转录组和代谢组分析，揭示了“黄川”梨的褐变点形成

背景

褐斑病严重影响了黄冠梨的外观品质，造成经济损失。对BS的研究多集中在生理生化方面，其分子机制尚不清楚。

结果

本研究利用扫描电镜(SEM)观察了黄关梨BS的结构特征，分析了果实失水和褐斑，并通过转录组学和代谢组学分析揭示了黄关梨表皮褐变紊乱的分子机制。结果表明，BS的发生伴随着蜡层的减少和木质化细胞的增加。与蜡质生物合成相关的基因在BS中被下调，导致了BS蜡质层的减少。与木质素相关的基因在转录水平上上调，导致苯丙类生物合成相关代谢产物的上调。BS中钙相关基因表达上调。冷诱导基因可能是诱发BS形成的关键基因。此外，结果表明外源性的NaH₂阿宝_4.h·2₂O和ABA处理可以通过增加蜡质相关基因和钙质相关基因的表达，增加植物抗性来抑制收获和贮藏期间BS的发生_3.可以加速BS的发病率和指数。

结论

本研究结果提示了一种可以解释BS形成的分子机制，阐明了不同处理对BS发病率和分子调控的影响。

梨(Pyrus spp。），属于家庭枸杞子的亚家族，第三个最重要的温带水果种类在葡萄和苹果之后[1］．中国种植的梨品种很多，主要用于商业生产的品种包括沙梨(p . pyrifolia中井)、乌苏里梨(P. Ussuriensis.马克西姆)、白梨(p . bretschneideriREHD）和新疆梨（p . sinkiangensis以及种间杂交类型[2］．

Huangguan梨(Pyrus Bretschneideri.×Pyrus pyrifolia)是我国北方广泛种植的早熟中熟品种，套袋后外观优质细腻[3.］．这种果实具有许多优异的特性，如美观的外观，抗性强，早期的果实轴承和高产的连续年份，这是大多数生产者和消费者所需的特征。然而，褐斑斑（BS）疾病经常发生在收获前或在储存期间袋装后'黄川'梨果水果的表面[4.］．BS的症状包括最初的棕色斑点，不规则地从病斑扩散到周围环境，在果实成熟期间颜色变深[4.那5.］．整个果实褐变可能发生在这一疾病的后期。有趣的是，这种紊乱只影响梨的外果皮，而果肉和果核不受影响[6.］．多个病变连接成圆形，不规则的形状或鸡爪状形状。因此，BS障碍也被中国果园称为鸡爪疾病，并导致水果农民的果实商业价值显着下降[7.］．

1996年，河北省新济市首次发现了BS。这种疾病主要发生在“黄川”梨上。但是，少数绿色梨品种，如'dangshansuli'（p . bretschneideriRehd。），'Lvbaoshi'（p . pyrifolianakai），'suisho'（p . pyrifolianakai），'xuehua'（p . bretschneideriRehd.)和《学青》(p . pyrifoliaNakai)，也经历了BS [8.］．据报道，黄冠梨BS病是一种重要的生理疾病[9.那10.那11.]主要发生于成熟期和低温贮藏后的套袋果实[12.那13.那14.］．一般来说，黄冠梨的BS紊乱受多种因素的影响，如环境因素(连续降雨、低温天气[12.]化学肥料使用[15.]），预征收源（袋装时间，水果袋类型[5.那16.]和溶胀剂使用[17.]）和采后因子（冷却期持续时间[12.那13.那14.那18.]、储存温度和CO₂和O₂浓度(19.那20.那21.])。

一些研究人员认为，由袋装引起的蜡层和皮肤细胞壁的变薄是BS的主要原因[16.］．袋装后，果实EXOCARP对严重环境变化的适应性降低，果实的发展延迟了。据报道，BS与Pericarp组织中的缺钙和酚醛缺陷密切相关[9.那19.那22.］．迄今为止，对BS病的研究主要集中在矿物营养（如CA [3.那5.那9.那11.那17.那23.那24.那25.那26.那27.], Mg [5.那9.), K (5.那9.和B [23.)和生理学及生物化学[28.那29.］．此外，使用溶胀剂可能是BS的另一个原因[17.］．与乙烯的外源性处理[4.那30.]，茉莉酸甲酯（Meja）[31.]，1-甲基环丙烯（1-MCP）[18.]和cacl.₂[32.据报道，据报道，影响波萨多斯黄园梨的褐变。此外，快速采后冷却趋于增加BS地层，而缓慢的冷却抑制BS地层[12.］．然而，很少有研究侧重于外源植物激素治疗的影响，以及调节“黄川”梨中的BS过程的分子机制。

