Pepc.GydF4y2Ba甘蔗调节谷胱甘肽S-转移酶和不同N源浓度下的碳 - 氮代谢改变GydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

磷酸胆胆碱酸羧基酶（Pepc）在高等植物的主要代谢中起重要作用。几项研究揭示了Pepc在碳和氮代谢的相互作用中的关键重要性。然而，Pepc在氮代谢中的功能机制尚不清楚，需要进一步调查。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

该研究表明，表达甘蔗的转基因水稻GydF4y2BaC4-PEPCGydF4y2Ba基因显示较短的主要根部，幼苗阶段的冠冕较少。然而，转基因水稻总氮含量显着高于野生型（WT）植物。蛋白质组学分析表明，在转基因水稻中响应氮气变化的更差异表达的蛋白质（DEPS）。特别地，在转基因水稻中鉴定出主要含有GSH S转移酶（GST）的最富集的途径“谷胱甘肽（GSH）代谢”。内源性的表达GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba销售税GydF4y2Ba和参与TCA循环的几种基因，糖酵解和氮同化在转基因水稻中发生变化。相应地，包括GST，柠檬酸盐合酶，6-磷质子油酶，丙酮酸激酶和富勒沙昔林依赖性谷氨酸合酶的酶活性的活性显着变化。此外，在不同的氮源浓度下，TCA循环和包括蔗糖，淀粉和可溶性的碳水化合物中的有机酸水平，包括在转基因水稻中改变。GSH将GST和其组分的基材及其组分包括谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸积聚在转基因水稻中。此外，在总营养物质下，在转基因水稻的根部较低，在总营养物质的根中较低，植物激素等水平较低。结合在一起，转基因水稻表达的表型，生理学和生化特征GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba在不同的氮水平下与wt不同。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究结果表明，Pepc通过调节GST来影响氮代谢，这为进一步研究了氮态代谢的Pepc功能机制进一步研究了新的方向和概念。GydF4y2Ba

Pepc广泛存在于血管植物，蓝藻，绿藻，非光合细菌和古代，但不是在真菌和动物中[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba］．PEPC因其在植物碳代谢中的特殊作用而被公认。在C语言中GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba和古代植物，Pepc在大气合作的初始固定中发挥着关键作用GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在C.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba光合作用和景天酸代谢光合作用。在C语言中GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba植物和大多数非光合组织，Pepc主要催化HCO存在下磷酸丙酸盐（PEP）的不可逆β-羧化GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba和我GydF4y2Ba^2+GydF4y2Ba形成草酸（OAA）和无机磷酸盐（PI）[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba］．OAA是用于合成天冬氨酸（ASP）和天冬酰胺（ASN）的碳骨架，以及三羧酸（TCA）循环中的重要材料，其产生参与其他生理功能的中间体，并为生物合成和氮同化提供碳骨架[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

PEPC是一种用于氮储存的丰富的植物蛋白[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]. 此外，PEPC在碳氮相互作用中起着重要的作用[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．击倒GydF4y2Baosppc4.GydF4y2Ba编码一个针对水稻叶绿体的植物型PEPC导致OAA、柠檬酸和异柠檬酸的下降。同时，谷氨酸和天门冬氨酸含量下降，全株氮含量下降GydF4y2Baosppc4.GydF4y2Ba敲低线，表明下调GydF4y2Baosppc4.GydF4y2Ba抑制NH.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba同化和氨基酸合成[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．的双突变体GydF4y2BaPPC1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPPC2.GydF4y2Ba在拟南芥中编码Pepc显示出生长抑制表型和肽活性降低，并进一步减少了苹果酸盐和柠檬酸盐的合成，并且严重抑制了铵同化[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．转基因水稻过表达玉米GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba增加了碳水平，每株植物的谷物产量较高，并且对光致潮流的上调更高的氮胁迫更耐受氮胁迫[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．过度表达GydF4y2BaZea Mays Pepc.GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba导致转基因植物中的蛋白质和游离氨基酸含量增加[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．细菌的种子特异性表达GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba在GydF4y2Ba野豌豆属narbonensisGydF4y2Ba导致种子干重增加，粗蛋白质和游离氨基酸含量升高[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba］．这些研究表明改变了GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba植物中的表达改变了生物量，有机酸含量，蛋白质和氨基酸水平的变化。此外，DOF1转录因子调节基因的表达，例如GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba，调节碳和氮代谢物。玉米的表达GydF4y2BaDOF1.GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba水稻显著提高了GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba基因表达，提高PEPC活性和氨基酸含量，促进低氮条件下的生长[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．该研究间接证明了Pepc在碳和氮代谢中的功能。而且，过表达GydF4y2BaGS1; 1GydF4y2Ba和GydF4y2BaGS1; 2GydF4y2Ba谷氨酰胺合成酶是一种参与氨同化的关键酶GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba基因表达[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]谷氨酰胺合成酶2共抑制的植株表现出显著的降低GydF4y2BaPepc1GydF4y2Ba和GydF4y2BaPepc2.GydF4y2Ba基因表达 [GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]，这表明这一点GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba与氮代谢有关。Pepc参与氮代谢，但它可能不会直接参与氮素同化。Pepc在碳和氮相互作用调节中的影响需要进一步阐明。GydF4y2Ba

