DELLA基因家族与胁迫耐受性相关的全基因组分析和功能表征B那不勒斯

背景

甘蓝型油菜是石油和牲畜饲料的重要作物。最终，由于人为气候变化，这种作物的经济利益是最多的风险。Della蛋白构成植物生长的显着阻遏物，以促进在恒定胁迫条件下存活。Della蛋白缺乏DNA结合结构域，但可以与不同荷尔蒙家族的各种转录因子或转录调节剂相互作用。已经取得了重大进展拟南芥和谷类植物。然而，目前还没有关于DELLA蛋白在油菜籽中的研究。

结果

在我们的研究中，我们已经确定了10巴纳德拉基因。全部巴纳德拉基因与五个密切相关阿特德拉基因，表明一个相对的功能和结构。基因复制与共时关系芸苔。n那拟南芥。拟南芥那Brassica Rapa.那芸苔属植物oleracea， 和芸苔属植物黑质基因组也被预测将提供有价值的见解巴纳德拉基因家族的进化特征。染色体定位显示不均匀分布巴纳德拉八种染色体的基因，以及特定于特别的选择评估提出巴纳德拉基因净化选择。主题全部构成巴纳德拉基因是不一致的;然而,每一个巴纳德拉该基因包含12个高度保守的基序，编码DELLA和GRAS结构域。两个已知的miRNAs（bna-miR6029和bna-miR603）靶向BnaC07RGA公司和BnaA09GAI公司，也预测。此外，定量实时PCR（QRT-PCR）分析已经表现出来巴纳德拉根部，成熟 - 石，叶，花，花蕾，茎，射尖和种子中的基因不同的表达模式。此外，独联体-作用元素预测表明巴纳德拉基因的启动子上含有光、应激和激素反应元件。基因本体论(GO)富集报告表明巴纳德拉基因家族可能调控应激反应。结合本研究中使用的转录组数据，我们检测了不同的表达模式巴纳德拉生物和非生物胁迫下的基因。

结论

在本研究中，我们探讨了该基因的进化特征、基因组结构、miRNAs靶点和表达模式巴纳德拉基因家族B那不勒斯，丰富了我们对巴纳德拉基因在B那不勒斯并建议调节个体巴纳德拉表达是提高油菜抗逆性和收获指数的有效途径。

从1970年代开始，甘蓝型油菜已经成为世界上最有经济价值的作物[1］．近年来，在推进方面取得了重大进展B那不勒斯选择性育种去除不良成分，生产优质植物油和美味牲畜饲料。不幸的是,B那不勒斯产率易于各种非生物和生物应力，例如盐度更高，干旱，高/低温和病原体感染。这些压力导致世界许多地区收获指数和石油生产中的严重损失，并限制了其地理分布[2那3.]. 因此，环境压力对B那不勒斯耕作最终会失去其经济重要性。

作为固着生物的植物进化出各种策略来调节它们的生理以应对波动的环境条件[4.］．为了理解植物对非生物和生物胁迫的生化、分子和细胞反应的作用，已经做了大量的工作[5.那6.]. 这些研究表明，植物激素是传递内外刺激以促进植物对环境挑战的适应性反应的关键成分。在这些激素中，赤霉素（GAs）被认为是最重要的植物激素之一，它通过与多种激素相互作用而显著影响植物的生理[7.那8.]. 然而，在外界压力下，植物通过一个共同调节因子家族DELLA蛋白介导气体和其他植物激素的动态平衡，为植物的生存储备资源[9.那10.]. DELLA蛋白的一个重要功能是调节多种植物激素的多种转录因子（TFs）和转录调节因子（TRs）。例如，DELLA蛋白以光依赖和温度依赖的方式与转录因子相互作用，包括光敏色素相互作用因子（PIFs）、油菜素类固醇不敏感因子1（BZR1）和扩展蛋白A2（EXP2），以抑制细胞伸长和细胞增殖[11.那12.那13.]，或与脱水响应元件结合蛋白1B (DREB1B)、茉莉酸zim1结构域1 (JAZ1)和TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF (TCPs)相互作用，集中于植物的生存而不是生长[14.那15.那16］．Della蛋白是转录调节剂GRAS的亚家族（以吉布拉酸不敏感1，盖-3的阻遏物和稻草人命名）[17]. 大多数GRAS亚家族包含共同的N-末端基序，而DELLA蛋白有一些被称为DELLA、LEXLE和THYNP的α-螺旋片段被称为DELLA结构域[18那19］．此前有研究认为，DELLA n端17个氨基酸的突变导致了重度矮秆转基因植物的发生GAI-1叶深绿色，对盐和干旱不敏感[20那21］．稍后有人证明了Della域的N末端区域是负责任的德拉斯这是由一个气体受体赤霉素不敏感矮1 (GID1)在气体依赖和独立的方式来促进植物生长提升德拉斯镇压[22那23那24］．

