低氮可用性抑制玉米的磷饥饿反应（Zea Mays.ssp。梅斯l .)

背景

氮(N)和磷(P)是作物生长和生产力所必需的常量营养素。在耕地中，氮和磷水平很少充足，导致实际生产和潜在生产之间的差距。施肥增加了养分的有效性，但并非所有农民都能获得，目前的施肥速度也不是可持续的或符合环境要求的。对谷类作物的转录组学研究显示，低氮或低磷单一胁迫处理的反应显著。然而，在田间，氮和磷的水平可能都不是最优的。N和P饥饿反应之间的相互作用仍有待完全确定。

结果

我们在营养丰富，低N，低P或组合低NP条件下表征了幼玉米植物的生长和根叶和叶片转录om。我们确定了1555个基因，以应对我们的营养处理，在一个或两个组织中。一大群基因，包括许多典型的P饥饿反应基因，在低N和P条件下拮抗拮抗。在一系列N可用性范围内的另外的实验表明，N级的轻度降低足以抑制P饥饿基因的低P诱导。虽然在低N或低NP下压抑了P托管基因的表达，但我们在N限制下确认了P高累积的早期报道。

结论

对低n或p的转录反应是不同的，很少有基因以与两个单一应力处理类似的方式响应。在NP应激组合中，低N响应占主导地位，并且在很大程度上被抑制了P饥饿响应。N可用性的轻度降低足以抑制P饥饿相关基因的诱导。我们得出结论，对玉米中P饥饿的转录反应的激活取决于N可用性。

氮（N）和磷（P）是多种生物过程所需的必需常规营养素[1那2那3.那4.那5.］．n是所有蛋白质的组分和光合碳固定所需的叶绿素。P是必需的，以产生形成环绕细胞和细胞内细胞细胞的膜的磷脂。此外，N和P是核酸的结构组分，包括在蛋白质合成中发挥关键作用的丰富RNA分子。对这些MACRONRICES的需求使得农业土壤中的N和P可用性很少足以实现作物的全部产量潜力[6.那7.］．P随着其他元素，如酸性土壤中的其他元素或碱性土壤中的钙反应，将其留在土壤的上层并降低其植物的可用性[8.那9.］．相比之下，n，在很大程度上以硝酸盐形式存在，是移动的并且倾向于移动到更深的土壤层，在那里可能超出植物根系系统的范围[10.］．在高投入系统中，氮和磷限制的问题可以通过添加化肥来缓解，尽管考虑到负面的环境影响，目前的施用水平既不可持续也不可取[11.］．工业N固定昂贵昂贵并有助于温室气体生产[12.］．高品位磷矿是一种不可再生资源，预计本世纪末前产量将达到峰值[13.］．由于这些原因，提高氮磷效率已被确定为植物育种和农业管理的关键目标[11.那14.］．

研究拟南芥蒂利亚纳和大米(奥雅萨苜蓿)已经确定了低氮或低磷胁迫的生理和发育响应，以及潜在的基因表达的大规模变化(分别是N饥饿响应- NSR和P饥饿响应- PSR) [15.那16.那17.那18.那19.那20.])。营养缺乏的常见策略是通过增加根部中的高亲和力转运蛋白的丰度来促进摄取。在n或p局限下，诱导编码硝酸盐的基因[21.那22.那23.]或磷酸盐转运蛋白[24.那25.那26.那27.]）， 分别。NSR的其他方面包括与硝酸盐同化和氨基酸，寡糖和核酸生物合成相关的基因的下调[15.那28.］．PSR包括紫酸磷酸酶（PAPS）诱导参与来自有机池的内部和外部P，改变多糖代谢，并改造脂膜以减少磷脂的要求[29.那30.那31.］．有趣的是，NSR和PSR的某些方面是拮抗的，在N限制下，PSR中诱导的许多基因被抑制[15.那30.那32.那33.］．人们早就认识到，一种元素的缺乏会影响对另一种元素的反应，而且不同营养缺乏的影响不一定是添加剂[34.那35.那36.那37.那38.那39.那40］．因此，很难从单一胁迫数据来预测氮磷缺乏症的转录组响应，特别是在拮抗调控基因的背景下。然而，一些研究已经证明了N和P信号通路之间的分子相互作用的明确点。

N和P信号之间的第一个分子连接是识别SPX- ring (SPX域:以酵母gpa1抑制因子命名，酵母磷酸酶81和人类异嗜性和多变性逆转录病毒受体1;RING域:真正有趣的新基因)蛋白氮限制适应(NLA1)拟南芥．atnla1.突变体不能适应低氮环境，表现出早期衰老[41.]与p毒性相关[42.］．进一步的研究表明，ATNLA直接靶向pHT1磷酸盐转运蛋白以n依赖的方式降解[43.]以及靶向硝酸盐转运蛋白NRT1.7 [44.］．在磷饥饿条件下，磷的下调atnla.通过P饥饿诱导诱导MicroRNA miR827促进pHT1的积累[42.］．Rien Osnla还规范了PHT1丰度，并以n依赖方式调制P累积[45.那46.］．然而，在米饭中，MiR827并不瞄准OsNLA，氮和磷水平也不能调节OsNLA成绩单积累，表明调节差异拟南芥[45.那47.］．

MYB-CC转录因子AtPHR1在激活PSR中起核心作用[48］．在高磷条件下，AtPHR1的同源基因OsPHR2被SPX蛋白OsSPX4隔离，防止其转位到细胞核并激活PSR基因[49］．在P饥饿条件下，26S蛋白酶体降解OsSPX4，允许OsPHR2激活其目标。最近，有研究表明，氮调控的硝酸盐转运体osnrt11 .1b是OsSPX4降解所必需的。在N饥饿时，osnrt11 .1b水平降低，使OsSPX4脱离周转，导致PSR的抑制[50］．有趣的是，OSSPX4不仅搅拌散硅，而且还序列蛋白质OSNLP3，稻米中的氮气反应的中央调节器[50］．这些研究，以及其他研究，已经证明了N和P反应的相互作用，并确定了包含蛋白的SPX结构域在它们的协调中起着重要作用。

