基因同时表达与多基因沉默GydF4y2Ba玉米GydF4y2Ba使用玉米矮小马赛克病毒GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

玉米矮花叶病毒(MDMV)，属的一个成员GydF4y2Ba马铃薯Y病毒GydF4y2Ba，感染玉米，并不是由蚜虫持续传播。一些植物病毒已经发展成为植物基因表达和基因沉默的工具。检测了MDMV的基因表达能力和基因沉默能力。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

获得了MDMV，MDMV OH5的俄亥俄州孤立的传染性克隆，并仅用于基因表达，以及用于三个内源玉米靶基因的同时标记基因表达和病毒诱导的基因沉默（VIGS）。对单一插入构建体中的单一基因表达和绿色荧光蛋白（GFP）的同时表达和三种玉米基因沉默在双插入构建体中的沉默。插入HCPRO的N-末端的GFP的构建体比我们研究中CP的N-末端插入的GFP更稳定。出乎意料地，具有两个插入位点的构造也以比单插入构建体更高的速率保持插入。工程化MDMV表达和Vigs构建体通过蚜虫传授（GydF4y2Ba帕氏菱鲆GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

结果表明，mdmv载体可作为玉米基因同步表达和多基因沉默的载体。GydF4y2Ba

玉米(GydF4y2Ba玉米GydF4y2Ba)是世界上种植最广泛的作物之一，用于人类消费、动物饲料以及作为生物燃料和其他产品的原料（见[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba])。除了它的农业重要性，玉米是单子叶作物遗传学的模式植物，具有完整的B73基因组序列[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]和其他34个储存在玉米遗传及基因组数据库(GydF4y2Bamaizegdb.org.GydF4y2Ba). 然而，很少有基因组学工具可用于个体基因表型的影响。玉米转化技术难度大、成本高、耗时长（见[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]). 因此，替代稳定转基因的方法是有价值的。基于病毒的高通量病毒诱导基因沉默（VIGS）工具的开发有助于填补玉米基因功能研究的空白。GydF4y2Ba

许多植物病毒已经发展成为表达蛋白质或VIGS的有益工具(综述见[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba])。Vigs已被用于主体植物中的基因功能分析[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]，以正反义方向或发夹结构利用病毒载体中的靶基因片段（参见中的示例）[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba])，插入序列片段小到100–300 nt能有效沉默靶基因[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．植物病毒也已广泛用于许多不同植物物种中的蛋白质表达（在[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]). 在一个案例中，一个来自豆荚斑驳病毒（BPMV）的植物病毒载体甚至被开发用于同时进行单基因表达和单基因沉默[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］．对于玉米，已经开发了几种病毒作为基因表达或沉默的工具，包括斑马马赛克病毒（BMV）[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]，黄瓜马赛克病毒（CMV）[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]，玉米瑞拉多芬诺病毒（MRFV）[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]基因沉默[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]小麦条纹花叶病毒[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]甘蔗马赛克病毒[GydF4y2Ba27.GydF4y2Bafoxtail花叶病毒(FoMV)的基因沉默[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba或蛋白质表达[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]和引导RNA递送CRISPR/Cas9基因编辑[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]，大麦条纹马赛克病毒为基因沉默[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba或蛋白质表达[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]或用于指导RNA递送[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]和大麦黄纹花叶病毒（BYSMV）同时进行导向RNA和高载量蛋白的表达[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

家族中的病毒GydF4y2Bapotyviridae.GydF4y2Ba或Potyviruses已被发展为各种植物宿主中的异源基因表达载体，从而能够跟踪病毒运动和其他实验。家族中的病毒GydF4y2Bapotyviridae.GydF4y2Ba具有用病毒涂层蛋白包封的单链阳性感测RNA基因组具有弯曲，杆状病毒颗粒，是最大的植物病毒组（在[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]). 马铃薯y病毒基因组编码一种多蛋白，它被自身的病毒蛋白酶切割，产生10种成熟的功能性病毒蛋白，通过与许多植物寄主蛋白的相互作用，实现病毒复制、致病性、蚜虫传播和其他功能（综述见[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]). 用于蛋白质表达的马铃薯Y病毒包括烟草蚀刻病毒（TEV）[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba、西葫芦黄花叶病毒(zyv) [GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]，李痘病毒（PPV）[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]，马铃薯病毒A（PVA）[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]，萝卜马赛克病毒（tumv）[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]，烟草静脉带马赛克病毒（TVBMV）[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba], WSMV [GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]，和SCMV[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]. potyvirus由于具有较强的沉默抑制作用，不利于VIGS载体的构建，而PVA是一种用于瞬时基因沉默的载体[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]. 在这些基于马铃薯y病毒的载体中，最常见的插入位点是P1/HCPro和NIb/CP编码序列连接，在一些载体中使用了多蛋白开放阅读框（ORF）或多蛋白ORF的5′端的其他四个连接位点。GydF4y2Ba

自多个序列插入网站可以利用一些potyviruses,和可扩展的杆状病毒粒子通常比病毒插入序列的更加宽容和二十面体病毒粒子固有包装限制,2到5的表达蛋白质从单一向量技术已经取得了一些系统(GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

