甘蔗耐铝性增强的评价SbMATE过表达和全基因组鉴定ALMT年代糖果spp。

背景

酸性土壤中的铝毒性是植物生长的一个主要限制因素，特别是在热带地区。通过苹果酸、柠檬酸等有机酸的根系分泌将Al从根尖排除是植物界最普遍的耐受机制之一。文献中描述了两个具有铝耐量的阴离子通道家族，ALMT和MATE家族。

结果

在这项研究中，甘蔗植物构成过度表达的高粱二色的伴侣基因（SbMATE)苏木精染色结果显示，与非转基因（NT）植物相比，转基因植物对铝的耐受性有所提高，表现为根系持续生长和根尖排铝。此外，对最近公布的甘蔗基因组进行全基因组分析，确定了11个ALMT基因和分子研究显示了潜在的抗铝新靶点。

结论

我们的结果表明，转基因植物过表达高粱二色的伴侣对Al具有改善的耐受性。AlMT基因陶醉潜在候选基因的表达谱在巴西和其他地区具有贫困和酸性土壤中的铝毒性的其他地区的替代方案。

甘蔗是世界上一种非常重要的经济作物，其生产主要用于乙醇和糖的生产。此外，甘蔗生产过程中释放的生物质可以作为木质纤维素材料被微生物降解，从而产生可再生燃料和附加值产品。尽管甘蔗非常重要，但甘蔗种植面积正在减少，尤其是在最大的甘蔗生产国巴西[1那2］．例如，在巴西，甘蔗种植面积扩增的替代方案是Cerrado区域，以酸性土壤为特征的生物群落。因此，科学界在改善贫瘠酸性土壤中甘蔗生长性状方面做出了很大的努力[3.］．

在低pH值条件下，铝(Al)，土壤中粘土组分的天然成分，呈具有高度植物毒性的离子形式(Al³⁺或铝(H₂o）_6.³⁺)破坏根系，限制植物生长[4.那5.那6.]。植物铝中毒的最初症状是根系生长受到抑制，根毛萎缩等根系形态发生变化，顶部叶片表现出铝中毒的褪绿和烧焦症状。此外,阿尔³⁺可影响根尖细胞的分裂和伸长，使细胞排列不规则，细胞壁增厚。铝(Al³⁺)离子在微摩尔浓度下，并在短时间内暴露，可对植物造成严重的毒性作用[7.那8.那9.那10.］．

铝的毒性降低了土壤水分吸收效率，加剧了干旱胁迫对酸性土壤作物减产的影响。对铝敏感的作物在酸性土壤中的粮食产量和生物量严重减少。施用石灰是一种常用的提高土壤pH值的方法，然而，除了显著的额外成本外，在最常见的情况下，施用石灰并不有效，因为有毒铝存在于土壤的深层，并且损害了维持植物生产的根系的适当发育[11.］．因此，使用适应于酸性土壤条件的基因型以及添加石灰石和足够的施肥是具有高水平的土壤中使用的一些策略³⁺[2那4.］．

在主要作物中，人们对植物耐铝机制的认识和抗铝策略的研究不断深入，但植物耐铝的确切机制和分子机制仍不清楚，主要是由于铝在外质体和共质体中的多个位点发生干扰。以及植物自卫的复杂性[8.那12.那13.］．植物界最普遍的耐受机制之一是通过根系分泌物(如苹果酸和柠檬酸)将Al排除出根尖[14.]但是其他有机酸被植物分泌在al的曝光时[15.那16.那17.]，并螯合能力与每个有机酸不同³⁺苹果酸(柠檬酸草酸> >)18.］．在这种情况下，由于铝的流出，阴离子通道负责授予铝耐受性³⁺通过这些通道螯合苹果酸/柠檬酸阴离子，通常由铝刺激³⁺存在于根际。在文献中，赋予Al耐受的两个阴离子频道系列AL.uminum激活m有翼的T.Ransporter家族（ALMT）和一些成员multidrug.一种nT.含氧的化合物E.xtrusion(配偶)的家庭。almt与通过苹果酸分泌铝有关，而已知的MATE转运体在根际分泌柠檬酸来螯合铝³⁺[14.那19.那20.那21.］．在甘蔗中，迄今为止没有一个基因家族成员被鉴定出来。由于MATE转运体是一个大基因家族的成员，在硅识别伴侣甘蔗耐铝基因的研究非常困难，特别是由于其高倍性和基因组复杂性[21.］．因此，我们的目的是鉴定和表征同源基因ALMT甘蔗(糖果SPP。）。十一ALMT甘蔗基因组中的基因被鉴定为SoALMTs(1 ~ 11)，并进行系统发育分析划分SoALMTs分成4个不同的支系。的表达水平索阿尔姆特在甘蔗植物的存在或不存在下，还研究了基因的基因。结果表明，甘蔗植物过表现SbMATE向根际分泌柠檬酸，并在Al的存在下保持根的生长，证实了转基因植物的耐受性。

