拟南芥培养基稻草稻草稻草稻草族族同源物的保守和非储蓄功能，调节MBW复合蛋白

背景

拟南芥中的毛皮组合由R2R3 MYB转录因子GLABRA1（GL1），MYB23或MYB82，BHLH转录因子GLABRA3（GL3），GLABRA3（EGL3）的增强子形成的MYB-BHLH-WD40（MBW）转录活化剂复合物调节或透明的Testa8（TT8）和WD40重复蛋白透明Testa Glabra1（TTG1）。然而，MBW复合蛋白的稻米同源物的功能保持不表达。

结果

基于氨基酸序列同一性和相似性，以及蛋白质相互作用预测，我们将OSG1，OSG13和OSTTG1S鉴定为MBW复合蛋白的稻米同源物。通过使用原生质体转染，我们表明OSG1D，OSG1E，OSGL3B和OSTG1A主要是核心，OSGL3B用作转录激活器，并且能够与GL1和TTG1相互作用。通过使用酵母双杂交和原生质体转染检测，我们表明OSG13B能够与OSG1E和OSTTG1A相互作用，并且OSG1E和OSTTG1A也能够与GL3相互作用。另一方面，我们发现OSGL1D用作转录激活器，它可以与GL3相互作用但不是OSGL3B。此外，我们的结果表明表达了OSTTG1A.在里面TTG1.突变体恢复了毛状体和根毛的形成、种子颜色、粘液生成和花青素合成等表型，表明OsTTG1A和TTG1可能具有类似的功能。

结论

这些结果表明拟南芥MBW复合蛋白的稻米同源物能够形成MBW复合物，但可能具有保守和非保守的功能。

毛状物在植物的空中部位表面上是附属物。毛状体是从表皮细胞开发的，外观多样化。毛状体可以通过增加表皮组织和环境之间的边界层厚度来保护植物免受过热和水分，以及来自昆虫或病原体攻击[1，2］.

现有证据表明，拟南芥的毛状体起始受一个由R2R3 MYB转录激活子、一个bHLH转录因子和一个wd40重复蛋白形成的MYB-bHLH- wd40 (MBW)复合物调控[3.，4，5，6，7］.该MBW复合体中的R2R3 MYB转录因子是GLABRA1（GL1）[8， bHLH转录因子是GLABRA3 (GL3)， GLABRA3的增强子(EGL3) [9，10]或透明的testa8（tt8）[11，而wd40重复蛋白是透明的TESTA GLABRA1 (TTG1) [12］.已经表明，MyB23和MyB82也能够与GL3和/或EGL3相互作用，并调节培养体形成[13，14］.MBW转录激活复合物能够诱导同源结构域蛋白基因的表达GLABRA2（GL2) [15]，导致培训培训体启动[3.，4，5，6，7，16］.

这个MBW复合物也能诱导一些R3 MYB基因的表达，包括tryptichon.（试一试），任性（中国共产党），try和cpc1的增强器（etc1） 和etc3［17，18，19，20.，21，22］.这些R3 MYB转录因子，包括ETC2，TRICHOMELEST1（TCL1）和TCL2，其表达不受MBW复杂的调节[22，23，24，25，能够移动到邻近的细胞，在那里它们与GL1竞争GL3的结合，从而抑制MBW复合物的形成，导致毛状体起始的抑制[3.，4，5，6，7，26，27，28］.

至少在一些植物中，MBW复合蛋白调控毛状体起始的功能是保守的，例如，芸苔属植物显著植物表达拟南芥GL3产生异位毛[29] GL1和GL2的棉花同源物调节拟南芥中的培养体引发[30.，31]和毛状体的表型TTG1.突变体通过表达苹果得以恢复TTG1同族体基因(32］.

