RUS6，含DUF647的蛋白质对早期胚胎发育至关重要GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

这GydF4y2Ba拟南芥俄文GydF4y2Ba（GydF4y2Ba根UV-B敏感GydF4y2Ba)基因家族包含6个成员，每个成员编码一种含有DUF647(功能未知域647)的蛋白质，这种蛋白质通常在真核生物中发现。已有研究表明，RUS1和RUS2在幼苗早期发育中起着关键作用。所有六个GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因在整个植物中表达，但对功能统一的众所周知GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS4GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS5GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

我们使用了一种反向遗传方法来识别敲除突变体GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS4GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS5GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba．通过直接DNA测序和遗传偏析分析证实了每个突变体。没有观察到可见的表型差异GydF4y2Barus3GydF4y2Ba那GydF4y2Barus4GydF4y2Ba， 或者GydF4y2Barus5GydF4y2Ba标准生长条件下的敲除突变体，但GydF4y2Barus6GydF4y2Ba敲除突变体表现出很强的胚胎致死表型。两个独立的敲除系GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba被特征。这GydF4y2Barus6GydF4y2Ba突变只能通过杂合子维持，因为GydF4y2Barus6GydF4y2Ba纯合突变体没有生存。纯合的仔细考试GydF4y2Barus6GydF4y2Ba胚胎GydF4y2Barus6GydF4y2Ba/ +父母植物透露了这一点GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba早期胚胎发育是必需的。lossGydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba导致胚胎致命性，特别是在半球阶段。胚胎致死性表型互补GydF4y2BaRUS6: RUS6-GFPGydF4y2BaGFP信号贯穿整个胚胎。组织学分析GydF4y2Baβ-葡萄糖醛酸酶GydF4y2Ba记者基因由此驱动GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba启动子显示组织和发育特异性表达GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba，以花组织最高。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的数据显示GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba早期胚胎发育的关键是什么GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，那个GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因家族在植物发育多个阶段的功能。GydF4y2Ba

各种内部和外部因素调节和控制各个阶段的植物开发[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］.每个特定发育阶段需要许多基础蜂窝功能。已经使用各种方法来鉴定组织或器官发育所需的基因，包括胚胎，芽，根，幼苗和花卉发育。例如，逆向遗传方法已成功地用于鉴定胚胎发育至关重要的基因GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］.截至2020年，510个胚胎缺陷(EMB)基因，这是成功的胚胎发育所必需的，迄今已被鉴定和描述GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］.这些基因是胚胎活力所必需的，具有从合成大分子（DNA，RNA和蛋白质）到细胞结构和代谢的专业函数。很可能更多GydF4y2Ba循证GydF4y2Ba基因将被识别，估计有750到1000个GydF4y2Ba循证GydF4y2Ba基因在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］.删除额外的一个策略GydF4y2Ba循证GydF4y2Ba基因是专注于基因家庭，其中已知一种或多种成员的丧失在某些阶段导致发育逮捕。GydF4y2Ba

这GydF4y2Ba根uv-b敏感GydF4y2Ba（GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba编码含有DUF647（UNKONWN功能647的结构域）的蛋白质的基因首次被鉴定GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba作为一个必不可少的球员GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba早期幼苗发展[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.敲除突变体GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba在紫外线B（UV-B）受影响的方式中萌发后的被捕的表型[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.进一步的研究发现了一个同源基因的突变，GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba，这表明那些相同的表型GydF4y2Barus1GydF4y2Ba敲除突变体[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.纯合子的GydF4y2Barus1GydF4y2Ba和GydF4y2Barus2GydF4y2Ba单突变体,GydF4y2BaRUS1 RUS2.GydF4y2Ba双突变幼苗显示出相同的发芽后发育抑制表型。通过具有高浓度维生素B6的MS培养基中的幼苗，和/或将UV-B与标准维生素B6降低到MS介质板的UV-B暴露，可以部分地抵押这种发育抑制表型。遗传抑制研究表明，影响天冬氨酸氨基转移酶2（ASP2）的维生素B6结合口袋的特定突变抑制了GydF4y2Barus1GydF4y2Ba和GydF4y2Barus2GydF4y2Ba表型[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba这些发现表明RUS1和RUS2可以与ASP2相互作用来通过维生素B6稳态调节早期幼苗发育[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

有趣的是，这GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba基因编码另一种含Duf647的蛋白质，两者GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba共享类似的表达式模式[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.此外，显示RUS1和RUS2蛋白质以DUF647依赖性方式物理地相互作用，并且相互作用似乎对其生理功能至关重要[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba被独立被确定为GydF4y2BaWXR3GydF4y2Ba（GydF4y2Ba弱生长素RESPONSE3GydF4y2Ba） 和GydF4y2BaWRX1.GydF4y2Ba，分别在筛选生长素反应缺陷和生长素相关生长缺陷的遗传突变体时[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.两个都GydF4y2BaWRX1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaWRX3.GydF4y2Ba突变体累积胚轴和子叶中的植物蛋白，根部顶点中的养蛋白水平降低[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.这些研究表明，RUS1和RUS2可能在包括UV-B响应，维生素B6稳态和极性砧蛋白转运中的生理过程中发挥重要作用。GydF4y2Ba