鉴于potyvirus的特点和对进一步用于玉米的工具的兴趣，玉米矮花叶病毒(MDMV)是一个有吸引力的发展选择。MDMV于1963年在俄亥俄州首次被报道[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］．MDMV自然是由蚜虫以非持久性的方式传播[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]，并易于在实验室通过摩擦接种传播[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba]. 感染MDMV的植株在感病玉米品种的叶片上有花叶病症状，早在5-7年就可以看到 接种后几天。MDMV在美国很常见，并且能够降低产量，但是成功的抗性育种和疾病管理限制了主要产量损失（见[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]). 除玉米外，MDMV的寄主范围还包括一些高粱品种和约翰逊草(GydF4y2Ba高粱霍尔德GydF4y2Ba是一个主要的越冬病毒库[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba］．一个实验室维持的MDMV OH2分离物的接近完全一致序列(GenBank登录号:JQ403609)和一个衍生感染性克隆(MDMV OH1;加入基因库。来自俄亥俄州的JQ403608) [GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]. 在这里，我们报道了一个新的俄亥俄州MDMV分离株MDMV-OH5的克隆和测序，MDMV-OH5感染性克隆的开发，以及在玉米中同时表达和多基因沉默的工程构建。我们报道了第一个在玉米中同时表达基因和多靶点VIGS的病毒载体的开发。GydF4y2Ba

MDMV-OH5全序列分析及全长感染性克隆的建立GydF4y2Ba

俄亥俄州采集的约翰逊草的MDMV感染(GydF4y2BaS. Halepense.GydF4y2BaL.）通过先前公布的MDMV OH-特异性引物进行NIB（MDMV-7065F）和3'UTR（MDMV GENR1，[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]，附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1），并对扩增片段进行测序。当约翰逊草叶汁液被接种到易感的“银皇后”、“早期Sunglow”和“Oh28”玉米植株上时，出现典型的花叶病症状（数据未显示）。从原始采集的约翰逊草叶片中提取RNA，用于cDNA合成、克隆和测序。用Sanger扩增子序列测定MDMV分离株的全序列，包括cDNA末端扩增子（RACE）的5′和3′快速扩增；附加文件中的引物GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。GydF4y2Ba

从克隆的cDNA平台表达的精确5'序列，以及是否是真实的，可能是衍生克隆的感染性的重要甚至是必不可少的（见[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]及参考文献)。因此，我们使用5’-RACE作为获得最佳克隆的第一步，通过实验确定了MDMV OH5真实的5’大多数核苷酸。5 ' RACE扩增子Sanger序列鉴定出的MDMV OH5的5 '多数核苷酸为腺苷，与其他已发表的MDMV分离株相同:NC_003377, (GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]，MDMV GoLestan（GenBank登录号JQ280313.1），MDMV SZ0605（GenBank登录号。FM883211.2 [GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba]，MDMV MV0801（GenBank登录号。FM883164.2 [GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba] （桌子GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．还对MDMV-ITALY（GENBANK登录NO.JX185302）和MDMV OH2进行了比赛，因为GENBANK序列缺少5'大多数序列。该测序鉴定了近近完全序列提交的MDMV OH2（5'-AAAAACA-3'）的七个5'核苷酸，并且在近乎完全序列提交MDMV意大利提交中缺失的35个5'核苷酸（5'-AaaaacaacaacaAgaacaacaacaacaaaca-3'）。Genbank序列提交的这些病毒的近完整序列的含量被更新并完成了这些病毒的5'序列数据。基于种族数据，所有分离株的含有5'末腺苷残留，而不是克隆病毒MDMV OH1（GenBank登录No.JQ403608）的5'-大多数鸟嘌呤，在其中5'次播放的源病毒未成功进行[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．所有三种MDMV OH序列（MDMV OH1，MDMV OH2和MDMV OH5）具有相同的3'-末端序列，如3'赛（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．与9442NT MDMV OH2血液完成的序列相比，MDMV OH5的完整序列为9538NT，并共用89％核苷酸和96％的聚丙烯蛋白氨基酸序列同一性，具有MDMV OH2。在MDMV OH5中存在的另外的96个核苷酸位于MDMV涂层蛋白（CP）基因的N-末端的编码区域中的框架中，使得MDMV OH5预测为编码含有32种含氨基酸的涂层蛋白和A与MDMV OH1和OH2预测的30kDA CP相比，预测分子量为34kDa。在玉米和johnsongrass调查中，先前发现了N末端CP编码序列的该额外序列是MDMV的所有俄亥俄州场隔离物[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]，暗示在俄亥俄州CA收集的实验室机械分离的分离物（MDMV OH2）。1970年和衍生的克隆（MDMV OH1）可能在传代中丢失了N-末端涂层蛋白编码序列[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba］．克隆得到的强生草源多肽mv的全序列命名为MDMV OH5，并存入GenBank。MN615724。GydF4y2Ba

将全长MDMV OH5序列克隆到二元载体PJL89 [GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba，命名为pWX6(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa） 是的。为了检测pWX6的侵染性，将pWX6体外RNA转录本通过血管穿刺接种法（VPI）接种到“银皇后”玉米中[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba])使用扩增的全长序列和添加T7启动子的引物来产生转录物，正如先前报道的MDMV OH1感染性克隆所成功的那样[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．在接种后的一个植物亚群中观察到典型的花叶症状(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bag)，说明pWX6克隆具有传染性，VPI感染率为33%(表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)，比最初报道的MDMV OH1感染性克隆最高约10%的感染率有所改善[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．原MDMV OH1克隆的感染率也得到了提高(57%)，这表明改进的接种剂制备方案(全长序列扩增和/或体外转录，VPI程序保持不变)而不是mdv OH5 pWX6克隆固有的更高的传染性。通过玉米或玉米的农业渗透从二元载体无性系中发射病毒感染的初步试验GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba从该构建体不成功（数据未显示），只使用成功的玉米VPI方法测试更多克隆。GydF4y2Ba