尽管毛状体可以为植物提供保护[1，2]，无毛被认为是大米中最喜欢的农艺性质（栽培稻)，因为无毛米粒具有更强的包装能力，而且无毛米粒产生的致痒尘埃较少[33，34］.因此，努力解决了在水稻中培养的培养中的调控机制来解决巨大的努力。

到目前为止，在水稻中鉴定了几种滴毛体启动的调节剂，其中一些是拟南芥的同源物，而其他人则不是。例如，OSWOX3B，GL2的同源物调节水稻中的培养基[33，34，35］.SPL9是一种Squamosa启动子结合蛋白，已被证明通过直接调节表达式来调节拟南芥中的培养体引发TCL1［36]， SPL9的同源物OsSPL10也能够调控水稻的毛状体起始[37］.这些结果表明，水稻中的滴毛组可通过与拟南芥中的类似机制调节。

另一方面，已经显示了SDG714，组蛋白H3K9甲基转移酶HL6（毛片6），AP2 / ERF转录因子和型B型反应调节剂参与水稻培养体引发的调节[35，38，39]但是它们都不是已知的拟南芥毛状体引发调节剂的同源物。我们以前的研究还表明，TCL1的同源物也能够调节拟南芥的毛细血管，但不含水稻[40］.这些结果表明，水稻毛状体的起始也可能受到不同机制的调控。

本文报道了拟南芥毛状体启动调节MBW复合体蛋白的水稻同源蛋白的鉴定和特性。基于氨基酸序列同源性和相似性以及蛋白互作预测，我们鉴定出OsGL1A-OsGL1E、OsGL3A-OsGL3C、OsTTG1A和OsTTG1B分别为GL1、GL3和TTG1的同源物。通过拟南芥原生质体转染实验，我们发现这些蛋白在形成MBW复合物中可能具有保守和非保守的功能。通过转基因植物表达OSTTG1A.在里面TTG1.我们发现，在拟南芥中，OsTTG1A和TTG1可能在调节毛状体起始、根毛形成和次生代谢方面具有类似的功能。

水稻中MBW复合蛋白的同源物

在以前的实验中，我们已经确定了osgl1a.，OSGL1B.和OSGL1C.拟南芥GL1的同源基因OsGL3A，OsGL3B作为Arabidopsis GL3的稻米同源物，和OSTTG1A.,OSTTG1B.作为拟南芥的稻米同源物ttg1 [40］.

为了检查水稻中的MBW同源物是否可以形成MBW复合物，首先分析它们对弦的互动关系（https://string-db.org/）.我们发现OsGL1D (Loc_Os03g29614)和OsGL1E (Loc_Os06g10350)被预测为OsGL3B的潜在相互作用蛋白。如图1所示。1a, OsGL1蛋白在氨基酸水平上与GL1的相似性为29.4% ~ 36.3%，与GL1的相似性为43.9% ~ 54.6%。1一种）。系统发育分析表明，OSG1A与OSG1B密切相关，而OSG1D与OSG1E有关。与OSG1C一起，这五个OSG1S形成了疏水板（图。1b）。另一方面，GL1与MyB23关闭，它们与MyB82一起形成另一个疏水板（图。1b).序列比对表明，OsGL1s最保守的区域是R2R3 MYB结构域(图1)。S1）.MYB转录因子与R/ b样bHLH转录因子相互作用所需的[D/E]L × 2[R/K] × 3L × 6L × 3R氨基酸特征[41]，而S残基已被证明是活化所需的GL2［42]在所有五个OSG1S中完全保守（图。S1）.

对于OSGL3S，OSGL3A和OSG13B两者均显示出超过33％的同一性和与GL3和EGL3的相似性超过51％，而对于OSG13C，分别仅为25％和40％（图。1c).系统发育分析表明，OsGL3A与OsGL3B亲缘关系密切，它们与GL3和EGL3对组成了一个进化枝(图3)。1d).序列比对结果显示，OsGL3s最保守的区域是n端和c端(图1)。S2）.OsGL3A和OsGL3B，而不是OsGL3C与GL3和EGL3在HLH结构域区域以及GL3与GL1相互作用所需的前97个氨基酸高度相似[9] （图。S2）.

