TEAAS：茶叶植物中替代拼接的综合数据库（茶树）

替代剪接（AS）通过选择不同的剪接位点来增加转录物和蛋白质的分集，并在植物的生长，发育和应力耐受性中起重要作用。随着茶叶厂的参考基因组（茶树)和转录组测序技术的发展，研究人员报道了AS在茶树中的存在。然而，目前还缺乏一个以不同RNA-seq数据集为中心的平台来提供关于AS的全面信息。

为方便查阅有关AS信息，揭示AS在茶树中的分子功能，我们建立了第一个综合性的茶树AS数据库(TeaAS，http://www.teaas.cn/index.php). 在这项研究中，从66个不同的RNA-seq数据集中收集了3.96个Tb的读数来确定AS事件。TeaAS支持基于基因ID、基因名称、注释（非冗余/京都基因和基因组百科全书/基因本体注释或染色体定位）和RNA-seq数据的AS信息的四种检索方法。它整合了66个RNA-seq数据集中与基因组注释、AS事件类型、转录序列和异构体表达水平有关的数据。通过这个在线数据库，可以清楚地识别由不同环境条件引起的AS事件和发生在不同组织类型中的AS事件，以及特定转录物的表达水平。此外，它还提供了两个有用的工具，基本的局部比对搜索工具和通用基因组浏览器，用于序列比对和基因结构的可视化。

TeaAS数据库的特点为研究人员提供了一个综合的AS生物信息平台，为研究木本作物AS事件提供了参考。这也有助于揭示AS在茶树基因调控中的新的生物学功能。

选择性剪接(Alternative splicing, AS)是指通过可变剪接位点的选择，从同一基因产生多个mrna的前mrna加工事件。它是调节基因表达和增加蛋白质多样性的重要方式[1］．AS可分为4种主要类型:内含子保留(IR)、选择性3’剪接位点(A3SS)、选择性5’剪接位点(A5SS)和外显子跳过(ES)。AS被发现参与了许多植物细胞类型的生长发育、代谢，并调节对生物和非生物胁迫的反应[2，3.，4]. 例如，开花位点M(FLM)拟南芥开花受温度的影响[5］．此外，MYB转录因子AS中的基因影响了番茄果实中花青素的生物合成，剪接位点的突变导致野生型蛋白功能完全丧失[6]. 此外，LlHSFA3B-III的AS亚型LlHSFA3B(热胁迫转录因子)，也被发现调节百合植物的非生物热胁迫[7］．在茶树中，对不同组织的as相关分析表明，as可以通过某些转录因子和功能基因调控类黄酮通路[8]. 植物对冷胁迫的反应是通过AS来调节糖代谢途径和抗氧化酶基因的表达[9］．此外，AS的异构体CsLOX公司基因由茶几喂养生成病原真菌感染。因此，AS在植物生长发育和逆境响应中发挥着重要作用。AS数据库已经在许多其他作物上建立，如黄瓜[10］．此外，建立了植物群落数据库，包括棉花[11,番茄12，水果植物[13、二穗短柄草[14]和其他作物。这些数据库的建立丰富了对基因职能的知识，并促进获得与相关信息有关;但是，到达日期，没有茶叶植物的全面数据库（茶树)．

茶树是一种重要的多年生常绿木本作物，具有重要的经济和文化意义[15]. 茶叶用于制作茶饮料，茶饮料是世界上最受欢迎的三种非酒精饮料之一。它不仅含有多酚、儿茶素、咖啡因和其他香味成分，而且还具有促进健康的功效[16，17]. 为了促进茶树的研究，已经建立了一些数据库[18，19，20.]但是，这些不包括与AS相关的信息。

随着茶树参考基因组的释放[21，22，23]，研究者在功能基因及其调控机制的理解上取得了很大的进展，这也为AS的鉴定提供了基础。转录组测序已成为研究基因生物学功能的重要途径。最近，在许多植物中已经分析了不同环境条件下的转录组[24，25］．在茶树中，转录组测序已被用于了解对低温、盐、干旱和热胁迫响应的基因的表达[9，26，27]同时也揭示了自交不亲和、次生代谢和发育的机制[28，29，30.］．这些研究富集了对茶叶植物中基因的生物学功能的理解，但它们仅关注来自每个基因的单一成绩单，并且没有研究作为事件产生的多个转录物的功能。因此，如在茶叶植物中这些生物过程中的作用尚不清楚。将RNA序列（通过RNA-SEQ获得）映射到参考基因组并组装基因组是识别作为事件的重要步骤，这促进了对生物功能的理解。因此，本研究的目的是建立一个全面的茶叶植物，茶叶数据库，为研究人员提供公共和自由用作数据库。