GFP在PWX27中NIB / CP结的基因插入的表达GydF4y2Ba

为了探讨MDMV OH5是否可用于基因表达，将绿色荧光蛋白（GFP）基因组装在克隆pWX6中MDMV OH5的核内含物b-RNA依赖性RNA聚合酶（NIb RdRP）和CP基因之间的多蛋白框架内，以创建pWX27（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab).在插入的GFP序列的上下行重复NIb/CP裂解序列(EVIDVKHQAGE)，并对编码序列进行简并，避免直接的序列重复，以使编码的多蛋白有效地裂解GFP。VPI检测证实pWX27克隆具有传染性，平均感染率为37%(见下表)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）和在感染植物中产生的典型的马赛克症状。在荧光显微镜下可视化GFP表达，表明MDMV OH5可以用作基因表达载体（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种）。用于GFP的Western印迹显示，观测到的GFP的量（预期尺寸29.4kDa）与第一个和第一个相比略微下降（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba;原始图像显示在附加文件中GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

pWX68细胞P1/HCPro连接基因插入GFP的表达GydF4y2Ba

我们将GFP插入到多蛋白的P1和hcp编码序列的帧内，得到克隆pWX68(图1)。GydF4y2Ba1CGydF4y2Ba)．VPI证实了pWX68克隆的侵染性，平均侵染率为43%GydF4y2Ba2GydF4y2Ba). 观察到典型的镶嵌症状，可见GFP表达（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab）。PWX68感染叶片的蛋白质印迹分析也显示出GFP表达（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba;原始图像显示在附加文件中GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

从PWX56同时沉默三种基因和异源GFP表达GydF4y2Ba

由于两个位点的基因插入都成功表达了GFP，我们接下来研究了MDMV-OH5是否可以用于在单个结构中同时使用两个插入位点进行基因沉默和基因表达。使用类似的插入大小的VIGS，我们的目标是在一个插入位点的多个基因。三重基因靶向VIGS插入，GydF4y2BaZM.GydF4y2BaChlI-IspH-PDS是用来沉默镁螯合酶、柠檬白1和植物烯去饱和酶基因的，有249个 747的每个目标玉米基因的nt序列 nt总构造大小。这种三基因VIGS结构被插入P1和HCPro之间的多蛋白框架中，将MDMV-OH5的NIb裂解位点序列插入pWX27主干中以产生pWX56（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bad).克隆pWX56的传染性通过RNA转录本的VPI得到证实，平均感染率为22%(表)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

在受感染的植物中可见绿色荧光（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA-D）和通过蛋白质印迹分析证实的GFP蛋白表达（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．在所有叶片和茎组织(图2FG，图S1D)和雄穗(数据未显示)中也观察到强烈的光漂白。在根或其他组织中没有进行沉默试验。通过RT-PCR分析验证了GFP编码序列的保留和三个VIGS插入的每个成分的序列(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S1A)。与接种野生型无性系pWX6的植株或健康对照植株相比，叶绿素水平下降(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图印地)。采用定量RT-PCR (RT-qPCR)检测pWX56单个靶基因转录减少情况。这三个基因的目标，GydF4y2BaZM.GydF4y2BaChli，GydF4y2BaZM.GydF4y2BaPDS,GydF4y2BaZM.GydF4y2Ba在接种后14天，与野生型pWX6感染对照相比，IspH的RNA转录水平降低(图1)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

构造的微分稳定性GydF4y2Ba

植物病毒表达和VIGS载体的普遍挑战之一是病毒复制周期中异源序列的不稳定性和插入序列的丢失。利用VPI发射的pWX6、pWX27、pWX68和pWX56在-80°C冰箱中保存的感染叶片材料，对10日龄幼苗进行摩擦接种3周后，测定了pWX27、pWX68和pWX56中异源序列插入的稳定性。在每个时间点，每个植株顶部最年轻的完全出叶通过RT-PCR分析病毒和插入位点两侧的引物(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。扩增片段仅为全长插入条带GydF4y2BaA.GydF4y2Ba; 检测到全长插入加上较小的带GydF4y2BaBGydF4y2Ba; 未检测到全长插入的多个带GydF4y2BaCGydF4y2Ba;单带小于全长刀片，尺寸通常靠近野生型病毒扩增子的尺寸GydF4y2BaDGydF4y2Ba;没有乐队GydF4y2BaEGydF4y2Ba（表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC;附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S2;原始图像附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．pWX27的插入序列快速丢失，没有样品显示全长插入仅14 dpi。pWX27扩增子检测到的扩增子从主要的全长或带有全长插入的扩增子的混合到21dpi时大部分全长插入检测的缺失(表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．相比之下，PWX68保留了14和21 DPI的一些全长插入。对于PWX56 Vigs和GFP插入序列，观察到甚至少的全长只插入损耗（表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba). 单波段分类的统计比较GydF4y2BaA.GydF4y2Ba（全长插入单带）和GydF4y2BaDGydF4y2Ba（单个小于全长带/接近野生型回流），用于各种构建体的插入位点支持的，与PWX27和PWX68插入相比，各种构建体的插入位点被支持显着改善了PWX56插入的插入稳定性（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA，B;查看其他文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S2-S4GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 表明双插入稳定构建体。通过摩擦接种，还通过一系列五个段落检查了GFP和Triple Vigs在PWX56中插入稳定性。在所有五个段落中检测到GFP表达和Vigs Photoblaching，但第五段段落弱（附加档案GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S5;附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S1)。GydF4y2Ba