这些结果完全代表了巴西甘蔗扩张的有希望的替代方案，以及贫困和酸性土壤中铝毒性的其他区域。

鉴定和表征索阿尔姆特

一共11个阿尔姆斯与先前确定的阿尔姆斯使用tblast工具发现了Pfam PF11744的存在。在假定的阿尔姆斯按1到11顺序编号，以物种为前缀蔗糖officinarum（索阿尔姆特)．序列数据存储在GenBank数据库中，访问MH137222到MH137232。的大小索阿尔姆特从190到539 AA变化，MW从6.04到59.11 KDA和PI，从5.36到50.77（表1)．全部索阿尔姆特包含至少一个pf11744，具有例外Soalmt2.和Soalmt4.显示两个PF11744(表1)．系统发育分析对其进行了分类索阿尔姆特分成四个不同的支系。Soalmt2.那soalmt3那Soalmt6.和SoALMT10属于第1类；所以ALMT5，所以ALMT8，所以ALMT9和所以ALMT11被鉴定为clade2，而Soalmt1.和Soalmt7.如枝3和Soalmt4.在枝支4(图。1)．蔗糖officinarum ALMTs在支部5中没有任何有代表性的成员。观察到不同数量的内含子索阿尔姆特，从1〜5之间变化，没有与系统发育分类的相关性（表1,无花果。2)．总的来说，有三个保守的主题被观察到SoALMTs，除了基因soalmt3，没有显示出守恒域，以及Soalmt6./SoALMT10，这属于分支1与只有motif 1的存在(附加文件1：图。S1）。在图案1中，可以观察保守的ALMT基序2，特征为ALMT/ Motoda等人描述的类似频道。（2007）[22.]在AtALMT．有例外Soalmt4.那Soalmt6.和SoALMT10，另一个索阿尔姆特成员可能定位于跨膜(表1)．

转基因植物中的铝耐受评估

本研究以甘蔗RB855156为载体，对其进行过表达高粱二色的伴侣编码柠檬酸转运体的基因。SbMATE是一个人³⁺赋予高粱耐铝能力的活化转运蛋白[20.］．在{0}和{505.9}μM Al上获得17个不同的转基因事件³⁺超过七个星期。每天测定含铝和不含铝处理的pH值，保持在4.2，以保证游离三价铝的优势。本研究采用的Al浓度基于Oliveira (2012) [23.]和其他利用水培系统评估其他作物对铝的耐受性的研究[24.那25.那26.那27.］．初步筛选后，选择两个对Al反应不同的甘蔗独立转基因事件(事件1和事件2)进行进一步的详细研究。

数字3.在水培系统中，2周后和试验结束时(6周后)对植株进行拍照。在根中也观察到棕色斑点的形成，可能是由于氧化应激或酚类化合物的积累[28.］．有趣的是，即使在NT植物中，受Al影响的植物的根系也表现出了生长的增加和轻度的氧化损伤症状，这表明RB855156在一定程度上对Al具有耐受能力。然而，只有过表达的转基因植物才能实现持续的根生长SbMATE（图。4.)．与NT相比，Al处理的转基因植株根系相对净生长(RNG)在6周内平均增加了40%。

苏木精染色

苏木素染色是通过染料与Al的络合来进行的。这种方法通常用于快速和定性地筛选可能耐受Al的植物[3.那23.那25.那26.那27.那29.那30.］．在苏木精的作用下，Al富集的植物的根尖呈深紫色。从图中可以观察到。5.与NT植物相比，甘蔗转基因植物的根顶部在Al处理下显示较少的染色。这些结果表明甘蔗过表达SbMATE与NT相比，对Al的耐受性更强。

根有机酸流动

从甘蔗根出渗出的有机酸分析表明过表达SbMATE与对照组相比，转基因植株中柠檬酸和苹果酸的含量增加。12点以后 有{505.9}μM Al存在的水培溶液中的天数³⁺与NT相比，转基因株系的柠檬酸和苹果酸分泌量分别为14倍和3倍(图1)。5.b)。

综述表达分析

验证内源性甘蔗是否伴侣该基因参与了铝诱导的反应，并对甘蔗同源基因进行了表达分析伴侣基因（综述）与高粱有关伴侣基因（SbMATE)完成了。表达分析显示，在Al存在的情况下，综述与在没有铝的缺失的NT植物的NT植物中，在NT植物的根中增加了其表达〜20倍（附加文件2：图。S2），暗示综述转运体参与了甘蔗的铝反应。不出所料，外生的SbMATE该基因在NT植物的根中不表达，但在转基因甘蔗株系中高表达(附加文件2:图S2)。