该研究观察了BS位点的变化，并分析了在转录组和代谢组水平下BS形成的分子机制。用外源试剂治疗后Bs的发病率[nah₂阿宝_4.h·2₂O (P)、脱落酸(ABA)、赤霉素A3 (GA_3.)在收获和贮藏期间进行了调查。并对处理后的外果皮形成的关键基因进行了分析，为BS形成的分子机制提供了基础，阐明了不同处理对BS形成的分子调控作用。

“黄会”梨BS病的表型特征

与“黄川”梨的正常梨皮相比，BS感染的皮肤呈现出不规则的鸡爪状形状的斑点，这些形状随机分布在表面上（图。1一种）。BS是一种生理疾病，导致受影响区域略有抑郁症。石蜡截面观察结果表明，BS部件的Exocarp细胞的瘫痪程度明显高于正常部位的程度（图。1C，D）。SEM观察显示正常“黄川”梨皮肤上的厚咬合层，然而，BS部分的“黄会”梨皮的部分由死池层组成，更密集地布置的外部牛肉细胞（图。1e，f）。那些结果表明，BS的发生可能是由外官方和皮下皮质组织的坏死引起的。

SEM分析还发现果实表面上有许多裂缝，尽管BS部件上的裂缝被病灶覆盖（附加文件1：图。S1）。因此，在CK和BS组之间进行检测水分损失率（RWL）的实验。在室温（25°C）的10 d储存后，计算了三组'黄川'梨和“黄川”梨，患有BS疾病的RWL。结果表明，群体＃1和＃3的RWL显着高于BS疾病的“黄川”梨（图。1B). CK组和BS组的平均RWL分别为3.49和3.19%。因此，BS损伤可抑制水分流失，这可能是由果实表面密集排列的死细胞层调控的。

CK和BS果实的转录组和代谢组差异

RNA-SEQ为来自5个互补DNA（cDNA）文库的每个样品产生的6.24千兆字节（GB）的清洁数据。鉴定了总共30,596种表达基因，包括在本研究中最初鉴定的1212个新基因。成功映射的读数范围在69.91和72.68％之间，平均为71.29％（附加档案2:表S1)。

To compare the metabolites in the control group (CK) and BS-infected group (BS) metabolites of ‘Huangguan’ pears, datasets obtained from a Xevo G2 XS QTOF high-resolution tandem mass spectrometer (Waters) in electrospray ionization positive ion mode (ESI+) and negative ion mode (ESI−) were subjected to a principal component analysis (PCA). The results showed that metabolites from the CK and BS groups were clearly separated in the score plots, in which the first principal component (PC1) was plotted against the second principal component (PC2). (Additional file1:图S2 A, B)。进一步进行PLS-DA(从偏最小二乘判别图)分析，检查CK组和BS组之间的代谢物差异(附加文件1:图S2 C、D)，结果表明CK与BS之间存在显著的生化差异。

Deseq2的两种比较群体的转录物分析[33.]在BS梨外果皮中鉴定出6299个DEGs，其中上调的4854个，下调的1445个。2A).为了区分CK和BS基团间的deg功能，对组装的unigenes进行了不同蛋白数据库(GO和KEGG)的注释，进行同源比对。在GO类别中，DEGs被注释1212个GO术语，其中生物过程中有1480个unigenes，细胞组分中有1906个unigenes，分子功能中有1609个unigenes，其中包括代谢过程、膜和催化活性等术语(附加文件)1:图S3)。KEGG通路注释分析显示，全球和概览图、碳水化合物代谢、信号转导和环境适应被过度代表(附加文件1:图S4)。通过KEGG富集分析进一步评价CK组和BS组之间的DEGs。我们发现了7个重要的途径，包括MAPK信号转导(245)、类黄酮合成(72)、植物-病原体相互作用(267)、类胡萝卜素合成(38)、卟啉和叶绿素代谢(37)、植物激素信号转导(216)和油菜素内酯合成途径(17)(图)。2b）。为了进一步确定BS相关基因的功能，我们分析了这些显着富集途径的基因表达。表中列出了上调和下调基因的数量1．