在pam数据库中注释的所有蛋白质中，约有24%被归类为含有“未知功能域”(DUF)的蛋白质。在pam数据库的16295个蛋白家族中，有3892个是DUF蛋白，这些DUF蛋白的功能尚未通过实验确定[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］.在分类上，含duf蛋白广泛分布于原核生物和真核生物中。研究表明，许多duf可能是生物学上必不可少的[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］.含有DUF647（PFAM系列PF04884）的蛋白质广泛分布在植物和动物王国的真核物种中[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.具有Rus1和Rus2的遗传和分子研究表明DUF647可以用作蛋白质 - 蛋白质相互作用结构域，并且需要RUS1和RUS2之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba早期幼苗发展[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］.此外GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba,GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba基因组含有四个额外的GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因命名GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS4GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS5GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba人们对这四种病毒的功能作用知之甚少GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因。DUF系列函数的分配通常取决于从特征成员的函数中进行假设。目前未知是否含有其他DUF647的蛋白质参与任何特定的发育过程。在这里，我们提出了一个全面的遗传表征GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因家庭。我们的结果表明，零突变GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba导致完全破坏GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba在球状体中期发生胚胎。严重胚胎致死表型GydF4y2Barus6GydF4y2Ba突变体和GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba鲜花中的表达，建议GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因家族在胚胎发育的多种发育阶段中发挥不同的功能作用。GydF4y2Ba

这GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因家族在真核生物中普遍存在，并在藻类中广泛存在GydF4y2Ba

我们之前报道过GydF4y2Ba根UV-B敏感度1GydF4y2Ba（GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba） 和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba萌发后生长需要GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba他们可能在维生素B6（吡哆醛-5'-phophate）稳态中发挥作用。这GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba基因都编码含有未知功能域647 (DUF647)的蛋白质[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.这GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba基因组编码含六个含含六种蛋白质的蛋白质（GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba通过GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba）.在大多数真核物种中发现rus蛋白，包括所有植物和大多数真菌和动物。我们以前确定过GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba作为明确的同源单GydF4y2Barus.GydF4y2Ba在大多数动物基因组中发现的基因[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.发现分析的所有植物基因组织为多个Rus蛋白编码，通常是六个或更多个。蛋白质序列分析确定了透明的直晶GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba在所有植物基因组中。水稻和苔藓的基因组GydF4y2BaPhyscomitrella patens.GydF4y2Ba每个都有最近的重复GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba，但水稻基因组缺乏明确的Rus4 Ortholog，而且GydF4y2BaP. Paten.GydF4y2Ba基因组缺乏清晰GydF4y2BaRUS5GydF4y2Baortholog。裸子植物的基因组GydF4y2BaPinus sylvestrusGydF4y2Ba包含所有六个的同源性GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因(图GydF4y2BaS1GydF4y2Ba）.有趣的是，我们还确定了所有六种的同源性GydF4y2Barus.GydF4y2Ba野生动物藻类基因组中的基因，GydF4y2BaKlebsormidium nitensGydF4y2Ba从植物血统分支至少7亿年前分支[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］.因此，扩大了GydF4y2Barus.GydF4y2Ba在胚胎的进化开始之前，基因家族进入目前的六种基因。GydF4y2Ba

敲除突变体的鉴定与分析GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS4GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaRUS5GydF4y2Ba

为了进一步了解所有人的功能角色GydF4y2Barus.GydF4y2Ba成员们，我们筛选并鉴定了敲除突变体GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba（GydF4y2BaAT1G13770GydF4y2Ba)，GydF4y2BaRUS4GydF4y2Ba（GydF4y2BaAT2G23470GydF4y2Ba)，GydF4y2BaRUS5GydF4y2Ba（GydF4y2BaAT5G01510GydF4y2Ba） 和GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba（GydF4y2BaAT5G49820GydF4y2Ba）.在公共数据库中鉴定出潜在的T-DNA插入线并通过基因特异性PCR标记验证。鉴定了纯合的敲除突变体GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba(两行:GydF4y2Basalk_135717c.GydF4y2Ba和GydF4y2BaSALK_042033C,GydF4y2Ba哪个是GydF4y2BaRUS3-1GydF4y2Ba和GydF4y2Barus3-2,GydF4y2Ba分别）GydF4y2Ba, RUS4GydF4y2Ba（一条线：GydF4y2Bagk - 447 f02 - 024530GydF4y2Ba） 和GydF4y2BaRUS5GydF4y2Ba（一条线：GydF4y2Basalk_038772c.GydF4y2Ba)(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.所有突变线含有外显子的T-DNA插入（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba） （数字GydF4y2BaS2GydF4y2Ba）.所有三种基因的纯合突变体（GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS4GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaRUS5GydF4y2Ba)，表明这三个基因的突变不会导致胚胎的死亡(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.在标准生长条件下，这些突变体与WT (Col-0)植株之间没有明显的形态差异。GydF4y2Ba

功能丧失GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba（AT5G49820）导致胚胎杀伤性GydF4y2Ba

两个T-DNA插入线（GydF4y2BaGK278G06GydF4y2Ba和GydF4y2Baemb1879 / CS16037GydF4y2Ba)被鉴定为GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba（GydF4y2BaAT5G49820GydF4y2Ba），并通过PCR标记和直接测序验证（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA，B;数字GydF4y2BaS2GydF4y2Ba）.GydF4y2BaGK278G06GydF4y2Ba从Gabi-Kat获得[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba) (GydF4y2Bahttps://www.gabi-kat.de/GydF4y2Ba)，并确认有GydF4y2BapAC106 / pAC116GydF4y2BaT-DNA插入第11外显子(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种）。这GydF4y2Bacs16037 / EMB1879GydF4y2Ba系来源于拟南芥生物资源中心(ABRC)。这GydF4y2Bacs16037 / EMB1879GydF4y2Ba线与启动子区域删除，直到内含子6，被替换为GydF4y2BaPCSA104GydF4y2Ba本文分别插入(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab).通过PCR标记和DNA测序验证缺失/插入(图)GydF4y2BaS2GydF4y2Ba）.确认突变后，我们命名GydF4y2BaGK278G06GydF4y2Ba和GydF4y2BaCS16037 / EMB1879GydF4y2Ba作为GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba分别（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

