基因组分析MYB转录因子及其对盐压力的反应木麻黄

背景

MYB转录因子是一种能够与启动子区域特异相互作用的DNA结合蛋白。的成员MYB转录因子广泛参与植物的生长发育、次生代谢、胁迫反应和激素信号转导。然而，目前尚无对MYB家族进行全面生物信息学分析的报道木麻黄．

结果

在这项研究中，生物信息学方法用于筛选182MYB转录因子木麻黄其中，1R-MYB 69个，R2R3-MYB 107个，R1R2R3-MYB 4个，4R-MYB 2个。的C. EquisetifoliaR2R3-MYB基因按系统发育拓扑结构和分类分为29组MYB总科在拟南芥蒂利亚纳，剩下的时间MYB基因(1R-MYB、R1R2R3-MYB、4R-MYB)分为19组。此外，保守基序和基因结构分析表明，该菌的成员CeqMYB实验组被分为基因结构基本相似的亚组。此外，在蛋白质的R2和R3结构域中有许多保守的氨基酸CeqMYB特别是色氨酸残基(W)，在R2重复中有3个保守W，在R3重复中有2个保守W。结合启动子和GO注释分析，推测其多种生物学功能CeqMYB年代,因此32MYB选择基因以通过使用QPCR分析技术进一步探索其对盐胁迫的响应。最多CeqMYB不同盐处理对基因的调控存在差异。

结论

七个基因(CeqMYB164，CEQMYB4，CeqMYB53，CeqMYB32，CEQMYB114，CEQMYB71和CeqMYB177通过GO注释分配给“盐压力响应”。其中，CEQMYB4的表达水平在各种盐处理下调节，表明CEQMYB4可能参与了对盐胁迫的反应。我们的研究结果为其生物学功能提供了重要的信息C. Equisetifolia，为盐胁迫机制的进一步研究提供候选基因。

MYB（V-MYB AVIAN脲素母细胞素病毒癌症同源物）转录因子（TF）家族是植物中最大的转录因子之一，并且获得其名称，因为其结构具有保守的DNA结合区域，称为MYB结构域。n末端区域MYB转录因子结构域高度保守，并且域由1-4个序列和非还原缺陷序列重复（R1，R2，R3和R4）组成。每次重复包括约50个氨基酸，含有一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列，其中氨基酸残基以螺旋转动螺旋（Hth）的形式与DNA一起参与结合过程[1，2］．MyB蛋白可以根据重复的数量分成不同的类别：1R-MYB（一个重复），R2R3-MYB（两次重复），R1R2R3-MYB（三个重复）和4R-MYB（四个重复）[3.，4］．

作为监管蛋白质，MYBTFS在植物生长和发展中发挥着重要作用。1987年，PAZ-ARES等人。确定了第一植物MYB玉米基因，研究表明，它与花青素合成有关，并命名为它ZmMYBC1［5］．从那以后，MYB基因已在许多物种中被鉴定和分离。其中，R2R3-MYB转录因子被证实广泛参与植物次生代谢的调控，在植物细胞分化和器官形成的调控中起着关键作用[4，6，7］．过度表达MYB6转基因杨树花青素和原花青素的积累显著增加，但抑制了次生细胞壁的发育[8］．Mu等人发现R2R3 TFAtMYB59能调节细胞周期和根的生长吗拟南芥蒂利亚纳［9]和JcMYB1 (R2R3-MYB)在非生物胁迫响应中发挥重要作用[10.］．此外,MYB30型在防御反应中，对根系生长具有重要的调控作用LcMYB2干旱胁迫下促进种子萌发和根系生长[11.］．发现3R型MYBMYBL2不仅抑制了毛状体的发育，而且抑制了类黄酮的生物合成[12.，13.]和3R类型MYBPhMYBx花青素合成下调[14.，15.］．之前的研究已经发现，表情AtMYB2型在植物后期发育中上调，并参与整株衰老的调控[16.］．