玉米是世界上最重要的经济作物之一。氮或磷的限制是世界范围内玉米产量的一个重大限制[51那52那53那54］．工作拟南芥稻米已经开始定义N和P信令网络之间的相互作用。然而，在我们可以将这些知识应用于更高效的管理实践或更营养的有效作物品种的发展之前，还有很多待发现。在这里，我们向营养物质的玉米幼苗的叶片和根部报告了整个转录组数据，低N，低P和组合的低NP应力。我们观察到对单次低N和低P处理的反应之间的拮抗作用，低N应答在组合的低NP处理中。我们进一步表明，即使是N可用性的轻度降低也足以抑制玉米PSR的组件。

低氮、低磷处理降低了玉米幼苗的生长

选择在其特征在于组合N和P限制的转录响应的材料中，首先表现出在完全营养条件下出现（完全;见方法）后生长40天的玉米植物的生长，减少N（leown：9％浓度），降低p（低剂：3％的完全浓度），并在组合减少N和P（LOWNP）下。植物在1米高，15厘米直径（〜17L体积）PVC管中生长，为根部发育提供足够的深度（图。1一种）。我们通过每5天手动测量绿叶区域（La）的植物生长，从出苗后10天开始（DAE）。完全条件下的植物表明，与减少的营养处理相比，叶片起始速率的增加（图。1B;年代1；MZ66_Growth_Analysis在附加文件7:补充文件1）.在25个Dae，Full和Lowp植物开始比Lown和Lownp植物更多的叶子（kw adj。P. = 0.003. Dunn test at α = 0.05. Leaf number - Full: 5.6 ± 0.2a; LowP: 5.0 ± 0.22a; LowN: 4.0 ± 0.22b; LowP: 4.1 ± 0.2b. Here and below, we give model coefficients, standard errors and means groups assigned by Dunn test or Tukey as indicated). By harvest, plants in Full had ~ 1.5 more leaves on than those in the stress treatments, with the stress treatments indistinguishable among themselves (KW adj.P. = 0.09. Dunn test at α = 0.05. Leaf number 40 DAE - Full: 8.6 ± 0.28a; LowP: 7.3 ± 0.32b; LowN: 7.0 ± 0.33b; LowNP: 7.0 ± 0.29b). The first two leaves were fully expanded in all treatments when we started to collect measurements at 10 DAE, and they began to senesce early in the course of the experiment, reflected by a loss of LA (Fig.1c, d)。各处理的第二叶均表现出等效的LA。P. > 0.05 for treatment at all time points) and began to senesce at the same time (~ 30 DAE; Fig.1d）。衰老早于第一次叶子比第二叶（〜20dee）开始，并且比在其他条件下更快，并且在其他条件下更快（图。1c.叶片1 - LA KWP.25和30 DAE时< 0.001。α = 0.05时的Dunn检验。low和LowNP处理第25天叶片完全衰老，Full和LowP处理第40天叶片完全衰老。第1个时间点出现第三片叶片，持续生长至~ 20dae，不同处理间LA无差异(图1)。1e。叶子3 la - kw adj。P. > 0.05 for treatment at all time points). Later leaves were initiated during the experiment, showing growth differences between treatments (Fig.1缩略词;年代1；补充文件中的MZ66_Growth_Analysis1）.随着每一片叶子的开始，处理差异变得更加显著。在第4叶中，我们观察到在叶片膨大后~ 10天的温和处理效应(leaf 4 LA 20 DAE - KW adj.)。P.= 0.044)，低np处理的叶片比其他处理的叶片表面积更低(图1)。1g;α = 0.05时的Dunn检验)。后期叶片的分化在分化后5天内表现出明显的差异，低营养处理的分化时间也有所延迟。到第6叶和第7叶时，我们观察到Full、LowP和low /LowNP处理之间的差异。1h,我;年代1；补充文件中的MZ66_Growth_Analysis1；叶61a，30 dae - kw adj。P.< 0.001;叶7la, 35 DAE - KW adj。P.< 0.001;DUNN测试在α= 0.05;保持差异直到40 dae）。完整治疗中的植物也产生第八（图。1J）和一些第九（未示出）在实验结束前叶。除了光合表面积之外，通过测量茎高捕获的处理中，植物身材在处理中明显不同（图。1j;年代1；补充文件中的MZ66_Growth_Analysis1）.到20dae时，Full和low - p植株比low和low - np植株高。1k.阀杆高度- KWP. = 0.011; α处的邓恩试验 = 0.05. 茎高20-全高：5.76 厘米±0.48a；低：5.59 厘米±0.53a；低：4.09 cm±0.54b；低NP:3.83 cm±0.48b），这种模式一直保持到收获。处理对总叶面积有显著影响（图。1l;平方根转换总LA 20 DAE - KW adj。P.< 0.05；α = 0.05时的Dunn检验。满：7.16 cm±0.46a;LOWP：6.72 cm±0.52a;leown：5.82 cm±0.53ab;Lownp：4.72 cm±0.47b）。通过收获，可以通过总叶面积区分四种处理（图。1l;方形根变换总LA 40 DAE - kW adj。P.< 0.001;α = 0.05时的Dunn检验。满：19.90 cm±1.02a;LOWP：13.55 cm±1.14ab;leown：9.15 cm±1.17bc;Lownp：8.35 cm±1.04c）。我们使用线性拟合的斜率通过平方根转化的总La，作为每种治疗的生长的估计，并且观察到所有四种处理之间的差异，排名饱和，低位，leown，lownp（图。2；MZ66_ENDPOINT_ANALICATION中的补充文件1．增长——KWP.< 0.001;α = 0.05时的Dunn检验。满度:0.45 cm/天±0.02a;低电位:0.34 cm/d±0.02ab;低:0.25 cm/天±0.02bc;低np: 0.22 cm/天±0.02c)。

