生物炭诱导的根系结构改善增强了棉花植物幼苗的营养增量GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

通过改善根系结构提高作物的氮气利用效率非常重要，不仅可以降低农业生产成本，而且是减轻气候变化。生物炭如何影响作物幼苗如何影响氮素同化的生理机制并未得到很好地阐明。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这里，我们报告了根系结构的变化，棉花培养型氮同化酶的关键酶的活动，以及棉花幼苗阶段的细胞蛋白（CTK），其不同土壤层的尿素用途和生物炭施用减少（0-10厘米和10-20厘米）。当尿素用量减少25％时，活性根吸收面积，鲜重和氮气农艺效率显着增加，并且在表面土层中施加生物炭。谷氨酰胺Oxoglutarate氨基转移酶（Gogat）活性与尿素/生物炭的应用深度密切相关，当尿素/生物炭施加在0-10cm层中时，它会增加。谷氨酰胺 - 丙酮转氨酶活性（GPT）也显着增加。通过CTK在非常细根中刺激硝酸还原酶（NR）活性，但在细根中抑制。此外，GydF4y2BaAMT1; 1, gdh3GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaGDH2.GydF4y2Ba当尿素用量减少25%和施用生物炭时，极细根中叶绿素含量显著上调。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

在棉花苗期，减少25%尿素用量和施用生物炭对土壤氮素同化效率有显著影响。的co-expressionGydF4y2BaGDH3.GydF4y2Ba和GydF4y2BaGDH2.GydF4y2Ba在细根中提高氮农艺效率GydF4y2Ba．GydF4y2Ba铵态氮转运蛋白基因的协同表达GydF4y2BaGDH3.GydF4y2Ba表明，生物炭可以是氨基酸代谢是有利的。GydF4y2Ba

生物炭是通过生物质的干碳化、热解或气化产生的，而水炭是通过生物质在压力下的水热碳化产生的浆状物质。生物炭粒度细、多孔、比表面积大，富含氮、磷、钾等官能团和营养物质[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．生物炭的应用已经被认为是一种有效的，环境友好的农业管理技术，提高氮肥利用率，同时减少氮肥施用量。它不仅提高氮的吸收，而且通过调节根形态和相关生理和代谢过程[增强氮同化GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．生物炭已被提出作为一种土壤改良剂，以加强养分保留，减少养分流失，提高土壤肥力和作物生长，并固碳[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．在一些种植系统中，Biochar添加有助于减少氮肥输入，同时保持生产力[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba，因为生物炭是对常用于从硝酸盐中捕获氮以提高碱土根际氮生物有效性的场地准备技术的良好补充[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］．根据其他报道，生物炭施用水平影响土壤养分和植物根系表型[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．此外，研究表明生物炭改变作物氮利用效率并增加根际微生物群落多样性[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]，它与根顺序密切相关[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．生物炭增加微生物生物量[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]，特别是与氮循环密切相关的氨氧化细菌(AOB)的丰度[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba，并引起NO的巨大变化GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba- n / NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba不同根阶根际土壤-N比值的变化。虽然关于AOB对NO的影响有很多研究GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba- n / NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N比例，关于矿物质氮，根际AOB界之间的相互影响，当BioChar应用于灰色沙漠土壤时，对矿物质氮，根际AOB界和根顺序知之甚少。GydF4y2Ba

生物炭诱导的矿质氮和激素相互作用的变化可能会随着氮同化而影响根系发育[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］．例如，添加生物炭改变了根的形态(更大的比根长，更小的根直径，更低的根组织密度)，以促进氮的吸收，表明无论施肥水平如何，根的增殖都很好[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba］．Di Lonardo等[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba发现生物炭降低了乙烯浓度并增加了组织培养杨树的根数，表明根表型受生物炭的显着影响。建议生物炭在根部开发过程中变化，这可能有助于氮循环，特别有助于增加捕获肥料和土壤的机会[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］．然而，生物炭通过诱导根系表型变化影响氮代谢的证据尚不充分。GydF4y2Ba

另外，生物炭之间可能存在更多关键链接和根表型的氮代谢和基因表达的相互作用[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]发现生物炭对细根的生理活性（氮可用性和养猪变化）的影响更大[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．最近的研究报告称50和100克GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba，说明生物炭的这种作用可能与剂量无关，而与激素激活有关[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]. 研究表明，添加生物炭可提高谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酰胺氧谷氨酸转氨酶（GOGAT）和硝酸还原酶（NR）的活性，从而改善氮同化[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba］．Hashem等人[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba[揭示生物炭通过增加NR活性来提高鹰嘴豆的氮同化效率。深入检查表明Biochar的DOM通过刺激NR和GS基因表达来促进氮同化并提高氮效率[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba］．虽然已经有大量关于植物各器官和作物中酶的研究报道，但生物炭诱导的根表型变化对氮代谢的调控机制仍有待阐明。GydF4y2Ba