MYB家庭基因也广泛参与植物对激素和环境因素的反应，并在植物对压力的反应中发挥着重要的监管作用。例如，R2R2-MYB TFAtMYB41不仅影响细胞壁发育，而且对ABA、干旱和盐胁迫也有响应[17.］．以前的研究表明AtMYB96增强了抵抗力答:芥以低温促表达CBF年代(18.),而AtMYB14公司和AtMYB15公司通过负向调控表达参与低温反应CBF年代(19.，20.］．更重要的是,AtMYB60在答:芥已被证明与植物的耐旱胁迫有关[21］．最近,ZmMYB3R和GmMYB118发现转基因植物能提高对干旱和盐胁迫的耐受性[22，23］．此外,AtMYB2型，AtMYB44和AtMYB74增强了容忍度答:芥盐胁迫[24，25，26),而AtMYB73在植物盐胁迫性抵抗中发挥了负面作用[27]. 此外，TaMYB73，StMYB30和GhMYB73型据报道，在转基因植物中增强盐胁迫耐受性[28，29，30.］．在转基因番茄植物中，SLMYB102通过调控Na来提高耐盐性⁺k⁺内稳态和活性氧平衡[31］．虽然最重要的是MYB盐胁迫应答基因属于R2R3型，少数3R-MYB基因(包括OsMYB3R-2和TaMYB3R1）参与植物盐胁迫的调节[32，33］．

木麻黄科是被子植物中较为特殊的一个科，与其他植物的亲缘关系较远[34］．C. Equisetifolia广泛栽培在热带和亚热带地区，有许多用途。适用于干旱区沿海防风固沙、改良盐碱地和造林。它还可以固定氮，提供木材和薪材，应用于农用林业[35］．此外，木麻黄是少数几种能在海岸海滩上茁壮成长的植物之一，因为它的耐盐性和树枝的灵活性可以抵御台风。木麻黄全序列的可用性[36]和生物信息学方法的结合提供了一个机会，进行全面的，全基因组分析c . equisetifolia MYB基因。

的MYB基因家族在单子叶植物和双子叶植物中已被广泛研究。然而，目前关于MYB蛋白的基础知识C. Equisetifolia仍然有限。在本研究中，共有182人MYB使用已知的鉴定基因MYB基因序列的答:芥基因组。并对其物理位置、系统发育关系、保守基序和外显子-内含子结构进行了分析。进一步分析了这些基因的选择压力、顺式作用元件和基因本体。最后，对表达水平进行选择CeqMYB通过使用RNA-SEQ数据和QRT-PCR研究了不同盐浓度和治疗时间下的根和芽的基因。基于当前数据，这是关于基因组基因家族鉴定的第一个报告C. Equisetifolia．因此，本研究提供了一个探索功能的起点MYB基因在C. Equisetifolia，为基因工程筛选候选基因提供了依据C. Equisetifolia繁殖。

小鼠MYB基因的鉴定C. Equisetifolia

初步筛选出具有典型MYB或MYB样结构域的候选基因木麻黄基因组数据库根据隐马尔可夫模型（HMM）剖面的MYB域。总共182个MYB基因在C. Equisetifolia去除冗余重复序列后。基于基因标识符的顺序，CeqMYB基因被命名CEQMYB1来CeqMYB182．CeqMYB蛋白序列长度范围为104 ~ 1072个氨基酸，分子量为11.08 kDa (CeqMYB153)至117.93 kDa (CeqMYB158）.理论等电点(pI)范围为4.06 ~ 10.65。其他一些参数，如支架位置，开放阅读框(ORF)长度和域的数量，在表S中有详细说明1．预测的亚细胞定位数据(表S2)的结果表明，大多数CeqMYB蛋白在细胞核中表达，也有部分在叶绿体(CeqMYB41、CeqMYB114和CeqMYB148)、线粒体(CeqMYB37)和细胞质(CeqMYB5和CeqMYB23)中表达。

系统发育树和类群分类CeqMYB基因

共鉴定出69个1R-MYB蛋白、107个R2R3-MYB蛋白、4个R1R2R3-MYB蛋白和2个4R-MYB蛋白C. Equisetifolia(表1). 在此基础上，利用MYB蛋白构建了两个系统发育树答:芥和C. Equisetifolia(无花果。1A和图。2). 数量分布MYB基因C. Equisetifolia是一致的吗答:芥(无花果。1b）。R2R3-MYB蛋白是最大的亚家族，而4R-MYB亚家族的数量是最小的。