我们无法确定任何纯合子GydF4y2Barus6GydF4y2Ba突变体中的任何一种初始种子库存GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba或者GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba．为了产生纯合子GydF4y2Barus6GydF4y2Ba植物，GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba/ +和GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba/ +每个都是自我施肥的，并且它们的后代种植。基于PCR的基因分型用于基因型个体后代，但没有纯合GydF4y2Barus6GydF4y2Ba在杂合子父母的后代鉴定突变体（GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba/ +,GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 121;RUS6-2GydF4y2Ba/ +GydF4y2Ba，nGydF4y2Ba = 14.GydF4y2Ba)，表明为纯合子GydF4y2Barus6GydF4y2Ba突变体是胚胎致命的。GydF4y2Ba

这GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2BaT-DNA插入含有磺胺嘧啶(Sul)抗性基因。我们培育了自花受精的后代GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba/ +植株，65.27%的幼苗表现出抗性，34.73%的幼苗表现出敏感性(GydF4y2BaNGydF4y2Ba= 262)(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba；如图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaC）。这些数字与2：1的比例一致GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba/ +到+ / +植株，若纯合子则为期望GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba植物是缺席。(一个子集GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 17) of the Sul-resistant plants were PCR genotyped and were all identified asRUS6-1GydF4y2Ba/ +;没有纯合GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba植物被发现。GydF4y2Ba

这GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2BaT-DNA插入赋予Basta（Glufosate）抗性。同意GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba结果，我们再次观察结果与缺乏纯合的结果一致GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba植物。66.20%的样品表现出basta抗性，33.80%的样品表现出basta致死率(GydF4y2BaNGydF4y2Ba= 213)(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.basta抗性植物(GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 22) that were PCR genotyped were allRUS6-2 /GydF4y2Ba+。GydF4y2Ba

在缺纯合子子代的情况下，Sul和Basta抗性结果符合预期的杂合子与WT的分离比例(66.7% ~ 33.3%(2:1))(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.此外，突变系和野生型对照的种子发芽率相当，表明纯合子的种子GydF4y2Barus6GydF4y2Ba没有产生胚胎。因此，我们假设缺乏GydF4y2Barus6GydF4y2Ba纯合子的产生是由于早期胚的致死导致种子败育，而不是萌发失败。综上所述，这些结果表明纯合突变GydF4y2Barus6GydF4y2Ba导致胚胎致死性。GydF4y2Ba

功能丧失GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba扰乱胚胎发育，导致白色发展种子表型GydF4y2Ba

我们观察到GydF4y2BaRUS6 /GydF4y2Ba + mutant plants from germination through maturity, and found that all vegetative parts of the plant were indistinguishable from WT (Fig.2GydF4y2Bad, e).研究纯合子的缺乏GydF4y2Barus6GydF4y2Ba种子,我们打开GydF4y2Barus6GydF4y2Ba/ +单次，其特征在于内部的显影种子。虽然大多数显影种子是绿色的，类似于野生型植物，但我们还观察到较高百分比的显影种子，呈白色，或棕色和皱纹，取决于石英的年龄（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.我们怀疑白色发展种子含有GydF4y2Barus6GydF4y2Ba纯合子，并预测它们代表了角果中25%的种子，符合绿色和白色种子3:1的比例[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］.对显影种子的更广泛的表型分析发现了25.59％的白色或棕色种子在SILIQUES中GydF4y2Barus6-1 /GydF4y2Ba + plants (NGydF4y2Ba= 895)， 23.88%的种子为白色或棕色GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba/ +植物（GydF4y2BaNGydF4y2Ba= 356)(表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.这些结果表明GydF4y2Barus6GydF4y2Ba纯合子是胚胎致命的，是白色显影种子表型的原因。GydF4y2Ba

补充废除了GydF4y2Barus6GydF4y2Ba胚胎致命表型GydF4y2Ba

我们的初步分析GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba强烈建议突变至少有一个功能副本GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba需要在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba植物。为了减少基因组的其他地方的额外T-DNA插入的可能性完全或部分地负责GydF4y2Barus6GydF4y2Ba表型上，我们两次回交GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba/ +植物到野生型Col-0。这GydF4y2Barus6GydF4y2Ba表型在纯净的回交线中保持一致，这使得强大的支持GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba突变是表型的原因。GydF4y2Ba