在这项研究中，甘蔗GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba将基因引入籼稻垂悬。为了进一步研究表型和生理生化变化，具有不同浓度的氮源的营养溶液培养转基因植物和WT（籼稻品种，悬挂）植物。然后，进行蛋白质组学分析以鉴定DEPS和相关代谢途径。另外，测量基因表达，酶活性，代谢物和激素并相对分析。最后，我们确定了转基因水稻表达的显着变化的DEPSGydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba.我们还总结并获得了转基因水稻表达的生理学和生物化学的差异GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba和wt植物。GydF4y2Ba

不同氮源浓度下的植物表型GydF4y2Ba

之前，我们引进了甘蔗GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba利用农杆菌介导将含有启动子和编码区基因导入籼稻品种Hang2中，获得tPEPC转基因株系。的GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba在TPEPC线的转录和蛋白质水平上成功地表达。相应地，与WT相比，所有TPEPC线都显示出更高的Pepc酶活性[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba］．此外，TPEPPC线的总氮含量在幼苗和分蘖阶段增加（补充图SGydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．这表明表达了GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba对转基因水稻的碳代谢和氮代谢均有影响。研究了不同氮源浓度下tPEPC和WT植株的表型和生化特性。tPEPC和WT植株在含正常氮水平的全营养液中培养，标记为tPEPC- t和WT- t。将tPEPC和WT植株在含微量氮的低氮溶液中培养，分别标记为tPEPC- l和WT- l，研究它们对氮的敏感性差异。为了更好地研究tPEPC与WT植株的生长差异，还将tPEPC在缺氮溶液中培养，标记为tPEPC- d和WT- d。不同条件下，tPEPC植株的株高和地上部长度均显著高于WT。tPEPC植株在全营养条件下的主根长度比WT短，而在低氮和缺氮条件下tPEPC与WT植株的主根长度没有差异(图1)。GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba广告）。值得注意的是，TPEPC植物的冠状根数低于总营养物质下的WT植物（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Bae） 是的。tPEPC-L和tPEPC-D的叶绿素a（chla）含量分别大于WT-L和WT-D（图1）。GydF4y2Ba1.GydF4y2BaF）。此外，TPEPC植物显示出较高的根脱氢酶活性（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Bag） 是的。相应地，tPEPC系6日龄幼苗chla含量和根系脱氢酶活性增加（补充图S）GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)．与WT的相比，TPEPC植物的总碳含量在总营养物质下增加了约14％。相比之下，在低氮和氮缺乏症下，它们在低氮和缺乏症下减少了大约22％和20％（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Bah). tPEPC植株的总氮含量在不同氮源浓度下显著增加(图5)。GydF4y2Ba1.GydF4y2Bai） 是的。这些结果提示GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba影响生长和生理学GydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

蛋白质组学分析GydF4y2Ba

阐明C的分子机制GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-PEPC调节植物生长GydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2Ba，我们采用串联质标记(TMT)方法进行蛋白质谱分析。折叠变化(FC)大于1.3和小于1/1.3的蛋白被鉴定为DEPs。tPEPC-L/tPEPC-T、tPEPC-D/tPEPC-T和tPEPC-D/tPEPC-L中分别鉴定出685、775和75个DEPs，而WT-L/WT-T、WT-D/WT-T和WT-D/WT-L中分别鉴定出538、446和32个DEPs。这表明tPEPC植株对氮素变化的响应涉及更多的基因。tPEPC-T/WT-T、tPEPC-L/WT-L和tPEPC-D/WT-D共鉴定出47个DEPs(上调27个，下调20个)、80个DEPs(上调27个，下调53个)、44个DEPs(上调25个，下调19个)(图1)。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba一种）。然后，我们专注于TPEPC-T / WT-T，TPEPC-L / WT-L和TPEPC-D / WT-D中识别的DEP。DEPS被注释并分类为三个主要基因本体论（GO）类别：生物过程，细胞组分和分子功能。主要功能GO术语是生物过程类别中的细胞过程和代谢过程;细胞组分类别中的细胞，膜和细胞器;分子函数类别中的结合和催化活性（补充图SGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba). DEPs主要分布在叶绿体和细胞质中（补充图S）GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba），暗示TPEPC植物中代谢活性的变化。进行富集分析以确定显着的功能分类。然后，进行比较聚类分析以表明组之间的比较（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Bab-d，补充图SGydF4y2Ba5.GydF4y2Ba). 在分子功能本体中，最突出的分类是tPEPC-T/WT-T中的转移酶活性和金属/铁硫簇，包括酶抑制剂/调节剂活性、分子功能调节剂、水解酶活性、硫化合物结合、营养库活性、tPEPC-L/WT-L中的锰离子结合和肽酶活性，tPEPC-D/WT-D中阳离子跨膜转运蛋白活性、半胱氨酸型肽酶活性和叶绿素结合。在细胞组分本体中，tPEPC-T/WT-T中的质外体、tPEPC-L/WT-L中的线粒体蛋白复合物和胞外区以及tPEPC-D/WT-D中的类囊体和光系统是最主要的分类。在生物过程本体论中，最突出的分类是tPEPC-T/WT-T中的细胞对化学物质/胁迫的反应，tPEPC-L/WT-L中的防御反应和金属离子转运，tPEPC-D/WT-D中的含嘌呤化合物/磷酸核糖/糖基化合物生物合成过程和光合作用。结果表明，tPEPC植物对氮的响应性与野生型植物有显著差异，tPEPC-T/WT-T、tPEPC-L/WT-L和tPEPC-D/WT-D组之间存在显著差异。GydF4y2Ba