索阿尔姆特年代表达分析

如上所述，对应于推定的11个基因ALMT在甘蔗基因组中鉴定（图。1)．在NT植株中，在Al存在的情况下，其中6个基因在甘蔗根系中的表达显著增加(图1)。6.)．索阿尔姆特S.4.那5.那7.和9.他们的转录水平增加了~ 与未暴露于铝处理的植物相比，在铝存在的情况下NT植物的根系为50倍，而Soalmts 2和11.分别在相同条件下使其表达水平达到〜30和40倍（图。6.)．表达水平SoALMTs在转基因植株中，铝的存在并没有显著增加，这表明在植株中铝的过度表达伴侣，柠檬酸盐是渗出的主要有机酸。

铝敏感基因表达分析

柠檬酸和苹果酸是铝胁迫下根际分泌的主要有机酸，它们的产生通常会给植物带来大量的碳成本[31.］．因此，应严格调节渗出过程以维持植物稳态。在这种情况下，参与三羧酸途径的一些基因的表达水平，例如柠檬酸合酶（社交），母酸脱氢酶（索姆德)和富马酸脱氢酶(索菲)，以验证转基因植物是否过表达SbMATE可能导致对原发性新陈代谢的重大影响。高表达水平索姆德即使在没有铝的情况下也可以观察到NT和转基因系的MDH，这表明在我们的控制条件下，甘蔗中MDH的基础转录水平很高（图。7.a).然而，Al的存在大大增加了转录本水平索姆德，与对照相比，在NT植株和转基因事件中分别高出约20倍和10倍。这些结果证实了苹果酸铝转运体(SoALMTs)，在Al存在的情况下(图。6.)．社交在缺乏铝的NT植物中，转录水平相对较低，但增加了~ 在有金属的情况下30倍（图。7.一种）。相比之下，转基因植物产生了高水平的社交正常条件下的转录本，如组成性过表达的植物所预期的SbMATE，渗透物组成柠檬酸盐。在Al存在下，转基因植物显示中等增加社交表达水平(无花果。7.一种）。索菲转录水平显示在测试的任一条件下没有显着变化，除了在控制条件下呈现比NT植物高〜8倍的Al的NT植物的例外（图。7.)．

STOP1是拟南芥耐Al胁迫所必需的锌指转录因子[32.］．同源基因STOP1在甘蔗基因组中鉴定出来（SoSTOP1)在有无Al的条件下，研究了其在NT和转基因植物根中的转录水平SoSTOP1Al胁迫下植株增加了~ 60倍，尤其是NT(图1)。7.b)。SoSTOP1转录水平SbMATE在没有铝的情况下，与NT植物相比，植株更高，并且在提交给铝的转基因植物中仅呈现中等程度的增加（图。7.b)。

STAR1是参与水稻耐铝机制的细菌型ABC转运体[33.］．推定基因编码STAR1在甘蔗基因组中鉴定出来（SoSTAR1公司)，以验证其转录水平。SoSTAR1公司表达在NT和转基因植物中高度调节，其中表达水平大幅增加（图。7.b)。

编码质膜Al的同源基因³⁺转运体(NRAT1)，位于水稻根尖细胞内，与水稻的耐铝性有关[34.那35.]，在甘蔗基因组中也有鉴定(Sonrat1.)并检测了其在水培条件下甘蔗根系中的表达水平。Sonrat1.对铝有很高的反应性，因为植物的根被金属吸收后表现出更高的铝含量Sonrat1.转录物与未处理的植物相比（图。7.b） 是的。总的来说，这些结果表明甘蔗根系中存在一些铝响应基因，这些基因对胁迫具有高度的响应性。

植物应对铝胁迫的生化机制是通过激活从根尖分泌有机酸到根际的膜转运体。这些有机酸与铝形成无毒的稳定配合物³⁺，阻止其被根部吸收[4.那35.-37.]. ALMTs蛋白是在酸性土壤适应过程中起关键作用的转运蛋白之一[4.］．这些蛋白在Al存在的情况下渗出苹果酸到根际，通过Al的螯合赋予耐受性³⁺[4.］．据我们所知，ALMT到目前为止，还没有在甘蔗中发现基因家族成员。对最近公布的甘蔗基因组的全基因组分析[38.)确定11ALMT系统发育分为4个不同的进化支(图1)。1). 对这些不同基因表达模式的研究ALMT基因证实参与鉴定的转运体在甘蔗的铝反应，因为高水平的索阿尔姆特在暴露于金属的NT植物的根部中观察到转录物（图。6.)．

然而，表达Soalmts 1那3.那6.那8.和10.在我们的实验条件下，在甘蔗根中未观察到，可能是因为这些基因在本工作中未研究的其他组织中表达。还已知ALMT蛋白质调节植物中的若干生理反应，如防护细胞调节，阴离子稳态，果实质量，种子发育和微生物信号通信网络[14.］．因此，这些转运体存在于不同的植物组织和不同的发育阶段。

