抑制侧枝形成的RNA干扰和化学诱导的基因突变表达的腋窝分生组织GydF4y2Ba烟草GydF4y2BaL.GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

在烟草中，侧枝在茎的花序部分顶部后蓬勃增殖，以成熟的叶片被收获。因此，具有抑制侧枝形成的烟草品种是烟农的理想选择。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

对烟草侧枝形成的遗传抑制进行了研究。通过RNA干扰检查两组基因。第一组包括在其他植物中介导侧枝形成的基因的同源物，而第二组包括在腋芽原始阶段高度表达的基因。虽然在出现的花蕾未受影响时，植物之后越来越大的“初级”侧芽，但在敲击时显着抑制了在原发性侧枝碱的亚轴侧检测到的“二次”侧芽的生长下降线GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba那GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba. 化学诱变GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba,GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba同样抑制次生侧枝和“第三”侧枝的发育，但不抑制初生侧枝的发育。的突变GydF4y2BantlGydF4y2Ba和GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba通过回复被纳入精英品种。在商业烟草生产区进行的现场试验中检测了回Cross系的农艺特征。该线通常适用于烟草生产，可用作新的烟草品种。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

压制的表达GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba那GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba,或GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba仅抑制烟草次生和第三次生侧枝的发育。该突变系可以使烟草种植者受益，因为农民在收获烟叶时，需要劳动密集型的过程，即尽量减少去除次生和第三次生侧枝所需的工作量。GydF4y2Ba

侧枝发育是植物的一个基本过程，在所有物种中都受到独特的调控。在作物品种中，如何控制侧枝形成直接影响收获质量和产量。参与腋生分生组织发育的基因已经在各种植物中进行了研究。突变GydF4y2Ba侧抑制器GydF4y2Ba番茄中的基因（GydF4y2BaLsGydF4y2Ba)[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba拟南芥（GydF4y2Ba拉斯GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]在营养期抑制腋芽的形成。水稻同源基因的突变GydF4y2BaMonoculm 1.GydF4y2Ba（GydF4y2BaMOC1.GydF4y2Ba），导致抑制分蘖和rachis分支和尖峰的减少[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]. 基因突变GydF4y2Ba盲目的GydF4y2Ba基因强烈抑制番茄腋生分生组织的形成[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．三个GydF4y2Ba腋生稳健机GydF4y2Ba（GydF4y2BarGydF4y2Ba)基因,GydF4y2Barax1GydF4y2Ba那GydF4y2Barax2.GydF4y2Ba,GydF4y2Barax3.GydF4y2Ba，以拟南芥鉴定为同源物GydF4y2Ba盲目的GydF4y2Ba．三重隐性突变体表现出几乎完全抑制的腋芽形成[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba盲目的GydF4y2Ba和GydF4y2BarGydF4y2Ba这些基因编码R2R3 MYB转录因子，这些转录因子对于营养阶段腋窝分生组织的发育至关重要。以前的研究表明GydF4y2Ba盲目的GydF4y2Ba也控制生殖阶段的腋窝分生组织起始[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．在拟南芥中，初生芽的去头并不刺激腋芽的生长GydF4y2Ba拉斯维加斯GydF4y2Ba突变或GydF4y2Barax1GydF4y2Ba突变体[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．的GydF4y2BaLAX1GydF4y2Ba水稻中的基因及其应用GydF4y2Ba巴1GydF4y2Ba基因编码bHLH结构域，并参与花序和营养芽的分枝[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．的GydF4y2Ba火箭GydF4y2Ba基因是拟南芥的同源GydF4y2BaLAX1GydF4y2Ba和GydF4y2Ba巴1GydF4y2Ba．据报道，据报道，早期植物阶段的横向芽形成[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