我们对‘黄冠’梨外果皮BS病部位的代谢组学变化进行了研究。ESI+和ESI−模式下共鉴定出8829和8646个离子。过滤RSD为> 30%的低质量离子后，ESI+和ESI−模式下分别保留8432和7887个离子。然后，我们鉴定了CK组和BS组之间的差异代偿产物，在BS中检测到1742个和1555个差异离子，其中ESI+和ESI−模式下，分别有1348个和1173个上调离子，394个和382个下调离子(图5)。2C).在ESI+和ESI−模式下，分别有1581个和781个分化代谢物被分为96个和74个KEGG通路(附加文件3.：表S2）。分化代谢物的Kegg富集分析（在ESI +和ESI-模式下除去重叠离子）表明，二次代谢物，卟啉和叶绿素代谢，Cutin Suberin和Wax生物合成，苯丙醇化生物合成，α-亚麻酸代谢和芸苔类化合物生物合成途径的生物合成是最丰富的（图。2D).差异上调和下调的代谢产物列于表中2．

CK和BS组之间的DEG和DEM分析

果皮的表型特征和代谢组学分析表明，角质、木质素和蜡的生物合成途径以及木质素的生物合成可能参与了BS的形成。脂肪酸延伸途径是角质木质素和蜡生物合成途径的上游[34.］．在转录组水平上，我们发现涉及蜡生物合成的许多基因在BS中下调，包括CYP94A1那HHT.那HTH那CYP704C1那WSD1， 和距离基因和10个KCS家族基因，提示蜡质减少可能是引起BS的原因之一(图。3.a b）。涉及木质素生物合成的六个基因，即，4CL2.那cad 1那CYP84A1那4CL1那CYP98A2， 和COMT1，两个基因被下调，即cad 6和CCR1（图。3.c），导致苯丙烷化生物合成途径中代谢物的上调（表2)．这些结果表明，BS的形成是由于表皮蜡质的减少和木质化细胞的增加。

转录组分析表明，植物 - 病原体相互作用（PPI）和MAPK信号通路（MAPK）也是与BS相关联的关键因素（图。3.D-F)。聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIPs (polygalacturonase inhibitors proteins, PGIPs)与植物细胞壁相关，在植物防御中起着至关重要的作用[35.，它们在BS中被上调。LSH10可能是一种转录调控因子，通过促进细胞对光的反应而发挥发育调控因子的作用，在BS中表达上调。我们还检测了6个钙相关基因在CK和BS中差异表达那包括凸轮那CML42那CML45那CANP7.那CALP2.， 和CaLP3,表明梨Exocarp中的钙含量可以是影响BS的因素之一。此外，我们在PPI和MAPK中发现了12次腕骨。这些结果表明，由袋装引起的梨子钙含量变化引起的防御反应涉及BS的形成。这些DEG的详细信息列于其他文件中4.:表S3。

通过代谢组学，我们发现CK和BS组之间的毒素（IAA）含量没有显着差异。在BS中，在BS中降低了细胞酮（CTKS），N6-二甲基烯丙基甲酰胺和Zeepin，而赤霉素（气体），脱落酸（ABA），茉莉酸（Ja）和水杨酸（SA）的含量在BS之外所有上调，除了吉布林蛋白A4（图。4.)．在转录层面，我们鉴定了植物激素信号转导的216只参与IAA，CTK，GA，ABA，JA和SA信号通路中的55,15,37,18,23和12℃（图。4.)．在IAA信号通路中，AUX1那Tir1.， 和AUX / IAA.基因表达下调，说明细胞增大和植物生长受到抑制。在CTK信号通路中CRE1和B-ARR基因表达上调，说明细胞分裂得到促进。在GA信号通路中，gid1c.和CES15被上调了吗GID1基因和SCL21那SCL22那SCL4那SCL14那SCL33那SCL30，和SCL11被上调了吗德拉基因。此外，鉴定出GA信号通路中bHLH家族的9个转录因子，其中6个上调，3个下调。BS中赤霉素含量和GA信号基因表达量的增加表明GA可能对BS有一定的促进作用。BS组中ABA、JA、SA含量较高，ABA、JA、SA信号通路基因表达量也显著增加，诱导了植株的抗病性。所有参与植物激素信号转导的基因的详细信息列于附加文件4.:表S4。