高粱中的一种膜转运蛋白基因，属于多药和有毒化合物(伴侣）鉴定家族，并表征为负责该作物中的耐抗体的Al活化的柠檬酸盐转运蛋白和过表达SbMATE拟南芥植物的抗药性[20.］．的接近同系物的过表示SbMATE，的短足动物基因（BDMate.),在Setaria冬青赋予Al宽容。美国绿冬青是一种C4植物，正在成为草类的模型[3.那39.］．基于这些研究，转基因甘蔗品系构成过表达SbMATE产生基因以验证转基因植物是否可以向AL表现出增加的耐受性。甘蔗cv。RB855156已成功转化为过度表达SbMATE基因由zmubi1.推动者使用我们组开发的协议[40］．生成17个独立的转基因事件并筛选在水培系统中生长的植物中的耐受性（附加文件3.:图S3)，以确定浓度的Al补充³⁺活动。与NT植物相比，17个事件中有2个在铝处理下表现出显著的持续根系生长，并用于进一步的详细分析。

在水培条件下，在无铝的Hoagland溶液中生长的NT和转基因植株的根在2周后都呈现褐色 周（图。3.)，这似乎与酚类化合物的氧化损伤或积累有关[28.］．有趣的是,在基地的存在,甘蔗根成为活力与降低氧化应激症状,品种用于我们的研究表明,至少在某种程度上,宽容。然而,NT植物无法维持根系生长的实验在此期间,而两种转基因处理均能维持根的生长。4.）除了增加不定根数量的增加（图。3.)，表示SbMATE与NT植物相比，植物可能更耐金属。这一现象可能是由于有机酸的外流，在这种情况下，柠檬酸盐，和其他机制参与耐性铝的研究在这项工作中，并报告了其他物种，如玉米，高粱，大豆，小麦，大麦和狗尾草[3.那17.那20.那41.那42.那43.］．此外，苏木精染色显示，转基因甘蔗根没有在根尖积累Al，这表明缺乏Al和染料相互作用时所特有的紫色(图1)。5.a） 是的。以往的研究表明，铝胁迫与氧化胁迫诱导的甘蔗根尖基因表达存在共同点，其中一些抗氧化基因在铝胁迫下表达上调[44.］．Al治疗下的高水平抗氧化基因表达可以解释在甘蔗CV根中观察到的氧化损伤症状的损失。Al治疗后RB855156。此外，由于具有广泛的育种，通常认为甘蔗的商业品种通常被认为是耐受性的，这些繁殖是有效的现代品种，如RB855156 [23.那45.那46.］．正如郭等人(2017)所讨论的[47.]，表明根对不同铝处理的适应反应柑橘类除了抗氧化能力外，其他因素也可能影响植物对铝的耐受性。这些因素包括:通过增强铝诱导的有机酸阴离子的分泌来提高体外铝的解毒能力;通过增强磷的获取和利用来维持细胞磷稳态的能力;细胞壁对铝的适应性反应;细胞骨架和碳水化合物代谢以及脂肪酸和氨基酸代谢相关基因的上调[37.］．尽管如此，甘蔗植株过度表达SbMATE当提交给A1时，能够诱导促进促进根生长的信号通路。除此之外，它的行为SbMATE运输者，以及ALMT1因此，在有铝存在的植物中，可以更好地观察到根系分泌OA的其他益处，例如提高磷的吸收[34.］．另一种可能的解释是，Al离子作为抑菌和稳定性的工作，因此，由于营养溶液中的机会性微生物的生长，根部的影响较小。目前，我们没有任何实验证据，即发生这种现象，但在甘蔗中的下一步中，我们将仔细解决这些植物正在证明改善的Al耐受的机制。然而，尽管甘蔗耐受性高，但密集栽培后土壤酸化的程度和严重程度表明对金属的略微易感性可能导致严重的经济损失[44.那45.那46.］．因此，培育具有较强耐铝能力的品种是确保适宜收成的关键。

从根顶部到根际的有机酸（OAS）分泌是植物使用的重要机制，以应对AS胁迫，因为OAS形成非植物毒性稳定络合物与AL³⁺，阻止其被根部吸收[47.］．然而，活性氧也是植物初级代谢的重要组成部分。苹果酸、富马酸、乳酸和柠檬酸是通过三羧酸途径(TCA)产生的，这些有机酸在几个生化途径中具有重要意义，包括能源生产、氨基酸生物合成前体的形成以及在整个植物水平上调节对环境的适应[14.那48.］．在这一背景下，在选择参与OAs分泌的转基因植物组成性表达转运体时，在OAs释放的积极作用和宝贵碳源的损失之间保持平衡是一个可取的特征。因此，我们研究了在存在或不存在金属的情况下，甘蔗根系中几种al响应基因的转录水平，包括编码TCA通路中间酶的基因，如柠檬酸合成酶(CYS)、苹果酸脱氢酶(MDH)和富马酸脱氢酶(FUM)。首先，将这些基因从甘蔗基因组中鉴定出来，进行qRT-PCR分析，以确定它们在水栽NT或转基因植株中表达水平，以及是否受到Al胁迫(图1)。7一个)．正如所料,SbMATE植物显示出更高的水平社交表达即使在没有Al，可能由于柠檬酸渗出浓度的增加。