随后，在基因和基因组（Kegg）数据库（Kegg）数据库的京都百科全书中鉴定了富集的途径，并通过聚类分析评估（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Bae;桌子GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba，补充图SGydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．在tPEPC-T/WT-T中，GSH代谢途径上调和下调，包括两个GSTs。在本研究中，GST下调的tPEPC植株主根更短，冠根更少，这与在GST中插入T-DNA的功能缺失水稻突变体主根伸长和侧根形成减少相一致[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．在TPEPC-L / WT-L中，上调途径类别“光合作用 - 天线蛋白”包括“光收集II叶绿素A / B结合蛋白1（LHCB1）”和“光收获络合物I叶绿素A / B末端蛋白质2（LHCA2）“。下调途径“植物激素信号转导/ MAPK信号通路 - 植物/植物 - 病原体相互作用”包括“病原相关蛋白（PRS）”。在TPEPC-D / WT-D中，富集的途径“碳代谢”包括上调蛋白质“异柠檬酸裂解酶”和“苹果酸酶”（ME）和下调蛋白质“丙酮酸磷酸二基酶”（PPDK）。下调途径“光合作用”包括“光系统I反应中心亚基xi，叶片塑料”。富集的途径“代谢途径/光合作用 - 天线蛋白质”包括上调的“α-淀粉酶”，下调的“叶绿素A-B结合蛋白，氯塑”（LHCB1）和“脂氧基酶”（LOX）。这些结果表明，TPEPC-L / WT-L和TPEPC-D / WT-D中的DEPS主要与光合作用和碳代谢有关。GydF4y2Ba

基因表达分析GydF4y2Ba

蛋白质组学分析表明，tPEPC与WT之间存在显著差异。为了补充转录水平的变化，我们采用实时定量PCR (qRT-PCR)分析了几种DEPs的基因表达情况。GydF4y2Ba销售税GydF4y2Ba(968),GydF4y2BaGST1公司GydF4y2Ba和GydF4y2BaGST4类GydF4y2Ba与WT-T相比，tPEPC-T植株中表达量明显下调，这与蛋白水平的表达调控一致。然而，表达GydF4y2Ba销售税GydF4y2Ba(968),GydF4y2BaGST1公司GydF4y2Ba和GydF4y2BaGST4类GydF4y2Ba在TPEPC-L和TPEPC-D中调节，其分别高于WT-L和WT-D中的TPEPC-D。与WT植物相比，Ferriedoxin-亚硝酸盐还原酶（GydF4y2Ba近红外光谱GydF4y2Ba)以及GydF4y2BaFD-Gogat.GydF4y2Ba在不同的氮源浓度下，在TPEPPC植物中上调氮同化的基因在不同的氮源浓度下进行上调（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).表达方式GydF4y2BaLhcb1GydF4y2Ba和GydF4y2Ba氧合酶GydF4y2BatPEPC-T的基因表达量高于WT-T，而tPEPC-L和tPEPC-D的基因表达量则分别低于WT-L和WT-D。的GydF4y2Ba我GydF4y2Ba基因在TPEPC植物中上调，特别是在TPEPC-T中（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）。结果表明，TPEPC植物中GSH代谢，氮同化和碳代谢中涉及的基因的表达模式与WT植物中的碳代谢不同。GydF4y2Ba

