质外体卸载向共质体卸载的转变。因此，木薯从须根到贮藏根也发生了类似的转换，而这个转换节点可能是木薯贮藏根发育的一个关键关卡。GydF4y2Ba

事实上，就立即分解或从细胞内移除蔗糖而言，这种姿势负荷事件对于蔗糖的共质体转运缺乏浓度梯度是极其重要的。负责蔗糖转化为葡萄糖和果糖的SuSy的表达与共质体韧皮部的卸荷和蔗糖转化为淀粉、纤维素和木质素，然后在库器官中积累显著相关[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．SuSy被认为是存储汇容量的生物标志物[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]. 在木薯根系发育的早期、中期和晚期，SuSy在贮藏根中的表达和蛋白质水平均保持较高的浓度，而CWI和SAI则不存在。这一特征在猕猴桃和苹果中也有发现[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．相比之下，作为蔗糖的妊娠传输中的关键球员的Suts在所有三个发育阶段的叶子中表达得多，并且在纤维根中表达比中间和晚期木薯的储存根部更多阶段。似乎是木薯叶中的主要妊娠加载机制。这已经被美国调查了博士论文。对于蔗糖卸载在根中，依赖于SUT依赖性正卸载在初级纤维根和二级纤维根中起着更大的作用，而是在储存根部中的作用，这与葡萄或枣果实的蔗糖卸载的作用不同[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．CWI，其催化蔗糖的不可逆转化为葡萄糖和果糖，与Phloem Applastic传输有关。CWI严格在休眠顶部芽中表达，但它已从马铃薯块茎的同股中分离出[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]. 在木薯中，我们发现CWI在贮藏根中的表达明显低于在须根中的表达，并且在根的一级结构中形成胞间连丝。因此，我们的结果推测，木薯初生贮藏根的形成层也可能是同质体分离的，并且在分化开始时功能上与薄壁组织中的同质体相连。之后，与周细胞相连的胞间连丝数目增加。报告GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaCF和自由绿色荧光蛋白(GFP)可以从韧皮部共卸载到根皮层和表皮细胞中[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba］．我们还发现CF仅限于初级纤维根的内皮层(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baj). SAI是另一种蔗糖分解酶，定位于液泡中，参与细胞内蔗糖的分解，特别是可溶性糖积累库中的蔗糖，如GydF4y2Ba山茶花oleiferaGydF4y2Ba水果(GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]. 在本研究中，木薯根系在不同发育阶段的SAI水平较低，变化很小。卸载途径与源细胞和库细胞之间总可溶性糖的浓度差异有关[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．与木薯一样，高水平的可溶性糖可能会增加托牙压力，并且Turgor梯度的陡度是通过散装流通过Plasmodesmata卸载对称验卸的驱动力[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba］．这种现象通常通过水槽细胞中蔗糖的亚细胞分区化和用于生产高分子量储存化合物或细胞生长的进口代谢物的利用[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，GydF4y2Ba4GydF4y2Ba］．涉及互相卸载的基因的表达水平与木薯品种的干物质产率之间的相对强烈的相关性证实，这种对储存根部的抵抗品卸载系统对于木薯的高潜在淀粉积累是必不可少的。GydF4y2Ba

基于上面提出的结果，我们总结了Cassava中蔗糖互补卸料模型的假设，如图2所示。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

1. （1)GydF4y2Ba

   栽培木薯贮藏根发育过程中SE-CC与PCs之间的胞间连丝增多。这使得蔗糖——光合产物的主要形式——能够有效地卸载到贮藏根的薄壁细胞中。GydF4y2Ba

2. （2）GydF4y2Ba

   这种相互作用的卸载过程导致初级纤维根部的变化，储存根部，并且存在从痉挛卸载以在形成等离子体的形成之后对其抵抗韧性卸载的转变。GydF4y2Ba

3. (3)GydF4y2Ba

   邮政卸货事件和增加的Susy活动（但不是CWI或SAI活动）负责木薯淀粉的蔗糖降解和生物合成。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

木薯(GydF4y2Ba木薯耐GydF4y2BaCrantz）品种arg7和Ku50和Cassava（GydF4y2Ba木薯耐ssp。flabellifoliaGydF4y2Ba）在本研究中使用了加入W14，这是一种野生祖先的野生祖先。W14由CIAR捐赠，KU50起源于阿根廷，并由泰国皇家农业大学提供arg7。所有材料均由中国热带农业科学院（CATAS）的热带作物遗传资源研究所（CATAS）和ARG7，KU50和W14签署，在热带作物的资源床中存放为MS000581，MS000124和MS000580遗传资源研究所，CATAS。GydF4y2Ba