PWX56的蚜虫传输GydF4y2Ba

蚜虫（GydF4y2Ba帕氏菱鲆GydF4y2Ba)来自俄亥俄州和堪萨斯州的原始殖民地被用来测试pWX56的传播。野生型pWX6克隆病毒和pWX56的典型花叶病症状表明，蚜虫传播是成功的，每种结构或每种病毒的传播率在统计学上没有显著差异GydF4y2Bar . padiGydF4y2Ba堪萨斯州和俄亥俄州的殖民地(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．在PWX56蚜虫接种植物中，观察到光博（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S3A)，荧光显微镜观察GFP表达(数据未显示)。通过RT-PCR检测目的基因进一步证实了VIGS和GFP的插入(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图。S3B）。Vigs插入序列在蚜虫接种后17天保持完整，而GFP插入序列在蚜虫接种后17天显示完整和部分完整序列的混合。两者中的每一个GydF4y2Bar . padiGydF4y2Ba种群传播pWX6和pWX56的比率相似，为45-90%(每20株被蚜虫侵染的植株中，9株- 18株被侵染，差异无统计学意义(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba > 0.05）（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

我们已经证明MDMV可以在玉米中同时进行基因表达和多基因沉默，这是在一个单一的基于病毒的玉米工具中这两种能力的首次配对。这一点非常重要，因为在功能分析中，可以同时评估多个基因，如果需要，可以使用相反的过表达和敲低表达。这为基因表达和功能研究提供了修饰其他农业上重要的马铃薯y病毒/作物的可能性。出乎意料的是，与单位点插入结构相比，双插入还增加了病毒中异源序列的稳定性。到目前为止，这种结构中双重插入的稳定作用机制尚不清楚。同样，由于这是仅有的两种针对VIGS的potyvirus之一，MDMV修饰成功的多靶点VIGS和并发基因表达的能力是常见的，但只是没有针对potyvirus进行测试，还是该病毒某些罕见特征的独特结果尚不清楚。然而，插入序列可以在pWX56中同时克隆和高效表达，并且可以通过转录物VPI启动构建。VPI的效率估计是最初通过植物叶片接种启动转录RNA的10倍[GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba］．一旦构造物感染植株，早期收集的叶片可以用于简单的摩擦接种新玉米植株，便于扩大规模。在玉米多肽mv中稳定插入或表达GFP，表明多肽mv可作为玉米基因功能分析和表达的有力工具。虽然本文报道的所有概念工作都是在玉米基因型Early Sunglow和Silver Queen中进行的，但pWX56结构也感染并诱导了玉米基因型B73和Mo17的VIGS光漂白，这表明它可以在敏感玉米基因型中得到类似的利用(初步数据未显示)。我们也注意对终端用户的利益,最优性能的报道pWX56依赖于植物生长的最佳条件:植物明显强调由于恶劣的种植条件,在我们的案例中由于生长箱故障,显示标记和快速丧失pWX56插入序列时接种(结果未显示)。GydF4y2Ba

与目前可用于玉米的其他病毒的工具相比，（基于BMV，CMV，FOMV，SCMV，WSMV，BSMV，BySMV和MRFV），多目标和多功能同时vigs /基因表达能力我们报告是草地的独特新开发。由于每种病毒具有独特的特征，并且尚未进行各种可用病毒的基因表达工具的直接实验和定量比较玉米中的基因表达或基因沉默的基因沉默的工具，直接比较玉米病毒的工具是有限的。然而，发表的文献可以帮助选择基于携带容量，递送方法，插入稳定性，表型透析和功能的不同特征的最终用户选择合适的工具，并采用直接比较由于宽度而导致的指导是不完美的警告每个系统中使用和测量的参数范围。作为额外的警告，还应注意，在检查所有病毒系统中，用于比较，用于比较，插入稳定性以及携带能力至少显示出至少一些序列依赖性，因此没有严格的承载能力或稳定性所有可能的插入序列。GydF4y2Ba