在40 dae，通过仔细地从PVC管和植物的空中部分仔细地移除植物来收获植物。在完全处理下的植物显然比在应激处理下的植物，而存在部分分离三个应力处理（图。2A，B。MZ66_ENDPOINT_ANALICATION中的补充文件1．根鲜重量- KWP.< 0.001;α = 0.05时的Dunn检验。满：18.07 g±1.36a;LOWP：10.13g±1.52ab;leown：5.17 g±1.55bc;Lownp：3.62克±1.37c。拍摄新鲜重量 - kw adj。P.< 0.001;α = 0.05时的Dunn检验。满:18.55 g±1.00a;LowP: 6.14 g±1.13ab;低:2.48 g±1.15bc;低np: 1.91 g±1.02 2c)。胁迫处理下的根冠比(鲜重)更大，分别是low、LowP和LowNP处理下的2.2-、1.7-和1.9-倍。2C）。低下株和LOWNP下的植物显示出更大的根系深度（RSD），而不是完全或脊髓条件下的植物，尽管治疗效果不显着（RSD kW adj。P. = 1). Specific root depth (SRD), calculated as RSD over total root fresh weight, did vary significantly among treatments, with LowN and LowNP showing higher values than LowP and Full treatments (Fig.2d.补充文件中的MZ66_Endpoint_Analysis1．SRD - KW adj。P.< 0.001;α = 0.05时的Dunn检验。Lownp：19.12 cm / g±1.46c;leown：13.37 cm / g±1.65bc;LOWP：9.49 cm / g±1.62ab;满：5.02 cm / g±1.44a）。

为了进一步表征不同营养处理间根系构型(RSA)的差异，我们拍摄了每棵植物的根，并使用giarroots分析软件对图像进行了处理[55]提取一系列根特征。营养处理对与根系大小有关的几个特征有显著影响（图S）3.；MZ66_Giaroots_Analysis in补充文件1)，包括网络面积、周长和体积，以及垂直扫描中横过一条水平线的根的最大数目和中位数(见[55获取根特性的完整描述)。充分处理的根系最大、最坚实，其次是LowP、LowN和LowNP。我们还发现，椭圆的长/短轴比例(EAR - KW adj.)对根系有显著影响。P. = 0.016; Dunn test at α = 0.05. Full: 0.46 ± 0.03a; LowP: 0.40 ± 0.04a; LowN: 0.36 ± 0.04a; LowNP: 0.29 ± 0.03b). EAR reflects the tendency to relatively narrower but deeper root systems in the low nutrient treatments. In comparison to the aerial traits, there was less difference between LowN and LowP for root features, and there was evidence of a partially additive effect in the combined LowNP treatment (Fig. S3.；MZ66_Giaroots_Analysis in补充文件1．例如:网络容量- KWP.= 0.009;α = 0.05时的Dunn检验。满:19.40±1.68a;LowP: 12.43±1.89ab;低:10.10±1.92bc;低np: 7.23±1.71 1c)。

在低氮、低磷处理下对叶片游离分子进行了修饰

我们使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）量化叶组织中二十种不同元素的总浓度。使用的协议不允许确定n浓度。我们检测到重要（ANOVA ADJ。P.< 0.05）E.ffect of treatment on the concentration of ten of the elements quantified (Fig.2e，s4.；MZ66_ionomics_Analysis在补充文件中1）.我们观察到不同元素的浓度有降低也有升高，这说明这种影响不能仅仅用根冠比的变化来解释。与以往的研究结果一致[15.那28.那46.]的研究中，我们观察到低磷处理下的植株叶片总磷浓度比全磷(P浓度-方差分析)增加了1.8倍。P.< 0.001;Tukey测试在α= 0.05。leown：3543 ppm±110a;满：1983 ppm±96b;Lownp：1174 ppm±98c;低价：734 ppm±108d）。不出所料，低于LOWP（734ppm）的总P浓度较低。更值得注意地，在LownP（1174ppm）下，总P浓度高于LOWP，尽管我们注意到LOWNP植物也小于LOWP的植物。我们还看到脊髓下的Ni浓度的显着增加，低于LowP下的k和Rb浓度增加（图。2e，s4.；MZ66_ionomics_Analysis在补充文件中1）.

在氮素限制下，对磷饥饿的转录反应受到抑制

基于我们最初的特性，我们选择了25个DAE，这是我们第一次看到处理对叶片生长的显著影响的点(图。1） - 用于转录分析。在先前使用的与先前使用的营养条件下，我们在相同的营养条件下增加了第二组植物，从每处理RNA提取和测序的两种单独的25 dae收获总根和合并的叶片。测序读数与玉米（VAR.B73，Ref-Gen V3）转录物组对齐并在基因水平下折叠以获得读数数据。我们分析了单个线性模型中的所有治疗和两个组织的计数数据，以识别脊，低保或其对基因表达的相互作用的显着影响。共有1555个基因被鉴定为N / P调节（假发现率[FDR]营养术语<0.01; |日志₂折叠变化[LFC] | > 1 for at least one nutrient-associated model term; MZ67_DEG_set in Supplemental File2）.根据相关组织中相对于Full处理的两两差异的符号和幅度(|LFC| > 1)(补充文件中的MZ67_DEG_set)，调节基因在不同组织/处理组合中进一步被分为上调或下调2）.