调查是否引入GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba内源性影响表达GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba基因，我们用qRT-PCR检测。首先，我们分析了GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba并且发现它在TPEPC-L和TPEPC-D中逐渐下调。表达式没有明显的差异GydF4y2BaOSPPC1.GydF4y2Ba和GydF4y2Baosppc2a.GydF4y2BaTPEPC和WT植物之间。GydF4y2BaOSPPC2B.GydF4y2Ba和GydF4y2BaOSPPC3.GydF4y2Ba在低营养素和氮缺乏症下进行上调，特别是在TPEPC-L和TPEPC-D中。GydF4y2Baosppc4.GydF4y2Ba在TPEPC植物中上调，TPC-D在显着上调（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac).这些结果表明，一些内源性的表达GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba基因确实在TPEPC植物中发生了变化。在C语言中GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba植物，Pepc主要参与TCA循环的托扑反应，这也与糖溶解有关。因此，我们分析了TCA循环和糖溶解中率限制酶基因的表达。表达GydF4y2Baα-酮戊二酸脱氢酶GydF4y2Ba(GydF4y2Baα-KGDHGydF4y2Ba)，GydF4y2Ba异柠檬酸脱氢酶GydF4y2Ba(GydF4y2BaICDHcGydF4y2Ba)，GydF4y2Ba六酮酶GydF4y2Ba(GydF4y2Ba香港GydF4y2Ba)GydF4y2Ba和pfk.GydF4y2Ba与WT-T相比，基因在TPEPC-T中更高，但TPEPC-L和WT-L或TPEPC-D和WT-D之间没有差异。相反，表达了GydF4y2Ba反恐精英GydF4y2Ba和GydF4y2BaPKGydF4y2Ba与WT-T相比，基因在TPEPC-T中抑制（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad).结果表明，在不同氮源浓度下，tPEPC中这些TCA循环和糖酵解基因相对于WT具有不同的表达模式。GydF4y2Ba

酶活性测定GydF4y2Ba

鉴于蛋白质组和基因表达的变化，我们推测酶活性发生了变化。因此，我们测定了tPEPC和WT植物的酶活性。tPEPC-T和tPEPC-L的GST活性分别低于WT-T和WT-L。同时，在不同氮源浓度下，tPEPC植物的GOGAT活性高于野生型植物（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa).与全营养条件下相比，低营养缺氮条件下tPEPC和WT的PEPC活性和丙酮酸脱氢酶(PDH)活性均显著降低。tPEPC植株的PEPC活性高于WT植株，而PDH活性则相反。tPEPC-T和tPEPC-L的ME活性分别高于WT-T和WT-L。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab).这说明在tPEPC植物中，这些酶的活性与TCA循环的变化相关。在低营养、低氮条件下CS活性降低，tPEPC植株CS活性显著低于WT植株。tPEPC-T的α-KGDH活性高于WT-T, ICDHc活性低于WT-T，但tPEPC-L与WT-L、tPEPC-D与WT-D的活性无差异(图5)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bac).在不同氮源浓度下，tPEPC植株的PFK活性高于WT植株。与此相反，HK在tPEPC工厂中较低，尤其是在tPEPC- l和tPEPC- d工厂。tPEPC-T植株的PK活性低于WT-T植株，而tPEPC-L和tPEPC-D植株的PK活性高于WT-T植株(图1)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad).综上所述，tPEPC植物的TCA循环和糖酵解中限速酶的活性发生了一定程度的变化，CS、PFK和PK活性发生了显著变化。GydF4y2Ba

有机酸含量分析GydF4y2Ba

随后，我们考虑了在TCA循环中代谢中间产物的含量和糖酵解的含量相应地改变。我们进一步测量TPEPC和WT植物中的有机酸含量。与WT植物相比，TPEPC-T中的OAA含量较低，而TPEPC-D的含量明显高。随着氮浓度的降低，OAA含量在WT植物中减少，而它们在TPEPC植物中增加。TPEPC-T和TPEPC-D中的富马酸（FA）含量高于WT-T和WT-D植物。TPEPC-L和TPEPC-D的α-酮戊酸（α-Kg）和苹果酸（MA）的水平仅为WT-L和WT-D。TPEPC-T中的柠檬酸（CA）和琥珀酸（SA）含量明显高于WT-T，但它们在TPEPC-D中较低，而不是在WT-D中（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA和B）。这些结果表明，TCA循环中这些有机酸的水平变化。此外，TPEPC植物中有机酸中有机酸的变化趋势与不同氮源浓度下的WT植物中的趋势不同。另外，TPEPC-T中的果糖-1,6二磷酸（FDP）和丙酮酸（PA）的水平高于WT-T，TPPC-L植物中的乳酸（LA）水平较高（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC）。其他两种比较群之间没有差异，这表明TPEPC植物中糖酵解中这些有机酸的含量几乎没有变化。GydF4y2Ba