Arg7和Ku50是具有高产储存根部的品种，含有约30％的淀粉含量。与Arg7相比，W14呈现较低的储存根产量，储存根产量低于其储存根部的5％淀粉含量。进行了品种与野生祖先之间生物指标的比较，以确定现代品种的潜在特征。2015年初在2015年初为温室种植了数百种植物，用于实验。关于对不同实验进行的生物质，微观结构和取样，在早期（60个DAPE）上施加处理，此时木薯储存根部形成和伸长;在中间阶段（180个Dape），在此，储存根部正在扩大和快速积累淀粉;在晚期（270 DAPE），在此，储存根部近最大重量或含有最高密度的淀粉。所有原始数据从三种植物中收集，每个基因型采取的平均值。GydF4y2Ba

CF和[GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC] Suc跟踪GydF4y2Ba

如前所述进行CFDA标记[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba，GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］．CFDA溶液被引入到木薯植株根部附近的茎中。棉线一端插在管中，另一端穿过贮藏根茎基部的韧皮部。该方法因其运输速度快、可靠性高而被选中。40 min后，用约500 μl的1 mg·ml标记植株GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}CFDA水溶液（由丙酮中的储备溶液制备）。将管子包裹在铝箔中，以避免阳光下的染料和荧光猝灭的损失，并且将CF粘接出72小时（在时间梯度实验后选择）。约1000-2000μl1mg·mlGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}CFDA水溶液用于显影储存根部。随后使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）（FV1000，Olympus，Japan），随后切断下沉组织并检查CF荧光。使用激发波长为350-600nm的激发波长扫描样品，并且在488nm处观察到最强的CF荧光峰。选择35.0％激光透射率，均匀选择，图像尺寸为800×800像素。GydF4y2Ba

木薯根的自发荧光在405 nm处最强。采用405 nm和488 nm的激发波长对每个切片进行扫描，确定CF的自发荧光和绿色荧光的分布。GydF4y2Ba

蔗糖被标记为GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC同位素在实验条件下。所结果的 [GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC]按照CFDA的相同方法，将Suc注射到上部茎中。48、72 h后取贮藏根，石蜡切片。将手工切割的切片轻轻压缩，用柯达XBT-1型仪器在4°C的条件下，在盒式胶卷中自动放射成像30 d。[GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC]在存储根中，通过[GydF4y2Ba^14.GydF4y2BaC] -放射自显影，然后由打印机（E408，佳能，日本）直接扫描。GydF4y2Ba

超微结构观测和浆性密度的测量GydF4y2Ba

超薄切片制作如下。贮藏根被切成小立方体(大约2毫米GydF4y2Ba^3.GydF4y2Ba)，立即用4% (v/v)戊二醛在100 mM预冷磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中在4℃下固定4小时。使用注射器手动渗透戊二醛缓冲液。在用预冷磷酸盐缓冲液(pH 7.4)大量冲洗后，组织立方体在1% (w/v)的二氧化硅中进行后固定GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba1-2小时，在此期间摇几次。然后用相同的缓冲液进行另一次广泛的冲洗，然后用分级乙醇系列(50-100%)脱水。环氧丙烷取代环氧丁酯树脂，然后在室温下浸润24小时。聚合温度为70℃，反应时间为8 h。这些切片(厚度约为80纳米)被安装在100目铜网格上，或用镀有0.25% Formvar薄膜的镍进行TEM (JEM 2100, JEOL，日本)的超微结构观察。GydF4y2Ba

如[中所述）测量等离子体密度。GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]在之前的研究中[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]. 从刺入的样品中制备了五个连续的两个方向（横向和纵向）的超薄切片。每组由大约20个部分组成 相隔μm。从每组中随机抽取6个超薄切片，放置在铜网（100目）上。从每个超薄切片中选择由韧皮部和周围PC组成的样品，并通过透射电子显微镜（TEM）对其中5个进行观察（JEM 2100，JEOL，日本）。所有细胞界面（即SEs和CCs之间，SEs和PCs之间，CCs和PCs之间，PCs和PCs之间，PCs包括韧皮部薄壁组织和木质部贮藏薄壁组织细胞）用于计算胞间连丝。胞间连丝数/界面长度称为胞间连丝密度（胞间连丝数··μm）GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}），半离子果多部分子数为一个。GydF4y2Ba