水稻，大麦，番茄只含有一个DELLA基因，SLR1型（细米1），SLN1型（长1），以及PROCERA,分别为(9.那25那26]豌豆和玉米有两个高度保守的基因Della.基因。LA.那哭吧，和D8那D9.分别为(27那28］．此外，研究拟南芥报告有五人阿特德拉基因GA-Insensitive (时至今日)，ga1-3的阻遏子(RGA.），RGA样1（RGL1），（RGL2），（RGL3). 单个和多个基因的分子克隆阿特德拉GA缺陷突变体中的基因ga-1型暗示了重叠和独特的角色AtDELLAs调节气体刺激植物生长。例如，AtGAI和阿特尔加被认为是植物营养生长的显著抑制因子[9.那29那30),而atrgl1和atrgl2.抑制开花和种子萌发[31那32那33那34］．ATRGL3.近年来，通过茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)介导的对病原体感染的反应，在植物防御方面得到了广泛的关注[10.那35］．

过去十年的工作德拉斯对种子植物生产力的研究已逐渐深入。除了外源性喷溅的气体，以改善植物生长抑制，一个关键因素是改变气体合成微调德拉斯半矮秆品种改良的活性[26那36那37]. 这就提高了植物对非生物胁迫的耐受性，最终提高了作物的收获指数和存活率[38那39那40］．除此之外，最近的一项研究还标识了函数半矮虫突变体的Della丧失ds-3在油菜中，其表型与先前报道的半矮秆品种相似，具有抗倒伏的能力[41］．然而,Della.乳腺癌基因家族的分子机制及特征B那不勒斯没有得到很好的报道。此外,多元化Della.基因家庭期间B那不勒斯多倍体化将是一个有趣的问题。

在这项研究中，10名巴纳德拉从系统发育和共系关系、亚细胞定位、蛋白基序、基因结构和基因结构等方面对基因进行了系统的特征分析独联体元素的B那不勒斯基因组。此外，表达式配置文件巴纳德拉用qRT-PCR方法对8种不同组织的根、成熟角果、叶、花、花芽、茎、茎尖、种子进行了分析。预先公布的RNA-Seq数据也被预测用于研究巴纳德拉不同应力条件下的表达模式，如冷，热，干旱，脱落酸（ABA），盐度和菌核病感染。基因本体论（GO）与靶向基因的mirna巴纳德拉基因家族也进行了鉴定巴纳德拉的角色。这些结果将为阐明DELLA蛋白的多种功能提供有价值的见解B那不勒斯也为进一步的基因操作提供了基础B那不勒斯对环境波动的耐受力增强的变体。

鉴定和表征巴纳德拉

我们已经确定了10个巴纳德拉在里面B那不勒斯使用已知的5个答:芥德拉斯（GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3)肽序列作为查询，并在序列中进行BLASTP搜索B那不勒斯基因组数据库（GENOSCOPEhttp://www.genoscope.cns.fr /黄铜icanapus) [42]. 以确认BnaDELLA蛋白在细胞中的完整性B那不勒斯，进一步分析不同类型检索到的序列B那不勒斯品种中双11 (ZS11)基因组浏览器(BnPIR，http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus)，并手动更正巴纳德拉并根据基因座命名。基于这些方法，我们发现阿特德拉基因家族对应于多种同源物B那不勒斯基因组(表1). 同时，五个Della.基因在B拉帕，四英寸B橄榄科，九个在B。芥菜，还有五个B. NIGRA.用同样的方法进行分类。我们发现10巴纳德拉成员是从其祖先派生出来的B拉帕和B油菜籽．基因组序列长度巴纳德拉范围从1524-1740 BP，分子量不同于55.83至63.32 kd（表1). 此外，BnaDELLA蛋白的等电点（pI）值在4.69～5.94之间，表明这些蛋白具有很强的酸性。此外，所有BnaDELLA蛋白的疏水性总平均值（GRAVY）均为负值，表明BnaDELLA是亲水性蛋白。此外，在细胞核中检测到10种BnaDELLA蛋白的亚细胞定位信号，显示了它们的转录调节作用。孩子们的名字巴纳德拉，其轨迹id见(表)1)．

进化关系与基因结构分析巴纳德拉

这德拉斯六个进化史十字花科物种A.拟南芥(在),B那不勒斯（法国国家银行），B拉帕（胸罩），B油菜籽(Bol),b . juncea(北大)那和B. NIGRA.(Bni)是用邻域连接法推导出来的。基于系统发育分析，38Della.其中5个基因AtDELLAs, 10巴纳德拉,五布拉德拉斯，四个Boldellas.， 九BjuDELLAs,和五个BniDELLAs根据拓扑结构和引导支持分为三组（图。1). 第一组包含GAI和RGA分支，第二组包含RGL1分支，第三组包含RGL2和RGL3分支。B. Napus della.基因相对更接近A.拟南芥．然而，B那不勒斯和B拉帕德拉斯显示彼此之间100%的相似性。此外，一个同源的atrgl1未在B油菜籽与…相比B.油菜那b . juncea和黑质。这可能是由于在进化过程中基因丢失或出现基因组空白B油菜籽．然而,在B那不勒斯I、II、III组有4,2,4个Della.成员,分别。Della.以前已知分组成相同亚家族的基因具有不同或重叠的功能[21那31那35那43]. 认识到Della.基因家庭多样化B那不勒斯，通过比较编码序列（CD）和相应的基因组序列，我们已经实现了基因结构显示（GSDS）纤维网分析AtDELLAs那巴纳德拉那布拉德拉斯那博尔德拉斯，和BjuDELLAs。如图。2的成员。Della.表示的物种中的基因是高度保守和内含子，只有一个外显子。而且，外显子位置德拉斯在不同的系统发育相关的物种中是保守的，暗示了类似的进化关系。但是，外显子的长度Della.亚家族不同。例如，BnaRGL1号外显子长度小于其他巴纳德拉I群和第三组成员，表明基因结构多样化。总之，基因结构Della.不同基因十字花科物种高度保守，外显子长度有一些差异（图。2)．