据报道，BS突然在温度下突然下降。冷漠或缓慢冷却通常用于生产以减少BS的发病率[12.那13.那14.］．我们确定了三种冷休克蛋白CS120（CS120）基因（基因ID：103937809,103,937,810,103,937,807）和一个低温诱导的65kDa蛋白样同种型X1（LTI65，基因ID: 103940885)在BS中显著上调(图。5.)．疏水蛋白RCI2B (rci2b，基因ID: 103955844)已被证实为冷诱导基因[36.]在BS中上调。Aquaporin是一种膜蛋白，最初是作为水通道的膜蛋白₂o可以渗透生物膜[37.］．Aquaporin pip中的四只°（基因ID：103946629,103,942,423,103,937,187,103,956,770），PIP1-4和pip2-8被上调，而PIP2-2和PIP2-5在BS中下调。

参与BS形成的转录因子（TFS）

TFs是激活或抑制编码和非编码基因的表达以影响或控制许多生物过程的重要调控因子[38.］．在我们对转录组数据的分析中，我们在CK和BS组之间检测到423差异表达TFS，包括341上调和82个下调的TFS。AP2-erebp，Myb和Wrky家庭是CK和BS组之间最丰富的TF家族，其次是BHLH，NAC，C2H2和HSF家庭（表3.)．

BS相关基因的共表达网络

在转录组分析中，我们发现蜡、木质素、钙、植物激素信号转导和冷诱导基因是BS形成的关键基因。我们进行了共表达网络分析，以阐明这些基因之间的协作，与转录组数据的分析显示，GA信号和IAA信号基因与蜡、木质素生物合成和钙相关基因分为不同的共表达簇(图。6.)．我们发现了bHLH137那bHLH128那IAA14和IAA27与脂肪酸伸长、角质、木质素和蜡的生物合成、木质素生物合成、MAPK和PPI的多个基因共表达。这些结果表明，BS的形成可能受植物激素信号，特别是IAA和GA信号的调控。

组合分析代谢物和转录组

MixOmics [33.[多功能用于多变量的维数减少，以探讨转录组和代谢组学之间的关系（图。7.A). mixOmics中block splsda功能用于分析差异基因和差异代谢物，plotVar和circosPlot功能用于可视化结果。我们发现，DEGs和dem的相关性非常密切。一般来说，大部分的deg和dem都远离圆心，这意味着它们之间有很强的相关性。或者，正则化正则相关分析(rCCA) [39.进行了测量基因和代谢物之间的相关程度（图。7.B).总共检测到6299个deg和1280个dem之间的相关性。我们用数字1-4命名四个象限。结果表明，第1象限和第4象限代表了DEGs和dem的表达趋势相反，说明DEGs和dem的表达呈负相关。而象限2和象限3代表了DEGs和dem的一致表达趋势，说明这些基因可能受到代谢物的正向调控。

磷、ABA和GA的影响_3.治疗上废话

用p，aba和ga治疗_3.研究了它们对黄冠梨BS的影响。8.P和ABA处理显著降低了BS的发生率和指数。用GA治疗BS的发生率和指数_3.均高于其他处理。结果表明，P处理对BS紊乱的抑制效果最好，ABA处理对BS、GA也有一定的抑制作用_3.治疗促进了BS的发生。

此外，我们还调查了不同处理的黄冠梨在贮藏期间BS的发病率。8.我们发现P处理在贮藏4个月和5个月时对BS有有效的抑制作用(图1)。8.(C, D)，而ABA处理抑制了BS在贮藏5个月时，但与CK相比，与其他时间段的结果没有显著差异(图5。8.D). GA后BS的发生率更高_3.在储存期间治疗，表明GA_3.可以在低温存储后促进BS（图。8.C, D, E)。

