白苷蛋白在贝甲酰胺 - 着色的属中的报告量天尺属证据不足，也不是驳斥互斥范式的有力依据

在这里，我们回复了题为“花青素途径对火龙果果肉着色的贡献“（FAN等人，BMC植物BIOL 20：361,2020）。在本文范围内。2020提出可以在β-色素的属中检测到花青素量天尺属，并建议他们负责果肉的着色。我们开放的观点是，考虑到betalain色素沉着物种中花青素合成基因功能的进化维持，花青素色素沉着可能与betalain色素共存，但在某些物种中尚未被发现。然而，在缺乏LC-MS/MS光谱和真实标准比较的共洗脱/碎片的情况下，Fan等人2020年的研究结果并不可信。此外，我们对论文的仔细审查，以及对现有数据集的重新分析，表明了许多其他问题。也就是说，在非目标代谢物分析中未能检测到β-半乳糖苷，所报告的与水果颜色无关的花青素积累，qPCR数据中缺少关键花青素合成基因，可能错误识别关键花青素基因，相关RNAseq数据的不可复制模式，缺乏与色素积累相关的基因表达，以及花青素途径转录上调的弱候选转录因子。

在植物王国中，贝纳索仅在秩序的自核糖中发生，其中替代其普遍无处不在的花青素颜料[1.,2.]。虽然在Caryophyllales的大多数家庭中发现了贝甲，但几个家庭有花青素色素沉着，不会产生贝甲。贝甲和花青素从未发现在同一物种中，并且广泛存在于有机体水平的相互排斥[3.,4.]. 然而，这两种色素都在转基因番茄植株中被观察到[5.]转基因异源生产β-半乳糖。互斥的分子基础尚不清楚，尤其是β-半乳糖色素物种似乎保留了编码花青素合成所需酶机制的所有基因。这仍然是一个引人注目的、基本上无法解释的生物学难题，50多年来的反复观察进一步证实了这一点[6.,7.,8.]。

以此为背景，Fan等人[9]最近报道的betalain色素属中的花青素量天尺属（仙人掌科），也称火龙果。Fan等人[9]分析了三种密切相关的种类的果实 - 一种红皮Hylocereus polyrhizus，a白皮Hylocereus undatus.一个中等的粉红色肉质杂种(H多根x H。裙带菜). 根据分析，他们报道了花青素的积累与红色和粉色果肉的颜色以及花青素生物合成基因的表达水平相关。Fan等人[9]建议他们的发现“反驳在同一物种/组织内的共同排斥的共同排斥和玻璃糖醛的范例”.

然而，我们对Fan等人的研究结果持怀疑态度[9]以下，我们概述了我们的担忧。

没有检测到betalains

范等人。[9]未报告在苹果果实中检测到β-半乳糖量天尺属在他们的分析中。但正如范等人所引用的[9]以前通过相同物种的许多研究检测到一系列β脑颜料[10.,11.,12.,13.,14.]。使用相同的两个物种作为风扇等。[9]，早期的研究令人信服地报告了红皮的贝纳坦积累H多根和白皮H. Undatus.[13.,14.]此外，还将β-半乳糖积累与红肉种不同成熟阶段的颜色发育相关H多根[12.]。FAN等人分析的第一步。[9]是一项非靶向代谢分析，鉴定了443种不同的代谢产物，包括酪氨酸、左旋多巴和酪氨酸Cyclo.-dopa-5-O-葡萄糖苷是β-半乳糖途径的中间代谢物，但没有β-半乳糖。我们不明白为什么在非靶向代谢分析中没有检测到β-半乳糖，而之前已经证明它们在这些物种中大量存在[11.,12.,13.,14.]。

花青素的分析不符合广泛的标准

范等人。[9据报道，检测五种不同的花青素。但是，它们对初始代谢分析提供了很少的方法论，只有以下简要说明：“苏州苏州苏州，中国苏州苏州二乙烯代谢多元植物平台进行萃取制备，代谢产萃取，鉴定和定量”. 我们发现这是不够的证据，并希望至少看到LC-MS/MS光谱和共同洗脱/碎片的颜料与真实的参考化合物。这一标准做法对于在事先没有预期检测花青素的betalain色素物种中坚持尤为重要。我们认为，更广泛地强调代谢物分析标准的必要性也很重要，因为Fan等人引用的研究[9]作为花青素的证据量天尺属具有类似的方法学局限性，也可能不是花青素存在的确凿证据。