多序列比对与序列分析巴纳德拉图案

来自Della蛋白的推定序列B. Napus，A. Thilana，B. Rapa，B. Oleracea，B. Juncea，和B. NIGRA.是为了探索氨基酸保护B那不勒斯．基于对准，我们发现了五种同源物Della蛋白A.拟南芥与氨基酸有较高的相似度B那不勒斯(表1)．类似于A.拟南芥，的B那不勒斯其他表示的物种分别在N末端和C末端区域的高度保守的Della和Gras域。众所周知，N末端Della结构域涉及稳定Della.基因活性(18那44]而GRAS结构域作为一个协同调节因子与多种转录因子和调节因子相互作用（图S）1）[37那45那46]. GRAS结构域C端存在的（VHIID-PFYRE-SAW）和两个亮氨酸七肽重复序列LHRI和LHRII负责蛋白质相互作用[47那48]. 然而，一些研究也提出DELLA结构域与非结构蛋白亲和力较低[45那49］．总体而言，域名安排B. Napus della.基因家族比较A.植物，B.油菜，B.甘蓝，B.芥菜，和B. NIGRA.．二级结构特征(α -螺旋和β表)来自atrgl1登记入册数量(AT1G66350.1.）显示在图中1．但是，所有的预测二级结构Della.来自表示的植物物种的基因相对较为不同。

为了深入了解巴纳德拉在里面B那不勒斯，我们生成了一张图，显示了域及其在AtDELLAs和BnaDELLA蛋白成员上的位置。我们发现DELLA和GRAS结构域在所有的DELLA蛋白中都是保守的蒂利亚纳和B那不勒斯，但图案分布不均匀(图。3.). 每个BnaDELLA成员包含4到16个保守的基序，长度从6到50个氨基酸不等。除3组外，其余各组均检测到1～13个基序atrgl3，bnaa10rgl3，和BnaC09RGL3缺少基序12。其中基序7和基序8被注释为德拉结构域（图。3.)．其中未检测到Motif 14和15atrgl2.那BnaA05RGL2型那BnaA05RGL2-2型，第二组。在大肠杆菌中检测到基序16ATRGL3，BNAA10RGL3那BnaC09RGL3、BnaA09GAI， 和BnaC09GAI公司．此外，Motif 17仅存在于n端区域AtRGA、BnaC07RGA、BnaA06RGA、BnaA05RGL2， 和BnaA05RGL2-2型基因．检测到图案18阿特尔加那BnaA09GAI那BnaC09GAI、BnaC07RGA、，和Bnaa06RGA。相比之下，我群体，atrgl2.那BnaA05RGL2型， 和BnaA05RGL2-2型有一个额外的主题19和20，分别。这些结果表明巴纳德拉亚科的母序排列不同，表明巴纳德拉重复事件中的基因家族功能分化。然而，具有相似基序排列的蛋白质指定了它们之间的功能相似性巴纳德拉成员。标志示意图巴纳德拉图案如图S所示2．

染色体定位与共线性分析

染色体定位分析显示，10个巴纳德拉分布在8个B那不勒斯支架（图。4.)，它们还没有被组装成染色体。此外，没有分布巴纳德拉在支架A01、支架A03、支架A04、支架A07、支架A08、支架C01、支架C03、支架C04、支架C05、支架C06和支架C08中观察到。然而，六巴纳德拉， 包括，bnaa02rgl1.那BnaA05RGL2、BnaA05RGL2-2那BNA06RGA公司那BnaA09GAI， 和BnaA10RGL3，位于AA亚基因组上。相比之下，四个巴纳德拉斯，包括BnaCO2RGL1那BnaCO9GAI公司那BNAC07RGA，和BnaC07RGL3型，位于CC亚基因组上，表明巴纳德拉在B那不勒斯基因组（图。4.)．此外，通过使用BLAST和MCSCANX方法，我们检测到六个分段复制对（如bnaa09gai / bnac09gai.那BnaA06RGA / BnaC07RGA那BnaA06RGA/BnaA09GAI/BnaC09GAI公司那

BNAC07RGA / BNAC09GAI / BNAA09GAI那BnaA02RGL1 / BnaC02RGL1那BnaA10RGL3/BnaC09RGL3，和一个串联重复bnaa05rgl2 / bnaa05rgl2-2决心(图。5.)结果表明，在进化过程中，节段性重复事件是导致物种分化的主要原因Della.基因家族B那不勒斯．此外，比较同步Della.基因对B那不勒斯那A. Thalana，B. Rapa，B. Oleracea，和B. NIGRA.是(图进行的。6.). 结果表明：巴纳德拉显示出最共线性的关系B拉帕那B橄榄科，然后A. Thaliana，和黑质。共五，五，10巴纳德拉表现出同系关系B拉帕那B油菜籽， 和B. NIGRA.(表S2)．然而那五AtDELLAs显示与10的共线性关系巴纳德拉，其中有一个以上的同源副本B那不勒斯基因组。例如，AtGAI和阿特尔加显示同义关系BnaA09GAI那BnaC09GAI公司那Bnaa06RGA，和BNAC07RGA，暗示AtDELLAs基因可能导致了Della.基因家族十字花科物种。此外，我们还评估了选择约束对每一对重复的压力巴纳德拉计算非同义(Ka)和同义(Ks)的比值(表S3.，图S3.)．我们的发现表明所有的巴纳德拉对的Ka/Ks比值小于1，表明巴纳德拉基因家族经历了强烈的净化选择性压力。

bna-microRNAs推测靶点的预测S.