未检测以pWX56模式设计的结构的最大序列承载能力。然而，pWX56携带的全部异源序列（约1.4 kb）远大于基于球形病毒粒子的玉米感染工具的报道，预期球形病毒粒子对插入大小有物理限制，并携带约300个沉默靶序列 nt或更小（BMV[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]，巨细胞病毒[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]，MRFV [GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]). pWX56序列的载物大小与报道的同样具有杆状病毒粒子的其他病毒的载物大小相当或略小，杆状病毒粒子可能随着序列插入的增加而增加衣壳长度。然而，修饰后的杆状病毒仍然存在着插入大小的限制，并且在插入序列较大的玉米中，如β-葡萄糖醛酸酶（GUS）（SCMV）的表现和稳定性普遍降低[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba], WSMV [GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba], BSMV [GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba，和FoMV [GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]). BYSMV弹状病毒工具本身就具有整体携带能力，其中一个已报道的结构携带大Cas9基因以及编码支架导向RNA和红色荧光蛋白基因（约5）的序列 总计kb[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]. 然而，应该注意的是，在玉米中启动这些基于负义RNA病毒的构建体是困难的，需要从注入玉米粗汁液的稻飞虱中传播GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba- 吞噬GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在基于病毒的工具中，对于玉米和其他植物来说，插入稳定性是一个常见的挑战，并且只能将效用限制在接种点以上的少数叶片上[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］．在插入稳定性方面，pWX56是玉米插入稳定性最好的病毒工具之一，例如基于相关病毒SCMV的单蛋白表达工具[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba)，系统地观察插入保留和相关表型，直到最后观察时间点和最顶部的叶片，并多达3代。然而，随着插入物逐渐丢失，其相对稳定性不如基于MRFV的单基因沉默工具在超过60天内几乎完全保留插入物那样令人印象深刻[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］．对PWX56的每个靶基因的沉默疗效，基因表达降至39-46％的对照表达水平，在单靶力BMV构建体（CA.30-60％的对照表达）期望的范围内，在预期的范围内[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]但具有比某些单一目标Vigs构建体（13-33％的对照表达为BSMV的控制表达的13-33％[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]和16–33%的MRFV对照表达[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba)——再次指出，由于方法和条件的差异，这种比较并不精确。pWX56中GFP的蛋白表达在视觉上也很稳定，但由于除了插入和表达稳定性外没有进行定量评估，我们无法在现有的报告工具中比较蛋白表达量。pWX56基因沉默和基因表达同时具有相反功能的定性特性，以及对多个靶点的沉默能力，使本设计的pWX56及其衍生物成为玉米病毒工具箱的新成员。GydF4y2Ba

我们证明MDMV衍生载体可以同时表达GFP蛋白和沉默三个玉米基因。我们还发现双插入增强了插入序列的稳定性。GydF4y2Ba

植物材料与接种GydF4y2Ba

MDMV OH5是2017年10月从俄亥俄州Chillicothe采集的具有马赛克症状的Johnsongrass植物中获得的（经个人土地所有者许可进行公共财产收集和私人财产收集，样品未区分为原始土地所有权），并保持在俄亥俄州立大学（OSU）伍斯特分校在OSU机构生物安全委员会规定的温室里。植物被破坏性地取样，没有被分类学专家正式鉴定。病毒通过揉搓接种从源植物传播，将叶片组织磨碎成5卷10份 磷酸钾，pH 7.将提取物涂在10-11的叶子上 一天大的'Oh28'、'Early Sunglow'和'Silver Queen'位于拇指和食指之间，接种物与600目碳化硅（碳化硅）混合。所有感染了改良病毒结构的植物材料在25℃的控制生长室中生长 摄氏度，16 h灯和8 h光强度为13000的黑暗条件 嗯。GydF4y2Ba

测序MDMV OH5GydF4y2Ba

使用Digenzol RNA Miniprep套件（美国Zymo Research，USA），从四个Johnsongrass样本（命名为MDMV OH3至MDMV OH6）中分离出总RNA。合成互补DNA（cDNA）并用于逆转录-PCR（RT-PCR）。用于MDMV OH1（MDMV-7065F，MDMV-4272F，MDMV GENR1）特异的引物用于MDMV基因组序列扩增（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。使用上述相同的引物和MDMV-6241r测序扩增的DNA片段。MDMV OH5用于后续研究。GydF4y2Ba

MDMV的末端序列由5'-和3'族测定。对于5'族，首先用底漆WX24退火1μg从MDMV感染植物中提取的总核酸（附加档案GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1），然后用于使用上标III逆转录酶（Thermofisher Scientific，USA）的第一链cDNA合成，其次是由制造商（Thermofisher Scientific，USA）所述的RNASEH处理。然后通过末端转移酶（New英格兰Biolabs，USA），通过Monarch®PCR和DNA清除柱（新英格兰Biolabs，USA），量化和G尾，用0.25mm DGTP进行量化和G尾。使用引物WX25和WX27的PCR用作PCR的模板，然后用引物WX26和WX29（附加文件）作为PCR的模板GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1）。PCR扩增的DNA要么直接用引物WX27测序，要么克隆到pMINIT 2.0载体（美国新英格兰生物实验室）中，然后进行测序。对于3′-种族，1 从感染MDMV的植物中提取的μg总核酸首先用引物WX292（附加文件）退火GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1），然后使用Superscript III逆转录酶（ThermoFisher Scientific，USA）进行第一链cDNA合成，然后按照制造商（ThermoFisher Scientific，USA）的说明进行RNaseH处理。然后将cDNA通过Monarch®PCR和DNA净化柱（美国新英格兰生物实验室）。以该cDNA为模板，用引物WX236和WX293进行PCR，然后用引物WX29和WX237进行第二次PCR。扩增的DNA要么直接用引物WX27测序，要么克隆到pMINIT 2.0载体（美国新英格兰生物实验室）中，然后进行测序。GydF4y2Ba

