野生番茄毛状体的自然变异使用随机森林方法选择有助于抗虫的代谢物

背景

植物产生的专业代谢产物是植物第一道防御食草昆虫，细菌和真菌的强大部分。当前栽培的番茄的野生祖先在其型I / IV滴毛中产生血糖血管藻，在其类型的植物培养物中挥发物，其在植物抵抗昆虫中具有潜在作用。然而，代谢型材通常是复杂的混合物，其识别功能性有趣的代谢物挑战。在这里，我们旨在鉴定来自各种野生番茄基因型的专门代谢物，可以解释对昆虫的抗性抗粉虱（Bemisia Tabaci.）西方花蓟马（西方弗兰克林菌（Frankliniella occidentalis）．我们评估了植物抵抗力那确定的毛细血管密度并通过LC-MS（酰核）和GC-MS（挥发物）获得腺体胎面的代谢物谱。使用定制的随机森林学习算法，我们确定了特定专用代谢物对所观察到的抗性表型的贡献。

结果

所选择的野生番茄酱表现出不同含量的粉虱和蓟马的抵抗力。耐昆虫的抗癌可以容易受到另一个昆虫的影响。腺体胎儿密度不一定是植物抗性的良好预测因子，尽管与酰基氏植物的生产相关的I / IV毛状体的密度看起来与粉虱抗性相关。然而，对于VI-滴体，似乎是抗腺体的特定含量决定的抵抗力。即使当它们来自相同种类，不同载体之间的代谢物轮廓存在强烈的定性和定量变化。在76个酰基臂出中发现，随机森林算法将两种酰基曲线（S3：15和S3：21）连接到粉虱抗性，但无呈刺激性。检测到86次挥发物中，筛窦α-Humulene与白粉易感探剂有关。该算法没有将任何特定的代谢物与抗蓟马的抵抗联系起来，但单点α-磷锡，α-萜烯和β-磷锡/ D-柠檬烯与易感番茄溶解显着相关。

结论

粉虱和蓟马被野生西红柿中发现的某些专门的代谢产物明显地瞄准。提出的机器学习方法有助于识别具有研究昆虫物种的功效的特征。这些酰胺代谢物可以是用于培育抗抗虫品种的努力的靶标。

病虫害对粮食安全构成威胁，初级产量每年损失约26%，次级产量损失甚至更高，高达38% [1］．草食性昆虫通过取食直接危害植物，导致光合能力下降，造成明显的危害，使作物无法销售。然而，它们也可以是疾病的载体，通常是将病毒从植物转移到植物，提供了病毒的移动性，从而大大降低了产量。昆虫如白蝇(Bemisia Tabaci.；以前是红薯或银叶白蝇)和西花蓟马(Frankliniella occidentallis.)是重要的入侵性食草动物，分布在世界各地的农业生产区。这两种昆虫都被认为是“超级载体”，它们可以携带多种病毒，并通过取食韧皮部（粉虱）或细胞内容物（蓟马）将病毒传播给大范围的寄主植物[2那3.那4.那5.］．对于这两种昆虫来说，植物间的病毒传播主要发生在它们(流动的)成年期[6.那7.］．然而，对于蓟马来说，病毒只在幼虫阶段获得，然后发展成具有传染性的成体载体[8.那9.］．农业中对这些病媒害虫的管理仍主要以化学控制和系统杀虫剂为基础，它们可提供强有力和持久的作物保护。然而，随着越来越多的经典合成杀虫剂因其负的脱靶效应而被禁用，了解和利用(野生)祖先作物近亲中发现的抗虫性再次引起人们的兴趣[10那11那12那13］．

植物对(食草)昆虫的抗性可以定义为一种遗传性的能力，与其他没有这种能力的植物相比，这种能力可以减少昆虫的攻击，从而降低危害[14那15]. 在自然界中，植物通过防御机制（如抗沉降或抗摄食特性、对昆虫的毒性或对其发育的干扰）来减少或阻止昆虫的定居[16那17那18］．它们的范围从物理障碍，表面覆盖，粘性物质或酶的生产和专门的代谢物。而非腺毛在植物表面上妨碍某些食草动物的运动，在植物表面，腺体组织如管道，肺泡细胞，或者在番茄，腺毛状体，生产和商店专门的代谢物，以防御昆虫对抗昆虫[19那20.］．储存在这种腺体组织内的代谢物通过渗出或通过昆虫的物理损伤来释放或通过昆虫的物理损伤破坏组织（例如，咀嚼，渗透或触摸）。植物化学物质的确切作用方式通常不完全阐明。除了像昆虫的口感粘性或堵塞的物理障碍之外，专门的代谢物可以通过受体干扰，生物学（例如酶）过程的干扰，激素平衡或影响昆虫的神经系统，通过干扰电子传输来作用于分子水平。21］．

番茄在其腺状毛状体中产生过多的特化代谢物，这些代谢物主要位于植物的绿色部分。特别是栽培番茄的某些野生亲缘植物(Solanum lycopersicum.)对重要的农艺害虫表现出相当大的抗性，这些害虫通常可以追溯到毛家传播的特化代谢物[22那23那24那25那26那27］．野生物种喜欢S. Pennellii.那S.哈布菊属和S加拉帕根塞例如，散列来自I型和IV腺体毛状体的广泛的酰基臂，从而为几种害虫昆虫提供抗性[28那29那30.]. 这些酰基糖由葡萄糖或蔗糖组成，其酰基被酯化成一个或多个羟基。酰基糖渗出物的组成可以高度多样化，因为完整的混合物是具有不同糖部分和不同酰基链长度和位置的酰基糖的集合[31那32那33那34那35］．有趣的是，昆虫似乎对特定的酰基熊组合物不同，表明昆虫靶向是组分的[36那37］．