数据源

茶树的基因组(茶树var。中华简历。)作为参考基因组[21]. 目前发布的茶树基因组和基因组注释是从TPIA平台收集的(http://tpia.teaplant.org/)．从SRA数据库下载了与不同环境条件或组织类型相关的六十六个RNA-SEQ数据集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)．所有RNA-SEQ数据的细节都提供在附加文件中1S1:表。

数据处理

SRA工具包用于从NCBI序列读取存档（SRA）数据库下载RNA-seq数据。所有原始测序数据均通过Trimomatic（v0.36）软件以相同标准过滤[31.］．使用最小适配器长度为8的ILLUMINACLIP参数删除了适配器序列。此外，经过过滤后的连续5 bp碱基平均质量低于20，长度低于36 bp的reads被过滤掉。其余的配对数据用于后续分析。

使用具有默认参数的Hisat2（v2.1.0）将过滤的RNA-SEQ读取映射到参考基因组。生成的序列对齐映射映射（SAM）文件由SAMTools软件转换为BAM文件。然后使用Stringtie软件（v.1.3.5）组装成绩单，其中默认设置[32.]. 最后，使用StringTie with“-merge”参数合并来自同一转录组中每个样本的基因转移格式（GTF）文件。

AS事件的标识

在线工具AStalavista (http://astalavista.sammeth.net/）被用来识别来自不同转录组数据集的事件[33.］．简单地说，合并后的GTF文件通过选择其他生物体提交到网站，其他选项使用默认值。从输出文件中提取出IR、A3SS、A5SS、ES等四种主要AS事件类型，并分别对单个转录上发生的多个拼接事件进行计数。应用rMATS (v.4.1.1, rnaseq-mats.sourceforge.net/)软件分析AS基因的剪切位点reads数和差异表达[34.］．

每百万读数（TPM）的转录物用于量化转录表达水平。使用stringtie计算来自每个样本的TPM。然后，提取基因ID，转录物ID及其TPM以形成所有转录表达水平的数据集。为了避免对结果的准确性的弱表达转录物的影响，我们在所有样品中滤除了TPM的转录物。仅当具有至少两个MRNA的MRNA具有至少两个样品的TPM而被认为是经历的基因，并且这些转录物的TPM大于至少一个样品中的TPM。

转录本的功能注释

使用Stringtie生成的GTF文件提取全长转录物和AS亚型的所有氨基酸和核苷酸序列。使用NR、GO和KEGG注释数据库将所有转录本与参考基因组的注释进行比较。利用TransDecoder软件对新产生的转录本进行编码区和氨基酸序列预测(https://github.com/TransDecoder/TransDecoder，第5.5.0版）。使用“–single\u best\u Only”参数和UniProt数据库的同源性搜索，每个转录本只有一个编码序列（CDS）。为了防止产生无义密码子或短肽，我们使用任何大于或等于100aa的氨基酸进行进一步分析。利用Pfamscan软件对所有氨基酸的结构域信息进行了鉴定(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Pfam/Tools/)．

采用多步骤流程构建TeaAS数据库(图1)。1)．TeaAS web界面提供了四个主要功能部分，包括首页(搜索)、摘要、工具和下载，以提供关于AS的信息。此外，链接部分为用户提供到基因组和其他茶种数据库的链接，用户可以通过“联系我们”部分提供反馈。

通用函数

主页包含搜索界面(图。2)．用户可以通过基因ID(如:CSS0013065.1)、基因名称(如:bZIP转录因子)、基因注释[非冗余(NR)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因本体(GO)注释、染色体定位]和RNA-seq数据集(如:干旱胁迫)检索数据库。搜索结果以两种方式显示在结果页面上。首先，如果用户对上述所有注释和不同的环境条件进行搜索，就会得到一份基因及其相关信息的列表(图1)。3.a).可以双击列表中的每个基因，以确定发生AS事件的环境条件。选择一个基因和治疗后，可以看到AS事件的转录本和蛋白产物。其次，当用户使用基因id和基因家族进行搜索时，呈现环境条件和遗传信息(图1)。3.b).点击一个环境条件，可以查看AS事件的详细信息。