一些调控腋生分生组织形成的基因突变影响主茎尖的发育。例如，在GydF4y2Ba罗沃拉GydF4y2Ba（GydF4y2Ba录GydF4y2Ba）拟南芥的基因显着降低了莲座叶和甲磺酸的生长，并抑制原发性芽的斩波后抑制腋窝的刺激[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．此外，这是GydF4y2Ba录GydF4y2Ba突变有时会导致初生芽顶端分生组织(SAM)在早期发育受阻。的GydF4y2Ba的杯状容器子叶GydF4y2Ba（GydF4y2Ba中联科利GydF4y2Ba）基因GydF4y2BaCUC1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaCUC2GydF4y2Ba,GydF4y2BaCUC3.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]和GydF4y2Ba侧向器官融合GydF4y2Ba（GydF4y2BaLOF.GydF4y2Bagene [GydF4y2Ba16GydF4y2Ba[拟南芥中调节器官分离和腋生分析。GydF4y2Ba多毛分生组织GydF4y2Ba（GydF4y2Ba火腿GydF4y2Ba)矮牵牛基因[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba和胡椒[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba他们在拟南芥中的同源物，GydF4y2Ba失去的分生组织GydF4y2Ba（GydF4y2Ba洛美GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]对SAM和腋生分生组织的发育有重要作用。因此，牵牛花和胡椒GydF4y2Ba火腿GydF4y2Ba突变体和拟南芥GydF4y2Balom1GydF4y2Ba-GydF4y2Balom2GydF4y2Ba-GydF4y2Balom3GydF4y2Ba三重突变体表现出枝条顶点的过早终止并阻止了腋下射击发育。一个突变GydF4y2Ba红光对于细长的下胚轴GydF4y2Ba（GydF4y2BaFHY3.GydF4y2Ba)基因抑制拟南芥腋芽的生长。此外，这是GydF4y2Ba录GydF4y2Ba-GydF4y2BaFHY3.GydF4y2Ba双突变比单隐性突变更能抑制腋芽的形成[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

由于烟草为叶子栽培，当植物开始花时，茎（主要是花序）的顶端部分被切断（即，顶部），以增强收获前的叶片发育和成熟。虽然烟草植物一般表现出强大的顶端优势，但顶部释放出休眠的侧芽。由此产生的横向芽，其通常被称为“吸盘”在烟草中，经历剧烈的发展。烟草农民必须在开发后尽快删除这些“初级”横向芽，但“二次”侧枝立即从初级侧枝底座的轴向侧生长。因此，在培养期间（最多“的”横向芽期间，横向射击依次出现。这些横向芽必须由化学物质手动或抑制（即“，”吸吮“）来抑制，以使植物能够产生许多高质量的叶子。然而，这种对侧枝的控制是一种劳动密集型和昂贵的过程。去除次级和三级射击尤其不方便，因为当农民必须收获叶子时，它们的出现时间一致，这是另一个劳动密集型任务。因此，非常需要具有较少的侧枝，特别是次级和三级的烟草品种。不幸的是，涉及常规和生物技术方法的繁殖并未导致侧面较少较少的品种。GydF4y2Ba

参与腋生芽的调节的烟草基因及其功能仍然相对无表。然而，在其他植物中的上述基因的同源物可能存在并且在烟草中类似地存在。例如，烟草同源物（Genbank Eu935981）GydF4y2BaLsGydF4y2Ba已被克隆[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]但它没有调查其功能。在该研究中，通过RNA干扰（RNAi）将这些基因的同源物以及优先在腋中的许多在腋中表达的其他基因的表达表达。另外，将化学诱导的突变抑制横向芽形成。突变线的特征在于温室和田间试验。GydF4y2Ba

爆炸的搜索GydF4y2Ba

研究了两组烟草基因对侧枝形成的影响。第一组包括与其他植物侧枝形成有关的基因同源物。对GenBank数据库和内部烟草cDNA数据库进行了BLAST搜索，以鉴定烟草同源物（表1）GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.因为烟草是一种双二倍体物种，它的基因组是从GydF4y2Ba美花烟草GydF4y2Ba(S-genome)和GydF4y2BaNicotiana tomentosiformis.GydF4y2Ba（T-基因组）[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba[每个同源物鉴定S-Genes和T-基因。的GydF4y2BaNtBlGydF4y2Ba和GydF4y2BaNtCUCGydF4y2Ba基因分别以同源性的降序为单位编号GydF4y2Ba盲目的GydF4y2Ba和GydF4y2Ba杯状GydF4y2Ba(GenBank HM210879)，一个番茄同源物GydF4y2Ba中联科利GydF4y2Ba基因。GydF4y2Ba