（半）挥发性单萜和倍半萜，至少主要在VI型毛状体中产生和储存，作为另一类重要的代谢物参与害虫防御[24那38那39那40］．Sesquiterpenes 7-膜化和野生番茄生产的r-姜黄S.哈布菊属Pi127826 repel粉虱和7-张加工的酒精衍生物对蜘蛛螨有一种驱虫效果Tetranychus荨麻疹[41那42］．另外，来自2,3-二氢甲酸S.哈布菊属文献LA1363和LA1927对蜘蛛螨的驱避作用[43]和类型 - vi毛状体S.哈布菊属LA1777产生一种佛手柑酸和santanaloic酸的混合物，提供了对番茄果虫的抗性(Helicoverpa Zea.）和甜菜羊虫（Spodoptera exigua)[44］．vi型毛状体以浓缩油性物质的形式将挥发物储存在内部储存腔内，据推测，其中只有少量的挥发物通过(被动)扩散释放[45］．一旦破裂，例如通过触摸，昆虫就会吸收大量的这些精油，这些精油本身是有毒的，或产生有毒气体[46那47]. 在包括栽培番茄在内的番茄品种中，产生这些代谢物的生化（前体）途径相当保守。由于栽培番茄的叶片和茎表面也有VI型毛体，尽管只是在早期生活阶段，但IV型毛体，因此从野生番茄向栽培番茄转移毛体所携带的特殊代谢途径是可行的[19那24那48］．

虽然很明显，从自然资源获得基于代谢物的抗虫性状，但仍然是识别靶向害虫感兴趣的那些代谢物的挑战。产生的代谢物混合物中的复杂性使得难以鉴定观察到的表型的功能化合物（例如昆虫死亡率或逮捕的发展）。包括随机森林（RF）分类的机器学习方法已经出现为经常使用的尺寸减少方法（例如偏最小二乘回归）的强大和准确的替代品，以确定变量辨别（表型）类[49那50］．植物生物学中成功的RF应用的实例包括对马铃薯的干旱耐受性的代谢标志物的选择[51]玉米DNA甲基化模式的鉴定决定了基因的转录和翻译[52]. RF处理来自相对较少样本的大量“组学”数据的能力使得RF也成为从自然资源中鉴定抗虫代谢产物的一个有希望的工具。

在这里，我们探讨了在野生番茄种质中，对昆虫（即粉虱和蓟马）抗性的自然变异以及腺毛产生特殊代谢物的情况。为此，我们连续量化了昆虫的存活率、不同腺毛类型的密度、以及材料中酰基糖和毛传挥发物的产生。接下来，我们使用定制的RF算法来预测哪些酰基糖和挥发性分子与昆虫的生存表型相关。这就产生了一系列的代谢物，这些代谢物被预测与昆虫的特异性抗性或易感性有关。最后，将讨论生物学结果，以及RF分类模型对这类代谢物表型数据的使用。

番茄加入的差分昆虫反应

在无选择条件下，对不同番茄材料的粉虱存活率进行了测定。生存范围从零到零S. Pennellii.加入LA0716，至88%S秘鲁人LA1278(无花果。1一种）。此外，还有蓟马的表现（F西方的）使用蓟马幼虫在不同的存活测定中测定了相同的野生番茄;蓟马获取病毒的生命阶段。In this experimental setup, the larval survival on each accession was recorded for 15 days on leaf discs whereafter the median survival time (i.e. when 50% of the thrips larvae deceased) was estimated using the Kaplan-Meier method giving the most conclusive proxy for the phenotype (Additional file: Figure S1)．这导致了除粉虱生存的过程不同，中位生存率从1.5天开始S.哈布菊属LYC4到14天S. Huaylense.LA1364(无花果。1b） 是的。当生存参数相互作图时，这些差异进一步显现出来（图。1c） 是的。结果表明，尽管有些材料确实对两种昆虫都是有毒的环境（例如。S.哈布菊属LA1777)，并非所有人都是如此。例如，白蝇在LA0407和LA1278上有较高的存活率，而蓟马没有。PI127826对白蝇有抗性，但对蓟马的敏感性稍高。正如预期,S圣女果加入MoneyMaker（mm）和La4024对两种昆虫的基准敏感性。

所选基因型的毛表型

在假设通过毛状体产生的专用代谢物促进抗血敏表型，我们首先将每个加入的毛细管密度突出（图3中所示。2a，对于所有accessions查看其他文件：图S2)．测定了不同类型毛状体的叶毛密度:非腺毛(NG;包括毛状体II/III/V/VIII)，腺状体I/IV和腺状体VI(附加文件:图S3.). 比较了叶片背面和近轴面上的毛密度表明，尤其是I/IV型毛在叶片背面占优势。VI型毛状体在叶片近轴面和远轴面上的分布大致相同，除了LA2695、LA1578和LA1718在叶片近轴面上有更多的VI型毛状体。S. Pimpinellifolium.La1578是面板中最缕缕的大多数毛粒子是NG。