第一个系统发育树(图。1A)含有125个R2R3-MYB基因答:芥107个R2R3-MYB基因C. Equisetifolia．然后，这107个R2R3-MYB基因C. Equisetifolia根据树的拓扑结构和MYB总科在答:芥(表3.）.C13、C18和C21只有1个成员，是最小的群，而C15有10个成员，是最大的群。此外，C4、C10、C14和C22的成员没有聚集到任何组答:芥，表示发生了一些变化MYB不同物种在进化过程中的基因。我们研究中的大多数组(C1、C3、C5、C6等)都得到了前人研究的高bootstrap支持。例如,AtMYB93，AtMYB92， 和AtMYB53C1组调控根发育AtMYB49，AtMYB41，AtMYB74， 和AtMYB102公司C3组对逆境应激有反应。

在第二种系统发育树中(图。2)共获得131个MYB蛋白（119个1R-MYB，9个3R-MYB和3个4R-MYB）C. Equisetifolia和答:芥提取，构建系统发育树。并根据树的拓扑结构进行分类答:芥，将131个MYB蛋白分为19组(A1 ~ A19)。如图所示。2，一个4R-MYB蛋白(CeqMYB43)聚集成4R-MYB蛋白答:芥，三个R1R2R3-MYB蛋白（CeqMYB104型，CeqMYB135型和CeqMYB158）被聚集成五个R1R2R3-MYB蛋白答:芥．

CeqMYB基因结构与蛋白质基序分析

为了更全面地了解守恒域CeqMYB基因，进行基因诱导（MEME）分析。在R2R3-MYB等中发现了20个保守的主题CeqMYBs (1R-MYB, 3R-MYB和4R-MYB)蛋白C. Equisetifolia(无花果。3.一个;无花果。4A).如图所示。3.A和表S4，发现图案1，图案2，图案3，图案4，图案4，图案10，图案10和图案10编码MyB DNA绑定域，而另一个图案在R2R3-MYB的情况下没有函数注释C. Equisetifolia．在107个R2R3-MYB蛋白中，共有100个包含motif 3、motif 4、motif 2、motif 6和motif 1。CeqMYB28由图案3和图案2，图案10和图案17组成。CeqMYB96，CeqMYB41，CeqMYB180，CeqMYB146，CeqMYB177和CeqMYB164C29组中的聚集在R2R3-MYB蛋白中具有9,19,10,4和8的独特图案C. Equisetifolia．这一特征与前人对红枣(Ziziphus jujuba轧机)。R2R3-MYB蛋白(3.]. 另外，其他基因的保守基序CeqMYB预测基因（1R-MYB，3R-MYB和4R-MYB），不同的群体具有不同的主题，而MOTIF 1是常见的MYB基因在无花果。4A.具体地，图案1重复四次CeqMYB137型，但在A16组成员中重复两次。和图案5重复三次CeqMYB43. 第17、1、5和4个基序在实验中各重复两次CeqMYB87．也发现了类似的结果向日葵L［37]. 此外，the result of PFAM and SMART annotation were shown in Table S5其中，Motif 1、Motif 2、Motif 5、Motif 6、Motif 8编码MYB dna结合域，Motif 4编码MYB- cc型域，其他Motif无功能注释。

为了证明在特定位置的保护，WebLogo被用来进一步调查。结果（图。5)结果表明，在蛋白质的R2和R3结构域中存在许多保守的氨基酸CeqMYBs，特别是色氨酸残基(W)，在R2重复中有3个保守W。在R3重复序列中，只有两个保守的W残基，第一个W通常被亮氨酸(L)或苯丙氨酸(F)所取代[38]，在本研究中被L代替。