为了遗传补充GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba突变，我们创造了一个嵌合GydF4y2BapZP222GydF4y2Ba构建包含GydF4y2BaRUS6-GFP.GydF4y2Ba由本土驱动GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba推动者（GydF4y2BaRUS6: RUS6-GFPGydF4y2Ba）.包括GFP标签以供以后分析荧光显微镜。GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba/ +植物转化使用GydF4y2Ba农杆菌肿瘤术GydF4y2Ba在抗生素选择MS培养基上收获并铺设T1种子。鉴定了两种抗性T1植物，并证实它们包含的PCR分析GydF4y2BaRUS6: RUS6-GFPGydF4y2Ba转基因。从每根测量T2种子，进行抗生素选择和PCR基因分型。我们确定了GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2BaT2中的纯合植物，其中包含至少一个副本GydF4y2BaRUS6：RUS6-GFPGydF4y2Ba转基因(无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa，b）。互补的互补GydF4y2Barus6GydF4y2Ba致死性表型GydF4y2BaRUS6：RUS6-GFPGydF4y2Ba证明了这一点GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba突变负责GydF4y2Barus6GydF4y2Ba突变表型（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

rus6GydF4y2Ba纯合子突变阻止胚胎发育过球形期GydF4y2Ba

目的:研究植物中白色和绿色种子的胚胎发育差异GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba/ +单体，我们在显影种子上进行了差异干扰对比显微镜（DIC）。种子来自同一个GydF4y2Barus6-1 /GydF4y2Ba + silique were removed, cleared, and examined together, and the results were consistent across siliques analyzed. We initially performed microscopy on seeds from late stage siliques ofRUS6-1GydF4y2Ba/ +植物，并观察到白色种子完全缺乏可检测的胚胎。然后，我们对成熟程度较低的种子进行了检测，结果发现含有胚胎的白色种子数量增加，这些种子从未被观察到过球形阶段。最后，我们观察到，在非常年轻的果粒中，所有的白色种子都包含球形期或早期胚。这些结果表明GydF4y2Barus6GydF4y2Ba事实上，胚胎发生了，但在未能推进过球状期后降解并且变得无法检测到。GydF4y2Ba

这GydF4y2Barus6GydF4y2Ba白种子中的胚胎严重延迟，并且无法发展过球状阶段（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba相反，里面的胚胎发育成绿色的种子，两者都不是GydF4y2BaRUS6 /GydF4y2Ba + or wild-type, had normal developmental morphology (Fig.5.GydF4y2Ba此外，每一种角果中绿色种子的胚均处于相似的发育阶段。这GydF4y2Barus6GydF4y2Ba胚胎的形态发生了改变，仔细观察发现它们无法达到过渡阶段。显示在5A, 5B, 5D和5F的图像都取自相同的胚胎GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba/ + silique。不存在麻痹或霉菌细胞或以呈现为下层的一部分的方式变形（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab）。另外，在该阶段突变胚胎的悬浮体难以检测并且通常似乎不存在。数字GydF4y2Ba5.GydF4y2BaD显示胚胎发育受阻，尚未开始恶化。一旦胚胎开始恶化，就很难对其内部细节进行成像。我们的分析表明GydF4y2Barus6GydF4y2Ba突变体胚胎发育停滞在球形期中后期，随后胚胎恶化导致种子发育失败。GydF4y2Ba

RUS6GydF4y2Ba在胚胎中表达GydF4y2Ba

观察GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba体内表达，我们在纯合中分析了GFP荧光GydF4y2Barus6GydF4y2Ba突变体互相补充GydF4y2BaRUS6: RUS6-GFPGydF4y2Ba构造。为了使更发达的组织产生的自体荧光最小化，我们对心脏晚期到早期鱼雷阶段的胚胎进行了激光扫描共聚焦显微镜观察。我们在补体胚中检测到GFP荧光，明显高于野生型对照的背景自荧光(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.在更高的倍数下观察显示RUS6没有特别地局部地局限于细胞壁，细胞核，线粒体或任何漫射器细胞器（图。GydF4y2BaS3.GydF4y2Ba）.相比之下，荧光模式表明RUS6主要局限于液泡外面的一些不同圆形和点状结构。TargetP 1.1预测RUS6定位为叶绿体或其他细胞位置[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

RUS6GydF4y2Ba在营养器官和生殖器官中的表达GydF4y2Ba

为了进一步评估GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba表达式模式，我们使用aGydF4y2BaPBI101GydF4y2Ba构造生成一个GydF4y2Barus6 :: gusGydF4y2Ba报告基因。这GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba本报记者中使用的启动子是同一地区，成功地用于互补GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba突变。后GydF4y2Ba杆菌-GydF4y2Ba介导的转化，选择和PCR分析证实了12个初级（T1）转化体。我们在所有十二条线上进行了初步GUS染色，并选择了具有最高GUS表达水平的两个，以进行进一步的成像和分析。来自12号线的T2植物在花中产生最高的GUS活性，而来自第1行的T2植物对所有其他组织具有最高的表达。GydF4y2Barus6 :: gusGydF4y2Ba观察到的表达是微妙的，令人惊讶的动态，并且只在特定的发展阶段检测到。GydF4y2Ba

我们染了一到六天GydF4y2Barus6 :: gusGydF4y2Ba垂直生长的幼苗在M.S中垂直生长盘子。在一天的幼苗中没有观察到GUS活动，但两天的幼苗在子叶中显示出一定程度的GUS活性（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa, b, c)。在3 - 6天的幼苗中，我们无法检测到GUS活性。此外，两天龄幼苗的GUS活性仅存在于约50%的幼苗中。这表明,GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba表达是动态的，是特定于特定发展阶段的。GydF4y2Ba

在20天龄幼苗中，GUS活动明确定义为显影根原序的边缘（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bae）。在某些横向根部的此时也观察到GUS活性（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bad，e），并且在主要根部的中间长度下非常微弱。有趣的是，一些横向根，根尖和根接合点显示了GUS活动，而其他人则没有。GUS表达似乎没有基于侧根的长度，或任何其他可观察到的发育标记。GydF4y2Ba