为了可视化腺体培养基密度和昆虫反应之间的关系，我们绘制了每种加入抗昆虫存活率的I / IV型和型 - VI培养基密度（图。2b, c)。通常在I / IV滴体的较高密度S. Pennellii.LA0716和S.哈布菊属LA1777, LYC4, PI127826和PI134418(附加文件:图S3.），似乎与较低的粉虱存活率相关（图。2b,上面板;R.² = 0.897,P.> 0.001)。相比之下，我们没有发现i /IV型密度与蓟马幼虫的存活率之间存在显著的线性关系(图。2C顶面板;R.² = 0.082,P.= 0.044)。此外，线性回归模型也没有显示vi型毛状体密度与白蝇和蓟马存活率之间的线性关系(图。2b、 c、下面板；P.> 0.05)。例如，每厘米大约有300个vi型毛状体²那S圣女果栽培品种MM和LA4024是最密集的vi型毛发来源(补充文件:图S3.）但显示出高昆虫存活率。对Ng毛状物的额外分析，所有毛滴毛瘤的组合，也没有产生密度与昆虫的生存率之间的显着关系（附加文件：图S3.)．

专门的代谢物组成

虽然腺毛可以包含其他特殊的代谢物，我们在这里集中在I/IV型和VI型腺毛中最丰富的分子：即分别是酰基糖和挥发性分子。通过洗叶获得酰基糖，并通过液相色谱-质谱（UHPLC-MS）进行分析。非靶向分析得到了19份番茄材料中76个酰基糖部分的列表，这些部分根据蔗糖（S）或葡萄糖（G）主链进行注释，然后是酰基链的数量加上分布在酰基链上的碳原子总数。反映了I/IV型毛密度，对粉虱抗性最强的材料含有大量酰基糖，但对蓟马抗性的材料不一定如此（附加文件：图S）4.A-C）。虽然大部分检测到的酰基曲杆菌由酰基组成，但没有迹象表明骨架的类型，即蔗糖或葡萄糖，与抗性水平相关。然而，粉虱抗性耐腐蚀剂的酰基朱砂渗出物主要由三酰臂（即G3和S3）组成，而较易感的腐蚀性，尽管在低水平，含有大多数Tetra和Penta-酰基糖（附加文件：图S4.d） 是的。分布在酰基链上的碳原子总数在抗性材料中主要在14到21之间，在感病植物中主要在21到25之间（附加文件：图S）4.e）。

为了可视化个体酰基臂，我们创造了一种热爱和基于其在粉虱存活中排名的不同载体中的丰富聚集了酰基春兆（图。3.一种）。形成出现的簇，群集1覆盖仅在少量抗性附加过程中发生的主要酰基釉料。在这个集群中，S. Pennellii.LA0716包含一个独特的酰基葡萄糖亚群和蔗糖，而两个S.哈布菊属含有另一种独特的子集，还包括混合糖骨架。簇2化合物，主要是三酰基蔗糖（S3），在抗体中超出了S.哈布菊属加入。在感病材料中，第3类群的酰基糖占优势，主要由四酰基蔗糖（S4）和四酰基葡萄糖（G4）组成。

除酰基糖外，还通过洗叶获得毛状体挥发物，并通过气相色谱-质谱（GC/MS-TOF）进行分析。我们总共检测到86种不同的挥发物，并通过将它们的质谱结合其Kovats保留指数（KI）与可用的文库进行比较，推断出它们的同一性（附加文件：表S）3.)．accive展示了一种多样化的挥发性型材，其中甲基酮，单萜，倍细胞萜烯和其他芳烃最丰富（附加文件：图。5.a).我们没有发现这些结构类中的一种主要存在于抗白蝇材料的挥发性谱中，尽管感病材料的挥发性谱主要包括单萜烯类(补充文件:图S5.a).将每个样本的所有离子丰度相加表明，白蝇和蓟马的存活率都不能用每次加入中检测到的总挥发物水平来解释(补充文件:图S5.b, c)。

绘制单个代谢物的结果是一个丰度分散的热图，显示了不同材料之间相当明显的挥发性特征(图。3.b).白蝇存活率高的材料中似乎包含了簇1和簇5中注释的挥发性代谢物，即以单萜和倍半萜为主，尽管在白蝇存活率低的材料中也发现了这些化合物。三个抗性最强的品种都有一组独特的代谢物。S. Pennellii.LA0716例如制备了一组不同的挥发性化合物，在簇3中注释，构成环状和无环（氧化）烃，而S.哈布菊属PI127826和LA1777分别显示一组不同的倍半萜，分别标注在簇2和簇4中。其他S.哈布菊属放入，LYC4，PI134418和LA1718，如群体2中所示制备甲基酮。

将特殊代谢物与粉虱抗性联系起来

为了预测哪些特定的个体代谢物可能与所观察到的抗性表型有关，我们采用了随机森林机器学习方法。RF模型需要一个二元分类作为输入变量，因此我们首先对白蝇和蓟马的生存数据拟合一个广义线性模型(GLM)，为每个昆虫代理创建两个表型分类(方法;附加文件:表S1)．因此，剩余的载体标记为“易感”（表1)．如图。4.，RF算法用于计算每个代谢物（“代谢物特征 - 重要性”）的重要性以重建GLM预定义的载体的表型分类（另见：方法）。我们首先在酰基臂上实现了acylum的模型和粉虱电阻分类。该模型的总精度得分为79％。我们选择申请严格P.-价值 （P.< 0.01)到模型得到两种特定的酰基糖，S3:15和S3:21(表2），与随机置换模型相比（附加文件：图S相比，被鉴定为代谢物具有明显更高的特征重要性6.a，b），表明他们对分离昆虫表型课程的重要性。绘制这两种化合物的丰度表明它们主要存在于归类为粉虱的耐腐蚀中。acylsugar s3：15发生S.哈布菊属材料PI127826、LYC4、PI134418、LA1718和acylsugar S3:21也存在于植物中S. Pennellii.LA0716(无花果。5.a，b）。一个易感性S.哈布菊属而LA0407似乎也同时产生S3:15和S3:21。