规管的目的德拉斯它们相互作用的靶点在各种植物中有广泛的特点；然而，一个潜在的转录后修饰德拉斯对环境压力的反应还不清楚[50那51那52］．据报道，miRNAs在转录和转录后水平中发挥重要作用，调节应激下的基因表达[28那53］．鉴定miRNAs与巴纳德拉，我们获得了bna-miRNAs数据B那不勒斯综合研究预测目标巴纳德拉网站。我们发现10巴纳德拉从B那不勒斯目标为18个B那不勒斯microrna。这些miRNAs的长度从1-24个碱基对开始，其中11个碱基对的频率最高巴纳德拉（表2)．目标预测分析表明BNADELLAS BNAC07RGA和BnaA09GAI分别由两个众所周知的miRNA，BNA-miR6029和BNA-miR6031靶向。在我们研究中鉴定的其他BNA-miRNA中，发现BNA-MiR2111A，BNA-MIR166A被发现参与靶向BnaRGL1号．相比之下，bna-miR172b的靶标是bnaa02rgl1.和BnaA05RGL2型．另外，发现BNA-MiR390A和BNA-MIR168A靶向BnaRGL3公司．基于这一分析，我们认为bna- mirna具有潜在的靶向作用B那不勒斯，A和C基因组，来调节巴纳德拉在恒定胁迫下表达，以稳定植物生长和防御权衡。

独联体的启动子区-元素分析巴纳德拉及其分销

生理和分子研究德拉斯通过与多种转录调节因子和转录因子的相互作用，提示它们在多种激素信号通路中的作用。然而，其相互作用和调控的分子机制Della.基因是相当不清楚的。为进一步深入了解其潜在的功能和调节机制巴纳德拉，我们分析了独联体-调控元件在1500 bp上游启动子区巴纳德拉通过使用plantCARE数据库，将它们分为四类（图。7.A).我们发现这个人Della.基因B那不勒斯包含多个独联体-作用元素(表S4.). 几乎所有的巴纳德拉启动子具有CAAT-box、TATA-box、光照、应激、激素和发育相关的应答独联体-Elements。但是，分布和数字之间的分配和数字在显着变化巴纳德拉(图。7.在细节,B)。BnaA09GAI那bnaa02rgl1.具有更高数量的光响应和激素响应元件。相比之下，BNA06RGA公司那bnaa05rgl2，和BnaA10RGL3携带更高数量的压力响应和发展相关独联体- 分别。但是，一些人独联体核心元素仅在一些中找到巴纳德拉．例如，GC-MOTIF（涉及缺氧特异性诱导性的增强子样元素），DRE核心（独联体-作用调控元件（调控低温胁迫，诱导脱水）和3-AF结合位点（一个保守的DNA模块阵列CMA3的一部分）BNA06RGA公司和BnaC07RGA公司. 同样，GATA主题(独联体- 涉及光响应性的花香，幼杆和种子发育的调节元件），富含富含序列（独联体-元素为最大激发因子介导的激活)BnaCO9GAI公司和BnaA09GAI．ATCT-MOTIF（涉及光线响应性的保守DNA模块的一部分），间隙箱（独联体存在与轻响应Gapa基因相关的元素）存在BnaC02RGL1型和bnaa02rgl1.,分别。此外,AuxRR-Core (独联体- 仅在疾病响应性中涉及的监管元素）仅发现BnaA05RGL2型和BnaA05RGL2-2型. 相比之下，O2部位(独联体-参与玉米醇溶蛋白代谢调控的调控元件均缺失巴纳德拉除了BnaC09RGL3和BnaA10RGL3（图。7.A） 是的。这些结果表明巴纳德拉基因家族含有各种各样的压力和防御相关独联体-与发育、光照和激素反应有关的元素独联体- 建议巴纳德拉不同的功能响应各种生物和非生物逆境。