在各发育阶段的叶片中均未检测到GUS活性。而花中检测到的GUS活性最高，尤其在花药中(Fig。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baf，g，h，i）。在第11期的花朵中，GUS活动在花中均匀地是最高的，（如Smyth等，[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]）。然而，在以后的一些阶段的花朵显示了GUS活动，而在同一阶段的发展阶段则没有。即使在附着在相同的花序茎上的花朵也持续存在这种模式。进一步调查解剖的花药显示，Tapetum中Gus活性特别高（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba我)。GydF4y2Ba

我们已经系统地进行了鉴定和鉴定GydF4y2Barus3GydF4y2Ba那GydF4y2Barus4GydF4y2Ba那GydF4y2Barus5GydF4y2Ba， 和GydF4y2Barus6GydF4y2Ba淘汰赛的突变体GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．我们的研究发现了重要作用GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba，编码含Duf647的蛋白质，GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba胚胎发展。这GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba基因组含有六个基因，其编码含Duf647的蛋白质[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.六个基因中的两个，GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba，并且已知在幼苗早期发育中起着关键作用。RUS1和RUS2作为功能合作伙伴，确保其异养性GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba胚发育成自养苗。两个都GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba在弱生长素反应基因筛选中也被独立鉴定，这表明GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba直接或间接影响植物素分布调节植物开发[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.最近，一个敲门的研究GydF4y2BaRUS4GydF4y2Ba通过人造microRNA（AMIR）建议GydF4y2BaRUS4GydF4y2Ba起作用GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba生殖发展[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］.纯合GydF4y2Barus4GydF4y2Ba敲除突变体在他们的研究中没有明显表型，下调GydF4y2BaRUS4GydF4y2BaAMIR方法的MRNA扰乱了脱裂，可能通过诸如此类的基因的下调GydF4y2BaNST1.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba第2号，GydF4y2Ba哪些已知的在次生细胞壁增厚中起作用GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba花药内皮[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］.在本研究中，我们对两个基因敲除突变体进行了详细的遗传和分子鉴定GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba那GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba，明确确定了不可或缺的作用GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba胚胎发育。GydF4y2Ba

胚胎杀伤性GydF4y2Barus6GydF4y2Ba在我们的研究中通过几种实验证据证实了敲除突变体。这GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba该等位基因早前被鉴定为GydF4y2Ba胚胎GydF4y2Ba（GydF4y2Ba胚胎有缺陷GydF4y2Ba)与名字行GydF4y2BaEMB1879GydF4y2Ba[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，并被标记为GydF4y2Ba胚胎GydF4y2Ba由Syngenta (CS16037，在启动子区域包含一个T-DNA插入)。然而，T-DNA插入对基因的精确影响GydF4y2BaAT5G49820GydF4y2Ba（GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba）尚不清楚。稍后从种子基因数据库（Seedgenes.org）中除去胚胎致死率的另一报告，最近GydF4y2Baemb1879.GydF4y2Ba/GydF4y2BaAT5G49820GydF4y2Ba被排除在全面的审查之外，提供510的更新数据集GydF4y2Ba循证GydF4y2Ba基因(GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］.我们在本研究中的分析提供了令人信服的证据GydF4y2Baemb1979GydF4y2Ba事实上是胚胎致命，应该包括在内GydF4y2Ba循证GydF4y2Ba数据库。我们的特点是GydF4y2Baemb1879 / rus6-2GydF4y2Ba与另一种可用的T-DNA线一起（GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba)，GydF4y2BaGK-27G06GydF4y2Ba．没有纯合子可以从任一线中获得，并且在杂合子的后代观察到缺陷的种子发育。这些表型表明胚胎致死性[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］.在一个隔离的人口中GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba等位基因和GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba等位基因只能在突变等位基因杂合的个体中保持。由于每个等位基因携带一个带有特定可选择标记的T-DNA插入，我们分别在含有选择试剂(磺胺嘧啶或basta)的生长培养基上分析了插入的存在。对于这两个等位基因，分离群体显示三分之二的后代是杂合的GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba或者GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba等位基因，其余三分之一的后代是wt（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.定量数据一致地表明纯合GydF4y2Barus6GydF4y2Ba敲除突变体是胚胎致命的。GydF4y2Ba

我们的研究直接检测到的性质GydF4y2Barus6GydF4y2Ba通过DIC显微镜胚胎致死性。虽然正常和发育的胚胎是绿色的，但异常和中产为白色或棕色[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］.我们对植物杂合的胚胎中胚胎中的胚胎的定量分析GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba或者GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba证实大约25%的胚胎是白色或棕色的(见下表)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.中产胚胎到正常胚胎的比率进一步支持结论GydF4y2Barus6GydF4y2Ba基因敲除导致胚胎死亡率。此外，解剖的白色种子进一步的DIC显微镜检查表明，胚胎发育似乎在过渡阶段之前就停止了。流产的胚胎表现出各种异常，包括胚柄扭曲，缺少柱头和/或胚柄。在一些病例中，没有观察到肉眼可见的胚胎。RUS6很可能在胚胎发育的早期阶段起作用。由于球状阶段是最近探测到的阶段GydF4y2Barus6GydF4y2BaRUS6似乎是胚胎通过过渡阶段所必需的。GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba已知在各种组织中表达和各种发育阶段，包括胚胎发育[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］.蛋白质组学分析表明，RUS6蛋白(Uniprot # Q93YU2)在所有被分析的组织中均有表达(GydF4y2Bahttps://www.proteomicsdb.org/proteomicsdb/GydF4y2Ba），但在成熟的胚胎和花粉中发现了最高的RUS6蛋白表达[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］.我们的RUS6- gfp共聚焦数据进一步证明了RUS6在鱼雷后期胚胎中广泛表达(图。GydF4y2BaS3.GydF4y2Ba）.虽然在花粉中发现了高水平的RUS 6表​​达，但在RUS6敲除突变体中没有观察到与配子体发育相关的表型。我们的遗传数据建议GydF4y2Barus6GydF4y2Ba配子体似乎是功能性的，可以以正常速率完成施肥。然而，胚胎是纯合的GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba或者GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba未能超越球阶段以形成种子。GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba在种子萌发和早期幼苗发展过程中，转录物水平也丰富[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］.是否以及如何以及如何分析早期幼苗开发中的功能。我们补充了纯合GydF4y2Barus6GydF4y2Ba用包含的构建体突变GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba本机推动者（GydF4y2BaRUS6: RUS6-GFPGydF4y2Ba）.进一步了解RUS6在其他发育阶段的作用，纯合中的转基因系列GydF4y2Barus6GydF4y2Ba背景携带GydF4y2BaRUS6-GFP.GydF4y2Ba在诱导启动子的驱动下，可以在未来创造。GydF4y2Ba