生物炭影响激素水平和空间分布格局，可能是影响氮代谢关键酶活性的主要因素[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］．Waqas等人[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]认为研究中茉莉酸信号的变化反映了生物炭对生物胁迫的缓解作用。最近的研究表明，生物炭刺激赤霉素途径，促进番茄和小麦植株的生长[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba］．相反，Hale等人。[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba发现，600°C-Pyrolyed松木锯末Biochar对养肝合成没有影响。早期的研究强调，根功能和根生长之间的平衡取决于乙烯信号通路和增强的H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba积累[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．虽然生物炭无关的植物内源激素的变化发生，但目前还不清楚Biochar是否会干扰CTK代谢并进一步影响GDH和铵转运蛋白（AMT）编码基因。GydF4y2Ba

一些研究表明，与GDH1-2-3突变体的野生型相比，每个器官中未检测到GDH。的25％的根GDH活性降低在GDH2突变体仅实现，而在根系统中的30％的活性增加gdh3突变体[达到GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba］．Sun等人[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba]发现，在玉米中的氮代谢相关组学特性和转录水平（zmGS1and zmAS1）中显著时氮肥降低并施加生物炭上调。通过Jaiswal等人番茄转录分析。[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]表明生物炭对基因表达具有启动效应;该小组还发现，上调的基因与植物生长有关，如茉莉酸、CTK、生长素和细胞壁。Kumar等人证明AMT1不仅影响NH之间的相互作用GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba- n,没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba-N在侧根生长过程中存在，生长素与NH之间也存在GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在稻根中[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．一些研究表明，Biochar通过干扰非生物应激下的微生物信号来调节植物基因[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba］．因此，生物炭可能通过多种途径影响AMT和GDH基因的协同效应。然而，生物炭介导的根氮代谢机制尚未阐明。尽管已被广泛报道，在养分吸收、氮储存和表型方面，不同根序之间存在显著差异[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]，目前对减氮条件下不同根序氮素代谢或氮素同化的研究较少，这使得我们无法充分了解添加生物炭减氮条件下氮素代谢的机理。GydF4y2Ba

本研究的目的是评价土壤参数(NH)的变化GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba,没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba和AOB丰度），棉根中的氮气代谢酶（NR，GDH，谷氨酸 - 丙氨酸转氨酶（GPT）和GS），以及由此引起的棉根生物学特征（根源吸收区域，生物质和氮气农艺效率）生物炭加入尿素的减少。此外，棉花AMT和棉花的影响GydF4y2BaGDHGydF4y2Ba在生物炭诱导的氮代谢上进行了研究，以便学习表达式之间的一致性和差异GydF4y2Baamt.GydF4y2Ba和GydF4y2BaGDHGydF4y2Ba铵态氮同化途径，以及ctk刺激的硝酸盐代谢对幼苗生长的影响。试验验证了三个假设:(1)添加生物炭会改变土壤生化特性，对土壤氮态有正影响，增加AOB丰度;(ii)生物炭诱导的效应有利于根系种内变异引起的串扰GydF4y2BaAMT1; 1GydF4y2Ba和GydF4y2BaGDH2.GydF4y2Ba;（iii）在生物炭施用和降低的尿素使用过程中的幼苗将显示出更高的氮代谢和生长速率。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

种子GydF4y2Ba陆地棉GydF4y2Ba49，从新疆九祖种子有限公司，中国新疆维吾尔自治区，中国，在无菌水中灭菌20分钟，放在培养皿上。在48到72小时后GydF4y2Ba休眠释放GydF4y2Ba在4°C的黑暗条件下，将培养皿转移到温室的生长盆中发芽。GydF4y2Ba

实验设计GydF4y2Ba

试验中使用的塑料罐(高21厘米，直径20厘米)每个装有7.5公斤灰色沙漠土壤。设置了以下处理:GydF4y2Ba

• Ck:不使用尿素或生物炭;GydF4y2Ba

• 锑:3.76克尿素公斤GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba0-10 cm土层的施土量;GydF4y2Ba

• Bb: 3.76克尿素千克GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba10 - 20 cm土层施土;GydF4y2Ba

