应用电阻抗断层成像技术评价玫瑰茎霜脱硬过程中的抗冻性

背景

电阻抗断层成像（EIT）在植物科学中的应用很少，特别是在研究植物对非生物和生物胁迫的抗性方面。在本研究中，我们评估了多花月季的抗冻性(罗莎利用EIT技术鉴定植物抗冻性快速无损检测的新方法。

结果

电流是激励源，测量边界电压值，然后形成边界电压重建值。使用成像算法，重建了阻抗或阻抗变化的二维（2D）分布。EIT重建值明显下降，冻结温度下降。茎的EIT重建值具有最适合物流方程，随后，计算半致致致死的温度。使用EIT重建值评估的冷冻抗性结果与传统电解质泄漏（EL）方法的结果线性相关（R. = 0.93,P. < 0.01).

结论

总之，在冻结测试之后，EIT图像的重建值可用于定量评估Floribunda玫瑰茎的冷冻性。本研究提供了进一步应用EIT技术的参考，用于植物冷冻抗性的非破坏性和快速检测。

生存次冻固温度的能力是限制许多树种的分布的最重要因素，并影响木质植物生长，发展和许多遗传，生理和生化反应[1那2］．为了获得木本植物年生长周期不同阶段抗冻性变化的正确信息，准确可靠的抗冻性评估方法对于一个树种或品种的抗冻性评估和栽培潜力评估具有极其重要的意义。这些方法也需要在育种和选育工作中，在霜冻损伤机制的研究，霜冻硬化和解冻。抗冻性通常是通过将植物组织或器官暴露在受控的冷冻温度下，然后用一种或多种方法定量组织损伤来测量的。抗冻性的鉴定和测试研究到目前为止已经取得了相当的成果和经验，但仍有发展的空间[2］．steponkus和lanphea [3.]提出了一种理想的抗冻性测试方法的定义。然而，应用研究，评估和识别抗冻性的措施受到许多因素的限制，例如树种，器官，组织类型和树木的生理条件以及研究目标和仪器。自19世纪植物抗冻性研究以来，测量冷冻抗性的方法涉及传统的直接现场观察，如视觉得分损坏和使用电解质泄漏方法;近年来，Aslamarz A. A.和其他研究人员使用过三唑氯化铵测定（TTC），脯氨酸分析和计算机辅助热分析（TA）研究植物的耐寒性[4.那5.那6.那7.]. 但这些方法都存在费时费力的缺点，需要几天的时间才能完成抗冻性的测定。迄今为止，还没有一种理想的方法被广泛接受为一种可靠而有效的植物抗冻性测试手段。改进和创新植物抗冻性鉴定和试验方法，对植物抗冻生理研究具有重要的指导意义。为了实现这样一种理想的方法，在现有方法的基础上进行研究，开发出一种新的方法，是抗冻研究者面临的巨大挑战。

1978年，亨德森和韦伯斯特[8.]将电阻抗断层成像(EIT)技术应用于肺水肿的研究，并生成了第一张阻抗图像。近年来，EIT技术发展迅速，一些研究者利用EIT技术研究医学领域、土壤性质、木材腐烂和植物根系表型信息[9.那10那11那12那13那14那15那16那17那18那19那20.那21.那22.那23.那24.那25.那26.那27.那28.]. 科罗纳洛佩兹[14]Li，X等人[15]在土根系上进行原位检测，以获得树木和种子根部的截面图像芸苔栗鸟L.（品种寺庙），并确定根部的形态学信息。但是，EIT技术很少应用于植物抵抗非生物和生物应激。根据Bera的说法[21.]，在交变电激励下，生物组织产生依赖于组织成分、结构、健康状态和应用信号频率的复杂电阻抗，因此生物阻抗方法可以用于非侵入性组织表征。在过去的几十年里，许多基于阻抗的非侵入性组织表征技术(如EIT)被提出，许多研究使用这些方法进行了非侵入性组织表征和疾病诊断。因此，EIT技术可以在不损害植株的情况下实现对植物抗性的实时监测。

应用EIT技术对三种月季的抗冻性进行了研究(罗莎Floribunda）在霜冻过膜的受控冻结试验下品种。半致命温度（LT_50.并与传统的电解液泄漏法(EL)进行了比较。采用EIT技术对品种间的抗冻性进行了分析，旨在为植物抗冻性的快速无损检测提供一种新技术，为植物抗冻性、育种等领域的应用奠定基础。我们假设低温胁迫会改变植物的EIT图像。利用该技术，以电流作为激励，测量边界电压值，形成边界电压重构值。利用成像算法计算了电站内部的电阻抗分布。然后，重建阻抗或阻抗变化的二维分布。在低温应力作用下，期望电阻率降低;利用图像重建技术直接定量地表征了植物的抗冻性。1)．