虽然我们已经明确规定了GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba早期胚胎发展，如何GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba此阶段的功能目前不清楚。已记录为的许多基因GydF4y2Ba胚胎GydF4y2Ba（GydF4y2Ba胚胎有缺陷GydF4y2Ba），已知是胚胎发育所必需的。他们的蛋白质产品通常进行必要的细胞功能，并且对这些蛋白质的任何主要干扰可能导致胚胎致死性[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］.预计RUS6将定位在叶绿体中[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］.正常的叶绿体功能对于胚胎发育至关重要，研究表明，许多对叶绿体功能至关重要的蛋白质的破坏导致胚胎致死性[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］.此外，许多研究已经确定了蟾蜍在胚胎发育中发挥作用[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba[疾病的特异性时滞分布有很好的记录[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］.这些分布模式是通过YUCCA成员或生长素转运体(流出或流入转运体)的本地生长素生物合成实现的。众所周知，RUS1和RUS2都与生长素的分布密切相关GydF4y2Barus1GydF4y2Ba和GydF4y2Barus2GydF4y2Ba突变体显示出改变的植物素分布。GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba已知在PLP中发挥作用（吡哆醛5-磷酸，维生素B6的生物活性形式）稳态[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]和PLP在胚胎后期根发育过程中对生长素稳态的调节起着重要作用GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba］.此外，先前的研究表明，RUS1和RUS2可能与plp结合蛋白(如天冬氨酸转氨酶)发生物理作用，以调节维生素B6稳态。天冬氨酸氨基转移酶(ASP)蛋白的plp结合袋特异性突变抑制GydF4y2Barus1GydF4y2Ba和GydF4y2Barus2GydF4y2Ba表型。GydF4y2Ba

我们的研究完成了Rus基因家族的所有六个成员的T-DNA敲除突变体的鉴定。在纯合突变体中没有检测到可观察表型GydF4y2Barus3GydF4y2Ba那GydF4y2Barus4GydF4y2Ba， 和GydF4y2Barus5GydF4y2Ba，表明这三个的遗传冗余GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因。我们还为不同的基因对创造了双突变体(GydF4y2BaRus3 Rus4.GydF4y2Ba那GydF4y2BaRus3 Rus5GydF4y2Ba)，在这些双突变体中未发现明显的表型(图。GydF4y2BaS10GydF4y2Ba）.可以创建三个基因的纯合三个突变体，以测试这三个成员是否确实共享了功能冗余，尽管胚胎致死性GydF4y2Barus6GydF4y2Ba提出了明显的限制与遗传杂交，并将需要一个纯合子转基因系GydF4y2Barus6GydF4y2Ba背景携带GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba由诱导型启动子驱动。关于各种组合的未来研究GydF4y2BaRus3，Rus4.GydF4y2Ba那GydF4y2BaRus5，GydF4y2Ba和GydF4y2Barus6GydF4y2Ba各种生理条件下的突变体将有助于确定这些突变体的遗传作用GydF4y2Barus.GydF4y2Ba会员。GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因在多细胞生物中广泛存在，我们之前的系统发育分析GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因建议GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba是和GydF4y2Barus.GydF4y2Ba在动物中发现的基因[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.因此，令人惊讶的是，没有检测到可观察表型GydF4y2Barus3GydF4y2Ba敲除突变体GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba在正常生长条件下。动物王国的物种有一个单一的GydF4y2Barus.GydF4y2Ba每个基因组中的基因，而植物王国的种类有多个（5-16）GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因。如何GydF4y2Barus.GydF4y2Ba其他多细胞生物中的基因功能在很大程度上是未知的。我们目前的四个研究GydF4y2Ba拟南芥俄文GydF4y2Ba基因提供了实验证据，可以帮助指导未来的努力发现如何GydF4y2Barus.GydF4y2Ba家庭功能GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和其他物种。GydF4y2Ba