• Soa:尿素比sb少25%，加上37.28克生物炭公斤GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba0-10 cm土层的施土量;GydF4y2Ba

• Sob:尿素与sb + 37.28 g生物炭kg相比减少50%GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba0-10 cm土层的施土量;GydF4y2Ba

• BOA：与BB加上37.28 G BioChar KG相比，尿素减去25％GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba10 - 20 cm土层施土;GydF4y2Ba

• 尿素比bb加37.28克生物炭少50%GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba10 - 20 cm土层施土;GydF4y2Ba

使用450℃下棉花秸秆热解获得的土壤和生物炭的性质如表所示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．每盆移栽健康棉苗12株，建立后削薄至5株。GydF4y2Ba

这些花盆被随机放置在新疆农业大学的一个苗圃中（E 43°49′07〃，N 81°51′16〃）。同时，土壤含水量保持在60% ~ 现场水容量的65%，光照14小时，黑暗10小时，温度保持在15°C至30°C。经过20天的生长，棉花植株被从花盆中取出，分成地上部分和地下部分。收集根际土壤后，在流水下仔细清洗根，并进一步分成细根(GydF4y2BaD.GydF4y2Ba = 0.1–2 mm) and very fine roots (D.GydF4y2Ba < 0.1 mm). Segments (20 mm in length from the apex) of both the fine and very fine roots were stored in liquid nitrogen before high-throughput sequencing.

酶活性分析GydF4y2Ba

对于粗酶提取，在添加0.05 mol/L HCl（pH 7.2）后，在冰上和地面上用2 mL咪唑在冷研钵中预处理根样品。将匀浆静置30分钟，通过两层纱布过滤，并在12000 g下离心20分钟。所有上述操作均在4°C下进行。GydF4y2Ba

用于GOGAT活性测定的反应混合物包括:0.4 mL 20 mmol/L L-谷氨酰胺、0.5 mL 20 mmol/L α-酮戊二酸、0.1 mL 10 mmol/L KCl、0.2 mL 3 mmol/L NADH、0.3 mL粗酶溶液和1.5 mL 25 mmol/L三盐酸缓冲液(pH = 7.6)。反应开始后，连续测量酶活性一段时间，每20秒用光度计记录340 nm处的消光值，直到光密度稳定下降7倍。GOGAT活性表示为单位反应时间内NADH还原产物的生成量。GydF4y2Ba

根据Cervilla等人进行NR活性的测定。[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］．在最终体积为0.8ml的反应混合物组成0.5ml 100mmol / L磷酸钾缓冲液（pH7.5），0.1ml 100mmol / L KnoGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba， 0.1 mL 2 mmol/L NADH, 0.1 mL粗酶溶液。在25°C孵育20 min后，以0.05 mL 1 mol/L醋酸锌终止反应。反应液3000 g离心10 min，用蒸馏水稀释上清0.6 mL至1 mL。将生成的亚硝酸盐与磺胺重氮化，与N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐反应生成偶氮染料，在540 nm分光光度下测定。谷氨酸脱氢酶活性也根据Cervilla等进行测定。根据Kasim和Dowidar测定谷丙转氨酶活性，以反应300分钟后单位时间产生的丙酮酸量表示[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

酶活性结果以平均值±标准误差(GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 5).

细胞分裂素含量测定GydF4y2Ba

细胞分裂素含量是通过酶联免疫吸附法测定的。GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba］．简而言之，用冷自来水冲洗根样品，以除去粘合剂土颗粒，用砂浆均化，液氮中的杵，用磷酸盐缓冲液（pH = 5）在-20℃下萃取1小时，以10,000×离心离心 GGydF4y2Ba和4°C 15分钟，在-20°C再次与辣根过氧化物酶孵育30分钟。最后，用酶标仪(Neogen 4700, USA)对细胞分裂素进行定量。GydF4y2Ba

高吞吐量排序GydF4y2Ba

RNA提取GydF4y2Ba

Total RNA was extracted from the cotton root using TRIzol® Reagent (Ambion, USA) according to the manufacturer’s instructions and genomic DNA was removed using DNase I. Then, RNA quality and quantity were determined with a 2100 Bioanalyser (Agilent, USA) and a NanoDrop ND-2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA), respectively. Only high-quality RNA sample (OD260/280 = 1.8 ~ 2.2, OD260/230 ≥ 2.0, RIN ≥ 6.5, 28S:18S ≥ 1.0, and > 1 μg) was used for preparation of the sequencing library.