数据库概述

数据和统计信息可以在摘要页(附加文件2：图S1）。本页提供：（I）转录组信息，包括转录组简介、NCBI登记号、每个治疗样本的信息以及相应的出版物(二） AS事件的四种主要类型和AS基因数量的统计（附加文件3.:表S2);(III) AS基因占所有注释基因的百分比;(四)AS基因在15条染色体上的分布;(五)所有AS基因的注释信息;和(VI)在处理之间的剪接百分比(PSI)和在剪接位置读取的数量(附加文件4:表S3)。

结果表明，在PRJNA576575转录组的11320个基因中共鉴定出131924个AS事件，而在自交不亲和性转录组（PRJNA355226）中仅鉴定出9152个AS事件。这可能是由于茶树处理条件和测序数据大小的不同。共有28648个基因发生AS，占注释基因总数（50525）的56.7%。此外，在所有的转录组数据集中，只有0.56%的发生AS的基因是共同的。

其他功能

TeaAS主要为用户提供两种有效工具:基本局部对齐搜索工具(BLAST) [35.]和通用基因组浏览器(GBrowse)。BLAST技术可用于发现茶树的同源序列。用户可以将查询序列与66个转录组数据集中组装好的任何一个转录本进行比较。然后可以对结果进行AS事件发生的分析。利用GBrowse对66个转录组数据集的基因结构进行可视化分析。

下载页面允许用户免费下载所有数据。从这个页面可以下载来自66个转录组数据集的已组装的GTF文件（作为事件识别文件）和所有转录表达文件。而且，搜索结果也可以直接下载。此外，TeaAS还提供了到茶树基因组网站和链接页上其他茶树数据库的链接。

使用情况

案例研究1，搜索一个基因中的AS事件:用户可以直接使用基因名称和基因ID来搜索该基因是否能够发生AS。同时，用户也可以通过BLAST工具提交序列来确认基因ID。例如，搜索ID为CSS0005154.1的结果是，该基因编码一个NAC转录因子，并在多种处理条件下经历AS事件，如盐胁迫、蔗糖暴露和冷驯化。此外，用户还可以识别接受AS特殊治疗的基因。例如，许多抗病基因和转录因子在灰叶枯病的条件下发生AS。

案例研究2，获取与AS基因相关的细节：例如，基于基因ID css001081.1的检索产生WRKY基因，该基因位于染色体14上，编码转录因子，没有GO和KEGG注释。此外，在不同的组织类型和遮荫处理下，也可以确定AS事件发生的条件，例如炭疽病。点击“不同组织2”后，我们确定该基因经历AS并产生两个转录本，CSS0011081.1和MSTRG.14319.1（图。4a).这两个转录本的结构如图所示。4b，其中AS亚型的第二个外显子缺失。从序列选项中可以直接查看转录本的RNA序列、编码序列(CDS)和氨基酸序列(图5)。4c).通过表达量数据，发现这两个转录本在花中表达量最高(图。4d). AS亚型中虽然缺少30bp的核酸序列，但该序列在WRKY结构域中不存在(图。4e)。

AS是一种基因调控机制，在植物生长发育以及对生物和非生物胁迫的响应中发挥着重要作用[1，2，36.］．在茶树中，AS与代谢相关的基因表达有关[37.]，对低温的响应[9和干旱胁迫[38.］．然而，研究人员缺乏关于茶树中AS的资料。在本研究中，我们首次建立了一个综合性的茶树AS数据库。本数据库包含的数据集可以作为as的参考，丰富的转录组数据可以提供基因功能的基本信息。