在Al的存在下，NT和转基因植物的根部增加了它们的社交这表明柠檬酸盐的产生与甘蔗铝胁迫反应有关。苹果酸脱氢酶(索姆德)与不含铝的水培植株相比，NT和接受铝的转基因植株的根中基因表达量显著增加，表明苹果酸参与了甘蔗对铝的反应。这些结果与苹果酸的高转录水平相一致SoALMTs在提交给Al的甘蔗根中验证（图。6.)．有趣的是，在转基因植物中发现更高的苹果酸渗漏与在Al的存在下进行控制（图。5.b).我们发现，在转基因事件中，柠檬酸的分泌伴随着苹果酸的外排，可能表明转基因植物中有机酸的生化代偿机制，这些化合物的外排可促进细胞的pH失衡。延胡索酸酯脱氢酶(索菲)的基因表达量增加，但对转基因植株根系的影响不显著。这些数据表明甘蔗过表达SbMATE与NT植物相比，可能在更大程度上使用了TCA途径中间体。的确，在一些植物物种中，增加的铝抗性与柠檬酸和苹果酸的分泌率相关，如在snapbean，玉米和卡西亚托拉[49.那50.那51.那52.[甘蔗也是如此（图。5.b).此外，在铝处理的两个根中，不同的糖酵解途径基因也有差异表达柑橘类，对铝和磷表现出不同的反应[53.］．这些结果增强了糖酵解途径在不同植物物种中积极参与Al反应。值得一提的是，有机酸分泌的增加并不总是植物中耐受性的主要机制，但有助于减少al³⁺在细胞溶胶中，这是改善植物耐受性的重要内部机制。然而，由于术中的多个位点以及植物自卫的多个位点，植物中Al耐受性和植物耐受的分子机制的确切机制仍然尚不清楚，以及植物自卫的复杂性。

铝的毒性机制和作物对铝的耐受性主要依赖于根系的研究。例如，磷(P)的供应可以通过增加根部Al的固定和幼苗P水平来缓解铝毒性，而不是通过增加OA阴离子分泌柑橘类[54.］．在这方面，验证土壤条件对提高不同植物的耐铝性至关重要。

最后，我们还研究了一些已知的与Al反应相关的基因的表达模式。同源基因STOP1那STAR1和NRAT1在甘蔗基因组中进行了鉴定，并对其TCA通路基因的转录水平进行了如上所述的研究。STOP1是一种锌指转录因子，在拟南芥铝耐受机制中共同调节一个关键基因，似乎是铝耐受所必需的AtMATE表达和al活化柠檬酸渗出[32.］．众所周知，转录调控作用是由STOP1不仅可以由Al激活，还可以通过低pH来激活[55.]. 在水稻研究中，Arenhart等人（2014年）[33.)发现,STAR1基因是唯一的ABC基因，其转录水平在AL处理的NT植物中增加，但下降ASR5.与未经处理的NT植物比较。STAR1是其中之一ASR5.在ChIP-Seq分析中确定的目标基因ASR5.绑定到STAR1启动子区域通过体外dna结合试验得到确认[33.]. 这种破坏导致了对铝毒性的超敏反应[56.]. NRAT1是一种质膜蛋白³⁺水稻根尖细胞中与铝耐受性有关的转运蛋白。正如Xia等人(2010)所证明的[34.]，敲门NRAT1导致Al吸收减少，Al与细胞壁结合增加，Al敏感性增强。的表达NRAT1在根中由Al上调，由C₂H₂锌指转录因子(ART1)在水稻中，这一机制是通过铝在液泡中的固存来实现最终铝解毒的前一步所必需的[44.］．转录水平SoSTOP1那SoSTAR1公司和Sonrat1.经铝处理后的甘蔗根系中铝含量显著增加，表明它们参与了甘蔗的耐铝途径。

不幸的是，水培生长的甘蔗没有达到发育阶段，在那里可以进行重要的测量，如蔗糖含量或生物量。这些测量对于验证SbMATE植物适于农业用途。现场试验在Cerrado巴西地区，利用这些候选精英活动，目前正在解决这些问题。值得注意的是，甘蔗耐铝的详细机理并不是本研究的范围。甘蔗中可能涉及Al反应的基因的鉴定，如SoALMT或TCA循环基因可能有助于阐明甘蔗的耐脂质的机制。

综上所述，甘蔗植株构成性过表达高粱二色的伴侣基因（SbMATE)与NT植物相比，表现出更强的耐铝性，其特征是根系持续生长，并且可能从根尖排除铝。此外，在硅分析和分子研究中发现了甘蔗耐铝的潜在新靶点。这些结果为巴西和其他铝毒性和酸性土壤地区的农业扩张提供了一个有希望的替代方案。