GSH，氨基酸和碳水化合物含量的变化GydF4y2Ba

蛋白质组学分析表明，tPEPC-T中GST表达明显下调。GST在细胞解毒中起重要作用，催化还原的GSH与有毒物质结合，GSH是由Glu、Cys和Gly合成的三肽。随后，测定了tPEPC和WT植株中GSH和三种氨基酸的含量。与全营养相比，低营养和缺氮条件下tPEPC和WT植株的GSH含量均增加。此外，tPEPC-T和tPEPC-L中的GSH水平分别高于WT-T和WT-L中的GSH水平（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一种）。这可能暗示由于GST活动较低的TPEPC-T和TPEPC-L累积的GSH。TPEPC-T中的Glu，Gly和Cys水平显着高于WT-T，而相对于WT-D，它们在TPEPC-D中较低（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab).此外，OAA是三羧酸循环的重要原料，也是Asp和Asn的碳骨架。在WT和tPEPC植株中，Asp水平随营养供应的减少而降低。同时，在低氮和缺氮条件下，tPEPC- t的Asp水平高于WT- t，而tPEPC的Asp水平低于WT。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab）。这表明在不同氮源浓度下，WT和TPEPC植物中发生了不同水平的ASP。GydF4y2Ba

作为Pepc在大多数非光合组织和C中的TCA循环中具有厌氧作用GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba植物，可能是碳水化合物含量在TPEPC植物中发生变化的原因。我们确定不同氮源浓度下TPEPC和WT植物中蔗糖，淀粉，可溶性糖的水平。TPEPC-T和TPEPC-L中的蔗糖含量分别为WT-T和WT-L的2.5倍。TPPC-T和TPEPC-L中的淀粉和可溶性糖含量显着高于WT-T和WT-L。相比之下，TPEPC-D和WT-D之间的蔗糖，淀粉和可溶性糖含量没有差异。此外，与WT-T相比，WT-D的蔗糖和可溶性糖含量明显增加，而TPEPC植物中具有相对较高的水平，TPEPC-D和TPEPC-T之间没有差异（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC）。结果表明，这些碳水化合物在TPEPC和WT之间发生不同的变化，随着营养供应而降低。GydF4y2Ba

IAA、ZT和2iP含量的变化GydF4y2Ba

植物的生长发育与内源激素含量密切相关。鉴于tPEPC与WT植株的表型差异，我们分别测定了植物地上部分和根中IAA、ZT和2iP的水平。与WT-T相比，tPEPC-T的地上部和根部IAA水平均较低。tPEPC-L和tPEPC-D的地上部分IAA水平分别高于WT-L和WT-D。与WT-L相比，tPEPC-L根系IAA水平较低，而tPEPC-D与WT-D根系IAA水平无明显变化。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa).低营养缺氮条件下tPEPC和WT地上部ZT含量较全营养条件下增加。tPEPC-T和tPEPC-L的地上部分ZT含量分别低于WT-T和WT-L，而tPEPC-D的地上部分ZT含量高于WT-D。在根系中，tPEPC-T和tPEPC-D的ZT水平低于WT-T和WT-D，而tPEPC-L的ZT水平高于WT-L(图1)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab）。无论是在TPEPC和WT的空中零部件，低营养素和氮缺乏的2IP水平约为总营养成分的一半，并且TPEPC-L的空中部位低于WT-L。在根中，TPEPC-T中的2IP水平仅为WT-T中的约35％，在TPEPC-L中，在WT-L中的47％约为47％，但TPEPC-D中的高于WT-D（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaC）。似乎这些激素的水平与培养溶液中的氮水平密切相关。最有可能是不同的激素水平诱导TPEPC和WT植物之间的表型差异。GydF4y2Ba

Pepc，位于植物中的碳水化合物代谢分支中的关键酶，补充PEP为TCA周期以支持合成代谢。在这项研究中，转基因水稻表达GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba在表型、基因表达、蛋白质组、代谢物和激素含量等方面都发生了很大的变化。GydF4y2Ba

蛋白质组学分析表明，在tPEPC-T植株中GST显著降低。相应地，tPEPC-T植物的GST活性较低。GST通过结合三肽GSH（γ-谷氨酰半胱氨酸甘氨酸）与有毒的外源和氧化产物在细胞解毒中发挥重要作用[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］．然而，几项研究表明转基因水稻表达GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba对光氧化和光抑制有较强的耐受性，通过CaGydF4y2Ba^2+GydF4y2Ba，没有和糖类反应[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．最有可能从GST路径不同的其他防御途径GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba-转基因水稻，也可能受到环境条件的影响，如氮素供应。值得注意的是，商品及服务税也参与调节植物的生长发育[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba］．GST与远红不敏感219相互作用参与调节细胞伸长和植物发育[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．突变GydF4y2BaOsGST4GydF4y2Ba显著抑制主根伸长、侧根形成和地上部生长[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．在我们的研究中，GST水平在蛋白质和转录水平上显着降低GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba正常条件下的转基因水稻。此外，GSH，GST的基材及其组分，Glu，Cys和Gly，积累在GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba转基因大米，和GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba转基因植物具有较短的根，冠状根部较少，但植物高度较高，射击长度较长。这表明引入GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba主要影响GST在根中的表达并影响其生长。但是，怎么样GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba调控GST表达的机制有待进一步研究。GydF4y2Ba