RNA测序（RNA-SEQ）分析GydF4y2Ba

在其他植物中未研究的基因也可能参与腋生分析和芽的调节或开发。因此，作为第二组，通过RNA-SEQ鉴定在腋芽原始阶段高度表达的基因。通过激光微解析从早期（EA）和早期（EA）和非常早期阶段（VE）和来自烟草植物的控制区的组织中取样（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.从组织中提取总RNA，并使用454 GS FLX下一代测序仪(454 Life Sciences, Roche)分析。每个组织样本获得约900000个reads，平均长度约为400 bp，组装成38569个独特基因。第二组的基因选择按照下列标准:(a)基因的读计数在EA或已经至少有着高于控制,(b)基因组装超过200个基点,和(c)基因编码转录因子或未知的蛋白质根据注释。我们选择了11个在EA组织中高表达的基因(GydF4y2Baea1.GydF4y2Ba-GydF4y2BaEA11型GydF4y2Ba)和13个VE组织高表达基因(GydF4y2BaVE1.GydF4y2Ba-GydF4y2BaVE13GydF4y2Ba） （桌子GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

第一组基因(即烟草同源物)的RNA读计数列于表中GydF4y2Ba2GydF4y2Ba．与对照组织进行比较GydF4y2BantlGydF4y2Ba和GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba均在EA或VE组织中高度特异性表达。在这三个样本中，GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba高度表达。关于其他同源物，三种组织中表达水平没有显着差异，或表达水平过低以检测。先前的调查证明了这一点GydF4y2Ba拉斯GydF4y2Ba和GydF4y2BarGydF4y2Ba基因在叶子原基的腋中高度表达[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．此外,GydF4y2Ba录GydF4y2Ba据报道，在初始横向射击中表达，以及在倒杯形细胞群中的SAM中心中[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．因此，至少一些同源物的表达模式（GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba,GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba)与其他物种的同类相似。GydF4y2Ba

值得注意的是，序列分析显示GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba，编码bHLH结构域，是同源的GydF4y2Ba火箭GydF4y2Ba拟南芥的基因。识别GydF4y2Ba火箭GydF4y2Ba是在我们对上述基因同源物的快速搜索之后发表的[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]．此外,GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba该基因编码一个NAC域，缺乏miR164的识别位点，被鉴定为aGydF4y2BaCUC3.GydF4y2Ba同族体。以前的研究证实GydF4y2Ba火箭GydF4y2Ba[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]它的玉米orthologGydF4y2Ba巴1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]在叶子原金的关于曲线边界和GydF4y2BaCUC3.GydF4y2Ba在叶原基与茎分生组织的边界处表达[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]. 因此，GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba和GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba在表达模式上与同源物相似。除了腋生分生组织的早期阶段，GydF4y2BaLsGydF4y2Ba那GydF4y2Bab11GydF4y2Ba，大部分GydF4y2Ba已经GydF4y2Ba和GydF4y2BaeaGydF4y2Ba基因在其他组织和器官中表达(附表GydF4y2BaS1GydF4y2Ba）.更重要的是，rna序列分析补充了同源物的搜索。GydF4y2Ba

RNAi混战GydF4y2Ba

对于在RNA-SEQ筛选期间选择的12个同源物和24个基因的RNA干扰，总共36个触发序列，平均长度为430bp的触发序列GydF4y2BaS2GydF4y2Ba）.三个GydF4y2BaNtBlGydF4y2Ba和四个GydF4y2BaNtCUCGydF4y2Ba基因。因此，较不保守的区域(即小于70%的同一性)占三个GydF4y2BaNtBlGydF4y2Ba基因和四个GydF4y2BaNtCUCGydF4y2Ba用基因设计触发序列来区分每个基因。对每个靶标进行s基因和t基因的比较。选择一个高度同源的区域作为触发器，以确保两个基因被一个单一的触发器序列有效敲除。s基因和t基因的触发区平均序列同源性为95.4%，高于Parrish等人确定的同时敲除两个基因的足够同源性[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