评估EIT重建质量

基于第四军医大学生物医学工程实验室的大脑模型，并与本实验植物材料相结合，在清华大学定制了一个带有半径为2,4或8厘米的有机玻璃容器的测试装置，16个电极在装置的壁上等间地放置（图。2一种）。

为了确定用于抗冻性测量的试验参数，选择了5种不同的玫瑰茎直径，分别约为2、3、4、5和6 毫米；6种不同的励磁电流强度：100、150、200、250、300和500 μA（图。2b）;施加4个不同的电流频率为1,50,100和150kHz（图。3.一种）。

在物理模型中，当激励电流的大小和频率分别为250 μA和1 kHz时，得到了最佳的重建图像的实验参数(图5)。2那3.B，A），测试装置半径的内径为8cm，玫瑰茎的直径大于4mm（图。3.b)。

在重建图像中发生严重噪声，并且当器件的半径为2或4cm时，玫瑰的测量阀门无法明确区分（图。2而当设备半径为8 cm时，在图像中可以分辨出测量的干(图1)。2A3）。当电极间隔大于1cm时，可以从图2所示的重建图像获得杆尺寸，形状和位置。2A3。

当玫瑰茎直径为5.68 mm，即大于4 mm，激励电流频率为1 kHz时，重建图像随激励电流的大小而变化(图4)。2b).当激励电流为250 μA时，重建图像最优。2B4)。

当玫瑰杆直径为5.68mm时，激励电流为250μA时，重建的图像随着激励电流频率而变化（图。3.一种）。当激励电流频率为1kHz时，重建的图像是最佳的（图。3.A1)。

玫瑰的不同杆直径为2.45毫米，3.23毫米，4.44毫米，5.63毫米和6.29毫米。每个实验在与250μA的激发电流相同的位置，激发频率为1kHz。当茎直径为2.45mm时（图。3.B1）和3.23 毫米（图。3.B2），无法产生重建的图像，因为玫瑰的杆直径太小。当玫瑰的茎直径大于4mm时（图。3.B3，B4，B5）检测到茎的更清晰的EIT图像，获得茎尺寸，形状和位置。

在霜冻过膜期间Floribunda玫瑰茎的EIT图像和重建值

在每个采样时间的三个Floribundas玫瑰品种中的每一个温度下捕获一帧EIT图像（图。4.那5.). 从这些图像中，在霜降过程中，EIT成像准确地反映了玫瑰茎的位置和大小。茎的位置呈蓝色，重建值大于0，表明该区域的电阻率增加，每个EIT图像中的纯蓝色对应重建结果的最大值。在整个霜降过程中获得了清晰的EIT图像。随着冷冻温度的降低，茎的EIT重建值呈下降趋势，“无忧无虑的奇迹”值在0.044～0.015之间，在5个取样时间内均小于其他两个品种（图。6.)．

抗冻性的变化

通过EIT重建值和EL方法值评估冷冻电阻

在霜冻过膜期间，通过EL方法测量的玫瑰品种茎的冷冻抗性显示出总体下降趋势（表1). 在霜冻退热初期（2月），抗冻性顺序为“水嫩水软”>“红帽” > ‘无忧无虑的奇迹。在3月14日至4月25日期间，各品种的抗冻性迅速下降，抗冻性顺序为“红帽” > ‘柔嫩如水 > ‘无忧无虑的奇迹。5月16日的抗冻性结果高于其他时期；然而，三个品种的抗冻性没有显著差异（表1）1)．

LT._50.通过EIT重建值和物流方程（R.² > 0.90), and only two significant differences were detected between the LT_50.通过EIT重建值和EL方法获得（表1). 4月25日，“水嫩如水”的抗冻性最低− 6 °C，而“红帽”和“无忧无虑的奇迹”在5月16日的抗冻性最低，即。，− 7 °C和 − 5 分别为摄氏度。总的来说，抗冻性顺序为“红帽” > ‘柔嫩如水 > ‘无忧无虑的桌子1)．

在霜冻过膜期间，可用于在控制冷冻试验后获得玫瑰茎的冷冻抗性的EIT重建值。虽然是LT._50.用EIT重建值计算的茎的值高于用EL法计算的茎的值，结果之间没有显著差异(表1)．