SbMATE克隆

事件的顺序高粱二色的伴侣（SB03G043890）基因使用优选的优化优化Zea Mays.密码子以促进克隆步骤中基因的合成，因为本地SbMATE基因具有高GC含量。此外，在编码区的上游中加入Kozak序列（CCGAA-ATG）。随后，对齐SbMATE和osbmate.(密码子优化)序列使用geneous软件v. 2020.2进行[57.］．进行核苷酸和氨基酸序列的对准以证明优化步骤没有修饰最终的蛋白质序列，如附加文件所示4.图S4和附加文件5.：图。S5。通过DNA克隆服务（德国）合成了优化的序列并克隆到二元载体中。

识别ALMT甘蔗中的基因

识别铝活性苹果酸盐转运蛋白（ALMT)，利用关键词“ALMT”搜索在国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中筛选植物蛋白。然后将发现的蛋白质序列与从GenBank登录号GC_002018215.1下载的甘蔗(SP80-3280品种)基因组序列进行查询，使用blastp withe值截止设置为1e-10，以识别潜在的alm。冗余蛋白质序列被使用自定义Perl程序移除，残留序列被研究Pfam服务器v. 33 (http://pfam.xfam.org/)．去除数据集中缺少PF11744结构域的蛋白质。利用Protparam (Protparam (Protparam))工具预测了分子质量(MW)、理论等电点(pI)和蛋白质长度(aa)。http://web.expasy.org/protparam)，并利用HMMSCAN v. 2.41.1 (https://www.ebi.ac.uk/tools/hmmer/search/hmmscan.)．

甘蔗的亚细胞定位阿尔姆斯（索阿尔姆特）使用Protcomp 9.0计划确定（http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl& group=progs&subgroup=proc.)．推定的外显子/内含子模式和保守的进化域SoALMTs使用在线软件Softwares基因结构显示服务器v。2.0（GSDS：http://gsds.cbi.pku.edu.ch.)、多重Em for Motif Elicitation (MEME v. 4.11.1)服务器软件[58.]，FFPRED v.2.0和MEMSAT v.2.0 [59.那60.］．

ALMTS的系统发育分析

目的:研究昆虫的进化关系和分类索阿尔姆特Orysat Os02g49790.1, Orysat Os06g15779.1, at3g18440.1 1_almt9, AT1G18420.1_ALMT3, at2g17470.1 1_almt6, AT1G68600.1_ALMT5, at1g25480.1 1_almt4, Orysat Os01g53570.1, Orysat Os01g12210.1, at5g46610.1 1_almt14, AT5G46600.1_ALMT13, at4g17970.1 1_almt12, Orysat Os10g42180.1，Orysat Os04g47930.1, Orysat os06g226001, Orysat Os02g45160.1, at4g00910.1 1_almt10, Orysat Os04g34010.1, AT1G08440.1_ALMT2, AT1G08430.1_ALMT1, at2g27240.1 1_almt7和at3g11680.1 1_almt8)，序列用Muscle进行比对，并在FastTree v. 2.1.5程序中进行推测[61.］．参考序列来自Dreyer等人(2012)[62.并用作分类的模式所以ALMT。利用在线软件iTOL v.5对系统发育树进行可视化（https://itol.embl.de/)．

甘蔗的遗传转化

在本研究中，我们使用了甘蔗品种RB855156，该甘蔗品种属于公共领域，由Ridesa（Rede interuniversitária para o desenvolvimento do setor sucroenergético）注册/提供(https://www.ridesa.com.br/)，没有存放在任何一个公众可获得的植物标本室。

根据Basso等人(2017)的研究，收集甘蔗品种RB855156 6 - 9月龄植株的未成熟顶茎，并在体外诱导获得胚性愈伤组织[40］．在轰炸之前，在相同培养基上以3周的间隔选择并培养胚胎癌[63.那64.］．选择胚胎源性愈伤组织并用于通过生物分析使用遗传转化，并且表达载体P7U用于甘蔗转化（DNA克隆服务，德国）。这个矢量包含高粱二色的伴侣含优化密码子的基因(osbmate.）在控制的控制下zmubi1.启动子。选择性标记是酒吧(磷酸thricin乙酰转移酶)基因驱动zmubi1.促进剂，它提供了抗草氨铵除草剂(附加文件3.:图S3a)。微弹悬浮液的制备方法如上所述[65.］．

轰击后，愈伤组织转移到固体MS培养基上[66.]，添加20 g/L蔗糖、3 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4- d)， 4 g/L Phytagel™固化，添加250 mg/L头孢托肟钠，27±2℃黑暗孵育7天。随后,愈伤组织转移到盘子包含MSC3介质[MSC3组成的盐和补充女士为0.5 mg / L烟酸,0.5 mg / L盐酸吡哆醇、0.1 mg / L盐酸硫胺素,2 mg / L甘氨酸,50 mg / L精氨酸,0.15 mg / L柠檬酸、蔗糖27.25 g / L, 100 mg / L肌醇,50 mg / L半胱氨酸,500 mg / L水解酪蛋白,3 mg / L 2,4 - d、0.6 mg / L硫酸铜,50毫升/ L商业椰子汁,4 g / L Phytagel™,pH值5.8)+ 250 mg / L cefatoxime钠和3 mg / L该方法(LibertyLink™除草剂,拜耳)为选择性的代理和选定的假定的转基因愈伤组织再生被用于工厂,根据男低音歌手et al。(2017)40］．