组织化学分析GydF4y2Ba

抗CWI、SAI和SuSy的抗体是由ComWin生物技术有限公司(中国)针对多肽产生的。CWI基因序列来源于植物zome V12.1 (GydF4y2Bahttp://www.Phytozome.comGydF4y2Ba），我们选择了三种在木薯根（三种不同发育阶段）中表达的这种酶的同种型：CWI-1，CWI-2和CWI-5。具有相同氨基酸的前两个同种型具有部分序列QPyrTSyHFQPK，而最后的同种型具有特定的序列DPKQRQVQNYAVPK。SAI的异形特异性部分氨基酸序列是Qkgseqtfpsre。该序列由张鹏（上海生物科学院植物生理学研究所，中国科学院生物科学研究所）慷慨地提供，并被证明在木薯根中高度和专门表达。SASY的序列，也是在木薯根中高度表达的，由Luiz博士慷慨地提供（Crafapa遗传资源和生物技术，巴西利亚，DF，巴西）慷慨地提供。其GenBank号码是AAV74405.1，该同种型的特定序列是RRKeskdleexa（关于这些基因的基本信息如表所示GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

组织结构观察GydF4y2Ba

石蜡包埋组织切片用于组织学结构观察。小立方体（2-3） 厘米GydF4y2Ba^3.GydF4y2Ba)用福尔马林-醋酸-乙醇（FAA）固定木薯贮藏根36个月 在室温下，通过一系列分级乙醇溶液（80–100%）脱水。随后的材料用GydF4y2BaNGydF4y2Ba在60°C - 65°C下，石蜡包埋12 h。切片用显微镜(DM2500，徕卡，德国)在5倍镜头下拍摄。GydF4y2Ba

免疫金标记GydF4y2Ba

如[1中所述，进行免疫偶数标记GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]. 简而言之，超薄切片的制备如上所述，除了用4%戊二醛固定。首先用上述制备的SAI、CWI或SUT特异性兔抗血清孵育切片，然后与二级抗体（结合到10的山羊抗兔IgG抗体）一起孵育 纳米金）。最后，用碱性柠檬酸铅和醋酸铀酰对切片进行染色，然后用透射电镜（JEM 2100，日本JEOL）进行检查。设计两个阴性对照以验证免疫金标记的特异性和可靠性。在第一个阴性对照中，省略抗血清，检测山羊抗兔IgG抗体金结合物的非特异性标记。在第二个阴性对照组中，为了确定抗血清的特异性，在免疫金标记前用兔免疫前血清代替兔抗血清。我们对每个样品至少做了三次对照重复。GydF4y2Ba

mRNA提取，mRNA水平和酶活性测定，蛋白质凝胶印迹分析GydF4y2Ba

采用RNAplant plus Reagent (TIANGEN, China)从木薯根中提取总RNA。基于上述序列设计SuSy、CWI和SAI的引物，并使用实时定量PCR循环器(Rotor-Gene 6000, QIAGEN, German)检测扩增产物。β-肌动蛋白用作参考基因。GydF4y2Ba

SAI或CWI活性的酶提取和测定如前所述[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］．缓冲介质：10 mm mgclGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba, 150 mM Tris-HCl（pH 8.0), 1 苯甲脒，2 mM乙二胺四乙酸，0.1 mM苯甲基磺酰氟，0.2%（v/v）-巯基乙醇，3%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮和10 mM抗坏血酸。用四层粗棉布过滤初始液体，然后在16000℃下离心 g代表20 min，收集上清液进行SAI分析。用沉淀残渣制备CWI，用不含聚乙烯吡咯烷酮的相同缓冲液冲洗残渣，直至残渣中无蛋白质。增加0.5 M NaCl缓冲液A，轻轻摇动24小时提取CWI h、 然后离心，取上清液进行CWI酶测定。所有提取过程应在4点钟进行 摄氏度。SAI活性的测定使用的可溶性和不溶性部分如中所述[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]，每批0.3 100毫升 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.8), 0.1 100毫升 mM蔗糖，0.1 ml酶样品。GydF4y2Ba