拟南芥基因组含有六个GydF4y2Barus.GydF4y2Ba编码含有duf647的蛋白质。其中两个基因，GydF4y2BaRUS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaRUS2GydF4y2Ba，在早期幼苗发育中具有作用，维生素B6稳态，以及养鑫运输。在本文中，我们分析了剩余的敲除突变体GydF4y2Barus.GydF4y2Ba基因(GydF4y2BaRUS3GydF4y2Ba通过GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba）.有趣的是，纯合GydF4y2Barus3GydF4y2Ba那GydF4y2Barus4GydF4y2Ba， 或者GydF4y2Barus5GydF4y2Ba突变体在标准生长条件下未表现出异常表型。然而，纯合子突变体rus6胚胎未能发育超过球形阶段，导致其种子流产。GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba在植物发育的许多阶段检测到表达，鲜花特别强。GydF4y2BaRUS6GydF4y2Ba是拟南芥胚胎发育的重要基因，很可能在整个植物生命周期中起作用。含Duf647的蛋白质普遍存在于真核生物中，我们的研究揭示了含DUF647蛋白质中的一种基本作用GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba胚胎发展。GydF4y2Ba

系统发育分析GydF4y2Ba

序列与MUSCLE程序对齐(Log-Expectation多重序列比较，GydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/tools/msa/muscle/GydF4y2Ba），随后用于构建具有Upgma聚类方法，距离校正和排除间隙的邻近的系统发育树（GydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/tools/phylogyy/simple_phylogyy/GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

拟南芥GydF4y2Ba将种子在4°C的黑暗中被表面灭菌和冷处理48至72小时，然后在含有0.5％D-蔗糖的Murashige和Skoog（MS）培养基上涂布，具有全系列维生素补充剂减去B6（除非另有说明）．GydF4y2Barus6GydF4y2Ba/ +植物也直接发芽在灌封介质中，没有变化的表型。生长条件GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba（生态型Col-0）植物如前所述[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.T-DNA敲除线的种子GydF4y2BaRUS3-1GydF4y2Ba(SALK_135717C),GydF4y2BaRUS4-2GydF4y2Ba（GK_447F02），GydF4y2Barus5-1GydF4y2Ba(SALK_038772C),GydF4y2BaRUS6-2GydF4y2Ba(EMB 1879)来自美国俄亥俄州立大学(Ohio State University)拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)。GydF4y2Bahttps://abrc.osu.edu/GydF4y2Ba）.Salk研究所基因组分析实验室捐赠了Salk线。T-DNA线GydF4y2BaRUS6-1GydF4y2Ba（GK-278G06-015,156）是从诺丁汉大学提供的Gabi-Kat（GydF4y2Bahttps://www.gabi-kat.de/GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

种子计数GydF4y2Ba

发育成熟阶段(长度大于或小于13毫米)的体表在Olympus SZX12立体变焦显微镜下解剖，并配备Qimaging微型出版商500万像素CCD相机。使用Qcapture版本2.6软件进行图像捕获。我们注意到，发育较差的角果含有较少的棕色种子。在现存的种子中，大多数在外观上与白色的种子相似，饱满，呈灰白色或浅棕色。相比之下，更发达的角果含有明显更多的棕色种子，其中大多数是深褐色阴影，并起皱。我们怀疑，白色败育的种子的一部分出现了褐色和褶皱的外观，随着果柄的成熟，这种情况会越来越严重。为了验证这一点，我们计算了沿花序茎的顺序的穗状花序中棕色皱褶种子的数量，从而沿着发育的光谱列出了种子的颜色和形状。褐色皱粒种子的数量随着角质层的发育而增加，说明白色和棕色的种子代表相同的缺陷。GydF4y2Ba

播种、清理和观察GydF4y2Ba

在解剖显微镜下，在显影成熟的发育阶段（长度为13mm或更大）的单位。分离白色和绿色种子，并直接放置在含有一滴Hoyer溶液的载玻片上，如[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba，然后稀释为一半的浓度。在发育未成熟阶段(长度小于~ 13mm)的卵裂中，直接在载玻片上滴一滴Hoyer 's溶液。所有种子在溶液中RT培养2-16小时直至澄清。种子观察使用尼康Eclipse 80i手动立式显微镜Nomarski (DIC)光学。使用Qcapture版本2.6软件进行图像捕获。GydF4y2Ba

PCR基因分型GydF4y2Ba

从MS板上生长的幼苗中提取DNA，并筛选用于T-DNA插入和野生型等位基因。聚合酶链反应用于扩增DNA（参见补充表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba对于引物列表）在以下条件下：变性94℃5分钟，然后在95℃下在58℃下的60秒，在58℃，90s处，在72℃下进行45℃，然后在72°处为10分钟C。对于RUS6 GK278G06系列，引物被设计为扩增T-DNA左边界和IT的基因组侧翼序列：TJLB 155和RUS6-1936-F。野生型等位基因的引物被设计为跨越大（约5,800bp）T-DNA插入的两侧，允许扩增野生型等位基因：RUS6-1936-F和RUS6-CDS2-R。对于emb 1879系列，引物被设计为扩增T-DNA左边界和IT的基因组侧序序列：Garlic-LB3和RUS6 RTR。用于野生型等位基因的引物被设计成扩增启动子区域中的片段，并延伸到外显子1：Rus6-Liginer3-F和RUS6-R1中。注意，外显子1是伯伯1879系列中提出缺失的一部分，防止RUS6-R1退火到突变等位基因。使用Azure C200凝胶成像工作站对1％EtBR凝胶进行成像。GydF4y2Ba