Pepc催化PEP，糖酵解和HCO的中央中间体GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba，产生OAA，补充三羧酸循环。当数量GydF4y2Ba我GydF4y2Ba在过表达的转基因马铃薯植株中，ME和PK活性升高GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba］．在这个研究中，表达GydF4y2Ba我GydF4y2Ba,GydF4y2Ba氧合酶GydF4y2Ba,GydF4y2Baα-KGDHGydF4y2Ba,GydF4y2BaICDHcGydF4y2Ba,GydF4y2Ba香港GydF4y2Ba和GydF4y2BaPFKGydF4y2Ba基因上调GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba转基因大米。而ME、α-KGDH和PFK活性较高，CS活性较低GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba这些结果表明，转基因水稻的引进GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba诱导了包括三羧酸循环和糖酵解在内的代谢反应相关基因的变化。此外，下调GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba表达始终导致OAA，CA，MA和TCA周期的其他中间体的变化[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]. 内源性蛋白过表达GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba在马铃薯植物中导致MA，2-氧缺乏酸盐（2-OG）和OAA增加增加[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．在转基因水稻中，玉米OAA水平较高GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］．在我们的研究中，GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba转基因水稻具有较高水平的Fa，Ca，SA，FDP和PA，但具有较低的OAA水平，与先前研究的结果不同。这可能是因为代谢反应是一种动态过程，结果显示了代谢中间产品之间的差异GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba转基因水稻和wt。此外，李和王观察到，表达玉米的叶片和转基因水稻颗粒中的总可溶性糖GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba与wt中的那些相比显着增加[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．在我们的研究中，蔗糖，淀粉和可溶性糖显着高于GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba转基因水稻比wt在wt中。我们的研究一起携带，我们的研究表明GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba改变了三羧酸循环和糖酵解，进而诱导了中间产物和代谢物的变化。GydF4y2Ba

PEPC在碳氮耦合代谢中起着重要作用。碳氮代谢被重定向，氨基酸水平增加GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba转基因植物[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba］．Pepc促进蛋白质在成熟大豆中的积累，在高蛋白栽培中存在较高的Pepc活性[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]. Tang等人指出转基因水稻过度表达玉米GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba对低氮胁迫的耐受性强于野生型[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．然而，下调GydF4y2BaPepc.GydF4y2Ba基因抑制铵同化和随后的氨基酸合成[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．在我们的研究中，转基因水稻在不同生育阶段和不同氮源浓度下的总氮含量较高，这反映了不同氮源浓度对水稻总氮含量的影响GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba论氮代谢。NIR，一种氧化还原酶，主要是转换没有GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba到NH.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在没有的情况下发挥重要作用GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba转换 [GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba］．GOGAT是谷氨酰胺合成酶/GOGAT循环中的关键酶，在NH中起着关键作用GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba同化[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．表达GydF4y2Ba近红外光谱GydF4y2Ba和GydF4y2BaFD-Gogat.GydF4y2Ba基因显著增加GydF4y2BaGOGATGydF4y2Ba活动更高GydF4y2BaC4-PEPCGydF4y2Ba本研究中的转基因水稻。转基因水稻与野生稻在不同氮源浓度下基因表达、酶活性、有机酸和激素含量的变化不同，说明转基因水稻对氮有明显的反应GydF4y2BaC4-PEPCGydF4y2Ba转基因大米。Glu在氨基酸代谢中发挥着关键作用，在碳和氮同化界面中的中心信号传播和代谢作用中起作用[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．本研究中，谷氨酸含量显著高于GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba在总营养素下的转基因水稻，这对GLN合成酶/ Gogat循环中的铵同化可能有益。此外，Glu是GSH的组件之一，GST的基材。因此，很可能是cGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-PEPC对氮代谢的影响与GSH代谢有关，其调节机制值得进一步研究。GydF4y2Ba