MDMV-OH5感染性cDNA克隆的建立GydF4y2Ba

将MDMV OH5的全长cDNA克隆到二元载体pjl89中[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba]. cDNA由1 从感染MDMV的植物中提取μg总RNA，使用上标III逆转录酶和oligo d（T）引物进行第一链cDNA合成，然后按照制造商的描述进行RNaseH处理（ThermoFisher Scientific，USA）。使用引物LRS764和LRS765从MDMV第一链cDNA扩增全长MDMV基因组序列（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。然后使用Nebuilder®HifiDNA组装主混合物（新英格兰Biolabs，USA）克隆扩增的cDNA序列以SmaI和Stui消化的二元载体PJL89，如制造商所述。获得PJL89中的几种感染性MDMV OH5克隆，其中选择其中一个名为PWX6的，用于测序和进一步分析。GydF4y2Ba

在CP的N末端区域插入GFP（PWX27）GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白（GFP）基因序列[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba使用Nebuilder Hifi组件主混音（New England Biolabs Inc.，USA）在PWX6 NIB和CP编码序列之间插入，在NT 8386/8387：15 NT（5'-CAGGCCGCGCACC-3'之间插入了重复的切割位点，小写表明核苷酸改变为改变密码子，同时留下翻译的序列）编码氨基酸序列Q / ageet，在GFP基因开始时由NIA-Pro切割;和24 nt（5'-gaggttatcgacgtgaagcaccaa-3'）在GFP结束时编码EVIDVKHQ /）的NIB切割位点氨基酸序列。用于扩增全长GFP序列的引物WX123 / WX124和WX126 / WX127，用于MDMV OH5序列的引物WX125 / LRS764和WX128 / LRS765，并且LRS766 / LRS769用于放大PJL89向量（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。使用NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs, USA)将编码gfp的基因片段组装到pWX6中，并对随后的克隆进行传染性测试。GydF4y2Ba

在HCPro n端插入GFP (pWX68)GydF4y2Ba

采用NEBuilder HiFi Assembly Master Mix (New England Biolabs Inc.， USA)在MDMV OH5 P1和hcp pro编码序列之间插入NIb切割位点(nt 838/839)，添加12 nt 5 ' (5 ' -GCcGAtCCtacc-3 ')，编码氨基酸序列ADPT 5 '，和GFP末端的33 nt 3 ' (5 ' - GAgGTAATcGAcGTgAAgCAcCAAGCcGGcGag-3 ')编码氨基酸序列EVIDVKHQ/AGE，被NIa-Pro剪切。采用巢式引物WX36/WX37和WX63/WX64扩增GFP基因全长序列，采用引物WX247和WX250扩增具有MDMV序列的pJL89(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。将GFP基因片段组装到pWX6中，并对恢复的克隆进行侵染性检测。GydF4y2Ba

在HCPRO的N末端区域中创建三重基因插入（PWX56）GydF4y2Ba

具有在NIB和CP之间插入的GFP的传染性克隆PWX27用作P1和HCPRO之间的三重部分基因序列克隆的骨干载体。三种玉米基因，镁切酶（GydF4y2BaZM.GydF4y2BaChlI，GenBank登录号DQ084025，目标地区：946–1193），柠檬白1(GydF4y2BaZM.GydF4y2BaIspH，GenBank登录号NM001175829，靶区：740–988）和植物烯去饱和酶(GydF4y2BaZM.GydF4y2BaPD，Genbank登录号。L39266，目标区域：538-786）被选中以进行Vigs分析。总长度为747nt的每种基因的三重基因片段，249nt，被合成（Eurofins基因组学，USA），克隆到Pminit2.0载体中并通过测序验证。然后通过PCR用引物WX251和WX252通过PCR扩增Triple Vigs基因片段，并使用引物WX247和WX250扩增PWX27主链，使用Nebuilder Hifi组装主混合物（New England Biolabs Inc.，USA）在P1和hcpro创建pwx56。在Vigs插入开始时含有编码氨基酸序列ADP的氨基酸序列ADP的三倍Vigs DNA片段，和33nt 3'（5'- gaggtaatcgacgtgaagcaccaagccggcgGag-3'），编码nib在PWX27的NT 838/839之间，EVIDVKHQ / AGE的EVIDVKHQ / AGE的氨基酸序列。测试回收的克隆用于感染性，选择一种传染性克隆，PWX56，用于进一步分析。GydF4y2Ba

通过血管穿刺接种体外转录物的感染性测试GydF4y2Ba

使用含有5'T7启动子序列的引物，通过含有5'T7启动子序列，WX3（表S1）和反向引物MDMV GenR1的引物通过聚合酶链反应（PCR）通过聚合酶链反应（PCR）扩增所有全长病毒构建体。[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]互补至MDMV 3-末端序列的3'-最17nt，并向扩增子的病毒感测链中加入21nt的聚（a）。根据制造商的说明，使用从Takara Bio USA（山景，CA）的藻膏GXL DNA聚合酶进行PCR。GydF4y2Ba