转录组学和qRT-PCR分析巴纳德拉在不同的组织中

这巴纳德拉基因家族转录组表达数据来自根，子叶，叶，萼片，花瓣，长丝，花粉，芽，中茎，下茎，上茎，植物玫瑰花，石米，硅墙和种子B那不勒斯品种ZS11是从BnTIR数据库中获得的http://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR．提取的数据经过log2倍变化归一化并生成热图。如图S所示4.，10个基因的表达模式巴纳德拉在根、子叶、叶、萼片、花瓣、花丝、花粉、芽、中茎、下茎、上茎、营养莲座、西力克、西力克壁和种子中存在差异，说明同源基因的附加拷贝是不同的巴纳德拉在种子萌发到生殖发育过程中表现出表达差异。这可以提供重要的见解，这些基因的独特作用B那不勒斯. 为了更好地理解巴纳德拉方法：采用qRT-PCR技术，对黄瓜的根、成熟角果、叶、花、花芽、茎、茎尖、种子等8个初生组织进行检测B那不勒斯品种ZS11。我们发现转录组和我们的qRT PCR结果之间有很强的相关性（图。8.). 总的来说，布纳盖和巴纳加在茎和茎尖高度表达，而BnaRGL1号和BnaRGL2号主要在花器官和种子中表达。相反，在我们的QRT-PCR分析中，BnaRGL3公司在任何组织中的表达都很低。然而，结合转录组数据分析，BnaRGL3公司在西力克高度表达。qRT-PCR与转录组学数据之间的矛盾，特别是在BnaRGL3公司开花后第6天和第28天的角果收获可能是表达的原因，表现出复杂的变异巴纳德拉从种子萌发到营养和生殖发育。的唯一表达式模式巴纳德拉在植物的多个组织中，它可能在调节赤霉素等植物激素信号中起着不可或缺的作用，以调节植物在恒定胁迫条件下的生长和生存平衡。

表达分析巴纳德拉在不同的压力下

进一步探索并获得更多关于巴纳德拉在生物和非生物胁迫下的功能。我们研究了预先公布的RNA-seq数据，以检测不同胁迫条件下的基因表达模式，例如MA（低温4℃冷休克和冷冻） − 4°C温度）、CA（冷驯化14天后12小时4摄氏度）、FA（冷驯化14天后12小时4摄氏度）、DT（干旱处理）、HT（热处理）、ABA（脱落酸）、盐度和菌核病sclerotiorum。总的来说，RNA-seq数据分析显示巴纳德拉不同胁迫处理的表达模式不同。例如，BnaRGL2号除干旱和盐胁迫外，其余胁迫均上调(图8)。9.)．然而，布纳盖响应于MA，HT，DT和盐度，表现出诱导的表达。相比之下，BnaA10RGL3那BnaC09RGL3在对高温、干旱、ABA和盐处理的反应中，几乎都表现出减少的表达。然而，在低温和低温时观察到较高的表达菌核病治疗。许多以前的研究阿特德拉基因在非生物和生物胁迫下调节植物生理方面的独特和基本作用提供了证据[33那54那55那56]，建议强烈的关系巴纳德拉基因家族在提高应激耐受性中的作用。

基因本体论

为了解其功能调节机制巴纳德拉基因家族，我们用阿特德拉同源对A.拟南芥进行GO富集分析。观察到三种常见的GO术语，包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。在MF类中，DELLA基因在结合（GO:0003700），（GO:0005515）和转录调节活性（GO:01401110）方面高度富集。CC在细胞核中富集（GO:0005634），这表明DELLAs是核蛋白。类似地，大多数GO术语（GO:0009737，GO:0009739，GO:0009740，GO:0009753，GO:0042538，GO:0009863，GO:0072593，GO:0009651，GO:0009908，GO:2000033，GO:0030154，GO:0010187，GO:0009938，GO:0006355，GO:0010218，GO:0009723）在生物过程中也很丰富，表明对激素和压力的反应（图S）5.,表8.)．氧化石墨烯富集结果表明巴纳德拉在调节荷尔蒙信号响应应力时发挥关键作用，这与先前的研究一致[9.那57那58那59］．

在本研究中，假定有10个巴纳德拉是从B那不勒斯分为三个亚科布纳盖/巴纳加那BnaRGL1号， 和bnargl2 / bnargl3.基于它们的同源性。系统分析系统发育关系、基因结构、基序组成、理化性质、基因复制、miRNA预测等独联体对启动子进行了-元素分析。此外，分析qRT-PCR和预先发表的RNA-seq数据，以揭示表达谱巴纳德拉．这些结果为进一步的功能表征提供了有价值的见解巴纳德拉基因家族，可以改善分子育种，以适应油菜植物到预期的气候条件下。

DELLA蛋白是众所周知的负协同调节器，调节气体和各种激素信号之间的串扰，以维持植物的生长和生存权衡，对非生物和生物条件作出反应[8.那10.]. 以前关于种子植物的报告已经确定了一个、两个和五个Della.基因在水稻[25]，豌豆[27),而A.拟南芥,分别。DELLA蛋白的克隆和调控可提高这些植物的收获指数、种子质量、分蘖、花期和抗逆性。例如，DELLA蛋白的过度积累提高了淹水耐受性[60]，盐胁迫[61]、避荫[62那63]显著提高植物适应性。相反，DELLA蛋白表达的减少会减少分蘖[64那65种子休眠[66]，从而增加了种子的重量和萌发。在本研究中，共10个巴纳德拉已被确定在B那不勒斯，这意味着个体阿特德拉有多个同源物吗B那不勒斯．油菜是一种异源四倍体作物，由两个二倍体前体杂交而成B拉帕(AA)和B油菜籽(CC) [67］．染色体定位显示是5和4巴纳德拉分别位于AA和CC亚基因组的近端或远端(图。4.），它展示了那种同源物巴纳德拉可能在生物功能上扮演着与两个祖先物种相似的角色。