文库准备和Illumina测序GydF4y2Ba

RNA-seq转录组库由Illumina (San Diego, CA)的TruSeq™RNA样品制备试剂盒制备，使用1 μg总RNA。简单地说，信使RNA用磁性寡核苷酸(dT)珠富集，用碎片缓冲液将其碎片化成短片段。采用SuperScript双链cDNA合成试剂盒(Invitrogen, CA)，随机引物合成双链cDNA。然后对合成的cDNA进行纯化、末端修复、磷酸化和polyA尾部。用2%超低范围超琼脂糖筛选文库，用Phusion DNA聚合酶(NEB)进行PCR扩增。用TBS380进行定量后，用Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000测序仪(2 × 150 bp read length)对配对端RNA-seq文库进行测序。GydF4y2Ba

读地图GydF4y2Ba

原始reads由SeqPrep (GydF4y2Bahttps://github.com/jstjohn/seqprep.GydF4y2Ba)及镰刀(GydF4y2Bahttps://github.com/najoshi/sickleGydF4y2Ba)，以获得高质量的干净读取。然后，使用HISAT2将干净的reads与参考基因组进行比对[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba］．使用基于参考的汇编程序StringTie进行组装对齐的读取[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

差异表达分析GydF4y2Ba

为了在两个不同的样品之间鉴定差异表达的基因（DEGS），基于每百万读数（TPM）的转录物计算每个转录物的表达水平。使用RSEM软件量化基因丰富[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．差异表达分析基本上采用Q≤0.05的DESeq2/DEGseq/EdgeR和|log基因进行GydF4y2Ba_2GydF4y2BaFC|> 1和Q≤0.05 (DESeq2或EdgeR)/Q≤0.001 (DEGseq)被认为是DEGs [GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

土壤NO的测定GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba- n和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-NGydF4y2Ba

采集植物生长20 d的根际土壤样品，用1mmol /L KCl溶液提取，NO浓度为1mmol /LGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba使用CleverChem 380随机访问分析仪(Dechem-Tech，汉堡，德国)比色测量，根据制造商的说明[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

Ammonia-oxidizing细菌GydF4y2Ba

根际土壤样品用于AOB分析。qPCR反应混合物由10 μL quantitative SYBR green master mix (Qiagen, Valencia, CA, USA)、0.25 μL正向和反向引物、2 μL DNA模板(~ 10 - 40 ng DNA)和无核酸酶HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba最终体积为20 μL。标准曲线(GydF4y2BaR.GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba > 0.99) were generated by amplifying using the serial dilutions of the synthesized copies of the target gene sequences. All qPCR reactions were performed in quintuplicate and amplification efficiencies ranged from 80 to 90.8%. Amplification specificity was determined using melt curve analysis. The 16 s rDNA fragments of AOB were amplified by nested PCR (nest-PCR) and the primer sequence was used. F27/R1492 is a common primer used for bacteria. CTO189F/CTO654R is a specific primer for AOB; F341/R518 is a V3 region specific primer for 16 s rDNA.

使用AOB引物CTO189F-5 'GCAGRAAAGYAGGGGATCG和CTO654R-5 'CTAGGYTTGTAGTTTCAAACGC [GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

Bonferroni基因GydF4y2BaP.GydF4y2Ba值< 0.05视为差异表达[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba］．除配对t检验的方法，使用秩产品的方法根据不同级别的FDR来检测差异表达的基因。Transcripts satisfying both the above family-wise error rate level and FDR < 0.0001% were presented to achieve an optimal interpretation of the transcriptome. Genes were sorted by descending rank product values to provide a hierarchical list based on both strength and reproducibility, which was used as an input to identify groups of genes with the same or related annotated functions. BlastX was used to combine Unigene Sequence with NR (Non-redundant Protein Sequence Database in GenBank), Swiss-Prot (Swiss-Prot Protein Sequence Database), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) and COG (Cluster ofOrthologous Groups of proteins were compared in the database (Evalue < 1E-5) to obtain the proteins with the highest sequence similarity to Unigene, thereby obtaining the protein functional annotation information of the Unigene. According to the NR annotation information, Blast2Go software was used for GO annotation. After the GO information of each Unigene was obtained, WEGO software was used for GO function classification statistic [57.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

没有变化GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba- n和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-n在根际GydF4y2Ba