将RNAi基因引入GydF4y2Ba烟草GydF4y2Bal .简历。佩蒂特哈瓦那SR-1。TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba每个结构的三个单位点转化子的子代在温室中生长，并检测了目的基因的表达。目的基因在分析的植物中被完全抑制(表1)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba），除了GydF4y2BaVE3.GydF4y2Ba转化子，其中目的基因的表达量高于零分离子;表达增多的原因尚不清楚。数据显示，转基因植株和无分离子之间的初级侧枝产量(即数量和重量)缺乏差异(表1)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.因此，通过RNAi敲除靶基因的表达并没有抑制初生侧枝的形成。然而，次生侧枝的产生在数量和/或重量上受到抑制GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba那GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba是目标。例如，在野生型植物的初级侧枝的背面基部可以看到次级侧芽。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa），但不是转基因植物GydF4y2BantlGydF4y2Ba表达被撞击（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab).去除次生侧枝后，温室内生长的植物上不再形成额外的侧枝。一项较早的研究表明，至少22个连续核苷酸的序列匹配可能导致触发序列的脱靶沉默[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．因此，我们进行了BLAST搜索，筛选出22个与5个有效基因的触发序列相同的连续核苷酸。GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba那GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba）.除了GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba，没有发现22个核苷酸序列与触发序列相同的烟草基因。的GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba基因被认为是NAC基因，属于烟草中最大的转录因子家族之一[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]. 因此，我们不能排除目标外沉默的可能性GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba_RNAi烟草植物。关于GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba，我们确认了表达GydF4y2BaNtBl2GydF4y2Ba和GydF4y2BaNtBl3GydF4y2Ba没有下调监管吗GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba_rna干扰烟草植物。因此，进一步验证了RNAi的结果。GydF4y2Ba

化学诱导突变体GydF4y2Ba

甲基磺酸乙酯(EMS)突变体文库GydF4y2Ba烟草GydF4y2Bal .简历。筑珠1筛查了废弃的突变GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba那GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba．我们鉴定并绘制了以下突变(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）：每个两个GydF4y2BaNTLS-S.GydF4y2Ba和GydF4y2BaNtBl1-SGydF4y2Ba每个人都在GydF4y2BaNTLS-T.GydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1-TGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtRev-S公司GydF4y2Ba,GydF4y2BaNtRev-T公司GydF4y2Ba．此外，将s -基因组和t -基因组的突变通过杂交组合，产生双突变系，称为SAS株系(Table .)GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba). 因为在基因中没有发现无义突变GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba和GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba，这些基因没有被进一步研究。GydF4y2Ba

据报道，一些参与腋生分生组织形成的基因突变会影响主茎尖的发育[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]．SAS的幼苗 -GydF4y2Ba录GydF4y2Ba突变线产生杯形或不对称子叶（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaG）。此外，叶子为4到5周哥式猫319-GydF4y2BaLS-1GydF4y2Ba植物GydF4y2Ba那GydF4y2Ba在商业生产基地进行田间试验的回交系，在苗圃箱中生长有时会变黄（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一世）。在4至5周龄Coker319中观察到相同的表型GydF4y2BaLS-1GydF4y2Ba在生长室内15°C培养的植物，尽管在28°C下植株看起来正常。这些发现表明Coker319-GydF4y2BaLS-1GydF4y2Ba叶片着色对冷胁迫很敏感。然而，发黄的植物恢复得很快，没有延迟生长。将正常生长的SAS系移栽到试验田，观察其侧枝发育情况。同样，初级侧枝在SAS中没有明显的抑制作用-GydF4y2BaLS.GydF4y2Ba，sas-GydF4y2BaBL1.GydF4y2Ba，和SAS-GydF4y2Ba录GydF4y2Ba植物（表格GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)而次生侧枝的数量和重量则减少。此外，第三级侧枝的形成几乎完全被抑制（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bal，m和n）。温室中RNAi线的表型与现场EMS突变体的表型一致。有趣的是，初级侧面射击的位置在SAS中向上移动 -GydF4y2BaLS.GydF4y2Ba和SAS -GydF4y2BaBL1.GydF4y2Ba突变系（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaD和f)在田间和温室(数据未示)。在温室中生长的RNAi系中没有观察到类似的变化。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab).突变株系和RNAi株系的第二次和第三次侧枝位置不变。突变株中主要侧枝的位置GydF4y2BantlGydF4y2Ba和GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba但这种转变的原因仍不清楚。GydF4y2Ba