DELLA基因家族包含两个高度保守的N端DELLA和C端GRAS结构域。在这项研究中，我们发现巴纳德拉基因家族具有相似类型的保守结构域。然而，母题数量和它们之间的组成巴纳德拉是不均匀分布的，表明域改组在蛋白质结构巴纳德拉，这可能意味着巴纳德拉基因家庭。

Della.基因家族A.拟南芥那B. Napus，B. Rapa，B. Oleracea，和b . juncea显示含有单个外显子的重要基因结构，并且没有任何内含子。已经表明，没有或更少内含子的基因响应于生物和非生物应激而迅速表达[68那69]. 与本研究中使用的转录组学数据相比，我们检测到无内含子基因的不同表达模式巴纳德拉为了应对寒冷，干旱，炎热，菌核病sclerotiorum,盐度和ABA处理之间存在着很强的相关性巴纳德拉生物和非生物胁迫(图。9.,表7.). 此外，外显子组成表现出较高的进化保守性Della.基因十字花科物种（图。2)．

DELLA蛋白是GAs信号调节植物生理的主要抑制剂[70那71]. GAs通过多种正调控因子，包括GA受体GA-不敏感矮1（GID1）、SPINDLY（SPY）和F-box蛋白（SLY1，SNE）在自然环境下解除DELLA的抑制，从而刺激植物生长[44］．然而，几项研究表明了德拉斯稳定性可以通过气体依赖性和非依赖性的蛋白质水解来调节[72那73］．最近的一项研究推测，水稻microRNA (OsmiR396)可能调控水稻DELLA基因SLR1型以GA反应性生长调节因子（GRFs）为靶点抑制水稻的促生长作用[74］．在这项研究中，预测了总共18个BNA-miRNA靶向巴纳德拉（表2)．在这,BnaC07RGA公司和BnaA09GAI被认为分别受两个已知的mirna bna-miR6029和bna-miR6031的调控。与此相一致，最近的一项研究表明，增加的bna-miR6029表达调控脂肪酸的生物合成，以调节种子发育以应对环境挑战[75]. 因此，我们推测巴纳德拉是最可能通过预测的bna- mirna介导恒定的外源或内源刺激下植物生长和存活权衡的靶基因。然而，需要进一步的研究来阐明miRNA过程巴纳德拉基因。

本研究还发现独联体-元素巴纳德拉启动子，包括光响应、激素响应和应激相关元件（图。7.）但他们的分配是不平衡的。例如，bnaa02rgl1.那BnaC02RGL1型，和BnaA09RGL3型那BnaC09RGL3在启动子区域有两个ABREs，而BnaA05RGL2型和BnaA05RGL2型-2没有ABREs，尽管它们被认为诱导了不同的ABA反应。此外，BnaA05RGL2型和BnaA05RGL2型-2有一个MBS独联体-元素在启动子区域。有趣的是,BnaRGL2号干旱处理未观察到基因相对表达（图。9.)．因此，这些发现表明存在身份不明的独联体元素，表示的表达式巴纳德拉可能通过转录后修改来调节[50那52]为不同生物和非生物胁迫下基因表达的研究提供了线索。研究A.拟南芥已经确定了五个阿特德拉基因GA-Insensitive (时至今日)，ga1-3的阻遏子(RGA.），RGA样1（RGL1），（RGL2），（RGL3). 这些基因的克隆和测序阿特德拉基因报告了调节气体刺激的植物生长的不同和重叠作用。例如，AtGAI和阿特尔加控制下胚轴细胞分裂和花的诱导[29那30那76］．atrgl1和atrgl2.参与调节叶片衰老、雄性不育和种子萌发[32那33］．尽管ATRGL3.据报道，曾促进植物防御以应对生物应激[10.那35那77］．与此一致的是，我们的基因表达谱和预发表的RNA-Seq数据分析(表S5.,表7.)假定表明的不同的表达模式巴纳德拉基因家族对生物和非生物胁迫的反应。例如，BnaRGL2号除了干旱，盐度和盐度之外，在所有测试的应力中显示出更高的表达菌核病（图。9.)．然而，布纳盖在茎中表达，对MA、HT、DT和盐度有反应。相反，BnaRGL3公司几乎表现出响应热，干旱和ABA治疗的表达。然而，在冷和盐处理期间观察到诱导表达。这些发现与在其同源物中也发现的研究一致A.拟南芥[78那79］．此外，以前的研究还证实了增加的表达ATRGL3.作为对植物防御的回应[10.那35那77］．结合本研究中使用的转录组数据，我们观察到增加的表达BnaA09RGL3型和BnaC09RGL3在24小时内菌核病感染(图。9.)，建议BnaRGL3公司在调解中的重要作用B那不勒斯在恒定的压力条件下生存。此外，BnaRGL2号同系物答:芥AtRGL2被认为是积极调节ABA响应促进种子休眠的重要成分[80那81那82］．在qRT-PCR和RNA-seq分析中，我们发现BnaRGL2号主要在种子中表达，推测在ABA处理4 h后出现诱导表达，但在24 h后最终表达量下降。然而，需要进一步的实验研究来获得更多的见解巴纳德拉在ABA信号转导途径中。相比之下，在盐胁迫期间，该转录物BnaA09GAI那BnaC09GAI公司，和bnaco9rgl3.上调，而其余的巴纳德拉被抑制(无花果。9.)，表明…的重要性布纳盖易于严重的盐胁迫。重要的是链接AtGAI已经鉴定出盐胁迫，通过限制植物生长来证实了增强的耐盐性[83那84］．