为了对结构多样性有更多的了解MYBTFs, R2R3-MYB的外显子/内含子组织等MYB（1R-MYB，3R-MYB和4R-MYB）C. Equisetifolia是分开了。如图所示。3.B, 107个R2R3-MYB基因包含不同数量的外显子，从1个到12个不等。我们发现大多数R2R3-MYB基因有2个(20/107)或3个(71/107)外显子，而有9个和12个外显子的R2R3-MYB基因各有一个。此外，结合系统发生树分类，发现有5个基因包含1个外显子，并且这5个基因聚集在同一组C27中。此外，还详细分析了其他的外显子/内含子结构CeqMYB基因（1R-MYB，3R-MYB和4R-MYB）如图2所示。4B. 1r - myb的外显子数范围为1 ~ 11,3r - myb的外显子数范围为8 ~ 11。更重要的是，两个4r - myb有9 (CeqMYB8710（CeqMYB43“外显子”分别。基于上述观察结果，发现了CeqMYB聚集在同一组的基因具有相同或相似数量的外显子。例如,CeqMYB属于C28（3个外显子）和A14（6个外显子）组的基因具有相同数量的外显子，而A7组有4到6个外显子。简言之，基因的外显子数目MYB基因C. Equisetifolia系统发育树越近，基因结构的相似性越大。

MYB假字和直接同源

基于系统发育树的拓扑结构和BLASTN方法共鉴定出53个同源词和54个同源词。非同义替代(Ka)与同义替代(Ks)的比值可以反映生物进化过程中的选择压力。因此，探讨选择压力在其中的作用MYB获得基因家族演化，ks值，ka值和Ka / ks比例的谬论和旁级或正轨6和无花果。6）.通常，Ka / ks小于1的比率表示纯化选择;Ka / ks的比例大于1平均阳性选择;Ka / ks等于1的比率表示中性选择。所有的KA / KS比例CeqMYB基因对小于1，其中大多数正向素的Ka / ks比为0.1-0.3，寄生杆菌的比例为0.1-0.5（图。6）.结果表明，纯化选择可能在植物的进化过程中起了重要作用MYB基因在C. Equisetifolia．

分析的表达CeqMYB基因和GO注释分析

基于转录组数据，热图CeqMYB对200 mM NaCl处理不同时期的基因进行分析。7A） 是的。接下来是182年的热图数据MYB将基因聚类成25个表达模式进行趋势分析(图1)。7B;表的年代7）.的CeqMYB200 mM NaCl处理后不同时期的基因响应，如CeqMYB122型和CEQMYB14在盐处理后24和168小时强烈调高，而表达水平CEQMYB10和CeqMYB112型盐处理1 h后表达上调，盐处理后各时间点表达下调。其中一些对白有相似的表达模式;例如,CeqMYB163型/− 113在6h时达到最大值，之后逐渐下降。然而，部分对白表现出不同的表达模式;例如，表达CEQMYB16在盐处理后持续上调，在168h达到最高水平，而其对应物，CeqMYB140，在盐压力期间在1小时内表达了高度表达。

为了预测MYB蛋白的功能C. Equisetifolia，使用截断值的GO注释P≤0.05表示，盐处理共富集131个GO项目(表S8）.如图所示。8A, 80%的时间被归为生物过程。其中，细胞核、细胞器、结合、生物调控、细胞过程和代谢过程占主导地位。8b）。细胞组分注释的分析表明，这些蛋白质主要位于核中，结果与亚细胞定位的预测一致。此外，发现一些CeqMYB与发育、激素和应激反应相关的基因。七个基因被分配到“盐胁迫反应”类别，其中CeqMYB164，CEQMYB4，CeqMYB53，CeqMYB32，CeqMYB114型和CeqMYB71也被分配到与激素反应相关的类别。特别是，CeqMYB177属于与发育、激素和应激反应相关的类别(图。8CD） 是的。

总之，结合盐处理后的表达模式，并进行注释分析，32CeqMYB选择基因进行进一步分析。

启动子分析

选择32个顺式元素分析CeqMYB基因如图2所示。9，参与Zein代谢调控的O2位点在4个启动子中发现CeqMYB基因。细胞周期调控因子(MSA-like)的表达CEQMYB13和CeqMYB117型促进剂分别。另外，在启动子中还鉴定了分生剂表达（猫盒），种子特异性调节（Ry-元素）和胚乳表达（GCN4_motif）CeqMYB基因。许多hormone-responsive元素被识别,auxin-responsive元素(TGA元素和AuxRR-core), SA-responsive元素(柠檬酸元素),MeJA-responsive元素(CGTCA图案和TGACG图案),gibberellin-responsive元素(TATC-box GARE-motif和P-box)和ABA-responsive元素(ABRE)被发现在12的推动者,14 25 20 23CeqMYB基因,分别。此外，在32个启动子区还发现了与胁迫相关的顺式元件MBS(干旱诱导响应元件)、LTR(低温响应元件)、ARE(厌氧诱导响应元件)、GC-motif(缺氧特异诱导元件)和TC-rich(防御和胁迫响应元件)CeqMYB基因。因此,CeqMYB基因可能在不同的非生物胁迫下受到转录调控。