上调和下调的基因数量相似；在叶中检测到的受调控基因比在根中检测到的多（图。3.模拟)。我们通过组织比较了转录反应和治疗的效果(向上或向下)。low和LowP单一胁迫处理的响应几乎没有重叠(图1)。3.模拟。例如LowN和LowP之间上调的737个基因中，只有30个基因是共享的)。当采用联合低np处理时，植物普遍遵循低np响应模式:大多数调控基因在低np和低np之间共享;在LowP的调控下，很少有基因在lowNP的调控下表现出类似的调控(图5)。3.模拟)。这一趋势在叶片和根中以及上调和下调基因中都很明显。

我们的模型包括恩智浦互动项。虽然我们检测互动效应的权力毫无疑问是受重复水平的限制，但我们能够鉴定81个NXP相互作用基因（FDR NXP术语<0.05; | LFC | 1，用于至少一种营养相互作用模型术语。MZ67_NXP_SET在补充文件2)，IE。基因受一种营养物质的可用性的调节，其条件是第二种营养物质的可用性。我们探索了这81个基因在不同处理和组织中上调和下调基因(成对|LFC| > 1)的分布(图1)。3.e）。在叶片中的低分单处处理中越低于NXP基因的大多数（74个中的81个）（图。3.e;mz67_nxp_set在补充文件中2）.在Lownp下也上调了这些74个叶片Lowp诱导的NXP基因中的5个。此外，这些74的35和25分别在叶片下的叶片下调，叶片下（图。3.e;mz67_nxp_set在补充文件中2）.在ROOTS中，81个NXP基因的rOots -60在LOWP下的根部中升高，55种，与叶子共同的根;81个NXP基因中没有一个在leown或lownp下的根茎中上调;10和9根LOWP诱导的NXP基因分别在LOWN和LOWNP下的根下（MZ67_NXP_SET）下调（在补充文件中2). 这些观察结果表明，对LowP和LowN的反应不仅明显，而且是对抗性的，并且在LowNP下，LowN下的反应模式占主导地位。尽管在单基因水平上，NxP相互作用在统计上不支持超过81个候选基因，但在整个1555个基因组中，也可以看到类似的全局模式。LowP（pairwise-LFC）条件下叶片中444个基因表达上调 > 1） 只有30例在LowN下上调，178例在LowN下下调（图1）。4.一种;mz67_deg_set在补充文件中2）.类似地，在这些444中，在组合LownP下仅调节69，下调下调（图。4.A，S5A-B，MZ67_DEG_SET中的补充文件2）.

要深入了解转录反应的功能后果，我们检查了“古典基因”（一种含量的〜5000个注释基因，许多与现有的功能数据相关：maizegdb.org/gene_center/gene.）在我们监管的基因集中。我们补充了许多附加注释的经典集[56那57)，特别是玉米spx结构域和PAP基因家族的成员(图S5.C (58])。spx结构域家族蛋白已明确与N-P信号通路中的串扰联系在一起拟南芥和大米(42.那44.那50]但是，家庭以前尚未在玉米中注释。因此，我们鉴定了来自玉米的完整的SPX结构域蛋白质，并基于以下使用以下使用的系统进行分配的命名法（图。6.；补充文件中的MZ67_Spx_Genes2）.第三十（由FDR排名）的行为调节古典基因反映了全球趋势 - 即，在缺点或抑制的LOWP下强烈诱导，或者在leown或lownp中转移到镇压（图。5.C）。顶级古典基因编码先前与PSR相关联的功能[59那60那61那62]，包括pHT1高亲和力磷酸转运蛋白，PAPS，脂质重塑酶和SPX结构域系列的成员（图。5.CS6.）.我们进一步使用基因本体（GO）分析来研究完整的1555调节基因集（MZ67_GO_ANALY分析的补充文件中的MZ67_GO_ANALY）进行功能模式2）.我们计算了充满了属于属于营养处理的每种富集的受调节基因的平均值的LFC，根和叶片（图。4.B;补充文件中的mz67_go_Analy分析2）.在单基因分析中，我们观察到低磷下表达上调与低磷下表达下调的信号。排名前50的围棋开始了P.低磷处理下46组根系和50组叶片的平均LFC均为正;在同一组中，除两种情况外，除low和LowNP处理外，其余所有处理的根和叶平均LFC均为负值(MZ67_GO_Analysis in supplementary File)2）.这种模式从一般延伸细胞对磷饥饿的反应术语(GO: 16036)是指诸如半乳糖脂(GO: 19375)和激素生长素(GO: 9851)和茉莉酸(GO: 9695)的合成过程;无花果。4.b)。

轻度N应激足以​​抑制p饥饿反应

尽管分别将low和LowP处理调整到Full浓度的9和3%，但通过40dae可以明显看出，low处理比LowP处理对生长的限制更大。因此，我们推测在联合NP治疗下，low转录反应的优势仅仅是low胁迫更严重的结果。为了解决这一假设，我们在高磷和低磷条件下分别种植了一组植物(P5和P1;我们最初的Full和LowP水平)结合五种不同的N水平(N5到N1，高到低;与我们之前的全营养和低营养处理相对应的极端情况)。在我们的整个转录组实验中，我们在25dae收获植株(图。1). 我们测量了地上部和根系的鲜重，再次发现单一胁迫组合N1P5比补充N5P1处理更能减少生长（图。5.a, b).然而，在中间N有效时，我们可以观察到不同的N和P组合，且生长等效:例如，在拍摄鲜重的方面，N4P5与N5P1无法区分。为了评估N可用性对PSR的影响，我们使用实时PCR来量化所选基因面板的表达。我们首先测定了良好的N个响应基因Nir-a(GRMZM2G079381)和NPF6.6.(GRMZM2G161459)，编码亚硝酸盐还原酶和硝酸盐/肽转运体[23.那63分别确认N治疗的影响。如前所述，如在我们的转录组数据中观察到（MZ67_DEG_SET在补充文件S中2)，Nir-a和NPF6.6.减少氮肥处理(Nir-a主要表达在叶组织中。数字5.C，D;补充文件S中的MZ95_DE_analysis3.）.的积累Nir-a和NPF6.6.从N5降至N1治疗，表明对植物N状况和信令的逐渐影响（图。5.c, d).有趣的是，表达NPF6.6.在P1胁迫下也能诱导根系，其中在N5胁迫下反应最为明显。然后我们分析了4个PSR基因，这些基因是根据之前的报道和我们的转录组数据选择的:pht1; 9那PHT1：13根系中磷酸盐转运基因[27.]， 这MFS2 SPX-家族基因在叶片，和PAP10根和叶的紫色酸性磷酸酶基因[58］．在N5条件下P1强烈地诱导所有四个PSR基因（图。5.c - d;MFS2.叶片N5P1/N5P5增加1.8倍;PAP101.85倍的叶片增加N5P1 / N5P5，根部增加4.93倍;pht1; 94.33折在根中增加N5P1 / N5P5;PHT1：13根系N5P1/N5P5增加4.82倍)。然而，当N有效度降低到N4时，P1下PSR转录本积累水平降低(图4)。5.C，D;补充文件S中的MZ95_DE_analysis3.）.在N3及以下，PSR基因的P1诱导缺失。有趣的是,MFS2.和PAP10在N5P5条件下显示叶片中的组成型表达水平，降低了N限制（MFS2.N4P5和N1P5分别减少2.10-和14.72倍;PAP10N4P5和N1P5分别减少4.94倍和19.70倍;无花果。5.c - d;补充文件S中的MZ95_DE_analysis3.）.