体外RNA转录本使用T7 ARCA RNA转录试剂盒(New England Biolabs, USA)而不是之前报道MDMV OH1感染性克隆的转录试剂盒合成[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]用2号清洁 M氯化锂或Monarch RNA净化试剂盒（新英格兰生物实验室，美国）。通过NanoDrop（ThermoFisher Scientific，USA）估计转录物数量，并在非变性1%琼脂糖1X TBE（0.089）上评估质量 M三，0.089 M硼酸，0.002 M EDTA）凝胶）。采用维管穿刺接种法（VPI）对“银皇后”玉米种子进行了2.0%的接种试验 如前所述，每个种子有μg RNA转录本[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba］．接种种子在30℃下萌发两天，播种为灭菌的土壤，并在25℃，16小时光和8小时黑暗条件下在生长室中生长，光强度为13,000升。通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对来自个体植物的叶片对MDMV（WX111和WX112）的叶片的叶片进行逆转转录聚合酶链反应（RT-PCR）来测试。通过在葡萄萃取缓冲液中研磨样品1:20（g / ml）在每次点在每次点进行RT-PCR（GEB：0.05M碳酸钠缓冲液pH9.6,2％聚乙烯吡咯烷酮-40,0.2％牛血清白蛋白，0.05％Tween-20），然后将4μL稀释至50μl的样品在GES缓冲液（0.1M甘氨酸-NaOH pH 9.0,50mM NaCl，1mM EDTA，0.5％Triton X-10.0, and .01% beta-mercaptoethanol. One-step RT-PCR was performed with SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) and GoTaq polymerase (Promega Corp., Madison, WI) at 52 °C for 40 min. Followed by 2 min at 94 °C and 32 cycles of 94 °C for 15 s, 55 °C for 20 s, and 72 °C for 1 min, ending with a 7 min. 72 °C extension.

从转录感染材料中摩擦接种放大GydF4y2Ba

在用转录物接种VPI后，为了扩大结构体的感染，VPI感染的叶片在系统症状得到可靠确认（7–10 dpi）时尽早收获，以最大限度地收获病毒，同时最小化插入物可能丢失的复制周期，并以最快的速度储存− 80 3℃以下 0.5个月 g等分。冷冻组织被磨碎成5卷10份 毫米pH 7添加600目碳化硅（碳化硅）作为磨料的磷酸钾缓冲液。然后用拇指和食指将提取物涂在8到10天大的玉米植株的叶子上，用0.5%的水 冷冻组织为20株植物提供足够的接种量，导致感染率接近100%。植物有症状5-7 接种后天数。GydF4y2Ba

GFP表达的可视化研究GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白(GFP)在叶上表达GydF4y2BaZ五月GydF4y2Ba“银色女王”在7和21天后擦伤。使用荧光成像与夜司绿色的带通滤光片（Nightsea，USA）的荧光成像进行了用Leica DFC460C（Leica Microsystems，USA）相机拍摄的图像拍摄于3-S暴露，从玉米自发荧光分开绿色荧光。BrightField图像拍摄于1-S曝光。GydF4y2Ba

西方墨点法GydF4y2Ba

通过Western印迹评估GFP蛋白表达。通过RT-PCR用引物WX358和WX367测试阳性的植物组织在-80℃下保存，每个时间点为7,14和21天，后擦拭，后来用于蛋白质印迹。将在1ml放射免疫沉淀法测定（RIPA）缓冲液中被研磨的组织进行研磨，用一种片剂完整，迷你，无液蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Millipore-Sigma，USA）和每10mL缓冲液300μl1M二硫代噻唑（DTT）。将地面组织以16,000离心 GGydF4y2Ba在4°C下放置20分钟。上清液被转移到新的Eppendorf试管中，并放置在冰块上进行剩余的实验。总蛋白测定采用Pierce 660 nm protein Assay试剂盒和Pierce BCA protein标准品(ThermoFisher Scientific, USA)， 96孔板，每个样品3次。GydF4y2Ba

将等量的叶片上清液和2X Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad，美国）混合，煮沸3分钟 分钟后冷却。在25℃下将样品装载到4–20%迷你蛋白TGX无染色蛋白质凝胶（Bio-Rad，美国）上 μg每车道总蛋白质。重组GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaGFP蛋白（ABCAM，USA）以5ng装载为阳性对照。在Tris /甘氨酸/ SDS缓冲液（25mM Tris; pH 8.8,200mM甘氨酸，0.1％十二烷基硫酸乙酸钠）中电泳，在200V下电泳30分钟。在25V下使用Trans-Turbo硝酸纤维素转移包（Bio-rad，USA）纸上的反式涡轮涡轮转移系统将蛋白质在25V下进行7分钟。在TBS缓冲液（50mM Tris和150mM NaCl，pH7.5）中，在5％非脱脂干乳（NFDM）中封闭膜1小时。将膜在室温下在振荡器上孵育1小时，以1：3000抗GFP抗体（ABCAM，USA），1％TBS-T（TBS缓冲液，0.1％Tween-20）。在TBS-T中将膜洗涤10分钟3次。将膜与1：2500山羊抗兔IgG H＆L（Abcam，USA）温育1小时，然后在TBS-T中洗涤5分钟3次。使用ChemIdoc XRS系统（Bio-rad，USA）在ChemIdoc XRS系统（Bio-rad，USA）上通过化学发光可视化蛋白质。GydF4y2Ba

RT-PCR插入稳定性测定GydF4y2Ba

20种植物用野生型和用GFP插入用验证的VPI-植物SAP进行修饰的MDMV。从最小的完全出现的叶子接种后7,14和21天收集样品。通过使用上述相同的方法，通过RT-PCR筛选植物样品。跨越全GFP和GFP内部引物的引物用于upmV或下游GFP插入的MDMV OH5用于RT-PCR分析。在1％琼脂糖凝胶上电泳进行扩增的DNA。如上所述收集叶样品，并分析插入稳定性并使用半定量RT-PCR定量。GydF4y2Ba