我们的研究提供了功能多样化和全面的知识巴纳德拉基因家族在B。那不勒斯。然而，需要进一步的实验研究来更好地理解不同的角色巴纳德拉在生物和非生物胁迫条件下，这将有助于巩固我们对植物个体发生的认识，提高农艺技术水平B那不勒斯屈服。

Della蛋白的重要作用是介导气体，几乎所有植物激素信号传导途径，以在恒定应力下植物防御和生长之间的困境。在我们的研究中，我们确定并表现了巴纳德拉基因家族B那不勒斯．共10次巴纳德拉已经被确认在B那不勒斯分为三组。所有的巴纳德拉与A.拟南芥五Della.基因，表明具有类似的功能和基因结构。同一亚科的基序组成不均匀；但是，个人巴纳德拉该基因包含12个高度保守的基序，编码DELLA和GRAS结构域。植物的系统发育和共线性研究Della.基因介于B那不勒斯它的祖先物种提供了有用的线索或进化特征巴纳德拉. 此外，miRNAs靶点，独联体- 传递元素，以及转录的调控巴纳德拉基因家族也进行了预测。综上所述，这些研究结果为进一步了解其进化关系和潜在功能提供了有价值的线索巴纳德拉这将有助于进一步的基因操作，以促进人类的发展B那不勒斯对环境波动耐受性增强的变体。

大肠杆菌的鉴定及蛋白质序列分析巴纳德拉

为了搜索Della.基因家族B那不勒斯，五个肽序列Della.基因A.拟南芥基因组数据库(http://www.arabidopsis.org/)具有相应的基因ID(At1G14920.1、At2G01570.1、At1G66350.1、At3G03450.1、At5G17490.1)被检索并用作查询来执行BLAST P搜索B那不勒斯基因组浏览器（BNPIR，http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus)，和（基因镜，https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)．那些来自B油菜籽那B拉帕那b . juncea， 和B. NIGRA.下载了芸薹属数据库(BRAD,http://brassicadb.cn/＃/）。选择具有80％相似性的序列，在扫描扫描液中手动重新注释错误或重复的序列（https://prosite.expasy.org）和Interporcan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/). 然后用ProtParm工具计算蛋白质序列的等电点（pI）、分子量（MW）和氨基酸数(http://web.expasy.org/)．此外，预测每个亚细胞位置图案巴纳德拉使用Web-Server Plant-MPLOC进行（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）[85]，以及softberry中的ProtComp v.9.0(http://linux1.softberry.com/)．

Della的系统发育和基因结构评估B.甘蓝型油菜、拟南芥、油菜、甘蓝、芥菜、黑菜

推测的肽序列来自十字花科物种B那不勒斯那A.拟南芥那B拉帕那B油菜籽那b . juncea和B. NIGRA.用肌肉对齐(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle)，使用默认参数。然后用MEGA 10.2软件通过邻域连接(NJ)方法构建进化树[86］．通过执行1000个引导复制来测试树的真实性。然后将系统发生树Newick格式上传到iTOL web服务器(http://itol.embl.de/）为了更好的可视化。此外，基因组和编码序列甘蓝型油菜、甘蓝、油菜、芥菜、和A.拟南芥基因在基因结构显示服务器（GSDS2.0）中呈现(http://gsds.cbi.pku.edu.cn.）预测基因结构和外显子/内含子位置。

序列对准和评估巴纳德拉图案

中的della特征域进行分类B那不勒斯，我们已经将38位对齐德拉斯编码序列来自B那不勒斯那A.拟南芥那B拉帕那B油菜籽那b . juncea和B. NIGRA.使用MEGA 10中的Muscle选项和默认参数。此外，Motif启发版本5.1.1（MEMEhttp://meme-suite.org/tools/meme)被用来鉴定基因中的保守基序巴纳德拉使用最大图案搜索设置为20，并且其他参数设置为默认值。任何重复都被认为是在整个序列中传播的图案网站[87］．Interprancan（Interpro Ebi.ac.uk）实施了所识别的主题的进一步注释。通过使用TBTOOLS软件来可视化保守的主题[88］．另外，Bnadella蛋白的二级结构由Psipred携带（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/PSIPRED)．