下一个将挥发物与白色抗性分类联系起来的RF模型的准确率为63%，并指出86种挥发物中只有一种是非常重要的特征(P.< 0.01;附加文件:图S6.c） 是的。重要的倍二萜，α-海拔（表2)在白蝇易感材料中普遍存在(图。5.c） 是的。

将特殊代谢物与蓟马抗性联系起来

如前所述，蓟马在不同基因型上的存活率与白蝇不同。因此，该材料再次被划分为两个明显的类群，即对蓟马的抗性或易感(表1)然后计算各个特征的重要性。thrips acylsugar RF模型的准确率相对较低，为58%，并且没有预测任何特征重要性显著偏离随机排列模型的acylsugar。基于挥发物数据的模型显示了85%的准确度，并产生了三个显著的挥发物峰，均为单萜，包括α-苯丙氨酸、α-萜烯和β-苯丙氨酸/D-柠檬烯（表1）2; 附加文件：图S7.和附加文件：图S8.)．单萜α-水芹烯和α-松油烯在蓟马敏感植物中均占优势(图1)。5.D-e）。其他挥发性峰，β-磷锡/ d-柠檬烯也发生在一些抗血液抵抗载体中（图。5.f） 是的。

野生西红柿可以产生特定的代谢化合物，从而改善对各种昆虫的抗性[24那25那54那55那56那57］．植物抗性通常是广泛使用的术语，首先在1951年被画家描绘[14]并且可以被描述为“一种最大限度地减少工厂所经历的损害的遗传性状”[15］．昆虫对一种植物的反应可以用多种方式记录下来，而测量方法的选择会极大地影响所得出的结论[15］．在这里，我们研究了粉虱和蓟马的短期抗生素反应，提供了直接构成防御的措施。这种电阻的水平和特异性在所选择的附加方案中变化很大（图。1)．我们的工作证实了植物对食草昆虫的抗性特性不能一概概括，而是由与昆虫结合的特定(生化)环境来定义[25那29那56］．实际上，这不仅对昆虫物种持有，而且对他们的寿命持有，而且取决于所选择的参数。发展，产卵，生存，排斥[15]. 考虑到这里观察到的抗性水平，这表明番茄材料含有针对成体粉虱和蓟马幼虫的特殊防御代谢产物。虽然对昆虫的特殊代谢物的作用方式并不总是完全了解，但对细胞水平的影响，包括呼吸作用、膜完整性、细胞运输和受体都有描述[21那58那59]. 通过选择生存试验，通过排斥或扭曲发育的替代防御机制不包括在这里。因此，野生番茄的代谢物，我们早些时候确定为驱避剂，即挥发性萜烯7-肾上腺素-姜黄素R.-从PI127826中提取的姜黄素，在这里不能被认为与生存有关，因为它们被证明是无毒的[24那60.］．此外，还有一些不是由毛状体产生的防御代谢物，以及可能参与昆虫生存的酶和角质层结构[61.那62.那63.］．然而，选择毛家生产的防御代谢物是有趣的，因为培育植物生产的特殊代谢物，作为应用合成农药的替代选择。番茄品种可以发育出不同类型的毛状体，包括绿色组织上的IV型和VI型毛状体，虽然毛状体可以储存大量(自)毒性代谢物，但它们几乎不存在于成熟的番茄果实上[64.]. 从野生种到栽培种的毛特异性的导入，特别是驱虫剂和有毒代谢物的结合，可能是提高抗性的一个可行的选择。毛状体所发现的代谢物混合物的复杂性常常使确定有效个体变得困难，因此我们的目标是制定一项策略，包括以前与抗性有关的代谢物类型（即酰基糖和挥发物）。