有在没有明显的差异GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba- 在生物炭施用处理中细根根际之间的内容和非常细的根源（表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.此外，生物炭用量与施用深度之间存在较强的交互作用。根际没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba无论施用深度如何，施用生物炭均能增加-N含量。在0 ~ 10 cm土层，NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba-N含量在非常细根的根际的含量略高于细根的根源。根际没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba- 当尿素在0-10cm层中减少25％时，含量显着增加。没有的内容GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Baboam的-N比bbm高42%。在10 ~ 20 cm土层，NO含量最高GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba根际-N含量为6.33 mg LGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba．这说明细根对作物养分的吸收利用结果(GydF4y2BaD.GydF4y2Ba < 2 mm) may not be sufficient. Results based on further divided root functional segments (D.GydF4y2Ba< 0.1 mm和0.1 D.GydF4y2Ba< 2 mm)可以更清楚地反映根际氮浓度的变化。GydF4y2Ba

铵态氮与NO的变化趋势相似GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba- 在根际。nh的内容GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba25%尿素降低处理的细根和极细根根际-N显著高于对照。在0-10 cm土层，NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N降低0.003 mg LGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba在非常细根的根际，同时增加了0.026毫克GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba与100％尿素处理相比，生物炭处理中的细根的根际。当BioChar应用于10-20cm层时，NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N在boaf和boam中分别降低59%和57%GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

副本AOB的数量GydF4y2Ba

极细根和细根根际AOB拷贝数为4.71 ~ 8.65 × 10GydF4y2Ba^7.GydF4y2Ba4.53-10.8 × 10GydF4y2Ba^7.GydF4y2Ba分别为(表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），这表明细根可能为AOB提供了更多的生态效力。Boa非常细根的根际的AOB拷贝数为5.44×10GydF4y2Ba^7.GydF4y2Ba从SOA，SOB和BOB中的那些没有太大不同，并且略高于CK。与CK相比，在常规尿素施用处理中，两层细根的根际在细根的根际的量减少，而在25％和50％的尿素还原处理中（施加到0-10cm层）增加分别为1.86-和1.78倍。蟒蛇中细根的根际的Aob数量高达1.08×10GydF4y2Ba^8.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

尿素还原与生物炭施用对氮素代谢关键酶的影响GydF4y2Ba

尿素还原与生物炭施用相结合，强烈干扰幼苗根系中的氮代谢，导致氮代谢参与的关键酶的活性差异。与常规尿素施用处理相比，在25％尿素还原处理中，非常细根中的GDH活性增加了两倍，而细根的情况一般下降，在SOBM中最大降低91％。GDH活性显着下降（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05) when urea application was reduced by 50% (Fig.1GydF4y2Ba一个)。GydF4y2Ba

与ck相比，GPT活性显著增加(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)。显著下降(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05) in the very fine roots in boa. Reduced application of urea did not significantly influence GPT activity, indicating that 50% reduction in urea application in the 0–10 cm layer only influenced the GPT activity in fine roots while 25% reduction in urea application in the 10–20 cm layer influenced the GPT activity in both the fine and very fine roots (Fig.1GydF4y2BaB)。GydF4y2Ba

在生物炭处理下，GOGAT活性与上述3种酶的变化趋势不同。当10-20层尿素用量减少50%时，极细根和细根GOGAT活性均显著降低(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05 and 0.01, respectively) as compared with ck (Fig.1GydF4y2BaC)。与对照和常规尿素处理相比，抽薹的NR活性显著升高，而其他处理的NR活性降低(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2BaD)。GydF4y2Ba

以往的研究表明，AMTs在NH中起重要作用GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba氮素的吸收和转运直接影响氮素代谢和根系发育。样品中amt的转录水平发生了显著变化(表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.如图所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,GydF4y2BaAMT1; 1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAMT1; 3GydF4y2Ba极细根和细根的基因表达量均有上调或下调的趋势，且随着尿素用量的增加，基因表达量的变化更为明显。的表达GydF4y2BaAMT1; 1GydF4y2Ba在SOAM中下调2.14折，但在SOAF中上调3.91倍（表GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.生物炭在0 ~ 10 cm土层中对根系中AMT基因的表达有促进作用，在10 ~ 20 cm土层中对AMT基因的表达有抑制作用(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA).作为另一组转录因子，gdh显著影响氮效率。的表达GydF4y2BaGDH2.GydF4y2Ba极细根中，soa比ck增加62%，bb、boa和bob显著减少，sb和SOB变化不大。在鲍伯处理中，细根中gdh的表达量显著降低，而在其他处理中变化不大(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2BaB)。GydF4y2Ba