此外，荷尔蒙对植物生长和发育至关重要。生长素在植物发育过程中起重要作用，包括细胞伸长和分裂，射击伸长，血管分化，对热化反应的调节和建立顶端优势的影响[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]. 此外，生长素对植物根系的发育，包括侧根和不定根的形成、发生和出苗，以及根系的伸长都是必需的[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba］．参与疾病信号传导途径的基因的稻米突变体表现出降低的冠根或缺陷的根部发育[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba］．另一种重要的植物激素是Cytokinin，这是一群植物激素，参与了几种发育和生长过程，如昼夜节律，根部发育，萌发，芽，叶片衰老等[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba］．生长素和细胞分裂素相互作用调节根分生组织活性[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba］．wuschelrelated homeobox (WOX)基因被报道为生长素和细胞分裂素信号的整合因子，在冠根发育过程中调节细胞增殖[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba］．蟾蜍蛋白诱导的冠状卵石rootless5（CRL5）通过抑制细胞蛋白信号传导来促进冠根引发[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba］．IAA是植物中最广泛的植物素，ZT和2IP是高等植物中的自发性和主要的细胞肽。在这项研究中，GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba转基因水稻在总营养物质下显示较低的IAA，ZT和2IP水平。在TPEPC-T植物中较短的主要根部和较少的冠状根部可能由于这些激素在根中的较低水平。包括氮的营养素也是影响植物根系结构的重要因素，因此TPEPC-L的根源没有显示出显着的差异，但在根中也有相对较低的IAA水平。此外，已经提出了生长素可以调节GST基因表达或酶活性，从而改变氧化还原潜力，然后改变基因表达和细胞发育[GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba]. 因此，我们推测GSTs表达水平或酶活性的降低与IAA水平的降低有必然的关系GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba总营养素下的转基因水稻。GydF4y2Ba

Pepc参与植物碳水化合物代谢并支持碳氮相互作用。在这项研究中，转基因水稻表达GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba表现出与WT植物不同的特征，特别是较短的原始根和较少的皇冠根。基因表达，酶活性，植物激素含量，若干代谢中间体和与TCA循环相关的代谢物，在不同浓度的氮源下转基因水稻中的改变在转基因水稻中发生变化。蛋白质组学分析显着揭示了“GSH代谢”作为最丰富的途径GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba转基因水稻。表达GydF4y2BaGST公司GydF4y2Ba在蛋白质和转录水平上显着降低。伴随着，GST酶活性较低，其基材GSH的积累GydF4y2BaCGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-pepc.GydF4y2Ba正常条件下的转基因水稻。值得注意的是，GSH的一个组成部分和在GOGAT循环中起关键作用的谷氨酸的水平在转基因水稻中更高。因此，很可能是PEPC通过调控GST进而影响氮素代谢，为研究PEPC对氮素代谢的影响提供了新的思路。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

来自福建省农业科学院水稻研究所的TPEPC和WT植物（籼稻杭2）在含有正常水平的氮气（0.11875g / L NH）的总营养溶液（Yoshida）中培养GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba)，低氮溶液含微量氮(0.0057 g/L NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba）和20d的氮缺乏溶液，并在本研究中使用。GydF4y2Ba

蛋白质提取，鉴定和生物信息学分析GydF4y2Ba

用裂解缓冲液（10 mM/L二硫苏糖醇，8 mol/L尿素，1 % Triton-100和1 % 蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。然后，按照制造商的说明，使用双辛酸试剂盒测定蛋白质浓度。胰蛋白酶消化后，根据制造商的方案，使用TMT试剂盒（Thermo）标记肽，并使用高pH反相高效液相色谱（HPLC）对其进行分离。采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对多肽进行分离鉴定。MS/MS结果数据由Maxquant搜索引擎（v.1.5.2.8）处理，串联质谱由UniProt数据库检索(GydF4y2Bahttps://www.uniprot.org/GydF4y2Ba)连接一个反向诱饵数据库。利用来自UniProt-GOA数据库(GydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/GOA/GydF4y2Ba)．使用KEGG数据库注释蛋白质代谢途径。GO术语或KEGG路径。GydF4y2BaPGydF4y2Ba-Values <0.05被认为是显着富集的，并进行分级簇。通过狼Psort亚细胞定位预测软件预测了蛋白质亚细胞定位。GydF4y2Ba

定量逆转录聚合酶链反应GydF4y2Ba

对于qRT-PCR，使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas, LTU)从之前收集的RNA中生成cDNA。qRT-PCR采用Fast Start Universal SYBR Green Master系统(Roche, USA)，在7500实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行。以肌动蛋白基因表达量为参照，测定基因表达量的相对定量，并采用相对定量法(ΔΔCT)评价定量变异。qRT-PCR所用引物见补充表SGydF4y2Ba1.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

酶活性测定GydF4y2Ba

根据制造商的协议，通过试剂盒（Suzhou Comin Biotechnology Co.，Ltd.）测定GST，Gogat，Pepc，Pdh，Me，Cs，α-Kgdh，ICDHC，PFK，HK和PK的酶活性。GydF4y2Ba