P，ABA和GA后梨Exocarp的转录组体分析_3.治疗

我们分析了梨Exocarp转录水平的变化，探讨了不同治疗对BS发生的影响。在P治疗后，鉴定了2363℃，包括2115个上调基因和248个下调基因。在与ABA处理后共发生3104次，包括2354个上调基因和750个下调基因。ga_3.治疗引起1566℃，包括1052个上调基因和514个下调基因（图。9.一种）。为了在不同治疗后进行DEGS的功能，进行了KEGG注释分析，并显示全球和概述地图，碳水化合物代谢，信号转导和环境适应是超级效果的（图。9.此外，我们鉴定了参与BS形成的基因的表达(图。9.b）并发现蜡生物合成相关基因，例如KCS10那KCS19那KCS11那距离那WSD1那CER1，P治疗后令人追讨。类似地，ABA治疗也增加了蜡相关基因的表达，包括KCS11那KCS20那KCS4.那距离．此外，用P和ABA治疗增加了PPI和MAPK途径中涉及的许多基因的表达，包括钙相关基因（凸轮那Calp3.那CALP2.那CANP7.那CML42， 和CML45)及WRKY TFs (WRKY71那WRKY11那WRKY24那WRKY75那WRKY53那WRKY26那WRKY22， 和WRKY40），这可能改善植物对疾病的抵抗力。但是，ga的效果_3.治疗并不明显。这些结果与在三种处理后观察到的BS的前一次发生率一致。

q-RT-PCR分析处理后基因表达

先前的研究表明，蜡层的减少可能是导致BS的原因之一。因此，我们分析了不同处理后‘黄冠’梨果皮中5个蜡相关基因的表达情况。10.)．我们发现了KCS11那距离那WSD1， 和CER1在P治疗后上调KCS11和CER1均在ABA处理后上调。表达OCR1.而GA_3.治疗。据报道，BS据报道与剥离中的缺钙有关[3.那9.那22.］．五个钙相关基因，CALP2.那Calp3.那CANP7.那CML45， 和CML42，在P和ABA治疗后上调，但在GA3处理后没有显示出表达的显着变化（图。10.)．此外，参与PPI和MAPK的五种基因可以通过各种生物和非生物应激激活[13.),包括PGIP和LSH10和三个腕毛的家庭tfsWRKY53那WRKY71那WRKY33．其中，表达的LSH10，WRKY53，WRKY71，和WRKY33在P和ABA治疗后增加到不同程度。表达PGIP在ABA处理后呈上升趋势。然而,遗传算法_3.治疗不影响这些基因的表达，甚至具有持续效应（图。10.)．这些结果与转录组数据一致。

检测了5个冷诱导基因的表达情况，分别为CS120-1(基因身份证:103937807),CS120-2(基因身份证:103937809),CS120-3(基因身份证:103937810),LTI65.和rci2b。结果表明，ABA处理增加了表达量CS120-1那CS120-2和LTI65，尽管CS120-1和LTI65.在P治疗后被下调。表达RCI2B.所有树木处理后均下降。结果表明，ABA处理可提高果实对冷害的适应性，而P和ABA处理对低温相关基因的表达影响不明显。

BS形成的调控网络

根据我们的调查和研究，我们认为许多因素导致BS，特别是低温。可能的调节网络如图2所示。11.．水果外芥子的发展是延迟的，以及CA的浓度²⁺装袋后减少。当果实变大时，脆弱的果皮经不起膨胀。当温度下降时，果皮被拉伸，出现裂缝，低温诱导基因上调，通过PPI和MAPK途径引起一系列的防御反应。此外，袋内的高湿度条件导致梨外果皮角质层变薄，可能导致果实表面出现裂缝。然后，死亡的细胞聚集在这些裂缝附近，最终成为BS。

影响“黄会”梨子上BS的因素

BS疾病是“黄川”梨的主要疾病，主要发生在成熟阶段的袋装水果中。然而，在未爆破的水果上也发现了小比例的BS案例，尽管疾病的形状大多是圆形的，而不是与袋装的形状（附加文件1：图。S5）。因此，袋装可能不是BS的唯一原因。我们观察到BS的发作表征，通过表皮蜡的显着减少，患有番茄症的近距离细胞的紧密布置（图。1)．转录组分析表明，在增加木质素相关基因的表达时，BS中蜡相关基因的表达减少（图。3.)，这与观察到的表型现象一致。然而，造成这种现象的原因仍不清楚。