在水稻的MBW复杂蛋白同源物中，OsTTG1s是最保守的同源物。OsTTG1A和OsTTG1B与TTG1的相似性分别为60.5%和49.3%，75.4%和63.7%。1e）。系统发育分析表明，OSTG1A与TTG1密切相关（图。1F）。序列对准显示出OSTG1S和TTG1在全长氨基酸序列水平处高度保守（图。S3.)，包括TTG1与GL3相互作用所需的25个氨基酸序列[9］.

In order to get a better pictures on the relations that exists between the Arabidopsis MBW complex component proteins and their rice homologs, we identified MBW complex component protein homologs, i.e., proteins with highest amino acid similarity with GL1, GL3 and TTG1, respectively, in the Brassicaceae family plants芸苔属植物拉伯，Capsella Grandiflora和危害风疹，Fabidae家庭植物甘氨酸最大，Malpighiales家庭植物Populus Trichocarpa.和Panicoideae科植物玉米，Setaria Italica.和黍hallii，并消耗了系统发育分析。结果表明，OSG1S和Arabidopsis GL1，MyB23和MyB82仍然在两个不同的片状中（图。S4）.拟南芥GL1，MYB23和MYB82与来自三种芸苔属植物和Malpighiales家庭植物的同源物密切相关p . trichocarpa而OsGL1s与三种Panicoideae科植物和Fabidae科植物的同源基因关系较近g·马克斯(无花果。S4）.另一方面，OSG13C和TT8形成了一种疏水膜，而GL3，EGL3，OSGL3A和OSG13B与来自上述所有八种植物的同源物形成另一个疏水物，其中OSGL3A和OSG13B形成了来自三个胰腺家族的同源物的亚疏水层植物和GL3和EGL3形成了来自三种碳酸植物的同源物的另一个亚片，p . trichocarpa和g·马克斯(无花果。S5）.对于WD40蛋白，单独的OSTG1B形成了一种疏水物，而OSTG1A，TTG1和来自所有八种植物的同源物形成另一个植物，其中来自三种胰腺家庭植物的OSTG1A和同源物形成了亚洲疏水链，以及来自的TTG1和同源物三种芸苔植物，p . trichocarpa和g·马克斯形成另一个子分支（图。S6）.

MBW复合物同源蛋白的亚细胞定位

以前的报告显示，GL3，GL1和TTG1都是核的本地化[43］.基于上述生物信息学分析，选择OsGL1A、OsGL1B、OsGL1C、OsGL1D、OsGL1E、OsGL3B和OsTTG1A进行亚细胞定位分析。选择OsGL1A和OsGL1B是因为它们与GL1具有较高的氨基酸同源性和相似性。而根据STRING分析，OsGL1D和OsGL1E是OsGL3B的潜在相互作用子。之所以选择OsGL3B，是因为OsGL3A和OsGL3B都与GL3具有较高的氨基酸同源性和相似性，我们预测OsGL3B在STRING上与OsGL1D和OsGL1E相互作用，而OsGL1C没有与OsGL1的其他蛋白配对。选择OsTTG1A是因为它与TTG1具有较高的氨基酸同源性和相似性。

我们研究了它们在拟南芥原生质体中的亚细胞定位。用GFP融合构建的MBW复合物同源基因转染拟南芥原生质体，在共聚焦显微镜下观察GFP荧光。我们发现OsGL1D、OsGL1E、OsGL3B和OsTTG1A主要定位于细胞核，而OsGL1A和OsGL1B可能定位于细胞核，也可能定位于细胞膜和叶绿体等其他细胞器(图1)。2）.