AS数据库在其他植物中也有报道。例如，黄瓜的AS数据库CuAS提供了关于AS事件和转录本的详细信息[10］．这个数据库提供了关于AS亚型序列、域和表达水平的信息。此外，在CuAS中发现了大量的组织特异性AS事件。然而，仅将2种黄瓜的17个不同组织的测序数据纳入该数据库，这远远不能充分了解黄瓜植株的AS。在番茄中建立另一个AS数据库[12]，其中使用300,665个表达序列标签序列和27个转录组数据集进行AS鉴定。与黄瓜数据库相比，番茄数据库代表了多种组织类型，但它只提供了一个搜索页面，AS信息有限。为了丰富本研究建立的数据库的内容，我们收集了不同环境条件下获得的66个转录组数据集，总计3.96 Tb测序reads，使茶树AS的鉴定更加准确和全面。此外，我们的网站上提供了更多关于全长转录本和AS亚型的信息，并提供了有用的分析工具。因此，茶叶as可作为茶树as的参考。随着一株优质茶树基因组序列的公布，茶树信息档案(TPIA)应运而生[18]中包含了茶树基因组、转录组和代谢组的信息。它为分析茶树基因组数据和阐明茶树生长发育的生物学机制提供了有力的工具。简单重复序列(SSR)标记数据库[19]和共表达网络[20.]为茶树功能基因的研究和育种提供了基础。然而，与AS相关的数据库尚未报道。TeaAS的建立为研究茶树AS基因调控提供了重要工具。

TeaAS通过将RNA-seq数据映射到参考基因组来提供关于AS的全面信息。近年来，随着测序技术的发展，大量转录组数据被测序。例如，转录组测序显示，一些参与糖代谢、脯氨酸代谢、诱导CBF (C-repeat binding factor, C-repeat binding factor)表达和冷响应(ICE-CBF - COR)通路的基因在茶树冷驯化过程中发挥关键作用[39.]. 利用同样的数据进行AS分析，研究人员发现AS也可能影响糖代谢途径。此外，AS可能通过氧化还原酶和转录因子（如bHLH、WRKY）对低温作出反应[9]. 除此之外，已经有一些关于鉴定茶树花青素合成相关基因的报道[40，41.］．事实上，花青素的合成不仅受到全长转录本的调控，而且还受到像花青素还原酶(ANR)和花青素合成酶(ANS)等基因的AS亚型的调控[37.］．这些结果表明，AS在调节茶树的代谢和胁迫反应中起着重要的作用。为了方便AS信息的获取，TeaAS为研究者提供了一个简单的搜索界面。

总之，TeaAS是一个提供茶树全长转录物及其AS亚型的综合信息的平台。TeaAS的建立为AS的研究提供了参考，通过对茶树中AS的比较分析，有助于AS在基因调控中的潜在作用。

茶树(Camellia sinensis var. sinensis cv.)基因组数据。)可于TPIA平台(http://tpia.teaplant.org/download.html)．支持本文结果的RNA-seq数据集可在NCBI的SRA数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，所有有关的注册编号及详情均载于TeaAS (http://www.teaas.cn/static/html/browse.html.)．

TeaAS公司：

茶树选择性剪接数据库

为:

选择性剪接

红外光谱:

基因内区保留

A3SS:

可选的3'剪接位点

投产:

可选的5'剪接位点

锿：

外显子跳跃

TPM：

每百万次读取的抄本数

NR:

冗余蛋白质

走:

基因本体论

小桶：

京都基因和基因组百科全书

CD：

编码序列

不适用。

这项工作得到了国家自然科学基金(U20A2045),中国国家重点研发项目(2019 yfd1001601),安徽省科技重大项目(202003 a06020021)和引进人才的基地茶树生物学和化学质量(D20026),国家重点实验室开放基金项目(SKLTOF20150103);国家自然科学基金项目(31800585)。

作者笔记

1. 米小增和岳怡对这一工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. 安徽农业大学茶树生物利用研究国家重点实验室，安徽合肥长江西路130号，中华人民共和国230036

   米晓增、唐梦莎、安彦林、谢辉、乔大河、刘圣瑞、魏朝玲

2. 安徽农业大学信息与计算机学院，安徽省合肥市长江路西130号，230036

   岳毅，马志宇

贡献

CLW设计了这个项目。XZM、YY、MST、YLA、HX、DHQ、ZYM和SRL收集并分析转录组测序数据。XZM、YY、ZYM负责web界面的设计和服务器的维护。XZM编写了这篇文章。所有作者已阅读并批准最终稿件。

相应的作者

通信Chaoling魏．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有利益冲突。

出版商的注意事项

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