SuSy活性的酶提取和测定方法见[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]. 简单地说，冷冻根组织处理5 含50毫升的培养基 mM HEPES缓冲液（pH 7.0), 10 2-巯基乙醇，1%聚乙烯吡咯烷酮，2%聚乙烯吡咯烷酮，1 毫米乙二胺四乙酸，和10 毫米氯化镁GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．之后，将0.1ml脱盐提取物加入0.9ml由25mM Hepes-NaOH缓冲液（pH6.5），125mM蔗糖，15mM MgCl组成的反应培养基中。GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和2 mm UDP。在蔗糖存在下在28℃下测定蔗糖切割方向上的酶活性。使用[中描述的3,5-二硝基水杨酸基础方法测定产生的还原糖。GydF4y2Ba43GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

采用Miron法和Schaffer法提取蛋白质[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba］．萃取缓冲液由100mM Tris-HCl（pH8.9），250mM蔗糖，10mM MgCl组成GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba5. mM维生素C和3.5%交联聚乙烯吡咯烷酮(全日空航空公司GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba）GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba用于沉淀CWI，SAI和SUSY蛋白，使用BRADFORD测定蛋白质浓度[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]方法，用牛血清白蛋白用作标准。如PAN所述进行SDS-PAGE和免疫印迹测定[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba，稍加修改。聚丙烯酰胺凝胶电泳转移后，硝化纤维素膜被阻塞。4℃下与SAI(1:400)、CWI(1:2000)、SuSy(1:500)特异性抗血清共孵育过夜，用tris缓冲盐水(TBS;10mm Tris-HCl, 150mm NaCl) + 0.05%吐温20 + 3%牛血清白蛋白(BSA)。然后用Tween 20 (TBST;10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl + 0.05% Tween 20)，与羊抗兔igg碱性磷酸酶结合物，TBST稀释1000倍，室温孵育45分钟GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba（50mM Tris-HCl，150mM NaCl + 0.1％Tween 20 + 1％BSA），然后用二抗处理。在TBST洗涤三次后GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和TBS，膜用BCIP / NBT套件染色（中国康沃生物科技有限公司）。β-肌动蛋白用作参考基因。GydF4y2Ba

韧皮部分泌物的收集和分析GydF4y2Ba

根据King和ZeevaArt描述的60天龄幼苗的茎收集韧皮渗漏物[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］．将茎靠近根部切开，用超纯水清洗，插入20 mM EDTA (pH 7.5)溶液中。分离后的植株在30℃、95%湿度的黑暗中保存1 ~ 2 h，然后转到超纯水中收集4 ~ 5 h。韧皮部分泌物冻干后保存于−80℃。采用高效液相色谱法和蒸发光散射检测仪(ELSD)测定了蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨糖醇、水苏糖和棉子糖的含量。样品以水酰胺(xBridge 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, USA) 10 μl的浓度进行分析。流动相为70% (v/v)乙腈和0.1% (v/v)氢氧化铵;流速为1 ml minGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}；温度为25℃;漂移管温度为85℃;氮气流量为2.0 l minGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}；增益值是2。GydF4y2Ba

转录组测序和注释GydF4y2Ba

使用Illumina High-SEQ 2000系统测序从KU50，ARG7和W14植物的显影叶和储存根系产生的10个RNA文库，大约100bp读数。在预处理后，将来自10个样品的mRNA序列读入AM560-2的基因组序列草案。提示大约20,000人的unigenes。涉及10个样品的所有RNA-SEQ读取的基因将上传到NCBI SRA，如下版本号：SRX551093，SRX553797，SRX553799，SRX553800，SRX553801，SRX553802，SRX553803，SRX553804，SRX553805和SRX553807。群集3.0软件（GydF4y2Bahttp://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm#ctv.GydF4y2Ba）用于热图分析。GydF4y2Ba

化学品GydF4y2Ba

蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、水苏糖、棉子糖购自TCI(日本)。蛋白质梯(Fermentas, Canada)、SYBR Premix ExTaq (TaKaRa, Bio Inc.， Japan)、ReverAid cDNA First-strand Synthesis Kit (Fermentas, Canada)和戊二醛(TED, Pella, Inc.， USA)从指定的供应商获得。其他化学品均购自Sigma(美国)。GydF4y2Ba