叶片中的P浓度响应于基板中的P和N可用性

先前的研究和我们在40dae的观察表明，在N限制下生长的幼嫩植物叶片中总磷浓度增加了[15.那28.那46.］．因此，在对我们leown和Lowp治疗的转录反应之间观察到的拮抗作用可能是通过对较高细胞P浓度的PSR基因的下调来驱动PSR基因的驱动。为了研究这种可能性，我们在我们的N-DESE实验中使用ICP-MS量化ICP-MS的总P浓度（MZ95_ION_CONCONTER_ANALICALY在补充表S中的植物3.）.我们再次观察到，随着N的减少，P1和P5的叶片和根的总P浓度都增加了(图1)。6.a） 是的。然而，在N5-N3范围内的增加是最小的（P浓度）。α下的Tukey试验 = 0.05. N5P5:1035号 ppm±100ab；N3P5:1082号 ppm±82ab；N5P1:809 ppm±32b；N3P1:1139 ppm±55ab；叶片磷浓度。α下的Tukey试验 = 0.05. N5P5:2525号 ppm±103efg；N3P:3545 ppm±203abc；N5P1:2064号 ppm±81 GN3P1:2277 ppm±86 fg），表明总磷浓度不能解释我们在相同范围内看到的对基因表达的强烈影响。

为探讨玉米氮磷信号通路的相互作用，本研究对低氮、低磷和低NP联合胁迫下玉米根和叶的转录响应进行了表征。我们观察到对我们的low和LowP治疗的反应是不同的和拮抗的。此外，在联合低np胁迫下，尽管植物的生长部分受到磷限制(这是由与单次低np胁迫下的植株的表型比较决定的)，但低np模式占优势，经典的PSR不存在。虽然在个体基因水平上存在差异，但我们的LowN和LowP单胁迫结果与之前观察到类似拮抗作用的报道基本一致，许多经典的PSR基因在LowN下被下调[15.］．这种拮抗的潜在适应价值尚不清楚。

N在土壤中的含量通常比P高，这反映了土壤流动性的差异。因此，在表层土壤中获得磷的根系将不太适合获得氮反之亦然[64那65那66］．此外，获得N或P时，根系分枝和根系长度的最优模式不同[64那65那66]. 我们没有发现LowN和LowP处理在40dae中RSA的显著差异，尽管生长系统、相对年轻的植株年龄和胁迫的严重程度可能限制了潜在根系发育反应的表达。尽管如此，激素信号相关基因的拮抗调节(例如，属于GO术语GO:9851养阴生物合成过程去:9695茉莉酸生物合成工艺；: 9735对细胞分裂素）可以通过N和P限制来镜像植物架构上的不同需求。

一旦获得磷，内部利用的效率可以通过在生长季节将磷重新输送到植物最需要的部分而最大化[3.那4.］．通过从有机化合物中释放无机P来重新染色p。诱导PAP编码基因和增加的PAP活动是PSR穿过生命之树的经典组成部分，包括拟南芥[67那68]， 白饭 [69]和玉米[58］．我们观察到几个PAP.在根部和叶子中低下低于下降的基因。除了在植物中重新染色P，PAP还分泌到根际外，增强无机P的可用性[67那68］．PAP10是我们分析中调控最强的基因之一。反映了全球格局，PAP10强烈诱导Lowp，但仅在N4-N5条件下。此外，PAP10在我们的全营养条件下，由于氮利用率的降低，表达水平降低。与脂质重塑相关的基因——半乳糖脂或硫脂在P饥饿状态下取代膜磷脂[4.那70那71——遵循了类似的趋势。在4个商品玉米杂交种和2个玉米自交系中，低氮处理降低了构成型表达的psr相关基因[28.那32.那72］．未报告这种下调PSR基因的一项研究也没有发现N个饥饿通常与N饥饿相关的N同化基因的下调的证据，表明治疗的精确性和时间很重要[73］．在延长N饥饿下的水稻中发生类似的下调PSR基因[50]但不在前12小时内转移到N饥饿条件[5.]，尽管低氮代谢反应早在这种变化后1小时就会出现[74］．我们的观察表明，低氮利用率对PSR基因表达的负面影响在联合低np处理中占主导地位，这意味着在这种双重胁迫下，玉米植株无法激活PSR的明确定义的方面，如磷的再动员或脂质重塑。研究结果对低氮低磷条件下PAP活性和脂质组成的测定具有重要的指导意义。

我们的研究证实了在N个限制下，玉米叶片中的P超积分观察[15.那28.，水稻和拟南芥[42.那75］．最初，我们考虑了假设，降低PSR基因在leown中的下调是对全内部P浓度的增加的次要反应。然而，即使低P可用性阻止总P的积累量降至脊髓条件下所示的浓度，LOWNP条件也降低了PSR基因。值得注意的是，温和的N限制（N4）足以抑制LOWP下PSR基因的诱导，内部总P浓度没有变化。植物感知N 4和下面的N4，如减少的积累所证明Nir-a转录物，植物N状况的良好表征标记[76］．总的来说，我们的数据支持n通过修饰的信号传导或P划分对PSR的影响，而不是总内部P超积累的次级效应。