(腺)毛状体密度与对食草动物的影响之间的一般关系在番茄中得到了很好的描述[47那65.那66.那67.］．但这并不总是一个消极的关系。事实上，白蝇更喜欢在多毛的叶子上产卵，因为——尤其是非腺毛的——毛可以保护白蝇免受天敌(如拟寄生蜂)的伤害[68.那69.那70］．在这里，我们发现患者患者对其化学含量的昆虫对昆虫的影响出现，并且腺体毛细管密度不一定是可靠的电阻指示剂（图。2)．vi型毛状体密度与白蝇或蓟马的存活率无关，结果表明，这组番茄vi型毛状体相关抗性更多地取决于代谢物的性质，而不是剂量。事实上，昆虫可以对产生相对高量萜类化合物的植物有弹性(附加文件:图S5.). 然而，我们观察到I/IV型毛密度和成虫存活率之间存在明显的负相关（图。2）符合以前的研究结果[28那71.那72.]表明酰基糖对粉虱死亡率可能存在剂量依赖性影响。面板中的抗性番茄材料确实表现出更高的酰基糖水平（附加文件：图S）4.). 近年来研究表明，酰基糖分泌物对昆虫抗性的影响取决于糖主链的类型和酰基链的组成[28那29那59］．Leckie等人[36]的结论是，富含酰基蔗糖和3-甲基丁酸(iC5)的酰基糖渗出液对减少白蝇产卵最有效。我们还发现，大多数抗性材料主要积累三酰蔗糖(附加文件:图S4.). 该模型没有根据三酰蔗糖或蔗糖主链的总量显著区分抗性和感病材料（附加文件：图S）4.)而是预测了S3:15和S3:21对成虫存活的影响（表1）2)．两种化合物都在图中的簇2中。3.A、 主要由抗性材料产生的化合物组成。温室粉虱的研究(蒸发性三叉戟)抵抗Vosman等人[56]表明，着名的抗柴油番茄加入S加拉帕根塞LA1401还含有高水平的酰基蔗糖，其中S3:21的几种异构体非常丰富。尽管由于方法上的限制，我们无法确定确切的酰基糖构型，但我们可以推断酰基链的组成，因为这些化合物以前在番茄中已被阐明。Ghosh等人（2014年）报告说，LA1777中的S3:21异构体均包括iC5、2-甲基丁酸（aiC5）和9-甲基癸酸（iC11）链，因此S3:21（5,5,11）。S3:15发现于，S.哈布菊属确定La1718和La0407含有三个3-甲基丁酸酯基团，因此S3：15（5,5,5）[73.］．除了验证各种化合物外，是否实际上是IC5酰基链的酯化特别负责leckie等人所注意的抗性效应是有价值的。[36］．

另一方面，蓟马幼虫的存活似乎与所研究的番茄中存在的任何酰基糖无关。首先，存活率与I/IV型毛状体的密度没有白蛉的相关性（图。2c） 是的。其次，RF模型没有表明在这个小组中检测到的任何酰基糖参与分离抗蓟马和感蓟马。但是，基于S. Pennellii.（LA0716）梭菌材料，本Mahmoud等人。[37]和Leckie等人。[36]确实发现有迹象表明，酰糖剂量和脂肪酸组成都影响蓟马的产卵率。因此，酰基糖对蓟马的保护作用很大程度上取决于蓟马的发育阶段。我们在生物分析中使用了蓟马幼虫，它们可能不太可能接触到腺状头细胞，因此与体型更大、流动性更强的成虫相比，它们接受的酰基糖剂量更低。

尽管有证据表明特定的酰基糖或其结构特征在植物抗性中的重要性开始积累，但也有迹象表明酰基糖混合物具有协同效应。因此，酰基糖的特定组合比单个化合物的总和对昆虫的影响更大[36那37］．理想地，接下来，将进行验证实验和纯化的酰基臂S3：15（5,5,5）和S3：21（5,5,11）。但是，这种努力仍然具有挑战性。单酰臂的分离或合成是非常困难的，因为它们是复杂的分子，具有高分子相似性，通常存在于植物中不同的混合物中（图。3.) (74.]. 或者，从这里鉴定的一个抗性材料中创建分离群体，或者利用具有不同酰基糖谱的番茄导入系，如Leckie等人所做的[74.]，Smeda等人[75.和Ben-Mahmoud等人。[37]，可以帮助揭示特定代谢物(组合)与对不同类型害虫的影响之间的因果关系。

倍半萜α-胡麻烯是唯一能区分白蝇抗性和敏感品种的挥发性化合物。这种化合物存在于易感系中，以前曾报道可能作为宿主吸引线索[76.那77.]，此处未测试响应。所观察到的效应似乎是化合物特异性的，尽管在RF建模后，由于总挥发物量（基于峰面积）或结构代谢组没有区分抗性材料和敏感材料（附加文件：图S）5.)．该模型预测了3个单萜峰:α-水芹烯、α-水芹烯和β-水芹烯/ d -柠檬烯。这些化合物在易感品种中特别普遍，并不影响蓟马的生存。然而，茉莉酸信号通路的激活S圣女果品种中单萜的丰度增加，导致成年蓟马的偏好反应降低[78.］．因此，虽然我们的研究结果表明这些单萜对蓟马幼虫没有毒性作用，但它们可能对成虫有驱避作用。也在这里短期性能分析是在天真的植物,不具备早期损伤,关注本构和直接防御,但蓟马和粉虱感染已被证明按照他们喂养诱导特定的化学防御风格,甚至可以操纵主机响应在邻近的植物79.那80]，突出了这种动态特征的复杂性。

不同材料对蓟马的抗性差异显著（图1）。1B附加文件：图S2）这可能涉及培养的互相依赖性代谢产物，例如（Glyco）生物碱，最近建议蓟皮喂养行为[81.］．或者，这里测量的挥发性代谢物可能也涉及其中，但由于数据集的稀疏性，没有被选中。这一结论得到了一个观察结果的支持，即相对较大的一部分代谢物仅在一次登录中被检测到(图。3.). 在这里使用的一组番茄的代谢多样性使得统计分析具有挑战性，特别是因为具有重叠代谢产物的抗性材料的数量很少，特别是在挥发物的情况下。如上所述，这可能意味着，尽管具有生物活性，但一种独特出现的代谢物并非仅由于缺乏统计能力而被选中。例如，我们最近确定了-肾上腺素-姜烯衍生物9-羟基-10,11-环氧基姜烯（9H10epoZ）对粉虱有毒害作用[60.］．该化合物是通过，具体的，S.哈布菊属PI127826(无花果。3.b)，因此可能没有标记为显著的鉴别RF模型。另一个例子是santanoic acid，就像之前提到的，是有毒的H. Zea.和S. exigua.幼虫[44也可能对其他昆虫产生影响[82.］．我们的模型也没有选择这种代谢物，因为它被完全检测到S.哈布菊属加入la1777。这些示例表明，当代谢多样性宽度宽度的重叠宽度宽度太少时，这些示例表示模型的局限性。因此，使用更密切相关的趋化型（例如，展示相同物种的分离群体或探索）因此是RF分析的理想选择。