将再生植株移入添加250的MS培养基中 250毫克/升柠檬酸 mg/L头孢菌素钠，3 mg/L草甘膦酸铵，保存在Conviron®Adaptis 1000TC（Conviron，加拿大）的生长箱中，光照/暗照周期为16/8小时，温度为100℃ μmol M^{- 2} s^{- 1}和27±1°C。再生植株在含有土壤、商业基质Plantmax™和蛭石混合物(3:1:5 .5)的盆中(26±2℃)，在400 μmol m、16/8小时的光/暗光照条件下驯化8 ~ 12天^{- 2} s^{- 1}65%相对湿度[67.]. 植物被转移到温室中并繁殖，以进行随后的耐铝试验。所有实验均以未转化植株作为对照。

转基因事件的分子分析

用改良的CTAB法提取抗草氨铵再生植株的基因组DNA [67.］．采用PCR方法对该基因的插入进行了验证osbmate.放大（附加文件3.:图S3b)。

用LiCl法提取根尖总RNA [68.］．根据制造商的说明（Promega，Madison，Wi，USA），用RQ1无RNase的DNase处理样品，并使用NanoDrop ND-1000分光光度计（无所值）定量总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳验证了RNA完整性。使用提取的RNA作为模板和REVERTAD TM第一链CDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）完成第一链cDNA的合成。所有步骤都根据制造商的说明进行。使用Platinum®Sybr®GreenPCRSupermix-UDG进行QPCR分析，其具有ROX（Invitrogen，Carlsberg，Ca，USA），其中使用SepteroInPlusreal-Time PCR系统推荐的协议（应用生物系统）使用合成的单链cDNA作为模板)．使用软件Primerquest（https://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index)并用电子PCR技术验证其特异性(https://ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov/2017/06/28/e-pcr-is-retiring-use-primer-blast/)．引物由Integrated DNA technologies (IDT)合成并购买^®)，它们的序列在附加文件中描述6.：表S1。

使用q-Gene [69.]使用参考基因对表达水平进行标准化SoGAPDH和SoEF1,根据圣地亚哥等。（2018）[70］．相对量(RQs)的几何平均值使用BestKeeper软件v.1 [71］．使用LinRegPCR v. 11.0利用线性窗口建立个体扩增效率[72］．使用三种生物重复进行实验。

铝治疗测定和根生长测量

以含蛭石的试管苗为材料，以甘蔗试管苗为材料，建立了17个转基因品种和NT植株的芽前苗。60岁以后 第二天，根据植株活力和根系发育状况进行筛选，转入含½个腺体的水培体系[73]营养溶液。然后将植物适应7天（附加文件7.：图。S6）。之后，将植物提交至210mm ALCL的Al治疗_3.，对应Al的{505.9}μM³⁺在水培溶液中的自由活性。将pH调整到4.2，每天使用便携式pH计(汉纳HI9023 pH计;汉纳仪器巴西进出口有限公司。AL.³⁺使用GeoChem-EZ v. 1.0软件估算活动[74]. 每7周进行一次根系生长评估 7天 周。

评估转基因和NT植物的治疗中的治疗中的液体生长，如Ryan等人所述的那样。（2009）[75]. 为了测量相对净生长量（RNG），用直尺测量了在有（+Al）和无Al营养液中生长前后的根长(−Al）Al超过7周。

苏木精染色

血液杂志法用于评估Al处理下的甘蔗植物中的Al积累，如上所述进行所述根生长测量。该协议基于Tang等人。（2000）[30.］．简而言之，从小植物中切除从营养溶液中生长的每种转基因事件和NT植物的培养液和NT植物的植物长度的根尖，并从小植物中切除24小时，并在2ml蒸馏水中轻轻摇动60分钟．将水替代2ml水溶液水溶液（0.2％血红素素和0.02％碘化钾，W / V），并轻轻摇动样品15分钟。最后，将溶液再次替换为2ml蒸馏水，从而重复第一步。染色后，将根部拍照在立体显微镜Leica Model S8APO下。