代谢物测定GydF4y2Ba

通过HPLC（Agilent 1100）检测氨基酸含量。通过制造商的协议，通过试剂盒（Suzhou Comin Biotechnology Co.，Ltd。）测定GSH，蔗糖，淀粉和可溶性糖含量。GydF4y2Ba

IAA、ZT和2ip测定GydF4y2Ba

通过HPLC（Agilent 1100）测定IAA，ZT和2IP内容物。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

统计分析采用单因素方差分析或t检验。GydF4y2BaPGydF4y2Ba-values < 0.05为有统计学意义。使用Microsoft Excel 2019进行统计计算。GydF4y2Ba

在当前研究期间使用和分析的数据集可从合理的请求中获得相应的作者。GydF4y2Ba

Pepc：GydF4y2Ba

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶GydF4y2Ba

WT：GydF4y2Ba

野生型植物GydF4y2Ba

DEPs:GydF4y2Ba

差异表达蛋白质GydF4y2Ba

格林威治恒星时：GydF4y2Ba

谷胱甘肽S-转移酶GydF4y2Ba

TCA：GydF4y2Ba

三羧酸GydF4y2Ba

CS：GydF4y2Ba

柠檬酸合成酶GydF4y2Ba

PFK：GydF4y2Ba

6-phosphofructokinaseGydF4y2Ba

PK:GydF4y2Ba

丙酮酸激酶GydF4y2Ba

FD-GOGAT:GydF4y2Ba

富勒森素依赖性谷氨酸合酶GydF4y2Ba

GSH：GydF4y2Ba

谷胱甘肽GydF4y2Ba

Glu:GydF4y2Ba

谷氨酸GydF4y2Ba

cys：GydF4y2Ba

半胱氨酸GydF4y2Ba

gly：GydF4y2Ba

甘氨酸GydF4y2Ba

国际广告协会：GydF4y2Ba

吲哚乙酸GydF4y2Ba

ZT：GydF4y2Ba

扎丁GydF4y2Ba

2IP：GydF4y2Ba

IsopentenyladenineGydF4y2Ba

OAA:GydF4y2Ba

草酸乙酸盐GydF4y2Ba

asp：GydF4y2Ba

天冬氨酸GydF4y2Ba

ASN：GydF4y2Ba

天冬酰胺GydF4y2Ba

的背影,GydF4y2Ba

叶绿素A.GydF4y2Ba

FC：GydF4y2Ba

折叠变化GydF4y2Ba

去：GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

Kegg：GydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组的百科全书GydF4y2Ba

QRT-PCR：GydF4y2Ba

定量实时PCRGydF4y2Ba

我：GydF4y2Ba

雌性酶GydF4y2Ba

α-KGDH：GydF4y2Ba

α-酮戊二酸脱氢酶GydF4y2Ba

ICDHC：GydF4y2Ba

异柠檬酸脱氢酶GydF4y2Ba

香港：GydF4y2Ba

六酮酶GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

陈述GydF4y2Ba

该研究协议符合相关的机构，国家和国际指导方针和立法。我们有权收集“GydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2Ba“本研究中的材料。GydF4y2Ba

这项工作得到了中国国家重点研发方案（2017年）的开放研究基金，杂交水稻（湖南杂交水稻研究中心）（2019KF10）（2019KF10）和国家自然科学基金的培育项目，由中国重点研究和发展计划提供资金农业科学院（GJPY2019005）。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 福建省农业科学院大米研究所，福建省福州福州350019GydF4y2Ba

   连玲，林跃龙，魏毅东，何伟，蔡秋华，郑艳梅，徐惠斌，王福祥，朱永生，罗曦，谢华安，张建福GydF4y2Ba

2. 福建和台湾作物生态害虫防治国家重点实验室，南方杂交水稻种质创新与分子育种，农业部/中国杂交稻国家重点实验室/国家工程实验室基础富士省农业科学院，350003，福建福州，中国GydF4y2Ba

   连玲，林跃龙，魏毅东，何伟，蔡秋华，郑艳梅，徐惠斌，王福祥，朱永生，罗曦，谢华安，张建福GydF4y2Ba

3. 福建省农业科学院农业产品质量标准与试验技术研究所，福建福州福州，福州GydF4y2Ba

   黄伟GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

JFZ和LL构思并设计了这项研究。LL、YLL、YDW、WH1、QHC、WH2、YMZ、FXW、YSZ和XL进行了所有实验。HBX分析了数据。哈克斯指导并支持了这项研究。我写了手稿。JFZ修改了论文。所有作者都阅读并批准了手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

通信GydF4y2Ba建福张GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文是根据知识共享署名4.0国际许可证授权的，该许可证允许以任何媒体或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的信任，提供到知识共享许可证的链接，并指出是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可证中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可证中，并且您的预期用途不受法律法规的允许或超出允许的用途，您将需要直接获得版权持有人的许可。要查看此许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba.Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。GydF4y2Ba

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