在NCBI序列读取档案（SRA）中沉积了来自木薯叶和储存根部的10个样品的转录组的原始序列读数读数（GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?linkname =生物项目\u sra \u all&from \u uid=248260GydF4y2Ba)．CWI-1，CWI-2，CWI-5，Sai和Susy的氨基酸序列分别在加入号：JQ339929，JX291160，JX201159，JN616390和AAV74405.1下沉积在Genbank中。在当前研究期间生成和/或分析的数据集可在科学数据库存储库中获得（GydF4y2Bahttp://www.scidb.cn/s/p6bY3Q3GydF4y2Ba)，或根据合理要求向通讯作者索取。GydF4y2Ba

CF:GydF4y2Ba

carboxyfluoresceinGydF4y2Ba

复写的副本：GydF4y2Ba

伴侣细胞GydF4y2Ba

国家食品药品监督管理局：GydF4y2Ba

非荧光6（5）羧基氟胺蛋白酶GydF4y2Ba

CLSM公司：GydF4y2Ba

共聚焦激光扫描显微镜GydF4y2Ba

CW：GydF4y2Ba

细胞壁GydF4y2Ba

CWI公司：GydF4y2Ba

细胞壁酸转化酶GydF4y2Ba

DAPE公司：GydF4y2Ba

出苗后天数GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

HT:GydF4y2Ba

Hexose Transporter.GydF4y2Ba

你：GydF4y2Ba

中性转化酶GydF4y2Ba

最高审计机关：GydF4y2Ba

可溶性酸性转化酶GydF4y2Ba

SEL：GydF4y2Ba

大小排除限制GydF4y2Ba

SE:GydF4y2Ba

筛元素GydF4y2Ba

SFR编号：GydF4y2Ba

二次纤维根GydF4y2Ba

苏西：GydF4y2Ba

蔗糖合酶GydF4y2Ba

SUT编号：GydF4y2Ba

蔗糖运输车GydF4y2Ba

PC:GydF4y2Ba

薄壁组织细胞GydF4y2Ba

帕金森病:GydF4y2Ba

浆泥GydF4y2Ba

PFR：GydF4y2Ba

主要纤维根GydF4y2Ba

PPH：GydF4y2Ba

初级韧皮肌GydF4y2Ba

PPU:GydF4y2Ba

孔隙性分子单元GydF4y2Ba

S：GydF4y2Ba

淀粉颗粒GydF4y2Ba

SDS-PAGE：GydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳GydF4y2Ba

TBS:GydF4y2Ba

TRIS缓冲盐水GydF4y2Ba

待定：GydF4y2Ba

Tris缓冲盐水与吐温20GydF4y2Ba

透射电镜：GydF4y2Ba

透射电子显微镜GydF4y2Ba

UDPG:GydF4y2Ba

尿苷二磷酸葡萄糖GydF4y2Ba

五：GydF4y2Ba

灰烬GydF4y2Ba

成功：GydF4y2Ba

蔗糖GydF4y2Ba

Glc公司：GydF4y2Ba

葡萄糖GydF4y2Ba

Fru公司：GydF4y2Ba

果糖GydF4y2Ba

机票:GydF4y2Ba

中国热带农业科学院GydF4y2Ba

我们感谢贵州王博士，从海南大学获得扫描电子显微镜设备和普渡博士普渡大学普洱博士，为此纸张的建设性建议和修订。GydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(no . 2018YFD1000500);中国农业科学研究体系建设项目(no . CARSwwq-11);中国热带农业科学院中央公益性科研机构基础研究基金(no . 1630052016004)。关键词:黄土高原，土壤侵蚀，数值模拟，数值模拟GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. 潘坤和程路对这项工作的贡献不相上下。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 中国热带农业科学院热带生物科学与生物技术研究所，海口，571101GydF4y2Ba

   昆潘，程璐，梅莉和胡，新城周，鑫辰＆文泉王GydF4y2Ba

2. 海南医科大学，海口，571199GydF4y2Ba

   潘坤GydF4y2Ba

3. 山东省农业科学院山东果树研究所，泰安，271000，山东GydF4y2Ba

   Peixian Nie.GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

WW构思并设计了这个项目。KP和CL进行实验，KP写手稿，PN和MH参与了实验的前期准备工作。XZ分析RNA-seq数据，XC修改稿件。所有作者均已阅读并批准最终稿件。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

通信GydF4y2Ba王文泉GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准并同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

出版许可GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

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重印和权限GydF4y2Ba