据报道，BS与温度突然下降相关[12.那13.那18.］．BS已被认为是‘黄冠’梨冷藏后的冷害症状[30.］．研究表明，低温储存后，“黄川”梨易受BS障碍的影响[4.］．有报道称MeJA可以提高茄子的抗寒性(Solanum MelongenaL.），还可以抑制褐变紊乱[31.那40那41.］．该发现表明BS可能是由低温引起的。我们通过在正常的Pericarp中，通过BS高度表达的转录组科检测到四种低温诱导基因，包括CS120那LTI65.和RCI2B.基因(图。5.)．当温度骤降时，蛋白质的合成一般受到抑制，且产量明显低于正常生理温度;然而，冷休克蛋白(CSPs)在这些条件下显著增加[42.］．LTI65.和RCI2B.是由低温引起的吗拟南芥蒂利亚纳[36.那43.］．李。等等。[13.[研究结果表明，对“黄川”梨的效果，结果表明，冷运动有效抑制果皮棕色斑，对储存质量没有明显影响。基于这些发现，低温确实是BS的原因之一。

Pericarp的缺钙也对BS负责[3.那5.那9.那11.那17.那23.那24.那25.那26.那27.］．研究表明，水溶性和总钙²⁺皮肤和肉组织的内容和总CA.²⁺仅在BS的水果皮肤中的内容显着低于没有BS的水果[3.］．另外，胁迫不仅可以诱导植物钙信号转导，还可以诱导钙结合蛋白的表达[44.］．弗格森建议在加利福尼亚州的不平衡²⁺内容物导致导致生理疾病的代谢障碍[45.］．在我们的研究中，通过转录组分析感染和未受影响的终端中的钙相关基因的表达。我们检测到六种与钙相关的基因在BS中上调，即，CALP2.那Calp3.那CML45那CML42那CANP7.， 和凸轮．这些基因参与了PPI和MAPK通路。此外，研究表明钙与钙之间存在着密切的关系²⁺和水素（aqp）活动[46.］．CA的效果²⁺关于AQP活动主要通过CDPK实现[47.］．某些环境因素，如干旱、低温、光照和营养缺乏等，可以促进AQP基因的表达[48.那49.］．我们检测到四个AQP基因表现出不同的表达，即PIP1-4那pip2-8那PIP2-2， 和PIP2-5（图。5.)．AQP基因可能通过调节钙浓度来影响BS。

MAPK信号通路是CK-BS比较组中最显著富集的通路，它与各种生理、发育和激素反应相关[50.］．分子和生化研究表明，MAPK激活与刺激处理相关，例如低温，干旱，伤害，病原体感染，超渗透性和反应性氧物质[51.那52.那53.那54.那55.］．已检测到PPI和MAPK途径的基因。PGIP已证实改变梨果实细胞壁降解产物组成，增加果胶单体含量，诱导植物抗病性[56.，在BS中被上调。WRKY家族TFs参与植物防御反应[57.］．我们检测到12个腕表，显示出差异表达（图。3.)．因此，BS病可能是水果对不利环境反应的表现。

植物激素信号转导也在BS的形成中发挥着关键作用。荷尔蒙提示调节植物生长和发展的许多方面，从而促进植物在系统性上响应环境变化的能力[58.］．我们发现涉及IAA信号传导途径的基因被下调，而涉及GA和CTK信号传导途径的基因被上调（图。4.)．已经显示冷温度通过减少养蛋白积累来抑制植物生长[59.］．另外，之前的一项研究表明，低温诱导GA的增加_3.灵敏度 [60.］．我们预测低温导致植物激素信号通路基因的差异表达，这表明低温可能是引起BS的最重要原因。

此外，果袋湿度可能是影响BS的另一个因素。研究表明，蜡受温度、光照强度和湿度的影响[61.，高湿度会抑制蜡的合成[62.］．除了蜡外，果实表面上有网状或条带裂缝引起的肉细胞在开发阶段连续膨胀，从而导致表皮膨胀和裂缝。一些研究发现，这些裂缝很容易受到外部环境因素的影响[63.］．这些裂缝可能是BS的原因。在AQP的作用下，棕色斑点形成在梨果实中。因此，湿度可能是BS形成的关键影响因子。