ET法评价茎秆抗腐蚀性的比较及验证

在霜冻过膜期间，通过传统的EL方法显着和线性地通过EIT重建值评估的冷冻性能量（R. = 0.93,P. < 0.01; Fig.7.)．根据回归方程，EIT重建值方法的确定系数高达0.86，显示出高可靠性。

用于测量Floribunda玫瑰茎中凝固性的最佳EIT参数

EIT根据生物组织的电磁特性重建其电参数在生物组织中的分布。带电离子和离子基团等的相互作用使生物组织保持一定的结构和功能状态，由于EIT系统的敏感性，生理状态的变化反映在电特性中。在细胞结构、组织活动状态、测量体积、电源激发灵敏度等因素上，植物与人和动物之间存在着相当大的差异。当EIT技术应用于动物或人类时，所选择的激励电流和频率都高于植物。在物理模型方面，由于在人和动物身上测量到的组织直径比玫瑰的直径要大得多，我们构建了一个不同直径的有机玻璃测试装置。当测试装置半径较小时，严重的噪声污染影响了玫瑰茎的重建图像。在本实验系统中，激励模式为反向激励，测量模式为相邻测量，选择直径大于4mm，装置内径为8cm的玫瑰茎，获得最佳的EIT重建图像。激励电流频率为1 kHz，激励电流幅值为250 μA。根据EIT测量原理，增加电极数可以提高系统的分辨率，通过增加独立测量数提高成像质量。但被测物体通常是具有一定周长的封闭域。 The increase in the number of electrodes would inevitably reduce the electrode gap, limit the measuring current to penetrate into the central area, and then affect the detection sensitivity of the central area or deep targets. For the relatively small-sized imaging objectives, too many electrodes would reduce image quality instead in the case of insufficient hardware system performance. When the radius of the physical model was 8 cm and the electrode spacing was greater than 10 mm, a clearer rose stem image was detected, and the shape and location of the stem were also determined through reconstructed images. When rose stems were measured with different diameters, reconstructed images could not be generated when the measured diameter was small; however, the EIT images of stems could be detected clearly when the diameter was larger than 4 mm. Based on medical research, only objects larger than a given size can be distinguished because of the difficulty given the number of electrodes and the measurement precision of each electrode [29.那30.］．这一发现介绍了解决逆问题和相关难度的高度复杂数学算法的必要性。在绝对EIT中，具有相关图像失真和伪距的电极电导率的间间和内部差异是进一步的困难。人体或动物身体部分感兴趣的部分很少是圆形的，而个性间解剖结构是可变的，例如胸腔形状，影响单个电极间距[31.]，而玫瑰茎的身体更准确地圆润。为了进一步减少成像误差，使用有源表面电极可以提高信噪比[32.］．因此，重建的图像随着样本直径的变化而改变，激励电流频率和激励电流的大小当其他条件保持不变时。目前的实验是在植物抗性研究中进一步的原始和探索性使用EIT。

EIT技术在花月季茎秆抗冻性评价中的应用

本研究在霜冻脱硬条件下，获得了月季茎的EIT重建图像。根据EIT重建值估算的抗冻性与传统EL法测得的抗冻性接近，具有显著的线性相关((R. = 0.90,P. < 0.01). After the freezing test, the stems were in different states, which had an important effect on the conduction of the electric current. The changes in EIT images and reconstructed values were determined by decreasing the temperature step-by-step, which might be related to the damage caused to cell membranes due to the physiological, anatomical and structural changes. Researchers believed that cells show high impedance to low frequencies (f < 1 kHz), while low-frequency currents only existed in the extracellular space, and the impedance was mainly composed of extracellular resistance [33.］．在本研究中，激励电流频率为1 kHz，阻抗可能由细胞外电阻组成。细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换和信息传递的重要介质。随着冻伤的发生，细胞膜的通透性发生变化，原生质体离子渗出到体外，细胞活力增强。因此，共质体和外质体的离子浓度与细胞膜介电特性的变化之间存在一种新的稳定的平衡。随着温度的降低，茎的冻害程度增加，外质电阻降低，导致其电阻率低于对照组(4℃)，EIT成像结果差异。EIT的测量速度约为每秒1.25帧。插入棒并稳定盐溶液后，采集到清晰的EIT图像，并从图像中提取一维EIT重建值。EIT技术足够灵敏，可以检测到低温引起的茎秆电阻率的变化(通过重构值反映电阻率的变化)。植物茎秆的电阻率分布比动物或人体器官更均匀，EIT重建图像能够准确、高质量地反映茎秆的位置。 The functional imaging of ornamental plants was achieved. Application of the EIT technique is increasing in medical research [22.那23.那24.[将是一种与植物生物生理功能密切相关的检测方法。