的验证CeqMYB盐处理后的基因表达

根据盐处理后的表达模式和GO注释分析，筛选出32个表达CeqMYB在使用不同浓度的NaCl处理克隆A8幼苗以进行不同时间点后，通过QRT-PCR检测根和芽中的基因。此外，QRT-PCR的特定引物列于表S中9．

无花果。1显示90.6% (29/32)MYB在不同浓度的NaCl处理下，基因被诱导/抑制C. Equisetifolia的根源。例如，表达CEQMYB18，CeqMYB113型，CeqMYB163，CeqMYB177在400点达到峰值 嗯。此外，16个基因的表达在不同浓度下达到高峰（图。10.). 例如，CeqMYB31和CeqMYB90在低盐处理下，在200 mM处达到最大值，但随后下降。此外,CeqMYB90被显著上调超过4倍。另外，200 mM NaCl胁迫下根系的响应如图S2，选定的所有成员CeqMYBS可以产生相关的压力。九个基因(CEQMYB14，CEQMYB16，CeqMYB31，CeqMYB32，CeqMYB37，CeqMYB71，CeqMYB97，CeqMYB122型和CeqMYB165)在24h和168h时表达上调，而仅在24h和168h时表达上调CeqMYB164随着时间的推移被压抑。在副骨中获得了类似的结果（CEQMYB113 / - 163)，高盐处理(400 mM)和根中1 h时表达量显著上调(图。10.和无花果。2）.

接下来，我们分析了CeqMYB不同浓度NaCl处理后不同时间的基因表达谱。32的CeqMYB基因，15以不同浓度上调，而16个基因被下调，与未处理的幼苗相比（图。3.）.16个基因在低盐度(100 mM)时表达强烈上调，然后明显下调(图1)。11.一个)。CeqMYB113型（超过60倍），CeqMYB138型(超过15倍),CeqMYB108型(超过4倍),CeqMYB112型（超过4倍）和CeqMYB63(超过6倍)在100 mM NaCl处理下表达显著上调。进一步调查的反应CeqMYB使用脱盐胁迫的基因，使用不同的盐处理时间段。从这些，表达水平CeqMYB978个基因在24h达到诱导高峰，3个基因在不同时间点受到抑制(图S4）.此外,无花果。11.B显示32个中的15个CeqMYB基因表达量在1 h达到峰值，表明这些基因可能参与了幼苗对渗透胁迫的即时/早期响应。CeqMYB113型和CeqMYB163这一趋势是典型的，其表达在以后的时间点保持相对不变，但在1 h强烈上调约15倍。简而言之,最CeqMYB这些基因在不同NaCl处理下的根和地上部均有表达上调，表明这些基因可能在盐胁迫响应中起重要作用。

MYB基因家族是植物中最大的转录因子之一。和MYB基因在植物的细胞周期、初级代谢、次级代谢、环境反应和胁迫反应等生理过程中发挥着重要作用[4，7，38，39]. 到目前为止，这是人类首次对基因家族进行系统研究C. Equisetifolia利用生物信息学工具和表达谱的基础上测序C. Equisetifolia基因组。

在本研究中，共182人CeqMYB基因被鉴定在C. Equisetifolia基因组，以及分布趋势CeqMYB成员与报告的类似答:芥(无花果。1B).系统发育关系MYB基因家族在C. Equisetifolia和答:芥研究过（图。1和2）.系统发育树显示了一些MYB基因在C. Equisetifolia和答:芥形成了各自独立的类群，说明两个物种具有保守的进化过程。此外，并非所有CeqMYB基因控制ATMYB.基因。例如，C4组不包含任何ATMYB.，反映了物种适应特定环境的要求[40). .最密切相关的MYB基因可能有相似的功能。之前的研究已经报道过了AtMYB44通过阳性调节脱离酸（ABA）信号传导诱导气孔闭合来增强转基因大豆对干旱/盐胁迫的耐受性[41]，和AtMYB73在植物耐盐性中起负作用[27］．AtMYB44和AtMYB73都聚集在同一组，这意味着CeqMYB130/−7/−10/−129/−103C27组对盐胁迫有反应。