商业生产区的现场试验GydF4y2Ba

在用于烟草商业生产的地区进行了田间试验，以研究突变株的农艺性状。的GydF4y2BaLS-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaBL1-1GydF4y2Ba将突变引入日本广泛种植的烤烟繁殖的烟草品种“Coker319”中（GydF4y2Ba烟草GydF4y2Bal .简历。Coker319)通过回交育种(表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.因为空间限制，GydF4y2Ba录GydF4y2Ba未测试突变。GydF4y2Ba

Coker319-的分析结果GydF4y2BaLS-1GydF4y2Ba在四个地点和Coker319-GydF4y2BaBL1.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba1GydF4y2Ba在两个地点呈现在表格中GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba．在所有位置处每根线复制包括10株植物的曲线图。总的来说，在叶片产量或其他参数方面，突变线与原始的“Coker319”植物没有多大差异，尽管虽然小，但统计学上显着，但检测到差异。具体而言，与“Coker319”植物相比，Coker319-GydF4y2BaLS-1GydF4y2Ba在一个或多个位置的植株更高，有更大(长度和宽度)和更深的叶子，开花较晚。相比之下，Coker319-GydF4y2BaBL1.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba1GydF4y2Ba与“Coker319”植株相比，一两个部位的植株更短，产生更多的叶子，更小，颜色更浅(从顶部的1/2处)。因此，该突变系适合于后续试验。侧枝的发育受到抑制，尤其是次生和第三次生侧枝的发育。一项初步调查显示，Coker319-去除侧枝所需的劳力降低了52%GydF4y2BaLS-1GydF4y2Ba植物而不是'Coker319'植物（补充表GydF4y2BaS3GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

花卉发展与生育GydF4y2Ba

在温室和场地，大部分鲜花的花瓣 -GydF4y2BaLS-1GydF4y2Ba，sas-GydF4y2BaLS-2GydF4y2Ba，和Coker319.GydF4y2Ba-ls-1GydF4y2Ba植物被分开(Fig。GydF4y2Ba2GydF4y2Baj）。在严重的情况下，雌蕊和雄蕊完全暴露（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bak）。与天然授粉的WT花相比，从Coker319的异常花的种子产量GydF4y2BaLS-1GydF4y2Ba自然授粉降低35%，人工授粉降低55%。GydF4y2BaS1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

Coker319-GydF4y2BaBL1-1GydF4y2Ba在田间试验中，与野生型植物相比，植株的花量减少了73%。GydF4y2BaS2GydF4y2Ba）.每花的种子产量319-GydF4y2BaBL1-1GydF4y2Ba比Coker319少28%(补充Fig。GydF4y2BaS1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

对烟草侧枝形成的遗传抑制进行了研究。选择两组烟草基因，研究RNAi对烟草侧枝形成的影响。一组候选基因包含了据报道参与其他植物侧枝形成的基因的同源体。这类基因在拟南芥中研究得最为广泛。共鉴定出8个基因或基因家族:GydF4y2Ba拉斯GydF4y2Ba[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]，GydF4y2BarGydF4y2Ba家庭 [GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba火箭GydF4y2Ba[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba录GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba中联科利GydF4y2Ba家庭 [GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]，GydF4y2BaLOF.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba洛美GydF4y2Ba[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BaFHY3.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]. 一个BLAST搜索确定了这些基因的烟草同源物，除了GydF4y2Ba火箭GydF4y2Ba，这是在BLAST搜索执行后报告的。的GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba基因，同源于GydF4y2Ba火箭GydF4y2Ba，被包含在另一组基因中，通过RNA-seq分析发现这些基因在烟草腋芽的原始阶段高表达。的相同器官GydF4y2BaCUC3.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba也属于第二组基因。因此，烟草和拟南芥显然拥有相似的基因。GydF4y2Ba