植物细胞由细胞内液体、细胞膜和细胞壁组成，悬浮在细胞外液体中[34.］．EIT在电阻抗分布的断层图像方面有可能可视化组织生理学和病理，提供有关组织生理学和病理学的更多信息，因此在若干应用中具有更大的潜力[29.那35.那36.］．EIT测量植物横截面的电阻，不考虑植物长度和横截面积。EIT测量在植物故障中进行，使用2D测量。当激励电流和频率达到一定水平时，电流通量可以在故障的大多数区域分布并提高测量精度。EIT的另一个优点是，如果该方法允许可视化树茎的内部结构，则可以在冻结引起的损坏方面提供重要的附加信息。应继续进一步研究以实现与EIT技术相关的更多优势。

综上所述，本实验介绍了一种新的用于观赏植物的医学EIT技术，实现了植物的功能成像技术。人工冻温试验后2天内用logistic方程拟合重建值，评价抗冻性。EIT重建值计算的抗冻性与传统EL法计算的抗冻性高度相关，但略低于EL法计算的抗冻性。EIT重建值可用于评价月季茎的抗冻性，表明EIT技术可作为一种快速有效的评价树木抗冻性的方法。

植物材料

2年生花蔷薇(Rosa Hybrida‘Floribunda’) of three varieties, ‘Red Cap’, ‘Tender and Soft as Water’ and ‘Carefree Wonder’, were obtained from the Chinese Rose Base Co., Ltd. (32°98′ N, 112°53′ E) located in Nanyang City, Henan Province, was the biggest base of Chinese rose produce in China. We got the permission to collect the plant samples from the Chinese Rose Base Co., Ltd., and the plant materials were formally identified by Mr. Guoyou Zhao. The roses were planted in Specimen Park (38°50′ N, 115°26′ E) on the East Campus of Hebei Agricultural University, Baoding City, Hebei Province, on 31 March 2013. The experimental design was a complete randomized block in which 35 plants per plot were planted at a spacing of 0.25 m × 0.30 m with three replications. A total of 315 plants were planted (35 plants/plot × 3 replications × 3 varieties = 315). Before the roses were planted, the soil was ploughed and barnyard manure fertilizer was applied. After planting, in spring and autumn, the soil was watered one to two times per week, while during summer, the soil was watered according to the actual conditions by paying attention to the amount of rainfall, preventing water from accumulating in the soil. In summer, the broad-spectrum fungicide carbendazim was sprayed on the rose leaves to control black spot disease (Diplocarpon Rosae.）;除去患病的叶片，及时清除落叶叶。在不断增长的季节中，除草在繁忙的杂草增长期间或在玫瑰快速增长阶段浇水后两到三天进行了一次人工。这些管理措施适用于保持不同玫瑰品种的一致生长。

冻结温度测试

2016年2月至5月在冻融过程中进行抗冻性测定试验。2月22日、3月14日、4月4日、4月25日和5月16日共取样5次，每间隔20天。每个品种都选择了9株生长良好的玫瑰。每个取样地点都在玫瑰植株的中部;每株收集四根有叶的树枝。共收集108根枝条(3株× 3处理× 3块地× 4个方向= 108)[37.］．冷冻试验前，样品用自来水仔细冲洗3次，然后再用蒸馏水冲洗3次，以去除表面污染物。将装有样品的塑料袋置于冰箱(BCD-252WBCS;海尔,中国青岛)。这些冻结温度的范围从可能杀死样品的条件到不会造成损害的条件，并根据先前评估确定的抗冻性来选择[38.］．冷却速率为4°C h^{- 1}．将样品保持在4小时的靶温度下，然后移动到4℃以允许逐渐解冻[39.那40］．然后，在解冻2小时后，将样品用于EIT，电阻抗光谱和相对的EL测量。

EIT图像重建和数据采集

对于在不同温度下玫瑰茎的EIT图像，EIT图像重建是基于第四军医大学的数据采集系统[41.]，EIT监视图像重建软件[42.]，EIT作为表型植物根部的工具的方法[14]基于分裂增广拉格朗日收缩算法的实时EIT成像系统[34.］．数据采集​​系统包括多路复用器，模拟到数字转换器和微编程控制单元，以及其他组件[41.]（见图。8.)．系统的驱动模式是准相反的方向驱动，通过数字合成模式产生激励源，模拟数字转换器以高速和高精度的高精度集成到系统中，以及系统和主机之间的USB接口计算机是高速的，很容易插入。软件系统主要完成了与硬件系统的界面的功能，模拟成像，测量数据成像，图像处理和结果分析等功能。加权阻尼最小二乘算法用于重建EIT图像[43.[和16个电极用于连续成像。成像速度为每秒约1.25帧。