不同治疗对“黄川”梨BS的影响

通过转录组分析筛选BS中关键差异表达基因。不同处理均显示P和ABA显著抑制了BS的发生。然后分析处理后关键基因在转录水平上的表达情况。结果表明，磷处理可以提高蜡相关基因的表达WSD1和远的，产生更厚的角质层。钙相关基因的表达Calp3.那CML45那CML42那CANP7.， 和凸轮上调，可缓解水果Exocarp的缺乏症。另外，P治疗改善了PPI和MAPK途径所涉及的基因的表达，包括LSH10那WRKY53那WRKY71那WRKY33那WRKY31那WRKY26， 和WRKY11，提高了果实对不利环境的适应性，从而抑制了BS的发生。

ABA治疗也对BS进行了一定的抑制作用。据报道，ABA控制蜡合成基因的表达，防止叶片水损失[64.］．然而，它是一种参与植物对胁迫反应的主要激素。在我们的研究结果中，我们发现ABA处理可以增加钙相关基因的表达CALP2.那Calp3.那CML45那CML42， 和CANP7.通过增加表达式，可以提高水果的适应性PGIP那LSH10那WRKY53那WRKY71那WRKY75那WRKY33那WRKY31那WRKY26那WRKY24， 和WRKY11．总的来说，ABA处理可以使外果皮变粗，提高果实的抗病性。

本研究表明，BS的发生伴随着蜡层的减少和死细胞的木质化积累。在转录水平上，蜡合成相关基因大幅下调，木质素和木质素生物合成相关基因大幅上调，钙和低温相关基因大幅上调。另外，由于CTK降低，ABA、JA、GA和SA增加，CK组和BS组内源激素含量存在差异，这与除CTK外的信号转导相关基因的表达趋势一致。我们还发现P和ABA处理对BS有不同程度的抑制作用，而GA_3.治疗可能会促进BS。不同处理后与BS形成相关的关键基因表达水平与发病结果一致。这些结果为黄冠梨褐斑病发生的分子机制提供了理论依据。

植物材料和治疗

2018年收获季，在安徽省宿州市砀山县果园收获“焕冠”梨(CK)和“黄冠”梨(BS)。采用喷施NaH进行处理₂阿宝_4.h·2₂O (0.2%， Sigma 04269)， ABA (100 μM, Sigma A1049)， GA_3.（300 Mg / L，Sigma G8040）在“黄会”梨上10日，20日，盛开（DAFB）后30天。试剂处理通常用于生产过程中的水果袋。每种治疗有三种生物重复，每棵树约有120种治疗的水果。

梨收获后立即被运送到安徽农业大学(合肥，中国)的实验室。用双面刀片从果皮上剥离0.5 mm厚的外果皮。从“黄冠”梨外皮CK和BS中随机采集6个生物重复进行代谢谱分析。用CK、BS和不同激素处理的3个生物重复进行RNA测序(RNA- seq)。采集的水果样品立即在液氮中冷冻，然后在−80℃保存。

梨Exocarp的石蜡切片和扫描电子显微镜观察

在果实表面上取下污垢后，用双面刀片切割0.6cm×0.7cm件，并立即以FAA溶液固定。用锋利的刀片切割3mm组织块，然后固定在电子显微镜固定溶液中。在ServiceBio（武汉）生物技术有限公司进行石蜡切片和电子显微镜果实的制备

梨采后水损耗测量

本试验以相同大小的患BS病的‘黄冠’梨果实为对照，在室温条件下25°C保存并进行试验。失水率(RWL)计算公式为RWL (%) = (FW_T1.−弗兰克-威廉姆斯_T2.)/FWt1 × 100% (FW_T1.=一定贮藏时间内果实重量t1, FW_T2.=水果在一定贮藏时间内的重量t2) [34.］．每组有10个水果，进行三个独立的生物重复。

黄斑病变的评估

根据梨表面上斑点的覆盖率，将BS发病率分为4个水平[31.]：0对于NO褐变，1〜10％，2个持续11％〜20％，3％〜30，31％〜100％。基于以下公式计算BS的指数：索引=σ（水果×入射水平的数量）/ [总果实数×4（最严重的级别）] [3.］．