然而，这里选择的RF方法导致了从番茄腺毛中的酰基糖和挥发物的复杂混合物中选择特殊的代谢物，这些代谢物可以区分抗性基因型和敏感基因型。基于回归的分类方法，如PLS-DA，广泛应用于代谢组学，特别是植物-昆虫相互作用的研究[83.那84.那85.那86.，不能在这里应用，原因是稀疏性，或零值元素，以及高特征样本比[87.那88.］．甚至稀疏PLS-DA [89.]导致模型收敛性受损。RF方法被认为是一种强大的分类方法，特别是在稀疏数据的情况下[50那90]和在多元组学分析中常见的样本特征比低[91］．此外，RF结果对允许的数据集的比较允许统计辨别单个代谢物的重要性。尽管它许可只有少数几种使用RF用于植物科学中的代谢物选择的例子，包括马铃薯 - 块茎变色的代谢物选择[92]，初级代谢的指纹图谱拟南芥突变体[93和由球果释放的与性有关的挥发物热带榕属植物物种(94］．在这里，我们占据了RF可以从挑战数据集预测具有防御潜力的特定代谢物，使其在未来鉴定具有植物中经常发现的复杂混合物的潜在生物学意义的专业代谢产物的有希望的工具。

基于代谢产物的抗性育种具有挑战性，需要导入一些野生物种的qtl以获得有效浓度的草食动物特异性代谢产物。番茄抗虫性研究的进展是通过创造育种前材料，即含有代谢物QTLs的导入系，这些代谢物QTLs可结合用于抗虫性，特别是对酰基糖的抗虫性[28那30.那36那37那74.那95］．这里提出的方法可以作为补充。预测特定的生物活性化合物会导致预期的表型，从而可以更有针对性地阐明代谢物组成背后的遗传成分，并更有效地将昆虫抗性纳入育种材料[31那96那97那98］．对于农业而言，食草昆虫造成的损失很大程度上可归因于它们携带的病毒。因此，对病媒昆虫的治疗也会影响它们携带的病原体。我们预测会对白蝇存活产生负面影响的两种候选酰基糖预计会进一步减少病毒通过这种载体的有效传播[30.］．

虽然有许多关于精油和植物提取物的杀虫特性的报道，但关于个别生物活性化合物的信息有限[99］．在这里，我们看到，在代谢物型材中变化的各种含量可以对不同的载体昆虫产生不同的影响，并且我们提出了一组专门的代谢物，其潜力充当天然杀虫剂。在该材料中，分析了两种特异性酰基普罗尔斯似乎对粉虱的化学防御有可能，然而不适用于蓟马幼虫。代谢物的育种育种造成挑战，需要清楚地定义所需的特征和多个QTL的掺入。通过使用RF，我们能够将特定的专用代谢物与复杂的混合物分配给不同的表型特征。可以使用在代谢型材中显示更多重叠的载体进一步改进模型，例如在更紧密相关的物种或具有不同电阻谱的分离群体中。

植物和昆虫材料

番茄酱的小组旨在在专业 - 代谢物型材中多样化，抗虫性抗对比。基于以前的SNP注释[One hundred.并结合种子有效性，从10个不同番茄品种中选择了19份材料。属于该种的亲本数量相对较多Solanum Habrochaites.（以前称为S. typicum f。Glabratum.或S. typicum f。Hirsutum.)，因为这些都是众所周知的抗草食性和专门的代谢物生产[22那23那24那27那54那73.那101那102那103那104那105那106］．根据植物材料的适当指导方针和许可证，从恩克惠森恩扎登获得番茄材料。这些植物生长在封闭的温室室内，在控制条件下(22-25°C, 16/8小时光/暗条件)。实验中使用的所有叶片材料都来自于发育阶段和植株年龄相似的小叶。除非另有说明，从整个植物的顶端第四个完全展开的叶子的第一对小叶被使用。对于每个实验(即白蝇生物测定、蓟马生物测定、毛状体密度、酰糖测定、挥发性测定)，从种子中生长出单独一批植物，并随机分布在同一温室室内。

这B烟粉虱种群(MEAM1)在气候箱中饲养(Snijders, Tilburg;16/8 h光明/黑暗;150μm E⁻²年代⁻¹在28°C）在新鲜黄瓜植物上。西方花蓟马（F西方的）人口被饲养在补充的林纳豆上香蒲latifolia在eco2box塑料容器（Duchefa Biochemie，Haarlem，荷兰）的花粉，位于气候柜（16/8 H光/黑色;150μE⁻²年代⁻¹在24-20°C)。