转基因植物生产线的构建GydF4y2Ba

RUS6的启动子区域从基因组DNA与引物RUS6-P-KPN1-SAL1-F和RUS6 P-BAMH1的基因组DNA扩增（参见补充表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba为引物列表)，并插入pCR8。在Sal1和BamH1处从pCR8中酶切出RUS6启动子插入物，插入到修饰的pBI101中，GUS报告子完成构建。对于GFP构建，我们使用引物AT5G49820-Kpn1-F和AT5G49820-BamH1-R从现有构建中扩增了RUS6 cDNA(见补充表)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba对引物列表)。这个片段被插入到Kpn1和BamH1的pBluescript中。我们随后将来自pCR8的RUS6启动子插入Sal1和Kpn1。最后，我们消化了整个RUS6启动子和位于Kpn1和BamH1的cDNA插入片段，并连接到修饰的pZP222-GFP载体。GydF4y2Ba

转型和互补GydF4y2Ba

将转化后的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens, GV3101)接种5 mL发酵剂，在50 mL LB肉汤(含抗生素)中培养24 h。将细胞自旋下来，用等量的ddH20和0.2% Vac-in-stuff (Silwet L-77)重悬。这种溶液被用来喷洒拟南芥花作为转化途径。转化后的植株在室温下置于透明塑料下培养24小时，然后返回生长室。这个方法在一周后被重复，总共有两个转换事件。GydF4y2Barus6GydF4y2Ba/ + GK278G06植物通过由A构建体PZP222-GFP的RUS6启动子驱动的嵌合AT5G498920（RUS6）-GFP基因互补。种子被收获并镀在Sul +，Gen + MS培养基上进行抗生素选择。回收并通过PCR分析回收和证实两种T-1转化体和多T-2（补充）后代。使用与上述相同的方法，用由RUS6启动子驱动的改性的PBI101 GUS报道器构建体转化WT植物。收获T-1种子并在KAN + MS培养基上接种抗生素选择。通过PCR分析回收并证实了12个T-1转化体和多个T-2后代。GydF4y2Ba

GUS染色GydF4y2Ba

将所有植物组织与GUS染色溶液（1mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖酮（X-Gluc）溶于0.1ml甲醇，1ml 2×缓冲液（20μl0.1M钾铁氰化钾，20μl0.1m铁氰化钾），10μl10％（w / v）溶液的Triton X-100,0.85mL水溶液，然后在37℃下孵育过夜。使用70％乙醇清除样品。使用配备Qimaging Micro Publisher 5.0万像素CCD摄像头的奥林巴斯SZX12 Stereozoom显微镜观察所有样品。使用Qcapture版本2.6软件进行图像捕获。GydF4y2Ba

RUS6亚细胞位置RUS6-GFPGydF4y2Ba

解剖和安装在6％甘油溶液中的RUS6-GFP补充和野生型对照种子，通过敲击载玻片来挤出胚胎，如[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］.使用Zeiss LSM 710共聚焦激光扫描显微镜观察胚胎。通过蓝色氩激光（488-nm蓝色激发）激发GFP荧光，并在515-至530-nm波长下检测。使用Fiji ImageJ进行处理图像[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

在当前研究期间使用和/或分析的链接基因型和表型数据在TAIR（拟南芥信息REUMENT-ARABIDOPSIS.ORG）中沉积。可以在这些链接中找到四个基因（Rus3，Rus4，Rus5，Rus6）的链接基因型和表型：GydF4y2Ba

RUS3GydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=28854&type=locusGydF4y2Ba

RUS4GydF4y2Bahttps://www.arabidopesis.org/servlets/tairobject?id=32619&Type=locus.GydF4y2Ba

RUS5GydF4y2Bahttps://www.arabidopesis.org/servlets/tairobject?id=131341&Type=locus.GydF4y2Ba

RUS6GydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=132107&type=locusGydF4y2Ba

DUF:GydF4y2Ba

未知函数的域GydF4y2Ba

emb：GydF4y2Ba

胚胎有缺陷GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

格斯:GydF4y2Ba

β-葡萄糖醛酸酶GydF4y2Ba

PLP:GydF4y2Ba

吡哆醛5-磷酸盐GydF4y2Ba

MS媒体：GydF4y2Ba

Murashige和Skoog MediumGydF4y2Ba

罗斯:GydF4y2Ba

根UV-B敏感GydF4y2Ba

南:GydF4y2Ba

磺胺嘧啶GydF4y2Ba

WXR:GydF4y2Ba

弱植物响应GydF4y2Ba

X-Gluc：GydF4y2Ba

5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖醛酸酯GydF4y2Ba

我们要感谢Seedgenes（Seedgenes.org）的David Meinke博士，用于提供有关emb1879线的信息。我们要感谢旧金山州立大学科学与工程学院的细胞和分子成像中心（CMIC）的Chant博士，帮助我们共用成像。谢谢还去了他过去的其他人的实验室成员，现在为这项研究提供了宝贵的见解;Cinthya Ibarra，Nathan O'Neil，Keirstinne Turcios，迪伦Ting，Stacey Phan，Claudia Bucheli，Brendan Heath，Susan Prestol和Anna Calamonaci。GydF4y2Ba

该研究得到了旧金山州立大学研究和赞助计划厅的桥梁资助。资金组织为研究项目提供了财务支持，但没有参与研究，数据收集，数据分析或写作稿件的设计。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 旧金山州立大学生物系，加利福尼亚州，美国旧金山94132GydF4y2Ba

   Nathaniel Perry，Colin D. Leasure，Hongyun Tong，Elias M. Duarte＆Zheng-Hui他GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

N. p .;H.T.和C.L.在E. M. D.N.P的援助中进行了实验;C. L.和Z.-h.H.构思了项目和Z.-h.H.监督该项目;Z.-h.H.担保资金。N. p .;Z.-h.H.和C. L.撰写了所有作者的贡献。 All authors have read and approved the manuscript.

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba郑辉他GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准并同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

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