OSG13B是转录激活剂，它与拟南芥原生质体中的GL1和TTG1相互作用

我们之前已经表明，GL3用作转染拟南芥原生质体中的转录激活剂[44］.为了检查水稻中的MBW复杂同源物质是否可以形成MBW复合物，如果OSG13B也可以作为转录激活剂检查。效应基因的质粒Gd.，gd-osgl3b.或GD-GL3，与报告基因一起Gal4-GUS将与拟南芥原生质体共转染，通过使用微孔板读卡器检查GUS活性。结果表明，类似于GD-GL3, cotransfectiongd-osgl3b.激活报告基因表达(图。3.一种）。

已经表明，OSG13b用作转录激活剂，我们通过检查它们在酵母细胞和拟南芥原生质体中的相互作用来形成与GL1和TTG1的MBW复合物。如图1所示。4在酵母细胞中，OsGL3B与GL1和TTG1相互作用。Cotransfection的OsGL3B和GD-GL1和GD-TTG1.，分别激活的报告基因在原生质体中的表达(图。3.b），表明OSG13B可以在植物细胞中与GL1和TTG1相互作用。

OsTTG1A和OsGL1s与OsGL3B和GL3的相互作用

上述结果表明OSGL3B能够与GL1和TTG1形成MBW复合物。然后，我们将进一步检查是否可以使用OSG1S和OSTTG1A形成MBW复合物。为此，我们将OSG13与OSG1S和OSTTG1A的相互作用检查在酵母细胞和拟南芥原生质体中。如图1所示。4，OSG3B能够与OSG1D，OSGL1E和OSTTG1交互。同样地，COTRANSFETETOsGL3B和gd-osttg1.在原生质体中激活报告基因表达，而COTANSFETFETETOsGL3B和GD-OsGL1A或GD-OsGL1B未能这样做（图。5一种）。但是，COT转化OsGL3B和GD-OsGL1E活化报告基因表达(图。5b).这些结果表明OsGL1E、OsGL3B和OsTTG1A可以形成MBW复合体。

我们的原生质体转染实验也表明，OsTTG1A和OsGL1E都可以与GL3相互作用(图。5)，表明拟南芥和水稻中MBW复合体蛋白在形成MBW复合体过程中是可互换的。

令人惊讶的是，我们发现转染GD-OsGL1D活化报告基因表达(图。5b)，表明OsGL1D与GL1和其他被检测的OsGL1s不同，它是转录激活子。我们的结果还表明，当GL3， 但不是OsGL3B是CoTransfectedGD-OsGL1D(无花果。5b)，表示OsGL1D可以与GL3交互，但不能与OsGL3B交互。

异位表达OSTTG1A.获救TTG1.表型

在显示OSGL1E，OSGL3B和OSTTG1A之后，可以形成MBW复合物，我们想进一步检查它们是否可能与拟南芥同源物具有类似的功能。考虑到这一点TTG1.突变体具有多种明显的表型，与毛状体和根毛细胞命运决定和次级代谢有关，包括种子颜色、粘液产生和花青素生物合成[12，45，46)，而OsTTG1A与TTG1具有较高的氨基酸同源性和相似性，我们决定通过检测是否异位表达来检测OsTTG1A是否是TTG1的功能类似物OSTTG1A.可以挽救的TTG1.突变表型。

在中产生转基因植物TTG1.通过表达突变植物OSTTG1A.在控制的控制下35个年代启动子(35 s: OsTTG1A / ttg1）.两个独立的纯合线用于表型分析。如图1所示。6一个,记录TTG1仅在Ler野生型植物中可检测到，而OSTTG1A.只是可检测到的35 s: OsTTG1A / ttg1转基因植物，相对高转录水平OSTTG1A.在35 s: OsTTG1A / ttg1＃1线。我们观察到两者的植物35 s: OsTTG1A / ttg1转基因株系在莲座丛叶和茎上产生毛状体(图。6b).定量分析表明35 s: OsTTG1A / ttg11号系在莲座叶上产生更多毛状体(图。6c），与该线幼苗的相对高的转录物水平一致。另一方面，在两者中观察到减少的根毛形成35 s: OsTTG1A / ttg1与之相比的转基因线TTG1.突变体（图。7A)，而定量分析显示根毛密度在35 s: OsTTG1A / ttg1转基因幼苗与Ler野生型相似(图。7b）。