此外，保守的基因和基因结构为182CeqMYB基因分析(Figs。3.和4）.其中保守基序的数量和分布以及外显子/内含子结构不同CeqMYB基因。其中，4CeqMYB基因只有一个图案，最大值有10个主题元素。同一组的图案分布MYB相对一致，大多数基序元素浓缩并定期分布在N末端，少量（例如基序18和r2R3-MYB中的图案17）在C末端不规则地分布，表明这一点CeqMYB进化关系密切的基因具有相似的功能。一些基序的出现频率较高，如基序4和基序2，反映了它们在细胞功能中的重要性CeqMYB蛋白质。此外，成员CeqMYB基因分为与大多数相似的基因结构相同的基团。结合以前的研究[42，43]同时还发现，大多数基因的外显子数目MYB基因不超过两个内含子。总的来说，序列中保守基序和外显子/内含子结构的数量、类型和分布的差异可能揭示了每个基因的不同功能。Ka/Ks可以反映生物进化过程中的选择压力。对所有已鉴定的同源对进行Ka/Ks分析，结果表明所有Ka/Ks比值均小于1（图。6），表明这一点MYB基因在进化过程中主要受纯化选择的影响(表S6）.

许多MYB蛋白参与植物对不良生长环境的响应，其中一些与植物盐胁迫的调控密切相关。最近的研究报告称GhMYB108类基于定量表达分析，将在干旱和盐胁迫响应中发挥重要的调控作用[44和过度表达TaMYB344烟草对干旱、高温、盐胁迫的耐受性增强[45，而过度表达VcMYB4a蓝莓愈伤组织增强了对盐、干旱、寒冷、冰冻和热胁迫的敏感性[46］．基于转录组数据，我们分析了182个基因的表达模式CeqMYB在不同时间点对200 mM NaCl处理的响应，并根据不同的表达模式将其分为25组(图。7）.此外，分子功能注释分析显示7CeqMYB盐胁迫应答基因(图。8）.我们从中挑选了32个MYB基因来进一步探索它们对盐胁迫的反应。启动子分析（图。9)显示，32个样本中有24个被选中CeqMYB基因涉及ABA响应的ABRE CIS-SCONSICATION元素。还在选定的11的启动子中鉴定了植物素响应元件（TGA元素和辅助核心）CeqMYB基因。研究表明，ABA信号通路在介导的耐盐性中发挥了重要作用。过度表达TaMYB33能提高小麦的抗旱性和耐盐性拟南芥蒂利亚纳通过aba介导的应激反应信号调节[47］．此外，由多脂肪（OSMPS）编码的R2R3型MYB TF涉及植物激素和细胞壁合成，同时响应高盐度信号[48］．这些结果表明MYBTFs通过介导植物激素的信号转导，提高植物的耐盐性。

而基因表达模式的阐明可以为基因功能的研究提供重要线索。表达水平为32MYB对玉米根和地上部的基因进行了检测C. Equisetifolia不同NaCl浓度和不同时间点的盐胁迫。不同浓度的NaCl处理后，根系中22个基因表达上调，地上部中15个基因表达上调(图S1; 图S3.）.特别是表达水平CEQMYB16，CeqMYB37和CeqMYB56根的变化不明显，地上部则下调。以及CeqMYB71不同浓度下，根和地上部均有下调。此外，一些人的表达水平CeqMYB基因在盐胁迫下凝固，但在芽中下调。相似的结果是观察到的向日葵［37]表明部分MYB基因在根中特异表达。一些同源对在同一组织中表现出相似的表达模式。例如，CeqMYB7 /−10在300 mM NaCl处理下根系达到峰值，但在地上部不同浓度NaCl处理下下降到CK的一半以下。大多数具有相同数量外显子的基因具有相似的表达模式，如CeqMYB7/−10包含一个外显子，CeqMYB4/−16/−32包含3个外显子(图S3.）.此外，qRT-PCR实验和RNA-Seq数据分析显示CeqMYB盐处理后不同时间点根系和地上部基因表达量均有上调(图S2; 图S4)，与之前的研究一致，如周等人的报告，他发现MYB300 mM NaCl处理24h或/和48h诱导油棕榈基因[49]. qRT-PCR分析表明，盐胁迫下花生根系至少有8个基因表达[50］．此外，诱导速度快AtMYB41对渗透和盐胁迫反应的表达[51]，以及转基因植物过表达AtMYB74在种子萌发过程中表现出对NaCl的过敏[26］．CEQMYB4，CeqMYB98，CeqMYB72，AtMYB41和AtMYB74在同一组中聚集在一起，这表明这三个CeqMYB基因反应盐胁迫。在这项研究中，CEQMYB4，这是一对同源的AtMYB74，在1和24 h时，表达量强烈上调约10倍。它再次证明了这一点CEQMYB4在盐压力中发挥了重要作用。同样，最重要的是CeqMYBNaCl处理后，基因表达在一定程度上上调，表明在盐胁迫反应中可能起着重要作用。