转基因素线GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba那GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba,或GydF4y2BaVE12GydF4y2BaRNAi和化学诱导突变的细胞株的表达均被抑制GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba,或GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba次生侧枝形成受到抑制。这个GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba那GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba基因分别是GydF4y2Ba拉斯GydF4y2Ba那GydF4y2Barax1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba录GydF4y2Ba那GydF4y2Ba火箭GydF4y2Ba,GydF4y2BaCUC3.GydF4y2Ba．他们报告的表达模式与本文提供的RNA-seq数据一致。此外,突变GydF4y2Ba拉斯GydF4y2Ba那GydF4y2BaLsGydF4y2Ba（在番茄中），和GydF4y2BantlGydF4y2Ba影响花形态学。雄蕊GydF4y2Ba拉斯维加斯GydF4y2Ba突变植株异常短[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．其他研究证明，花瓣发育被抑制GydF4y2BaLS.GydF4y2Ba突变体和花瓣大多小于野生型花瓣[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．此外，花粉产量和种子产量也普遍下降。突变GydF4y2Ba盲目的GydF4y2Ba[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]，这是GydF4y2Barax1GydF4y2Ba,GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba导致鲜花数量减少。所以，GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba那GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba可能分别被认为是GydF4y2Ba拉斯GydF4y2Ba那GydF4y2Barax1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba录GydF4y2Ba那GydF4y2Ba火箭GydF4y2Ba,GydF4y2BaCUC3.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

一些观察到的特征敲除和化学诱导烟草植株没有报道其他植物。烟草初生侧枝的形成不受抑制，次生侧枝和次生侧枝的发育受抑制。此外，在烟草突变体中，初生侧枝的位置向上移动GydF4y2BantlGydF4y2Ba和GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba．植物物种之间差异的机制仍然不清楚;然而，这些差异并不令人惊讶，因为横向分支调节中的多样性是与相当多种植物形状相关的关键因素。GydF4y2Ba

其他分析的烟草同源物在击倒研究中无效。这些基因的表达要么是无法检测到的，要么不是特定于腋芽原始阶段。它们很可能是其他植物的非功能同源基因。GydF4y2Ba

第二组候选基因在腋芽原始期高表达。通过RNA-seq分析，筛选出24个基因。它们在EA或VE组织中高度特异地表达。然而，除了GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba和GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba，敲击这些基因的表达并没有显着抑制横向芽形成。因此，这些基因可能与横向射击发育有关的关键调节作用。或者，烟草中的功能可能是多余的。GydF4y2Ba

在商业烟草生产现场的现场试验中检查了具有“Coker319”遗传背景的两个突变烟草线。这些系列对烟草叶生产令人满意，应重复试验。关于抑制二次和叔侧芽形成的后果，在初步调查中评估了去除外侧芽所需的劳动。虽然在幼苗阶段的寒冷敏感性和一些花卉异常的含量较低，但在此期间观察到降低的种子产量GydF4y2Bantls-GydF4y2Ba突变的植物，这些特性不太可能影响烟草叶生产实践。GydF4y2Ba

本研究中检测的Coker319衍生物是潜在有用的烟草新品种。它们可以减少烟草种植者控制次生和三次生侧枝形成所需的劳力和时间。此外，培育其他有突变的品种GydF4y2BantlGydF4y2Ba和/或GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba进一步描述GydF4y2BantlGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtBl1GydF4y2Ba那GydF4y2Bantrev.GydF4y2Ba那GydF4y2BaVE7.GydF4y2Ba,GydF4y2BaVE12GydF4y2Ba基因是未来研究的重要目标之一。GydF4y2Ba

在这项研究中，我们试图利用抑制横向芽形成开发烟草线。对烟草农民之间的这种线条有相当大的需求。五种基因的RNA干扰和化学诱导的突变到三种基因显着抑制了温室和田间条件下烟草中的横向射击发育。在商业生产基地进行的现场试验中评估了两条突变线。虽然在检查的线中不抑制原发性横向芽形成，但二次和三级射击的产生降低可能对改善的商业烟草生产产生影响。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

烟草GydF4y2Bal .简历。Petit Havana SR-1由福井府大学于1995年提供，用于RNA测序和RNA干扰。GydF4y2Ba烟草GydF4y2Bal .简历。筑波1号于1980年由日本烟草公司开发，用于基因克隆和化学诱导突变体的发育。GydF4y2Ba烟草GydF4y2Bal .简历。Coker319由Coker's Fedigreed Seear Co.于1963年提供，用于繁殖。GydF4y2Ba