昆虫生物测定和统计

对特定昆虫量身定制的生物测定以提供最可靠的读出。对粉虱的19种不同番茄酱的抵抗力（B烟粉虱；MEAM1)的测定采用无选择生物测定法，以获得白蝇的平均存活率。在封闭的温室隔间(22-25°C;16/8 h光明/黑暗)。除PI127826 (N= 5)和MM (N = 8） 用于监视块和位置效果。每株植物有两个夹笼（2.5） cm，Bioquip，cat#1458）放在从顶端开始的第四片完全展开的叶子上。笼子里装满了水~ 用体视显微镜（Euromex StereoBlue Zoom SB.1902）记录15只成年粉虱和5天后每个夹笼中死粉虱和活粉虱的数量。在计算加入的平均存活率和标准误差之前，首先在两个夹笼中平均白粉虱存活率（%），以获得每株的平均存活率。为了创建两个表型组作为RF建模的输入，使用GLM.和glR包的功能LME4.[107那108]以“加入”为固定效应的变量及其应用S圣女果作为一个敏感的标准，作为拦截。白蝇存活数据来自S. Pennellii.La0716被排除在此分析之外;随着存活率为0％，无法计算系数。统计上显着的加入（P. < 0.05）系数被标记为“抗性”，其他系数被标记为“敏感”。

由于蓟马在这个生命阶段成为病毒载体，因此我们测定了蓟马幼虫的表现，从而确定了中位生存时间作为生存参数。为此，将直径15毫米的叶盘放置在12孔板(grener -bio one #665102)上，并在直径20毫米的滤纸(Whatman #28413904)上加入100 μl自来水，以保持叶盘的水分。每孔(24 ~ 36孔每次加入)，一个同步种群的蓟马幼虫(L1阶段)放置在叶盘的叶片正面。盘子被封闭，用胶带密封，然后放回气候柜，然后每天记录每个人的生存状态，1(死亡)或0(活着)，持续19天。Kaplan-Meier生存曲线(附加文件:图S1）在r [108]使用苏克福特函数(109]以及ggsurvplo.t函数survminer公司软件包版本0.4.0[110］．Cox比例风险模型，如Macel等人以前使用的[111，是用科克斯系统的功能生存[109]包与加入作为解释变量(附加文件:表S2)．对于每个番茄加入，拟合的Cox比例危险回归模型估计蓟马L1幼虫在暴露于叶片时死亡的概率系数，与基线相比（易感标准S圣女果很会赚钱的人)。例如,S.哈布菊属LYC4的指数系数为215，意味着死于LYC4叶片上的几率是MM的215倍。P.< 0.01)高于1的为“抗性”，高于1的为“敏感”。

毛状体密度和显微镜图像

每种探险小叶从3到5个单独的植物中取出，从中采用四个叶片（Ø4mm）;使用两种叶片圆盘来计算在轴向侧和两个用于相对侧的胎儿。对于所有，使用立体显微镜（Euromex Stereoblue Zoom SB.1902）计算II / III / V / VIII（“非腺体”），腺型I / IV和VI型。I型和IV型作为一组，因为两种类型有关并且在腺体中含有类似的酰基熊组合物。而且，虽然我应该具有比IV型更高的秆[112这一标准不可能区分不同的野生品种。在没有显著叶盘效应的情况下(P. > 0.05), trichome density (trichomes/mm²)在单个传单的两个叶盘上取平均值（在附加文件中绘制：图S）3.），此后计算每个加入的平均毛细血管密度。由于昆虫生物测定的设置允许粉虱在宣传叶的两侧之间自由移动，在胎儿和曲线表面上平均毛状体密度，以分析滴毛瘤密度对粉虱存活的影响（图。2B附加文件：图S3.c） 是的。仅限蓟马幼虫仅在对性表面上仅存在，因此将存活率与仅相对异的表面的毛细管密度进行比较（图。2C附加文件：图S3.d） 是的。用简单的线性模型对R地区的毛密度和昆虫存活率进行了线性建模LM.功能。

使用连接到尼康DS-Fi2数码相机的Leica Mzfliii立体化器官获得野生和培养的番茄粒状的图片。将组织置于显微镜下，在明亮的光线下以〜10nm的层拍摄照片。使用Adobe Photoshop中的层堆叠（CC 2019，Adobe Systems）堆叠层（20至60张照片）堆叠成单个图像。

代谢分析

代谢物提取

本研究从一张小叶(N = 3–4), that was weighed and briefly (~ 5 s) immerged in 500 μLN-添加0.5%的己烷 ng/μL乙酸苄酯作为内标物。短提取时间有助于避免提取额外的角质层成分，这是随后监测。下一个，10 镁钠₂所以_4.（S）加入到提取物中以除去水，并将样品涡旋〜10秒。然后将萃取物在13.9k rcf下离心5分钟，然后除去己烷层并储存在n下的玻璃瓶中₂（g） 在− 20 分析前°C。对于酰基糖提取物，两张传单(N= 6)，称重，浸于2ml二氯甲烷中，轻轻摇晃30 s。提取液风干过夜，−20℃保存，300 μL甲醇溶解分析。

数据采集与识别

使用安捷伦7890A气相色谱仪和7200精密飞行时间质谱仪进行挥发性分析。注入1μL提取物，立即加热至275 °C并在HP-5上分离 ms柱（30 M × 250 μm；0.25 μm膜厚；安捷伦）使用氦气作为载气（7.0699 磅/平方英寸；流量：1 毫升/分钟）。把柱子加热3分钟 40分钟 °C之后，温度升高了5 °C/min至140 °C，然后10 °C/min至250 °C，保持5分钟 样品在70℃下电离 真空下的电动汽车。溶剂延迟4.1后 分钟，以每秒50次扫描的速度检测到30–350μm范围内的离子。峰值检测采用MassHunter定性分析软件包（Agilent）。色谱反褶积后，用50%的浓度提取峰 与色谱图中的最高峰相比，最小离子计数为1%且S/N比为1%时的ppm准确度 > 10.代谢物鉴定通过质谱与NIST-和Adams（2007）库进行比较[113那114]与科瓦特留用指数(KI)相结合。[115]，通过运行C8-C20烷烃标准(Sigma Aldrich #04070-5ML)校准。当可用时，用分析标准来验证鉴别，文库中可信度低的峰值被标记为“未知”(附加文件:表S3.)．由于β-水芹烯和d -柠檬烯的共洗脱作用强，不能被分离，被视为一个峰。代谢物峰通过其基峰离子进行整合，峰面积通过内标和样品稀释进行校正，并通过鲜叶重量进行归一化。