目前，很难调和PSR抑制与P超积累的关系。是很有研究植物生长的早期阶段的证据的瞬态感应PHT1转运蛋白编码基因在平静的,虽然没有这样的信号之前已经报道过类似实验玉米或其他植物,也在实验中使用了转会到N饥饿条件下(74］．PHT1转运仪在后翻级调节受调节[45.那77那78]，蛋白质水平和定位的测量，以及根系磷渗透和磷吸收的定量将提供更全面的情况。在水稻中，据报道，在氮缺乏条件下生长的植物根系对无机磷的渗透能力增加[46.］．通过通过移动MicroRNA miR399的系统信号传导，通过系统的信号传导来维持叶片中P浓度和P的P浓度之间的平衡[79那80］．当P在芽中受到限制时，miR399就会产生并运输到根部，到达编码PHOSPHATE2 (PHO2) E2泛素缀合酶的靶点转录本，进而促进PHT1转运体的积累[81那82那83］．之前的报道表明，玉米中的miR399表达可以增加n饥饿，尽管效果取决于n治疗的性质和曝光长度[84那85］．

中NP串扰的研究拟南芥而水稻则强调了SPX蛋白家族的重要性。虽然最初被描述为P稳态调节因子[86， SPX和SPX- ring蛋白随后与N信号通路连接[42.那44.那50］．我们在玉米中发现了15个与水稻相同的spx结构域家族基因，并将它们分为先前报道的4类(SPX.那SPX-exs.那SPX-MFS和SPX戒指[87]). 氮和磷的有效性调节了SPX家族的转录水平，与氮和磷信号通路的整合作用一致（图6.）.编码单个SPX域类成员的转录本在根和叶中都对LowP有积极的反应，正如之前在拟南芥和大米(88那89］．在米饭中，过度表达OSSPX1.和OSSPX6.抑制PSR，这表明它们可能处于负反馈循环中。相反,under-expressionOSSPX1.和OSSPX6.通过涉及p吸收中涉及的基因的上调来提高p累积[89那90］．水稻的SPX4蛋白通过将MYB转录因子PHR2隔离在细胞质中，阻止其转位到细胞核并激活靶基因，从而对PSR发挥进一步的负控制作用[49］．在P饥饿下，SPX4降解，释放PHR2以激活PSR。最近据报道，水稻中的SPX4营业额需要NRT1.1b的活动[50］．鉴于NRT1.1b本身的丰富是响应的，NRT1-SPX4模块表示N和P信令路径之间的集成点。

P下P下的p升压表明叶P浓度的p吸收的解耦[81那82那83］．发生类似的解偶联拟南芥表达SPX-EXS基因的突变体Pho1.，与亚细胞分配的亚细胞分配的变化平行，在真空储存和细胞溶溶胶之间[91］．玉米基因组编码了两个共同矫形器拟南芥PHO1- - - - - -玉米pho1; 2a和PHO1; 2B.[92］．我们发现两个pho1; 2a和PHO1; 2B.表明在leown下的下调的证据，可能导致P分区的变化。虽然我们的观察结果表明，全内部P浓度的变化无法解释PSR对PSR限制的观察到的影响，但我们没有关于细胞溶溶胶本身的P水平的数据。第二组SPX蛋白质，SPX-MFS蛋白，通过将P流入液体调节胞嘧啶P浓度来调节细胞溶质P浓度更直接的作用[93那94］．在P饥饿,osspx-mfs1.和OsSPS-MFS3是下调的，与胞浆中保留更多的内部总磷池直接使用一致[84］．相比之下，osspx-mfs2.在P饥饿下上调，可能会有不同的作用[95那96］．MFS2蛋白在液泡P外排转运体筛选中未被识别[94]，表明它不仅仅是对MFS1和MFS3起拮抗作用。在玉米中，我们两者都找到了MFS1和MFS3由两个基因编码，每对同源基因在叶片中均受低磷调控，表明其功能与水稻基因相似。MFS2.被发现是玉米中的单一拷贝基因，如在水稻中，在低下下调。在功能性地表征玉米SPX域蛋白和N-P信号之间的联系将是信息性的。

氮肥利用率的降低抑制了玉米幼苗的PSR。有些矛盾的是，低氮利用率也会导致内部磷浓度的增加，尽管没有达到可以解释低磷响应基因抑制的水平。在耕地中，磷限制可能与氮有效度低相一致。因此，玉米的生长可能没有典型的低磷响应模式系统，这使我们重新思考目前对缺磷驯化的理解。在玉米栽培条件下，PSR的转录特性有待进一步研究。我们也可以考虑在低氮条件下生物技术操纵提高低磷响应的优点。

植物材料及生长条件

本研究的作物为玉米(Zea Mays.ssp。野生型可能从一个较大的种群隔离为Zmpho1; 2-m1.1突变，从库存产生bti31094:交流[92］．最初的bti31094:交流库存可从玉米遗传合作股票中心提供。对分离群体的基因型分析如前所述[92］．样本来自携带Zmpho1; 2-m1.1保留突变以供将来分析。植物在砂衬底的温室中生长，营养条件通过与Hoagland溶液的施肥组合保持[97];5毫米KNO._3.， 0.25 mM Ca (NO_3.）₂，2 mm mgso_4.，1毫米kh₂人事军官_4.， 20 μM FeC_6.H_6.O._7.， 9 μM MnSO_4.，1.2μmznso_4.，0.5μmcuso_4.， 10 μM Na₂B._4.O._7.，0.008μm（nh_4.) 6月_7.O._24.），如下所述修饰，并且通过添加1.5％（v / v）的对电荷的酸化氧化铝[98］．通过KNO的替代调节霍格兰氮浓度_3.用氯化钾和氯化钙₂[99那100.］．将Hoagland溶液施用在1/3强度下，与如下所述的不同实验中使用的最终N和P浓度施用。