使用0.9％的生理盐水作为背景（阻抗与频率不变）[43.]; 玫瑰茎放在20 距有机玻璃容器边缘70 mm，杆长70–90 mm mm垂直插入。在液体表面完全平静后，收集大约10帧数据进行成像。以电流为激励，测量了边界电压。通过不同频率的边界电压，用最小二乘法对图像进行加权。得到了边界电压的重构值。EIT成像结果以相对灰度显示。当所得图像的重建值小于0时，相应区域的电阻率降低，在伪彩色图像中表现为边色红色，图像的纯红色部分对应于EIT重建结果的最小值。当重建值大于0时，对应区域的电阻率增大，以蓝色边为代表，纯蓝色部分对应重建结果的最大值。重建结果的中值对应于图像中的纯绿色。同一位置的绝对重建值越大，表明该区域的电阻率变化越大[37.］．

相对el测量

采用电解质渗透法(EL)测定膜透性。冷冻试验后，从茎的中间切下4个茎，每个10毫米长。每个试管中加入12毫升蒸馏水，然后在室温(22°C)下摇晃24小时，然后第一次测量电导率(C₁）和空白测量（C）_空白1）（仅测量蒸馏水）。然后将样品在100℃下热杀死20分钟并在第二导电测量之前摇动另一24小时（C.₂）和空白测量（C）_空白2)．相对电解质泄漏（Rel）定义为[44.]：

EL法的总茎样数为1680个(4个茎样× 4个重复× 7个温度× 3个品种× 5次= 1680个)。

通过EIT重建值和EL方法值冷冻电阻计算

为了确定冰冻电阻，使用Logistic Sigmoid函数建模EIT重建值和Rel值（在EQ中。2) [44.那45.]关于测试温度:

在哪里X为测试温度(°C)，y是EIT重建值（或rel值），B.是拐点的斜坡C（Ωm°C）^{- 1})，C表示抗冻性值的函数的拐点（即半致死温度LT_50.，°C）和一种和D.定义函数的渐近[33.那38.］．一种 + D.表示EIT重建值，没有冻结损伤（或在冷冻损伤下的最大值）;D.代表冻结损伤下的最低EIT重建值（或没有冻结损伤的rel的基本价值）[46.那47.那48.］．

统计分析

EIT图像重建值的计算方法见5.3节。采用线性回归分析方法，研究了用EIT法和EL法评价茎部抗冻性的关系。所有三个品种在整个研究期间的原始数据（每个品种在每个给定时间的平均值）被汇集在一起，并应用线性回归曲线拟合(SPSS v22.0版统计软件包的Windows，SPSS.公司，芝加哥，IL，美国)。为评价模型的可靠性和准确性，确定系数(R.²)被检查过。线性回归的相关系数(R.还提供了）。应用重复的测量分析用于分析不同方法茎的冷冻抗性的差异。LT的不同评估方法之间的差异_50.当Wald 95%置信区间的值不重叠时，每个时间瞬间的估计值被认为是显著的。利用三个品种的综合数据，研究了EIT重建值与EL法测定值的相关性。

所有数据维持本研究中的结果都包含在本文中或其信息文件中。在该研究期间产生的其他数据集可在相应作者（jiqian）的合理请求后获得。

企业所得税：

电阻断层扫描

2D：

二维;

el：

电解液泄漏

LT50:

Semi-lethal温度

我们要感谢冯富博士和他的研究团队成员提供的出色技术支持。

本研究得到了中国国家自然科学基金的补助金（31272190奖励到G.Z.）。河北省海外学生介绍的经济援助项目（C201838）和河北省高等教育科技研究项目（QN2019090）。资金组织为研究项目提供了财政支持，但没有参与研究，数据收集，数据分析或书面文章的设计。

作者笔记

1. 胡安周和瑞娟锣同样贡献了这项工作。

隶属关系

1. 河北农业大学园艺学院，保定，河北071000

   吉倩刚张

2. 河北农业大学机电工程学院，河北071000

   胡安周

3. 河北经贸大学艺术学院，石家庄，050051，河北，中国

   Ruijuan龚

4. 河北软件研究所软件工程系，河北071000，中国071000

   杨柳

贡献

JQ和GZ策划项目，并负责部分稿件的撰写和编辑。JZ和RJG贡献了样品制备和方法，JZ和YL贡献了数据分析和结果解释。所有作者都已阅读并批准了原稿。

通讯作者

对应于霁钱．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

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