染色体定位、共线性分析和特定地点选择评估和测试

巴纳德拉从下载的GFF基因组文件中获取详细的染色体位置B那不勒斯基因组数据库（BNPIR，http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus)利用TBtools软件，以红色的基因名作为相对位置，对预测的染色体位置进行定位。基因复制事件是通过比对巴纳德拉使用BLASTP和MCScanX来描述巴纳德拉串联和分段复制[89]. 此外，我们还得到了德拉斯之间的同源B那不勒斯那A.拟南芥。橄榄科，和B. NIGRA.是由自定义植物脚本获得的吗．用于检查特定网站的选择，贝叶斯推理方法选择Selecton Server（http://selecton.tau.ac.IL/[90]用于预测阳性和纯化选择。除此之外，我们还计算了同义词(ks.）和非纯突变（K a)在每个密码子进化压力_计算器2.0[91]. 此外，巴纳德拉基因对分化时间由公式T = Ks/2r + r (1.5 × 10)推定⁸)，代表每年每一地盘的中立替代[92］．

miRNA靶点预测及应用独联体-作用因素监管分析

验证miRNA与其靶点之间的相互作用。我们获得了B那不勒斯来自PNRD的干环和成熟miRNA序列(http://structuralbiology.cau.edu.cn/PNRD/index.php）[93]和mirbase（http://www.mirbase.org/)数据库。植物小RNA靶标分析服务器psiRNATarget[94]使用默认参数用于预测BNA-miRNA靶基因巴纳德拉基因家庭。为了独联体-元素分析，1500 bp上游启动子序列来自翻译起始位点巴纳德拉在plantCARE数据库中进行了检查(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[95]和分布独联体-通过TBtools软件可视化的动作元素[88］．

植物材料RNA提取和QRT-PCR

的种子B那不勒斯品种“ZS11”由石油作物研究所刘胜地教授捐赠，

中国农业科学院，武汉。B那不勒斯在江苏大学生命科学研究所温室20±5℃，光照16 h /暗8 h，光照强度50µmol/m2/s，相对湿度70%的条件下生长。从成虫中采集根、成熟角果、叶、花、花蕾、茎、茎尖和种子等组织，立即用液氮冷冻，并在-80℃保存^οC为RNA提取。用Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取总RNA，用RNase-free dnase (Invitrogen, Carlsbad, CA)处理。然后，根据制造商的说明，使用HiScript III-RT SuperMix生产cDNA，用于qPCR (Vazyme，中国)。实时荧光定量分析(qRT-PCR)采用Thermo Fisher Scientific QuantStudio 5 Real-time PCR系统进行，有3个独立重复。这显著肌动蛋白基因（GenBank ID:xm013858992）被用作内部控制。2号^−∆∆采用Ct法检测细胞相对基因表达水平巴纳德拉. 相对表达式巴纳德拉在根中用作控制，实施T检验以测量组织之间的显着差异，并且使用GraphPad Prism8.0软件可视化结果[96]. 本研究中使用的所有基因特异性引物均由Beacon引物设计程序（primer Biosoft International，Palo Alto，CA）设计并列于（表S）6.)．

基因本体论及表达模式分析巴纳德拉

这巴纳德拉使用在线web服务器DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)和黑豹(http://go.pantherdb.org/webservices/go/overrep.jsp)进行基因本体富集分析。使用TBtools软件对预测的GO项进行注释。此外，表达概况巴纳德拉在高温、干旱、低温、ABA诱导、盐胁迫下菌核病从预发布的转录组数据集（SRP277041）中获得应激状况（SRP190170）[97), (CRA001775) [98]和（SRP075294）[99］．差异表达分析采用R.中的DSEeq2包进行，预测值用log2倍变化归一化，热图通过TBtools生成。

的基因组、蛋白质和基因组转移格式(GTF)文件拟南芥，芸苔，芸苔属rapa，brassica oleracea，和芸苔属植物黑质是从集合FTP下载的(http://plants.ensembl.org/info/data/ftp/index.html.)．盐度和ABA治疗下的RNA SEQ数据在项目ID下提供：CRA001775（https://bigd.big.ac.cn/). 支持的转录组学数据集已保存在NCBI序列读取档案（SRA，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra.)注册号为：SRP277041、SRP190170和SRP075294的存储库。所有支持这项研究的数据都包含在文章及其附加文件中。

B那不勒斯：

甘蓝型油菜

A.拟南芥：

拟南芥

B拉帕：

Brassica Rapa.

B油菜籽：

芸苔属植物oleracea

B. NIGRA.：

芸苔属植物黑质

b . juncea：

芥菜

阿特德拉：

拟南芥

巴纳德拉：

Brassica Napus della.

气体:

吉布林斯

去：

基因本体论

BLASTP公司：

基本的局部对齐搜索工具-蛋白质

分子量：

分子量

模因：

基序诱导

bna-miRNAs:

B.甘蓝型油菜小RNA

ZS11：

中双11

基德1：

赤霉素不敏感侏儒1

汤:

疏水性的盛大平均水平

圆周率：

等电点

美国律师协会：

脱落酸

氯化钠：

氯化钠

GSD编号：

基因结构显示服务器

光盘：

编码序列

非常感谢中国农业科学院湖北省武汉市油料作物研究所刘胜义教授提供中双11种子。作者还要感谢麦克斯·威尔博士(江苏大学，中国，修订原稿。

国家重点研发计划(no . 2016YFD0100305;基金资助:国家自然科学基金资助项目(31671720);江苏大学杰出学者研究基金资助项目(10JDG134)。资助机构在本研究和相关数据的设计、分析或解释中没有发挥任何作用。

从属关系

1. 江苏大学生命科学研究所，中国镇江

   高岳，谭晓丽，朱克明

贡献

R-S和KM-Z设计了实验。R-S和T-J进行了数据分析。P-D和Y-G提供了RNA-SEQ数据。R-S写了稿件草案，并修改了KM-Z并编辑了稿件。XL-T监督稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

通信崔克明朱．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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