爆破分析GydF4y2Ba

NCBI BLAST数据库中用于BLAST查询的基因(GydF4y2Bahttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi.GydF4y2Ba）和包含多次内部研究累积的烟草cDNA序列的数据库列在表中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

RNA序列GydF4y2Ba

在‘小哈瓦那SR-1’烟草幼苗萌发后29～37天，采集其茎尖组织，然后将其固定在3:1乙醇和乙酸的冰凉溶液中。Takahashi等人先前描述了用于制备石蜡包埋切片和激光显微切割的方案[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．使用PicoPure™RNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)提取的总RNA使用安捷伦2100生物分析仪和RNA 6000 Pico试剂盒(安捷伦技术公司)进行检测。然后用T7启动子序列的oligo-dT引物合成cDNA，然后用T7 RNA聚合酶转录反义RNA。反义RNA作为模板，随机引物合成cDNA。经过一个片段化步骤，收集含有3’端的cDNA (400 - 1000 bp)，并用454 GS FLX系统对片段的5’端进行测序。包含这些序列的文件已存放在DDBJ (DRA011900)。获得的读取用Newbler(2.6版)组装。GydF4y2Ba

基因克隆GydF4y2Ba

从GenBank和内部cDNA数据库中提取编码序列信息后，使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)进行5 ' -或3 ' -RACE，获得编码序列全长cDNA克隆。从休眠的腋芽、茎尖、花蕾或根中提取总RNA (magtion®;精密系统科学有限公司)。扩增片段使用BigDye®(3.1版)循环测序试剂盒(赛默飞世尔科学公司)和3730xl DNA分析仪(赛默飞世尔科学公司)进行测序。标准程序用于DNA操作[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]．获得的序列信息见补充表GydF4y2BaS4GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

RNA干扰GydF4y2Ba

引物见补充表GydF4y2BaS2GydF4y2Ba从‘Petit Havana SR-1’烟草植株的休眠腋芽、茎尖、花蕾或根中分离的克隆cDNA或RNA，用于扩增触发序列。扩增片段被克隆到pENTR™/D-TOPO载体(Takara Bio)中，然后引入改良的pHellsgate12二进制载体[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba含有表达盒，其包含在CAMV 35s启动子的控制下编码绿色荧光蛋白的基因。将二进制载体插入GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2Ba菌株LBA4404细胞，然后用于转化小哈瓦那SR-1烟草植株。根据转基因植株中绿色荧光的分离比，确定了转基因的位点数GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba的一代。采用定量PCR检测目的基因表达水平。简而言之，从叶片、根或不含叶片的地上组织中提取的RNA作为模板，使用带gDNA橡皮擦(Takara Bio)的PrimeScript RT试剂试剂盒合成cDNA。采用TaqMan Fast Advanced Master Mix(赛默飞世尔科学公司)和StepOnePlus系统(赛默飞世尔科学公司)进行定量PCR分析。引物和探针的详细信息见补充表GydF4y2BaS5GydF4y2Ba．以编码伸长因子-1α (AF120093)的基因作为内参对照。目的基因在RNAi系中的相对表达量与不含该基因的无分离对照中的表达量进行了比较。GydF4y2Ba

化学诱导突变体GydF4y2Ba

图书馆GydF4y2Ba烟草GydF4y2Bal .简历。Tsukuba 1与Tajima等人的EMS突变[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]如Takakura等人所述进行筛选[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]，使用补充表中列出的引物GydF4y2BaS6GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

植物栽培GydF4y2Ba

在25℃下在自然的日间长度条件下或12小时光（25℃）：12-H黑色（18°C） 循环。它们也在日本烟草公司叶烟草研究中心的实验领域种植，或在日本西南部用于商业烟草生产的领域。根据各自的标准实践进行管理。当出现花蕾时，植物被截止，然后在生长室或在该领域进行每周测量横向芽5周。使用叶子颜色图2019A用于烟草（藤叶岛工业;补充表GydF4y2BaS7GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在稿件及其补充文件中。图中描绘的所有图像都是我们自己的。番茄，拟南芥和烟草基因的序列信息可从Solanaceae基因组学网络获得（GydF4y2Bahttps://solgenomics.net/GydF4y2Ba），Genbank（GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GydF4y2Ba)及日本DNA资料库(GydF4y2Bahttps://www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html.GydF4y2Ba）.本研究获得的基于下一代测序的原始reads可从DDBJ/EMBL/NCBI获得，注册号为DRA011900 (GydF4y2Bahttps://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/submission?acc=DRA011900GydF4y2Ba）.本研究中产生或分析的数据集可从通讯作者处获得，用于非商业目的。GydF4y2Ba