种子颜色表型TTG1.突变体在恢复35 s: OsTTG1A / ttg1转基因植物，但也到两种不同线的不同程度（图。8a).而粘液的产生35 s: OsTTG1A / ttg1＃1线几乎与Ler Wild类型相似，但在＃2线上的线上很像类似于TTG1.突变体（图。8B)，花青素的生物合成也在很大程度上恢复35 s: OsTTG1A / ttg1＃1线，但不是＃1线幼苗（图。8c).这些结果表明OsTTG1A可能是TTG1的功能类似物。

然后，我们检测了下游毛状体形成调节基因TTG1在Ler野生型的表达TTG1.突变体和35 s: OsTTG1A / ttg1转基因植物幼苗，包括GL2和R3 myb基因。我们发现表达水平GL2被显着减少，而那样etc2和TCL2增加了TTG1.突变体，而在35 s: OsTTG1A / ttg1转基因植物在很大程度上类似于LER野生型幼苗（图。9）.

由R2R3 MYB转录活化剂GL1，BHLH转录因子GL3，EGL3或TT8形成的MYB-BHLH-WD40（MBW）复合物，以及WD40重复蛋白TTG1调节拟南芥中的培养体引发[3.，4，6，7，24］.通过鉴定和表征水稻毛状体启动调节MBW复合物的同源蛋白，我们发现类似的MBW复合物可能存在于水稻中，而且复合物中至少有一些成分可能具有与拟南芥中类似的功能。

First, the rice homologs shared similar features as the Arabidopsis MBW complex, i.e., the [D/E]L × 2[R/K] × 3L × 6L × 3R amino acid signature required for the interaction of MYB transcription factors with bHLH transcription factors [41]和激活所需的s残留物GL2［42]，在所有的5个OsGL1s中都是完全守恒的(图。S1）;GL1的前97个氨基酸区域是与GL3相互作用所必需的[9[osg1a和osg1b两者高度保守（图。S2）;以及TTG1中与GL3相互作用所需的25个氨基酸区域[9]，在OSTG1A和OSTTG1B中也高度保守（图。S3.）.第二，有研究表明GL3具有转录激活子的作用，而GL1和TTG1没有[41，44]，同样，我们的结果显示，OsGL3B激活了转染的原生质体中的报告基因表达，而OsGL1E和OsTTG1则没有激活报告基因的表达(图。3.）.第三，OsGL3B分别与OsGL1E和OsTTG1A相互作用。3.和4)，表明它们可以形成MBW络合物。另外，OsGL1E和OsTTG1A可以与GL3相互作用。3.和4）和OSG13与GL1和TTG1相互作用（图。5)的研究表明，水稻同源蛋白与拟南芥MBW复合体蛋白可互换形成MBW复合体。最后，异位表达OSTTG1A.恢复了TTG1.突变体（图。6，7和8)，表明OsTTG1A可能是控制拟南芥毛状体形成的功能类似物。考虑到OsGL1E和OsGL3B能够与OsTTG1A形成MWB复合物，那么它们在拟南芥中是否分别与GL1和GL3在调控毛状体形成方面具有相似的功能，值得进一步研究。由于OsTTG1A和OsTTG1B的高氨基酸序列相似，所以研究OsTTG1B是否也具有相似的功能是很有意义的。考虑到OsGL3A与OsGL3B密切相关，研究OsGL3A是否可以与OsGL1s和OsTTG1A形成MBW复合体也很有意义。

由GL1，GL3 / EGL3和TTG1形成的MBW复合物通过激活来调节培养型开始GL2［3.，4，5，7]，但同样的MBW复合物也可以激活R3 MYB毛状体起始抑制基因[17，18，19，20.，21，22］.尽管我们之前的研究表明，OSTCL1可以调节拟南芥中的毛细血管，但它不能在水稻中[40]，考虑到水稻中的滴毛组发酵可以由oswox3b调节，gl2的同源物[33，34，35]如果通过OSG11，OSGL3B和OSTTG1A形成的MBW复合物，可以通过激活调节水稻中的培养运动，值得注意OsWOX3B．