柠檬酸和苹果酸流出量的测量

在上述水栽条件下，转基因植株和NT植株的根尖中枸橼酸/苹果酸的外排量在接触含0和505.9 μM铝的营养液12天后收集³⁺．暴露期结束后，用蒸馏水清洗根，收集的液体冻干用于有机酸分析。样品与200 μl吡啶和50 μl n - o -双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)在75°C搅拌下1 h进行衍生化。13000 rpm离心5 min，收集100 μl装入密封玻璃瓶进行分析。按照ceneno等人(2016)描述的方法，将1 μl注射到气相色谱-质谱(GC- ms)系统(安捷伦GC 6890和MSD 5973 N系列，安捷伦，美国)中进行代谢谱分析[76]在直径0.25 mm，膜厚0.25 μM (Supelco)的30 m HP5柱上。氦气作为载气，流速为1 mL。最小值^{- 1}. 在以下温度程序下进行分析：5 70℃等温加热最小值 °C，然后是5 摄氏度 最小^{- 1}烤箱温度上升至310°C，最后在310°C加热1分钟。质谱记录在2扫描秒^{- 1}扫描范围50-600 m/z。利用NIST质谱库对峰进行了鉴定。数据以各条件下转基因株系与NT的倍数变化来表示。

统计分析

实验数据采用随机区组设计(RBD)进行分析，每个处理({0}和{505.9}μM Al) 6个重复³⁺)．除有机酸分析样品在处理12天后采集外，所有分析样品均在处理7周后采集。每个样本处理之间的差异用T.考虑，考虑P.< 0.05为显著。

这阿尔姆斯-本文报道的测序数据已存入国家基因组数据中心，登录号为MH136222至MH137232的GenBank数据库中。用于支持本文结论的其余数据集包含在本文及其附加文件中。

艾尔：

铝

pH值:

氢的潜力

ALMT:

Aluminum-activated苹果酸转运蛋白

伴侣：

多药、有毒复合挤出

NT:

非转换

办公自动化:

有机酸

柠檬酸:

三羧酸

半胱氨酸:

柠檬酸合成酶

MDH:

苹果酸脱氢酶

嬉笑:

延胡索酸酯脱氢酶

存在:

定量实时聚合酶链反应

NCBI:

国家生物技术信息中心

分子量：

分子量

ZmUbi1:

络合素启动子UBI-1

2,4 - d:

2,4-二氯苯氧乙酸

CTAB：

十六烷基三甲基溴化物

PBS公司：

芽前苗

BSTFA：

N-O-BIS（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺

GC-MS：

气相色谱 - 质谱

RBD：

随机区组设计

不适用。

这项工作是由EnabPa宏程序SEG（项目编号03.16.05.0260.00）支持HBCM和圣保罗研究基金会（FAPESP）赠款（PROC）。N2019/04878–7; 过程。N2018/15576–9; 2019/16226–4（分别适用于WRS、DCC和KED）。资助机构没有在研究的实验设计、结果分析或手稿撰写方面发挥作用，但为手稿提供了资金支持。

作者笔记

1. Ana Paula Ribeiro，Felipe Vinecky和Karoline Estefani Duarte同样为这项工作进行了贡献。

隶属关系

1. 遗传学和生物技术实验室，巴西农业能源公司，巴西利亚，70770-901，巴西

   Ana Paula Ribeiro，Felipe Vinecky，Karoline Estefani Duarte，ThaísRibeiroSantiago，Raphael Augusto Das Chagas Noqueli Casari Brito Da Cunha，Polyana Kelly Martiveira Molinari，Adilson Kenji Kobayashi，Wagner Rodrigo de Souza＆Hugo Brunocorrea molinari.

2. 自然科学与人文中心，ABC联邦大学，SãoBernardo做Campo，SP，09606-045，巴西

   Karoline Estefani Duarte, Aline Forgatti Hell, Danilo da Cruz Centeno & Wagner Rodrigo de Souza

3. 植物病理学系，Brasília, Brasília, Distrito Federal, 70910-900，巴西

   泰国人里贝罗圣地亚哥

4. 基因工程中心和分子生物学中心，Gravapa Genclima，AC unicamp大学城，坎皮纳斯，13083-886，SP，巴西

   杰拉尔多·麦哲拉·德·阿尔梅达Cançado

5. 应用生物中心（NBA），Gravapa玉米和高粱，Sete Lagoas，35701-970，MG，巴西

   朱兰迪尔·维埃拉·德马加莱斯

贡献

HBCM、AKK、APR、FV和WRS构思并设计了实验。TRS和KED进行了硅分析。APR和BADC进行了遗传转化。APR、FV和RACNC进行了非生物胁迫试验。APR、FV、KED和PKM进行qRT-PCR检测，并对数据进行分析。APR进行苏木精测定。DCC、AFH、KED、PAOM进行有机酸分析。APR，FV和WRS写了手稿。APR、FV、WRS、GMAC和JVM对结果进行了讨论。HBCM、AKK、PAOM和GMAC提供了智力投入并修改了手稿。所有作者都阅读并批准了最后的手稿。

相应的作者

对应到瓦格纳·罗德里戈·德索萨或者雨果布鲁诺科雷亚莫里纳里．

道德认可和参与同意

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

所有作者声明没有相互竞争的经济利益。

出版商的注意

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