在这项研究中，182MYB在基因组中鉴定基因C. Equisetifolia．采用全面的生物信息学分析来研究系统发育关系、保守基序、基因结构和启动子分析。GO注释分析CeqMYB基因在C. Equisetifolia显示,7CeqMYB基因被归类为“对盐胁迫的反应”一类。结合RNA-Seq数据的表达谱分析，32MYB选择基因进一步探索其对盐胁迫的响应。采用qRT-PCR方法检测32个基因在不同浓度NaCl处理幼苗不同时间点的根和茎中的表达谱。表达水平选择最多MYB不同处理下，茎和根的基因表达均上调。此外，表达水平CEQMYB4在各种盐处理下上调，表明CeqMYB4可能参与了对盐胁迫的反应。这些结果提供的信息可能有助于进一步的功能分析CeqMYB阐明盐胁迫的作用机制C. Equisetifolia．

序列检索和基因鉴定

木麻黄基因组数据从网上下载(http://forestry.fafu.edu.cn/db/Casuarinaceae/）.MYB根据先前的研究方法鉴定基因[3.，52］．嗯剖面MYBTFs（PF00249）从Pfam蛋白家族数据库下载(http://pfam.xfam.org/)，然后将其用作查询(P< 0.001)用于所有推定的识别CeqMYB基因。最后,所有候选人MYBPFAM数据库手动筛选基因（http://pfam.janelia.org/)、NCBI保守域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wpsb.cgi.)以及智能数据库(http://smart.embl-heidelberg.de/）.答:芥基因组序列来自植物染色体数据库(http://www.phytozome.net/). 分析各组的氨基酸数目、开放阅读框（ORF）长度、分子量（MW）和等电点（pI）MYB使用ExPASy (http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）.此外，透过网上网站WoLP PSORT (https://wolfpeort.hgc.jp/)，预测CeqMYB推断蛋白的亚细胞定位。

多序列比对和系统发育树构建

Myb推断出蛋白质C. Equisetifolia是与ATMYB.s使用ClustalX 2.11 [53，54带有默认参数的软件。基于序列比对，采用MEGA7软件进行邻域连接(neighbor-joining, NJ)系统发育分析。采用1000个重复的Bootstrap分析来计算NJ树的可靠性[55］．

外显子-内含子结构和保守基序分析

为了映射MyB基因的外显子内分布的基因结构，在线基因结构显示服务器（http://gsds.cbi.pku.edu.ch用过）。为此目的，需要上传每个MYB基因的CD及其相应的基因组DNA序列。MEME在线计划（http://meme-suite.org/tools/meme)并对其保守基序进行了分析MYB超家族成员C. Equisetifolia．执行此分析的参数为:重复次数= any;最大图案数= 20;最佳基序长度= 6-200残基。对每一个假定的主题都进行了pam和SMART的注释。

同源对的Ka和Ks分析

根据研究方法[56]，定义的伞病。该方法是通过工作爆炸进行的[57]对于每个物种的所有核苷酸序列。一对对齐超过300bp的匹配序列，并且身份超过80％被定义为副古曲克C. Equisetifolia．基因对间每个位点的同义(Ks)和非同义(Ka)置换用dnaps v5.0软件计算[58］．