LsGydF4y2Ba那GydF4y2Ba拉斯GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

侧抑制器GydF4y2Ba

MOC1.GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

MonoculmGydF4y2Ba1GydF4y2Ba

rGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

腋窝分生组织的调节GydF4y2Ba

MYB:GydF4y2Ba

骨髓霉素GydF4y2Ba

lGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

宽松的圆锥花序GydF4y2Ba

巴1GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

贫瘠的茎1.GydF4y2Ba

bHLH:GydF4y2Ba

基本helix-loop-helixGydF4y2Ba

火箭GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

腋生稳压器形成GydF4y2Ba

录GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

罗沃拉GydF4y2Ba

中联科利GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

杯形子叶GydF4y2Ba

LOF.GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

侧向器官融合GydF4y2Ba

火腿GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

毛茸茸的公司GydF4y2Ba

洛美GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

失去的分生组织GydF4y2Ba

FHY3.GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

红光对于细长hypocotyl3GydF4y2Ba

RNAi：GydF4y2Ba

RNA干扰GydF4y2Ba

NCBI:GydF4y2Ba

国家生物技术信息中心GydF4y2Ba

爆破：GydF4y2Ba

基本的局部比对搜索工具GydF4y2Ba

blGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

B.GydF4y2Ba林德GydF4y2Ba

RNA-seq:GydF4y2Ba

RNA序列GydF4y2Ba

山姆：GydF4y2Ba

茎顶端分生组织GydF4y2Ba

NAC：GydF4y2Ba

Petunia nam和Arabidopsis Ataf1，Ataf2和Cuc2GydF4y2Ba

EMS:GydF4y2Ba

甲基磺酸乙酯GydF4y2Ba

种族：GydF4y2Ba

cDNA末端的快速扩增GydF4y2Ba

CaMV:GydF4y2Ba

花椰菜马赛克病毒GydF4y2Ba

SD：GydF4y2Ba

标准偏差GydF4y2Ba

作者感谢Mikio Nakazono博士和Hirokazu Takahashi博士在激光显微切割和RNA提取过程中提供的技术支持。我们也感谢Toshihiko Komari博士对手稿的友好、批判性和仔细阅读。我们要对大谷佐子博士、小泉雅子、竹原迈博士、佐藤南爱、小池早矢和高桥明子的出色技术援助表示感谢。GydF4y2Ba

所有作者都附属的日本烟草公司是研究的唯一资助。本研究作为烟草业务部门研发部的活动之一。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 叶烟草研究中心，日本烟草Inc.，1900 IDEI，Oyama，Tochigi，日本323-0808GydF4y2Ba

   Kaori Hamano，Seiki Sato，Masao Ari，Yuta Negishi，Takashi Nakamura，Tomoyuki Komatsu，Tsuyoshi Naragino＆Shoichi SuzukiGydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

KH、SS1、TN1、SS2设计了研究和实验。KH、SS1、MA、YN、TN1、TK、TN2、SS2进行实验。KH、SS1、SS2定期讨论研究进展，制定研究策略。KH和SS2写了手稿。SS1和SS2分别对应saiki Sato和Shoichi Suzuki。TN1和TN2分别对应Nakamura Takashi和Naragino Tsuyoshi。所有作者均已阅读并批准稿件。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

通信GydF4y2Ba薰HamanoGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

日本烟草公司资助所有研究的生产和持有关于RNAi烟草和化学诱导的烟草突变体的专利。专利WO / 2017/170796A1，日本烟草Inc.，烟草植物体和制造方法。GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。所有作者都与日本烟草公司隶属于这项研究的资助者。GydF4y2Ba

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