使用安捷伦1290 Infinity II UHPLC和安捷伦6230 TOF质谱仪对酰基糖提取物进行分析。注入1μL提取物，并在Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱上以50℃分离 °C，流动相流速为0.3 mL/min。流动相为水+ 0.1%甲酸（A）和乙腈+ 0.1%甲酸（B）在以下A:B梯度中；从6点40分到45点55分 8分钟到10:90 3分钟内到60:40 分子在325度电离 正模式下的eV和离子的检测范围为50–1500μm，频率为1光谱/秒。利用MassHunter定量分析软件（Agilent）通过计算组成色谱峰的母体离子的分子式来鉴定酰基糖。在这里，分子式受到限制，允许碳、氢和氧原子与氢结合重建母体离子⁺，na⁺和K⁺和甲酸加合物，加上双键当量（DBE）范围为1-10。生成的分子式，结合DBE，可以推断酰基糖分子结构；主链部分、酯化酰基链的数目和构成酰基链的碳原子总数。结构异构体用连字符和数字标记。

随机森林

作为RF分类算法的输入，在不同的生物重复中取样本的代谢物水平平均值，并从回归分析中提取样本的分类(即“抗性”或“易感”)。每个RF模型都采用六倍交叉验证方案，使用1000棵决策树建立训练和测试集，得出每个代谢物的特征重要性。模型运行5次，随机初始化参数产生每个代谢物的平均特征重要性和标准差(图。4.接下来，将每个代谢物的平均特征重要度分布与随机置换数据集的100个、250个和500个RF模型的特征重要度分布进行比较，评估其显著性(图1)。4.，步骤2）。当计算出的平均特征重要性高于100个排列RF模型中95%时，代谢物被认为对表型分类有显著贡献(P.< 0.01;如图。4.，步骤3）。使用Python机器学习库进行建模scikit-learn执行 [116]在Python数据结构中[117］．完整的脚本可以作为jupiter笔记本在GitHub存储库(http://www.github.com/BleekerLab)．

上述方法和植物材料符合相关的机构、国家和国际准则和立法。

本研究中产生的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。我们通过一个链接的GitHub存储库(https://github.com/bleekerlab/natural-izsecticides-Thrips-Whiteflies.）在Zenodo档案馆（https://zenodo.org/)．

DBE:

双债券当量

气相:

气相色谱分析-质谱法

ki：

Kovats保留指数

毫米：

很会赚钱的

ng：

非腺体

请：

部分最小二乘

PLS-DA：

偏最小二乘判别分析

飞行时间：

四极飞行时间

射频:

随机森林

UHPLC:

超高效液相色谱法

IC5：

3-methyl-butanoate

AIC5：

2-甲基丁酸甲酯

IC11：

9-甲基 - 癸酸酯

我们感谢Laura Riedijk在蓟马表型分析方面的帮助，以及Sanne Ypenburg和Michelle van der Gragt在毛发计数方面的帮助。Jurre Bleeker对acylsugar测量结果表示认可，Johan Westerhuis和Yipeng Song对数据和统计分析的投入表示认可。

这项工作得到了MG的MARIE-CURIE个人团契（拨款号655656，DURETO）的支持，涵盖了博士后研究人员的全日制薪资，并由荷兰语科学组织的NWO Vidi-Grant（NWO; GRANT编号12988）通过PB获得，涵盖所有项目成本和RK和AM的工资。资助机构没有参与研究的设计，也没有收集，分析和解释稿件的稿件或写作。

作者笔记

1. Ruy W. J. Kortbeek和Marc Galland分享第一作者

从属关系

1. 阿姆斯特丹大学斯瓦米丹生命科学研究所绿色生命科学研究集群，荷兰阿姆斯特丹1098 XH

   Ruy W. J. Kortbeek, Marc D. Galland, Aleksandra Muras, Maurice Heilijgers, Michel A. Haring, Robert C. Schuurink & Petra M. Bleeker

2. 阿姆斯特丹大学生命科学研究所数据分析组，荷兰阿姆斯特丹1098 XH

   弗兰斯M。范德克洛埃

3. Enza Zaden Research＆Development B.V，Haling 1E，1602 DB，荷兰恩牛恩

   BARTAndré.

4. Radboud大学医学中心，细菌基因组组，Geert Grooteplein Zuid 26-28, 6525 GA, Nijmegen，荷兰

   萨沙·a·f·t·范·希尤姆

贡献

PB，RK构思了这项研究;rk和pb写了稿件。rk，mg，am，ba进行了实验;MH提供照片和PB，MG和RK在图2中提取图像。4.．MG进行统计分析，Mg，SH和FK进行随机林模拟;RS和MH修订了手稿。所有作者讨论了结果并对稿件评论，并批准了其潜在出版物的提交。

通讯作者

对应到Petra M. Bleeker.．

道德认可和参与同意

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意事项

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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