如上所述，我们的一些实验支持稻米同源物和拟南芥MBW复合蛋白可能具有守恒的功能，但其他一些也表明他们也可能具有非保守的功能。第一，与OSG1D和OSG11相比，OSG1A和OSG1B与GL1共享较高的氨基酸序列同一性和相似度（图。S1)，但不能与GL3或OsGL3B相互作用(图。3.和4）.考虑到[D / E] L×2 [R / K]×3L×6L×3R氨基酸特征和所需的S残留物在所有五个OSG11s中保存（图。S1)，很可能其他一些氨基酸残基对OsGL1s/GL1与GL3/OsGL3B的相互作用也很重要。根据氨基酸序列比对,在R3 MYB域OsGL1A OsGL1B,只有少数氨基酸不同于这些GL1 OsGL1E,它将检查如果其中任何一个感兴趣的关键的交互OsGL1s / GL1 GL3 / OsGL3B。第二，与GL1不同，OsGL1D是转录激活子(图1)。3.）.OSGL1D不太可能包含激活域，而其他OSG1S没有，因为之前我们已经显示了GL1的C终端域赋予转录激活活动，但作为一个整体，GL1不起转录激活器[44］.因此，弄清楚为什么OSGL1D整体的原因是值得的，能够展示其转录激活活动，而GL1和其他OSG1S则不能。第三，OSG1D与GL3相互作用，但不是OSGL3（图。3.和4）.考虑到OSGL1D与OSGL1E密切相关（图。1），检查为什么OSGL1D可以与GL3相互作用但不是OSGL3B来说也很有意思。

我们的研究结果表明，OsGL1E、OsGL3B和OsTTG1A能够形成MBW复合体，它们与拟南芥MBW复合体蛋白可互换形成MBW复合体。此外，在拟南芥中，OsTTG1A还可以与TTG1互换调控毛状体的起始。我们的结果还表明，OsGL1D是一个转录激活子，它可以与GL3相互作用，但不能与OsGL3B相互作用。这些结果表明，水稻同源蛋白和拟南芥MBW复合蛋白具有保守和非保守功能。

生物信息学分析

鉴定米中GL1和GL3同源物（栽培稻)，包括OsGL1A, OsGL1B, OsGL1C, OsGL3A, OsGL3B, OsGL3C, OsTTG1A，和OsTTG1B已经被描述过[40］.OSGL1D和OSGL1E被识别为弦乐圈的差异相互作用蛋白（https://string-db.org/）.

全长氨基酸序列用于系统发育分析和序列比对。对系统发育进行系统发育分析（www.phylogny.fr.)，以默认设置的“一键式”模式。在网站“系统发育分析”页签中选择“一键式”进行分析，按提示输入氨基酸序列。选择“一键”模式后，点击“概述”可以查看“一键”模式的详细设置。序列比对使用BioEdit生成。采用MatGAT (v2.02)计算氨基酸同一性和相似性的百分比[47］.

植物材料和生长条件

粳稻品种Nipponbare采用Columbia-0 (Col)拟南芥(Landsberg erecta, Ler)拟南芥(Landsberg erecta, Ler)拟南芥作为对照进行表型分析。的TTG1.突变体在Ler Ecotypic背景中[12］.

为了进行毛状体表型分析、原生质体分离和植株转化，如前所述，对拟南芥材料的种子进行发芽和在土壤花盆中生长[48］.为了进行根毛表型分析，对种子进行表面消毒，然后将种子播种在固化的1/ 2ms (Murashige和Skoog)培养基上，然后在如前所述的生长室内垂直生长[40］.每条线的超过15种幼苗用于滴毛组和根发表型分析。

从拟南芥中分离RNA以检测其表达TTG1和OSTTG1A.，勒野生型的种子TTG1.突变体,35 s: OsTTG1A / ttg1转基因植物经过表面消毒，然后播种在固化的1/ 2ms培养基上，在生长室内垂直生长，如前所述[48］.对于每个基因型，使用至少8株幼苗的混合进行RNA分离。

为从水稻中分离RNA，克隆相关基因，种子Nipponbare水稻在生长室内的水中生长10天。生长室内光照周期为16 h /8 h，光密度为~ 120 μmol m⁻²年代⁻¹，并且拟南芥的温度为22℃，米为28℃[40］.将五种幼苗的混合物用于RNA分离。