对于生长至40天后（DAE），35种植物在PVC管（直径15厘米; 1米高）中，以4组种植，每周为1周。管填充〜17升洗涤砂。在管的上三分之一，将土壤与1.5％固相P缓冲液（氧化铝-P）混合[98]加载了209 μM KH₂人事军官_4.完全处理和11 μM KH₂人事军官_4.对于Lowp治疗。将四种吸收的种子植入每管4厘米深度，在出苗后每周稀释到单一的植物。用蒸馏水灌溉植物，直到10 dae，其中将Hoagland治疗作为1/3强度溶液，每第三天的速率为200ml，最终浓度：满1750μmno_3.²；Lown157.5μmno_3.²；Full 333 μM KH₂人事军官_4.；低p10 μM KH₂人事军官_4.．在生长期间，通过非破坏性测量茎宽、茎高、叶数和充分展开叶片的长度和宽度来评价植株。从土壤到最后发育的叶颈测量茎高。10 DAE每隔5天采集一次测量数据。在DAE达到40时，将植物从试管中取出，尽量减少对根系的损害，用蒸馏水清洗，并用纸巾干燥，然后测量根和茎的鲜重。清洁后的根系统被放置在充满水的浴缸中，使用数码尼康D3000相机拍摄。使用adobephotoshopcc (Version 14.0)对原始图像进行单独处理，以去除背景，获得前景和背景非根像素之间的良好对比。处理后的图像用GiA Roots软件进行缩放和分析[55］．将根和芽置于42°C的烘箱中一周，然后测量干重并收集样本进行离子分析(见下文)。收集到的完整测量数据集在补充文件MZ66_Raw_Data中描述1．

对于增长高达25 dae，植物生长在较小的PVC管（直径15厘米，高50厘米）。对于RNA-SEQ分析，50cm管的前30厘米包括1.5％固相P缓冲液（氧化铝-P [98])。收获整个植物，将茎和叶子分离，在冠根上方和下方和剩余的根系上方2cm。立即在液氮中冷冻组织并在-80℃下储存。将样品用冷却的杵和砂浆匀浆，并在液氮下调等，用于转录组分析。对于N-DESE实验，用10或333μm的P的组合灌溉在50cm管中生长的植物（P1，P5;在该实验中未使用固相P缓冲液），N为157.5,333,350，875或1750μm（n1至n5）。在25deE中收集叶子和根组织以进行基因表达和离子分析。

电感耦合等离子体质谱法测定元素浓度

如前所述测定离子浓度，[101.］．用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定根和茎中20种金属离子的浓度。称重后的组织样品用2.5 mL浓硝酸(AR精选级，VWR)消化，添加内标(20ppb in, BDH Aristar Plus)。Al, As, B, Ca, Cd, Co, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Mo, Na, Ni, P, Rb, S, Se, Sr和Zn的浓度是使用Elan 6000 DRC-e质谱仪(Perkin-Elmer SCIEX)连接到PFA微流喷雾器(element Scientific)和Apex HF溶出器(element Scientific)测量的。．每10个样本运行一个控制溶液，以纠正机器漂移在一次运行和运行之间。

植物生长和经济数据的统计分析

对于生长到40dae的植株，从34个个体中获得了性状(其中一个个体作为生长不良的明显离群值被剔除)。个体在不同营养处理间分布如下:N= 7;平静的,N = 5; LowP,N = 9; 低NP，N = 13, across 4 planting dates. Traits included direct measurements and derived values (例如，总叶面积或生物质总量）。在实验期间以5天的间隔重复非破坏性测量。对所有34个人进行了破坏性测量。数据集包括由ICP-MS和通过图像分析提取的根架构特征确定的元素集中，如上所述。数据集和分析在补充文件中呈现1．

所有统计分析都在r [102.］．完整，leown，lowp和lownp被视为单个治疗因素的四个水平。对于增长和终点数据和GIAROTS功能，我们使用R / STATS :: Kruskal-Test来评估非参数kruskal-wallis测试的每个性状的治疗效果。使用ANOVA分析元素浓度。在所有情况下，P.- 使用带有R / STATS :: P.Adjust的Bonferroni方法调整了多个测试的Values，分别应用于增长，端点，GiAROTS和元素数据集。治疗效果显着（调整P.< 0.05)，我们两两应用后HOCDunnett test (R/dunn.test::dunn.)测试(103.)的生长，端点和giaroot特性和Tukey HSD的元素数据(R/agricolae::HSD。测试(104.])。对于Dunnett测试结果，分配了字母来使用R / MultCompView :: MultiClecterters进行组[105.］．为了可视化，我们使用R/stats::lm来拟合模型特质价值 ~ 0 + 治疗+种植日期+错误，提取模型系数和标准误差，用于绘图。

差异基因表达的rna测序分析

RNA测序分析在根部和叶片上进行，用于4种营养处理（满，龙，低，龙，LownP）和两种重复，总共2种组织×4治疗×2重复= 16个样品。图书馆由Laboratorio de Servicios Genomicos，Langebio，墨西哥制作（www.langebio.cinvestav.mx/labsergen/）.文库使用TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/treuseq_rna_sample_prep_kit_v2.html.)，并利用由美国国立卫生研究院S10 OD018174仪器拨款支持的加州大学伯克利分校Vincent J. Coates基因组测序实验室的Illumina HiSeq4000平台和Labsergen的Illumina NextSeq 550设备进行测序。转录组数据可在NCBI序列阅读档案中获得，在研究SRP287300https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra/?study=srp287300.