CTK和NR之间的串音GydF4y2Ba

NR的活性是强烈的位置依赖性和与CTK密切相关。它在非常细的根部（范围为9至45），但抑制在细根（范围为16至27）中，CTK（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.结果表明，生物炭增强了CTK与NR的协同效应，一方面可以降低细根的代谢成本，另一方面可以加速极细根的氮素同化和周转。GydF4y2Ba

氮气还原与生物炭施用对根特征的影响GydF4y2Ba

非常细根的有源吸收区域增加了9.43厘米GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba细根增加1.80 ~ 9.10 cmGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba在soa中的应用与传统尿素的应用(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一个)。根部鲜重的变化与主动吸收区域的变化类似，即非常细根的鲜重的鲜重降低，而细根的变化不大减少。SB和BOA中非常细的根部的鲜重重量以及BB中的细根的重量显着下降（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05);然而，soa中细根的新鲜重量显著增加(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.01)(图GydF4y2Ba4.GydF4y2BaB).氮肥农艺效率提高1.49 kg kgGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba在soa中，减少了0.91 kg kgGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba在蟒蛇中，在其他治疗中表现出越来越大的趋势（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

提高作物氮素利用效率(NUE)，不仅可以降低种植成本，还可以减少化肥生产相关的能源消耗，从根本上缓解全球气候变化[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba］．生物炭与化学氮肥(如尿素)的联合施用，与单纯施用化肥相比，可通过减缓氮肥释放、调节微生物多样性、促进硝化抑制反硝化等方式，有效提高作物产量和氮肥利用率[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba］．目前已有许多研究关注生物炭施用改善土壤氮素有效性从而提高氮素农艺效率，但根际氮素有效性增加相关分子信号或根系表型的报道较少[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba］．最近的一份报告指出，根系的表型和构型受土壤矿物氮、水分和温度等生物物理和化学性质的影响。因此，植物根在其细胞结构、解剖学、细胞类型、形状、代谢和生化特性等方面具有巨大的表型可塑性[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]，引起根订单之间的功能差异。生物炭应用可能会扩大这种差异。例如，Biochar对D <0.5mm的根的形态特性表现出更强的影响[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．结果表明，降低25%尿素与生物炭联合施用可提高氮肥农艺效率;极细根和细根根际AOB和矿质氮均增加，其中极细根增加幅度较大。但也有研究发现，AOB的多样性随着生物炭的施用而降低或不发生变化，这可能与土壤pH和NH的变化有关GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba内容(GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba］．结果表明从遗传到表型的变化GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

广泛的研究表明外源性NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在水稻和拟南芥中触发基因表达、代谢、激素信号和根表型的多种特定变化[GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba因此，提高作物根系对NH的亲和力GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba也没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba能否提高氮的利用效率可能与调控氮代谢的关键酶密切相关[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．一般情况下，随着施氮水平的降低，NR、GDH和GS活性均呈下降趋势。这是因为代谢池和非代谢池中的氮水平是由外源矿质氮浓度决定的。相比之下，GOGAT与作物氮素表型有关，即在低氮水平下，其活性仍然很高[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．例如，研究表明，含有内部的根部变异和根际氮可用性的增加提高了氮效率和促进作物生长[GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba］．本研究观察到的参与氮代谢的关键酶的活性变化趋势与文献报道一致。我们认为细根根际AOB的增加是酶活性变化的重要原因。生物炭的应用有助于降低高等植物在合成氨基酸和核酸方面的能量消耗，增加NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba通过AMT转移到细胞中，并且有利于通过信号分子进行根表型调节[GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba70GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

植物中的amts是由...编码的GydF4y2BaAMT1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAMT2GydF4y2Baamt1与高效NH相关GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba运输在植物。GydF4y2BaAMT1; 1GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba主要表现在根和叶，而GydF4y2BaAMT1; 3GydF4y2Ba仅表示为根;GydF4y2Ba这两个GydF4y2Ba对缺氮很敏感[GydF4y2Ba71.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba72.GydF4y2Ba］．当氮气不足时，GydF4y2BaAMT1; 1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAMT1; 3、GydF4y2Ba根本真皮中显着上调。上调GydF4y2BaAMT1; 2、GydF4y2Ba这与根中的碳和氮代谢相关联[GydF4y2Ba73.GydF4y2Ba，则更加引人注目。这项研究的结果表明GydF4y2BaAMT1; 3GydF4y2Ba在非常细的根部明显上调，但在细根中明显下调。这表明了GydF4y2BaAMT1; 3GydF4y2Ba在细根中，用生物炭应用更容易受到调节。皮质中的结构变异可以是主要因素，根际的碳变异可能导致根部的氮/碳代谢。GydF4y2Ba

谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GDH)是植物在生物或非生物胁迫下铵态同化的限速酶。涉及NADH-gdh的代谢过程主要发生在根中[GydF4y2Ba74.GydF4y2Ba］．在黑暗或压力下，会发生可逆反应，为三羧酸循环提供碳框架[GydF4y2Ba75.GydF4y2Ba]，说明GDH是碳氮代谢的中间体，与环境关系密切。尿素还原处理下，极细根中GDH活性显著增加，而细根中GDH活性变化不大。原因可能是这些处理中较暗和较碱性(pH 9.8)的环境刺激了GDH蛋白编码，提高了GDH活性[GydF4y2Ba76.GydF4y2Ba］．此外，生物炭在不抑制碳代谢的情况下，提高了幼苗的光合作用[GydF4y2Ba77.GydF4y2Ba］．增加土壤有机质或微分子含量，在一定程度上弥补了碳的缺乏[GydF4y2Ba78.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba79.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

通常，高等植物中的GDH对NH具有弱亲和力GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba的，因此，NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba主要由GS / Gogat途径吸收。本研究的结果还表明，尿素还原加生物炭申请对非常细根中的Gogat活性具有很强的抑制作用，但对细根的轻度效果。在诱导的GS / Gogat途径中的铵同化过程中，外源铵离子可能不会降低，但甚至增加（在某种程度上），因为生物炭增加了细根根际的αob分集，这导致不增加GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba[GydF4y2Ba80GydF4y2Ba］．结果部分地证实，生物炭除了用于减少尿素应用到供给植物需要的氮补偿，保持氨基酸的稳定性中的氮代谢库，并最终降低的缓和尿素应用到根的效果。GydF4y2Ba

NR是高等植物氮代谢的另一关键酶。它受到NO的强烈影响GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba并与荷尔蒙相互作用[GydF4y2Ba81.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba82.GydF4y2Ba］．结果表明，与CK相比，SOBM中NR活性在SOBM中增加了83％，只有略微升高，并与CK相比，在其他治疗中显然降低。这表明高分浓度GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba在根际抑制极细根的生长，而促进细根的发育。因此，NR活性发生了变化，这可能与生物炭延缓根系衰老有关[GydF4y2Ba83.GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba生物炭所创造的特定环境有利于硝酸盐还原酶/亚硝酸盐还原酶在根和茎中的表达，从而促进植物/作物的生长和产量[GydF4y2Ba84.GydF4y2Ba］．此外，大量的实验证实，生物炭显着改变了根流症环境[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba80GydF4y2Ba］．在黑暗条件下，细根产生更多的CTK, NR活性增加;生物炭的施用创造了一个较暗的环境，并促进了氮同化(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaA).分子动力学分析表明，CTK增加生物炭界面NR活性的可能机制是，生物炭诱导的小分子可能通过降低能垒进入活性位点。GydF4y2Ba

简而言之，当尿素剂量减少25％时，施加生物炭，GydF4y2BaAMT1; 1GydF4y2Ba和GydF4y2BaGDH2.GydF4y2Ba铵态氮同化改善，这与AMT与GydF4y2BaGDH3.GydF4y2Ba．CTK刺激下极细根NR活性的提高也对铵态氮同化有重要贡献。GydF4y2Ba

给出的结果表明，系统之间的串扰GydF4y2BaGDH2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaAMT1; 1GydF4y2Ba信号通路影响了氨同化GydF4y2Ba陆地棉GydF4y2Ba在还原尿素加生物炭的条件下。苗期氮素农艺效率为1.51 ~ 3.99 kg kgGydF4y2Ba^-1GydF4y2BaBioChar应用治疗比CK更高。据推测，这种差异是直接结果GydF4y2BaGDH2.GydF4y2Ba上调和gdh3补充。生理上，降低尿素加生物炭条件下，GPT和GDH活性的提高是苗期氮素同化较高的原因。虽然高氮同化在很大程度上依赖于GDH途径，但它也受到根系功能和发育阶段的影响。GydF4y2Ba

我们进一步发现CTK不能在生物炭施用条件下激活而且抑制NR活性，这与根转周转率，年龄和功能直接相关。在生物炭施用处理中，CTK在非常细根中对NR活性显示出刺激作用，但在细根中抑制效果。这表明Biochar的应用深度对根生理学产生了很强的影响。总体而言，生物炭诱导的上调GydF4y2BaGDH3.GydF4y2Ba表达可以部分解释细根中氮同化的改善。GydF4y2Ba