用于表型分析和检查基因表达水平的种子被种植并在相同的条件下达到相同的时间。

RNA分离，RT-PCR和QRT-PCR

用10天大的拟南芥和水稻幼苗进行RNA分离。总RNA用EasyPure分离^TM值植物RNA试剂盒(转基因生物技术)和遵循制造商的说明。cDNA采用EasyScript First-Strand DNA Synthesis Super Mix (TransGen Biotech)按照生产程序合成，用于RT-PCR和qRT-PCR扩增。的表达式分析TTG1和OSTTG1A.，表达actin2.（ACT2.)作为对照。的表达式GL2MYB R3基因的表达ACT2.被用作内部控制。

用于扩增的引物osgl1a.是5'-caacatatgatggggggaggtcgccgtgc-3'and 5'-caacttaagtcatttcatggggagggcttctg-3'，适用于OSGL1B.是5 ' - caacatatgatggggaggtcaccg -3 '和5 ' -CAACTTAAGTCATTTCATTTCCAAGCTTCTG-3 'OSTTG1A.是5 ' -CAACATATGGAGCAGCCCAAGCCG-3 '和5 ' - caacttaagtcagaccctgagagagctgga -3 'GL1是5 ' -CAACATATGAGAATAAGGAGAAGAGATGA-3 '和5 ' -CAACTTAAGCTAAAGGCAGTACTCAACATC-3 '吗TTG1是5 ' -CAACATATGATGGATAATTCAGCTCCAGATTCG-3 '和5 ' -CAACTTAAGTCAAACTCTAAGGAGCTGCATTTTG-3 'GL3是5'-caacataTggctaccggacaaaaacag-3'和5'-caagagctctcaacagatccatgcaaccc。以前描述了用于RT-PCR的其他引物[40，48］.

构造

核指标构造NLS-RFP.，记者构建GAL4：GUS.效应者构建Gd.(Gal4 DNA结合域)，猫，GL3，GD-GL3，GD-GL1，GD-TTG1.用于原生质体转染以前有过描述[44，49，50］.

使HA(人类流感血凝素)标记OsGL3BGFP(绿色荧光蛋白)标记和/或gd标记OsGL1s，OsGL3B和OSTTG1A.利用从水稻幼苗中分离的RNA，或合成的(for .) RNA，通过RT-PCR扩增相应基因的全长ORF (open-reading frame)OsGL3B，OsGL1C, OsGL1D和Osgl1e.）由Sangon Biotech Co.，Ltd，用N末端HA，GFP或GD标签克隆框架，并在双层的控制下35个年代推动者进入pUC19向量(50，51］.

为了使35S：OSTTG1A.构造用于植物转化，HA被标记OSTTG1A.构建在pUC19用Ndei和Aflii消化并括在二元载体中PPZP211向量(52］.

为酵母 - 二杂化测定产生诱饵和猎物构建体，OsGL3B被克隆到了pGBKT7向量(Oebiotech),GL1和TTG1和水稻中的同源物基因被克隆到PGAdt7.矢量（Oebiotech）。

植物转化与转基因植物选择

表型挽救实验35S：OSTTG1A.Construct被引入农杆菌肿瘤术gv3101，并用来改变TTG1.使用花卉DIP方法突变植物[53］.的TTG1.用于转化的突变体植株约5周大，主花序上有几朵成熟的花。

将T1种子播种在含50 μg/ml卡那霉素和100 μg/ml卡苄西林的1/ 2ms培养基上，以筛选转基因株系。在含25 μg/ml卡那霉素的1/ 2ms培养基上萌发，获得20多株转基因植株，选择3株含毛状体T1的转基因植株，在T2中分离出T-DNA单插入位点的转基因植株，在T3中分离出纯合子株系。用两个纯合子系的种子进行表型分析。

酵母2台混合动力分析

根据制造商的说明，通过使用酵母转化系统2（CLONTECH）进行酵母双杂化测定。

质粒DNA分离、原生质体转染及GUS活性测定

用GoldHi EndoFree质粒Maxi Kit (CWBIO)按照制造商的说明分离用于原生质体转染的质粒DNA。

从3 ~ 4周龄Col植株50 ~ 60个莲座叶中分离到原生质体，并采用上述方法转染报告基因和效应基因质粒[50］.