报道的花青素与果肉颜色没有明显的相关性

范等人。[9]据报道，花青素的积累与粉红色和红色的果肉呈正相关，表明它们的“红色”可能对血液着色的贡献”. 然而，据报道，花色素苷-飞燕草苷3-芸香苷呈蓝色或粉红色，在白色肉质中积累到更高的水平Hylocereus undatus..实际上，基于它们的离子强度分析（图3）Delphinidin 3-Rutinoside的积累在白皮的较高水平Hylocereus undatus.其它4种花色苷在红肉中的累积量均大于其它4种花色苷的累积量多角龙。此外，如果所有检测到的花青素组合，白浆栽培品种（H. Undatus.）将在其纸浆中具有最大的花青素含量。因此，我们无法理解为什么肉体H. Undatus.是白色的，因为作者声称花青素对肉的颜色有显著的贡献。

关键花青素生物合成基因qPCR定量缺失

范等人。[9[据报道，与黄酮合成相关的基因的显着增加与粉红色和红色肉体相关。他们报告的基因显示出这种模式包括C4H（肉桂酸4-羟化酶,F3h（类黄酮-3'-羟化酶）,F3'5'H（类黄酮-3′，5′-羟化酶）,二氢黄酮醇-4-还原酶，和花青素合酶）。范等人。[9]提供所选基因的QPCR分析，以支持其RNA族实验，并且在很大程度上是一致的。但是，两者都是答案和DFR公司QPCR数据缺少。这种遗漏难以理解，因为它们是他们对其数据解释的两个最重要的基因，因为它们在花青素生物合成中编码晚期酶。尽管如此，他们的rnaseq数据报告了非常低的记录性丰富答案在白皮H. Undatus.，这难以与他们在同一物种中的高水平花青素的报告中调和。特别是由于花青素生物合成被认为是通过转录控制调节的模型系统，因此编码转录物和花青素的丰度与花青素之间的良好相关性是常见的[15.,16.,17.]。

注释和矫形分配出现错误

作者已经存入了原始的RNASEQ数据集，但不是他们的转录组合组件，并且不可根据要求提供。因此，不可能直接评估它们的注释。尽管如此，我们为自己的三个分类群重新组装了他们的RNASEQ数据集，我们自己的协议[18.]。我们试图基于同源性的同源性鉴定一组等同的花青素和黄酮化生物合成候选基因，以前描述了类黄酮生物合成中的序列（参见详细方法）。我们的注释结果显着不同于粉丝等人。[9]. 最引人注目的是，我们的系统发育分析并没有揭示F3'5'H候选基因，但强烈暗示唯一的候选基因实际上是F3'H。这些候选者显示了F3'Hs的所有保守氨基酸残基，而他们至少缺少一个F3'5'Hs的保守残基。F3'5'H是一些花青素生物合成途径中的关键酶，包括飞燕草苷。同样引人注目的是，没有一个真正的DFR公司在我们的H多根转录组合汇编（附加文件1.）。有几个规定的DFR公司- 麦克望者，但DFR公司属于一个大的多基因家族DFR公司确认序列是一个DFR公司ortholog。在分析所有时DFR公司系统发育树中的候选序列DFR公司其他物种的序列，没有H多根装配属于石竹目DFR分支。这最后一个发现很重要，因为DFR是花青素合成和合成途径中的一个后期酶DFR公司以前已经证明在β-半乳糖色素沉着的物种中有减少和/或组织特异性表达[19.]。

报告的花青素基因的转录物丰度不是可重复的

我们单独定量每个同源物的转录物丰度以检查它们穿过三种不同着色的物种的相关性（图。1.）。我们没有为花青素合成基因恢复与风扇等人的相同转录物丰度。[9]. 我们在Fan等人的研究中发现了转录物丰度的描述[9]这在视觉上有点误导，因为每个基因同源物都是以Y轴长度标准化的方式单独绘制的，当基因丰度相对较低时，这会产生低估的效果。因此，我们在同一轴上重新绘制了所有基因同源物，以强调这一点DFR公司不能在三种物种中的两种转录组合组件中检测到答案在所有三个中的表达量天尺属品种可忽略不计（RPKM） < 2). 综上所述，通过对黄酮类和花青素基因转录物丰度的重新分析，我们发现没有证据支持植物果实中存在功能性的花青素合成途径量天尺属，没有与果肉中的色素沉着相关的证据（表1.）。