在这项研究中，我们证明了减少氮肥用量加上生物炭施用对氮同化效率的影响与激素活化密切相关。了解极细根和细根的不同功能将为有效提高氮同化效率提供支持。我们还需要进一步探索各种激素与氮代谢酶之间的相互作用，即进一步揭示在减少氮肥用量和生物炭施用的情况下，根系表型与氮代谢之间的深层联系的机制。此外，生物炭对不同根序净氮释放速率的影响及其与根际微生物多样性的复杂关系也应作为未来研究的重点。GydF4y2Ba

支持结果的数据包含在文章和其附加文件中。其他相关材料可在合理的请求上获得相应的作者。GydF4y2Ba

GDH：GydF4y2Ba

谷氨酸脱氢酶GydF4y2Ba

GPT:GydF4y2Ba

谷丙转氨酶GydF4y2Ba

GOGAT:GydF4y2Ba

谷氨酸合酶GydF4y2Ba

NR：GydF4y2Ba

硝酸还原酶GydF4y2Ba

数量:GydF4y2Ba

铵转运蛋白GydF4y2Ba

国内企业:GydF4y2Ba

氨氧化细菌GydF4y2Ba

sbf:GydF4y2Ba

常规氮量为3.76克时，根非常细GydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}0 ~ 10 cm土层土壤施肥GydF4y2Ba

座:GydF4y2Ba

常规3.76g氮kg下细根GydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}0 ~ 10 cm土层土壤施肥GydF4y2Ba

bbf:GydF4y2Ba

常规施氮条件下10 ~ 20 cm土层根系极细GydF4y2Ba

bbm:GydF4y2Ba

常规施氮10 ~ 20 cm土层细根GydF4y2Ba

soaf:GydF4y2Ba

在施氮量为37.28 g生物炭kg的基础上，极细根减少了25%GydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}土壤GydF4y2Ba

soam:GydF4y2Ba

基于37.28g生物炭kg的Sb，氮气下的细根部减少了25％GydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}土壤GydF4y2Ba

sobf：GydF4y2Ba

在施氮量为37.28 g生物炭kg的基础上，极细根减少50%GydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}土壤GydF4y2Ba

sobm：GydF4y2Ba

在施氮量为37.28 g生物炭kg的基础上，细根减少50%GydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}土壤GydF4y2Ba

boaf:GydF4y2Ba

在施氮量为37.28 g生物炭kg的基础上，极细根减少25%GydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}土壤GydF4y2Ba

boam:GydF4y2Ba

氮气下的细根基于BB的BB减少了25％，37.28g BiocharkgGydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}土壤GydF4y2Ba

bobf:GydF4y2Ba

基于BB，氮气下的非常细的根部减少了50％，37.28g BiocharkgGydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}土壤GydF4y2Ba

bobm:GydF4y2Ba

在氮气下细根减少了50％BB的基础上与37.28克生物炭公斤GydF4y2Ba^{−GydF4y2Ba1GydF4y2Ba}土壤GydF4y2Ba

感谢新疆农业科学院张云舒女士对土壤有效氮测定的指导。我们还要感谢华南农业大学陆琴老师的一些实验想法。GydF4y2Ba

中国自然科学基金（31660073）支持高通量测序，RT-QPCR，酶活性分析和细胞蛋白检验的费用。矿物氮和氨氧化细菌的费用由新疆维吾尔自治院科技部门（2017XS08）的天山培训方案基金会的Deodar在天山培训计划基金会中支持，并通过重点研发支持出版费用陕西省项目（2018NY-094）。GydF4y2Ba

作者指出GydF4y2Ba

1. 广州唐和曾乔·耿同等为这项工作进行了贡献。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 西北部植物营养和农业部农业部，西北部A＆F大学工厂营养和农业环境学院，杨凌，712100GydF4y2Ba

   雷丰＆曾卓耿GydF4y2Ba

2. 2 .新疆农业科学院土壤肥水保持研究所，新疆乌鲁木齐830092GydF4y2Ba

   冯磊，徐万里，唐光牧GydF4y2Ba

3. 新乡市农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐830091GydF4y2Ba

   Meiying GuGydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

LF和Zg构思和设计了实验。LF，WX，MG和GT执行实验并收集数据。LF分析了数据并写了稿件。ZG，GT和LF解释并修改了稿件。所有作者均已读取并批准此稿件。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba光木堂GydF4y2Ba或者GydF4y2BaZengchao耿GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

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