采用GFP融合构建质粒和核指标构建质粒，对水稻GL1、GL3和TTG1的亚细胞定位进行研究NLS-RFP.共转染原生质体。将转染后的原生质体置于室温黑暗下孵育20 ~ 22 h，荧光显微镜下观察GFP和RFP荧光并拍照。

检查报告基因的OSG13B的转录活性，报告基因的质粒GAL4：GUS.还有效应基因gd-osgl3b.共转染原生质体。Cotransfections的Gd.和GD-GL3分别作为阴性和阳性对照。为了研究OsGL3B与报告基因GL1和TTG1在植物细胞中可能的相互作用GAL4：GUS.，效果基因GD-GL1或GD-TTG1.,OsGL3B或猫共转染原生质体。检查OSTG1A或OSG1S与OSG13B或GL3，报告基因质粒的可能相互作用GAL4：GUS.，效应基因GD-OsGL1s或gd-osttg1a.,OsGL3B，GL3或猫共转染原生质体。Cotransfections的Gd.作为对照。转染后的原生质体在室温和黑暗下孵育20 ~ 22小时。使用酶标仪(Synergy™HT, BioTEK)测定GUS活性。每个组合的转染包含3个生物学重复，实验重复至少2次，结果相似。

粘液生产测定

如前所述染色并安装种子[54[在动机K解剖显微镜下检查粘液和粘液。至少30种种子用于测定。

花青素生物合成测定

花青素生物合成分析如前所述[55[除了5％而不是3％的蔗糖用于实验。

显微镜

在Olympus FV1000共聚焦显微镜下观察转染后原生质体的GFP荧光并拍照。在Motic K显微镜下观察叶毛、根毛、粘液、花青素和种子颜色，并使用连接在显微镜上的EOS 1100D数码相机拍摄照片。使用EOS 1100D数码相机拍摄茎毛的照片。

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本公布的文章中。

• 2021年6月18

  已发表对本文的更正:https://doi.org/10.1186/s12870-021-03074-7.

COL：

哥伦比亚 - 0.

GD：

Gal4 DNA结合域

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

哈:

人流感血凝素

l:

兰茨贝格erecta

MBW：

MYB-bHLH-WD40

女士:

Murashige和Skoog.

子:

开放阅读框架

PEG：

聚乙二醇

SD-TL：

SD-Trp-Leu

SD-TLH：

sd-trp-leu-his

SD-TLHA：

SD-TRP-Leu-His-Ade

WT：

野生型

我们感谢所有实验室的帮助建议。

吉林省自然科学基金项目(20200201155JC);国家重点研发计划项目(2016YFD0101900);临沂大学启动基金项目(LYDX2019BS039)。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或手稿准备方面没有任何作用。

作者笔记

1. Kaijie Zheng和Xutong Wang在这项工作中同样贡献。

隶属关系

1. 中国科学院东北地理学与农业生态研究所大豆分子设计育种重点实验室，中国长春

   Kaijie Zheng.

2. 东北师范大学遗传学研究所的MOE分子外观遗传学重点实验室，中国长春

   Kaijie Zheng，Xutong Wang，Yating Wang＆Shucai Wang

3. 临沂大学生命科学学院，植物分子遗传学与作物基因编辑实验室，中国临沂

   嘘王

贡献

S.W.构思了这项研究。kz和s.w设计了实验。K.Z.， X.W.和Y.W.做了实验。K.Z.和s.w对数据进行了分析，并撰写了论文。所有作者都参与了稿件的修改。作者阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到嘘王．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

这篇文章的原始在线版本经过了修改:作者们在相同贡献者的声明中发现了一个小错误。“郑凯杰和王旭彤对这一作品的贡献相等”的缺失。

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