基因本体(GO)注释分析

基因本体（GO）分析进行了分析CeqMYBagriGO数据库中的基因(http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/index.php）.所有23,397个基因C. Equisetifolia分别作为参考集和CeqMYB取两个样本的基因作为测试集。研究结果分为分子功能、生物过程和细胞组分三类。

表达剖析CeqMYB基因

表达谱数据从NCBI数据库(项目登录号SRP064226)的Short Read Archive下载，用于表达分析C. Equisetifolia不同盐处理时期的根系。使用Htseq-count计算每个转录本的原始读取计数，然后将其标准化为每百万转录本(TPM)。热图通过TBTOOLS软件生成并可视化[59]，显示的颜色刻度表示TPM计数，比率进行log2转换。R软件(https://www.r-project.org)进行聚类分析。

假定启动子顺式作用元件分析

进一步研究药物的调节机制CeqMYB通过PlantCARE项目鉴定了许多与植物生长发育、激素响应以及非生物和生物胁迫响应相关的顺式作用元件。上游1500 bp区域的平移起始点CeqMYB基因是从木麻黄科数据库。PlantCARE程序用于筛选假定的顺式元素。综述了植物生长发育、激素反应、非生物和生物胁迫反应的相关因素。

植物材料和盐处理

的C. EquisetifoliaA8克隆系由中国林业科学研究院热带林业研究所保存栽培，于20世纪80年代由湛江林业科学研究院选育，现已商业化，样品采集和使用无需任何许可。将A8无性系的生根扦插在生长室内培养3个月作为实验材料。在200 mM NaCl处理后0、1、6、24和168 h分别收获根和地上部。将不同浓度(0、100、200、300和400 mM NaCl)溶液分别灌注于蛭石和黑土培养基上。盐处理24 h后收获根和芽，立即在液氮中冷冻，转移至超低温冰箱中，在80℃保存，然后提取RNA。

RNA提取及qRT-PCR分析

使用Aidlab植物RNA试剂盒(Aidlab Biotech，北京，中国)按照规格从根中提取总RNA。RNA的完整性和浓度通过1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop™One/OneC (ThermoFisher Scientific, USA)验证。第一条cDNA是由PrimerScript RT MasterMix (Takara，东京，日本)根据制造商的说明合成的。采用LightCycler480 II Real-Time PCR系统(瑞士制造)，采用TB Green Premix Ex Taq II(中国大连TaKaRa生物技术有限公司)，采样量为20 μL。每个反应混合物包含2.0 μl稀释的cDNA, 0.8 μl引物，10.0 μl TB Green Premix Ex Taq II, 6.4 μl RNase-free water。qPCR反应循环条件根据TB Green Premix Ex Taq II制造商说明书设置。每个样本重复进行三次生物实验。计算各基因的相对表达量为2^-ΔCT［60]与未处理对照植株(设1)进行比较。特定的引物CeqMYB基因设计采用primerpremier5.0软件和pcr技术EF1α.被用作管家基因[61］．GraphPad 8软件统计分析及绘图[62］．

统计分析

用jmp8软件进行配对t检验，具有统计学意义。平均值和标准差（SDs）是从三个生物和三个技术重复中计算出来的，与对照组相比有显著差异**P < 0.01 and *P< 0.05。

Illumina原始序列数据保存在NCBI数据库的Short Read Archive(项目注册号SRP064226)中。支持本文结果的数据集包含在文章和附加文件中。

不适用。

国家公益性科研机构专项基金项目(No. CAFYBB2018ZB003);国家自然科学基金项目(No. 31770716)。关键词:岩石力学，数值模拟，数值模拟资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释，也没有参与手稿的撰写。

从属关系

1. 中国林业学院热带林业研究所，广州510520

   王玉姣，张勇，范春杰，魏永成，李震，钟崇禄

贡献

构思设计实验:YJW, CLZ, YZ。分析数据:YJW、JXM和ZL。写的论文:YJW。参与了本研究的设计和修改稿:YJW, CJF, YZ。作者阅读并批准了最终稿件。

通讯作者

对应到永张．

伦理批准并同意参与

不适用。

出版许可

不适用。

相互竞争的利益

作者声明没有财务或商业利益冲突。

出版商的注意事项

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