代谢物统计分析

数据采集采用先进的Xevo G2-XS QTOF质谱仪(Waters, UK)，使用商用软件Progenesis QI (version 2.2) (Waters, UK)和BGI代谢组学软件包metaX [65.]用于质谱数据分析(过滤出相对标准偏差(RSD)大于30%的离子)。鉴定基于京都基因和基因组百科全书(KEGG，http://www.genome.jp/kegg/）数据库。在虚假发现率调整的超光测量测试统计数据中评估显着富集的途径（P.≤0.05)。我们使用R软件包中的prcomp函数来执行PCA。该项目使用了多元PLS-DA模型中前两个主成分的可变重要性投影(VIP)值，结合单变量分析中的fold change (FC)和q值来选择差异表达代谢物(dem) (VIP > 1和FC > 1.2或< 0.833，且调整后的q值< 0.05被认为具有显著性)。聚类分析使用了R中的pheatmap包中的pheatmap函数。

梨Exocarp的转录组分析

根据指示，通过乙醇沉淀和CTAB-PBIOzol试剂从植物组织纯化总RNA。DNA纳米杆装入图案化的纳米阵列中，并在BGISEQ500平台（中国BGI-深圳）上产生单端50基读数。读取质量低，连接器污染和比例N.>在数据分析前剔除5%，以确保结果的可靠性。将筛选到的干净reads与中国白梨(Pyrus Bretschneideri.）[1]通过Hiteat。通过袖扣V2.1.1从读取对准结果组装并注释转录物[66.］．基因表达水平的计算依据是每千碱基的转录本每百万标记reads (FPKM)，并进一步利用这些结果分析差异表达基因(DEGs) [67.］．DEGSEQ方法基于泊松分布，并根据王L.等人描述的方法进行DEG检测。[68.］．FC值>−2(上调)或<−2(下调)和调整的转录本P.-Value <0.001被认为是显着的。BGI交互式报告系统（https://report.bgi.com)用于后续分析。

qRT-PCR分析基因表达

采用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测不同处理下BS相关基因的转录水平。使用TRIzol试剂盒(Tiangen)按照制造商的说明从收集的植物材料中提取总rna。利用ABI PRISM 7300序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, California)在光学48孔板上使用SYBR Green (Toyobo, Shanghai)进行qRT-PCR。为保证数据的可靠性，进行了3次生物重复。

支持本文结论的转录组数据集可在美国国家生物技术信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA682706)．支持本文结论的代谢组数据集可在中国国家基因库数据库(https://db.cngb.org./ CNP0001613）。

BS:

布朗宁现货

惩罚:

甲基jasmonate

1-MCP：

1-甲基环丙烯

病人:

不₂阿宝_4.h·2₂O.

阿坝:

脱落酸

遗传算法_3.：

赤霉素A3

与原:

细胞分裂素

SEM：

扫描电子显微镜

IAA：

生长素

GA：

赤霉素

JA：

茉莉酸

山:

水杨酸

DAFB：

盛开后的日子

度:

差异表达基因

DEM：

差异表达的代谢物

FPKM：

每百万百万映射的成绩单每千碱基映射的碎片

FC：

褶皱变化

rwl：

水分流失的速度

主成分分析:

主成分分析

PLS-DA：

由偏最小二乘判别器绘制的图

应急服务国际公司+:

电喷雾电离阳性离子模式

ESI−:

电喷雾电离负离子模式

TFs:

转录因素

贵宾:

投影的不同重要性

PPI：

植物与交互

MAPK:

MAPK信号通路

AQP：

水素蛋白

存在:

定量实时聚合酶链反应

作者希望感谢黄康(BGI)在数据分析方面提供的帮助。

国家自然科学基金项目(no . 31972985)和国家农业科研专项资金(CARS-28-14)资助。

作者指出

1. 齐王，新沂吴和李柳是联合第一作者。

从属关系

1. 安徽农业大学园艺学院，安徽合肥，230036

   王琦，吴欣怡，刘莉，姚道志，李金超，方杰，陈晓楠，朱立武，刘普，叶振峰，贾冰，衡伟

贡献

QW和WH构思和设计了这项研究。XNC和DZY进行了治疗实验。JF和JCL收集了水果并为RNA制备。LWZ，PL和ZFY有助于数据分析。XYW，BJ和LL准备了数字和表格。XYW进行了QRT-PCR验证。WQ写了手稿和HW修改了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应于Bing贾或者魏亨．

伦理批准并同意参与

我们的研究没有涉及任何人类或动物的对象、材料或数据。本研究的植物材料采自安徽省宿州市砀山县某园林园区的果园，由安徽农业大学保存。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

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