推定的MYB调节剂不是已知的花青素途径的已知活化剂的同源物

范等人。[9]讨论了两个myb和一个bHLH，并提出了这些转录因子在感兴趣的色素沉着模式中的作用。然而，我们没有发现任何证据表明PAP1 R2R3-MYB同系物具有典型的上调作用答案[20.]在我们的装配（附加文件1.). 此外，我们使用qPCR引物序列从我们的组装体中恢复相应的全长序列，并发现了3个相应的MYB序列，而Fan等人讨论的2个[9]. 它们的序列都不属于r2r3mybs的分支，而是与MYBS3相似，后者只有一个MYB重复序列（MYB1Rs）。单重复MYBs曾被报道为花青素和类黄酮生物合成的抑制剂[21.]而不是激活。单一重复Mybs也不会与BHLH转录因子相互作用，如R2R3-MYBS，所以不清楚作者从这些MYB或BHLH基因的表达中绘制的重要性。最后，我们使用我们的组件来定量数据集中的转录性丰富，并且没有恢复与QPCR数据相称的模式（图。2.）。

转录组组装

通过FASTQ-DIPP，从序列读取归档中检索不同品种的RNASEQ数据集[22.]。通过Trimmomatic V0.39进行基于一组所有可用的Illumina适配器进行修剪和适配器去除[23.]使用滑动窗口：4:15前导：5尾随：5最小长度：50顶高33。我们决定对这三个物种使用单独的转录组装配，因为装配质量似乎优于组合装配的质量。如果不能通过这种方法恢复转录本，它们不太可能对果实的颜色有实质性的贡献。干净的读取对受Trinity v2.4.0的约束[24.]为了从头使用k-mer大小为25的转录组组件。丢弃了低于200bp的短折引体。以前描述了Python脚本[25.]和Busco v3 [26.]用于计算装配统计数据以进行评估。基于连续性和完整性评估装配质量。尽管这三个物种都产生了装配体，但装配体是根据这些物种的数据集产生的Hylocereus undatus.（SRR11190792-SRR11190794）用于所有下游分析。

转录组注释

使用先前描述的方法来进行编码肽的预测，以识别和保留每个contig的最长预测肽[25.]。通过组合Interoscan5来执行功能诠释[27.]带批注从拟南芥和Beta寻常魅力基于相互最佳的BLASTp命中率[25.]. 通过KIPEs鉴定了类黄酮生物合成相关基因[28.]使用肽模式（附加文件2.和3.）。额外的tblastn [29.]用DFR肽序列进行搜索，以筛选可能在BLASTp搜索中丢失的假定的退化DFR转录本。预测的肽序列也通过KIPEs筛选以鉴定MYBs用于转录物丰度分析。火龙果候选序列与特征序列的系统发育树[30.,31.]用FastTree V2构建[32.]（摇摆） + CAT模型）基于通过MAFFT v7构建的路线[33.]并用pxclsq清洁[34.]使所有路线柱的占用率最小为0.1。

转录物丰度量化

用Kallisto V0.44.0进行转录物丰度的定量[35.]使用RNAseq reads和我们的Hylocereus undatus.转录组组件[18.]. 定制的Python脚本用于汇总各个计数表并比较表达式值[36.]。

在当前研究期间生成和/或分析的数据集可在Bieldefeld大学存储库中获得：https://doi.org/10.4119/unibi/2946374.

我们感谢比勒费尔德大学生物技术中心（CEBTEC）提供了一个环境来进行计算分析。我们感谢纳撒尼尔·沃克·黑尔的有益讨论。

英国石油公司由德意志联邦基金会（DFG，德国研究基金会）资助——436841671。HBS、MK和MIK由印度政府科学和工程研究委员会（ECR/2016/000952）和生物技术部（BT/PR16902/NER/95/422/2015）资助。SFB由来自工厂网络和NERC-NSF-DEB RG88096的BBSRC高价值化学品资助。

从属关系

1. 剑桥大学植物科学系，网球场路，剑桥，英国CB2 3ea

   Boas Pucker＆Samuel F. Brockington

2. 生物化学与分子生物学实验室，Gauhati大学生物技术系，781014，Guwahati，Assam，印度

   Hidam Bishworjit Singh，Monika Kumari＆Mohammad Imtiyaj Khan

贡献

英国石油公司进行了所有的分析，由HBS和MK提供数据。英国石油公司、SFB、HBS和MK准备了数据。BP，SFB和MIK写了手稿。作者们阅读并批准了最后的手稿。

相应的作者

通信穆罕默德·伊姆蒂亚杰·汗或塞缪尔F。布罗金顿.

道德认可和参与同意

不适用。

出版许可

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

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