RNA测序reads与在Ensembl Plants上可用的AGPV3.30玉米基因模型进行比对[106.]使用kallisto版本0.43.1 [107.])。使用R / Tximport预处理抄本级丰度数据[108.]并在基因水平上进行总结，再进一步分析。采用线性模型法对磨边机的计数数据进行了分析[109.那110.］．我们拟合了完整的模型算 ~ 拦截+组织*n级*p级+错误跨越16个样本。我们基于至少一个含有一个模型术语的非零系数的证据来选择兴趣基因n级或者逐行扫描（R / EDGER :: GLMQLFTEST的COEF参数包括除拦截和截距之外的所有模型系数组织主要效果;调整后FDR < 0.01;绝对对数折叠变化(LFC) > 1;日志计数每百万(CPM) > 1)。根据相关系数，再选择81个NxP交互基因子集n级X逐行扫描和组织Xn级X逐行扫描（调整FDR <0.05; | LFC |> 1; LOGCPM> 1）。基于对对根部或叶片的全营养对照的每种应力处理的成对LFC进一步分类兴趣基因。从模型中提取每个组织的LFC算 ~ 治疗+错误，门限为+ 1，门限为−1，分别用于上行和下行调节。基因功能注释被指定为blastp倒数最佳命中值相对于Araport11的功能注释[https://doi.org/10.1111/tpj.13415和单蛋白，以及来自PANNZER2 [https://doi.org/10.1093/nar/gky350]功能注释Web.使用r / spreadr和r / complexheatmap生成镦粗图[111.那112.］．使用宾果游戏3.0.3进行分析[113.]在Cytoscape 3.7.2环境中[114.]采用超几何检验，Benjamini & Hochberg FDR校正，显著性水平为0.05。基因本体文件(go.obo)从基因本体网页(http://geneontology.org/docs/download-ontology/）.对于每种GO类别，使用上述成对值对每个组织/治疗组合计算相关基因的平均值的LFC。

实时PCR

对于实时PCR转录物定量，分析了每次治疗5个生物学重复的叶片和根。使用TrizoL提取总RNA，使用来自Invitrogen的Superscript®II逆转录酶合成CDNA（猫No.18064071）。RT-PCR在通过Roche中使用LightCycler®480仪器中的96孔板进行。使用Kapa Biosystems的Kapa Sybr Fast QPCR主混合物套件进行PCR反应，下列循环条件：95℃持续7分钟，其次为40个95℃的循环15 SEG;20℃的60°C;72°C对于20段。最终反应体积为10μL，其中每个5μm底漆为1μl，1μl（40ng /μl）模板cDNA，5μlSYBR主混合物和2μL蒸馏水。基因表达的相对定量测定为2^ΔCt，其中Δct= 2 ^（平均CT的感兴趣基因的参考基因 - CT）[115.］．报告的值是一个代表性实验的五个生物副本的平均值±标准差。先前描述的内参基因[116.]作为对照：细胞周期蛋白依赖激酶(CDK.；GRMZM2G149286）和编码一个非特征蛋白质的基因（未知；GRMZM2G047204）。使用PRIMER3PLUS软件设计PCR引物[117.在补充文件mz95_rt_primer中列出3.．

spx结构域蛋白家族的系统发育分析

使用先前针对玉米描述的方法鉴定了玉米推定的SPX域蛋白质编码基因PAP.基因家族[58］．简单地说,拟南芥和水稻蛋白[64]使用MUSCLE v3.8检索并对齐[118.］．然后将对准转换为斯德哥尔摩格式。B73玉米初级转录物预测蛋白序列V3.31 [119.]从Ensembl植物获得[106.使用HMMER套件版本3.1b2 [120.]. 在手动检查和过滤缺少标准SPX结构域的蛋白质之后[121.，鉴定了15个推测的spx蛋白序列。注意到，v4基因组装配中注释的基因模型是首选。系统发育分析,拟南芥，水稻和玉米的SPX蛋白通过MUSCLE [118.]，并转成MEGA版本X [122.那123.］．我们手动选择SPX子域，由[87)，并纠正了对准中的不匹配(图S3.）.利用极大似然法和Le_Gascuel_2008模型构建1000 bootstrap系统发育树[124.］．

转录组数据可在NCBI序列阅读档案中获得，在研究SRP287300https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra/?study=srp287300.

大街：

出现后的日子

罗斯福:

错误发现率

去：

基因本体论

ICP-MS：

电感耦合等离子体质谱

利物浦:

日志₂褶皱变化

NSR:

氮饥饿反应

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

PSR:

磷酸盐饥饿反应

我们感谢Benjamin Barrales-Gamez, Ana Laura Alonso-Nieves和Jessica Carcaño-Macias对植物生长和收获的帮助。我们感谢Ivan Baxter (Danforth Center, MO, USA)对ICP-MS分析的支持。

资助者在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或准备稿件。

墨西哥国家科学理事会Tecnología (CB-2015-01 254012)资助。

RJHS由美国农业部国家食品和农业研究所和项目PEN04734和Accession #1021929下的Hatch Appropriations支持。

隶属关系

1. 国家实验室Genómica para la Biodiversidad (Langebio)， Unidad de Genómica Avanzada, Centro de Investigación and de estudio os Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN)， Irapuato, C.P, 36824，瓜纳华托，墨西哥

   J. Vladimir Torres-Rodríguez, M. Nancy Salazar-Vidal, Ricardo A. Chávez Montes, C. Stewart Gillmor & Ruairidh J. H. Sawers

2. 加州大学演化与生态系，戴维斯，一条盾大道，戴维斯，加利福尼亚州，95616，美国

   M. Nancy Salazar-Vidal

3. 2 .密苏里大学植物科学部，美国密苏里州哥伦比亚大学，65211

   M. Nancy Salazar-Vidal

4. 德克萨斯科技大学，德克萨斯州德克萨斯科技大学，德克萨斯州德克萨斯州非生物胁迫耐受性研究所，79409

   RicardoA.ChávezMuntes

5. Unidad de Biotecnología Vegetal, Centro de Investigación y Asistencia Tecnología y Diseño del Estado de哈利斯科A.C. (CIATEJ) subsead Zapopan，瓜达拉哈拉，墨西哥

   Julio a Massange-Sanchez

6. 美国宾州州立大学，宾州州立学院，植物科学系

   Ruairidh J. H. Sawers

贡献

JVT-R和MNS-V构思和设计了实验，进行了实验，分析了该数据的数据，准备的数字和表和撰写的纸张草稿。RACM分析了RNA-SEQ数据和撰写纸张的撰写草案。JAM-S执行的实验，分析了论文的数据和撰写的草稿。CSG构思和设计了实验，贡献了试剂/材料/分析工具和撰写或审查的论文草案。RJHS构思和设计了实验，分析了数据，贡献的试剂/材料/分析工具，准备的数据和/或表格，撰写或审查草案。所有作者均批准了最终草案。

通讯作者

对应于Ruairidh J. H. Sawers．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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