利用MDMV OH5特异引物上游(WX317)或下游(WX315)和特异引物(WX321)分别鉴定了三个VIGS插入的单个靶基因GydF4y2BaZM.GydF4y2Bachli，wx325为GydF4y2BaZM.GydF4y2Ba对镁螯合酶、柠檬白1和植物烯去饱和酶(GydF4y2BaZM.GydF4y2BaChlI-IspH-PDS;中收取三倍)。观察光漂白症状并拍照，按照制造商的说明使用MC-100叶绿素浓度计测量叶绿素含量(Apogee Instruments, USA)。每一片叶子都做了三次测量。GydF4y2Ba

RT-qPCR定量基因沉默GydF4y2Ba

采集叶片样品7、14和21个 在rub接种后第天，如上所述提取总RNA并使用半定量RT-PCR或RT-qPCR进行定量。从每个样本中提取一微克总RNA，在20个细胞中合成cDNA 用iScript进行μl反应™ 反转录Supermix（Bio-Rad，美国）。用1 1/5、1/10、1/20、1/40和1/160稀释度的μl cDNA（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S6）。qPCR是在美国Bio-Rad公司的CFX96型实时C1000触摸式热循环仪上，采用先进的通用SYBR-Green-Supermix（Bio-Rad）在95℃条件下进行的 30°C s、 39岁 周期：95 °C持续10分钟 s和60 30°C s、 然后95 °C持续10分钟 s、 熔化曲线65 °C至95 °C，增量为0.5 摄氏度，5 S所有样本的cDNA稀释度为1:5，cDNA来源于10 ng总RNA。对目的基因进行基因定量分析GydF4y2BaZM.GydF4y2BaChli，GydF4y2BaZM.GydF4y2BaIspH,GydF4y2BaZM.GydF4y2BaPDS以及GFP，MDMV以及膜蛋白PB1A10.07C（MEP）和甲吡酰胺合酶（FPG）的参考基因[GydF4y2Ba61GydF4y2Ba］．用于RT-QPCR分析的引物显示在（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1，S6）。使用E = 10 ^ [ - 1 /斜率确定CT（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S6)。GydF4y2Ba

蚜虫传播试验GydF4y2Ba

通过GydF4y2Ba帕氏菱鲆GydF4y2Ba．GydF4y2Bar . padiGydF4y2Ba在无病毒的“早霞”玉米植株上维持，光照时间为15小时/ 9小时，温度为25°C。用体外RNA转录本VPI接种“银皇后”玉米植株。收集感染组织，保存在−80℃，用于摩擦接种。将VPI组织摩擦接种7日龄苗“早霞”制备病毒源植物，在20℃下保存，光周期15 h / 9 h，光照14 d。对MDMV症状较强的叶片(通常在植株第2叶顶端1/3处)喷洒10%的蔗糖，晾干后采集。然后将收集到的叶子切成小片(约1厘米)GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba）并放在一个小盒子里（约10厘米GydF4y2Ba^3.GydF4y2Ba)内衬湿纸巾，以保持水分。GydF4y2Bar . padiGydF4y2Ba然后在盒子里的源植物上取食10 min(获得访问期)，获得结束后，每株移入10只蚜虫，每处理共移入20株健康的“早秋”玉米轮毂。用塑料管覆盖3 d，然后用NUVAN prostrip (AMVAC化学公司，美国)去除蚜虫2 ~ 4 h。接种后第7天和第14天对感染症状进行评分，采用RT-PCR对VIGS和GFP插入引物WX368/WX357进行进一步鉴定。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

统计分析MDMV-OH5结构在7、14和21dpi时的插入稳定性。利用插入位点两侧的引物，用RT-PCR方法检测了pWX27、pWX68和pWX56构建体（每个构建体接种20株植物的三个复制体）插入序列的完整性。采用线性混合模型分析结构、时间及其相互作用对带型的影响。线性混合模型拟合反正弦平方根变换带数据的F统计量和概率值。数据在分析前进行反正弦平方根变换以稳定方差。由于数据是在同一个实验单元上作为时间重复测量收集的，因此在时间上是相关的，因此格列美脲中的随机残差陈述和类型选项用于解释和建模受试者内数据的协方差结构（复合对称性）。模型采用SAS的GLIMMIX程序进行拟合。GydF4y2Ba

将履行合理的请求，条件是书面材料转移和/或许可协议以及适当的APHIS许可证和遏制要求。请求应向相应的作者进行。克隆得到的强生草源多肽mv的全序列命名为MDMV OH5，并存入GenBank。MN615724。GydF4y2Ba

内容提供商：GydF4y2Ba

外壳蛋白GydF4y2Ba

cDNA：GydF4y2Ba

互补DNAGydF4y2Ba

GFP：GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

HCPro公司：GydF4y2Ba

辅助组分蛋白酶GydF4y2Ba

MDMV：GydF4y2Ba

玉米矮小马赛克病毒GydF4y2Ba

NIB-RDRP：GydF4y2Ba

核包涵b-RNA依赖的RNA聚合酶GydF4y2Ba

r . padiGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

帕氏菱鲆GydF4y2Ba

rt - pcr:GydF4y2Ba

逆转录 - 聚合酶链反应GydF4y2Ba

ZM.GydF4y2Bachli：GydF4y2Ba

玉米GydF4y2Ba镁螯合酶GydF4y2Ba

ZM.GydF4y2BaIspH:GydF4y2Ba

玉米GydF4y2Ba柠檬白1GydF4y2Ba

ZM.GydF4y2BaPD：GydF4y2Ba

玉米GydF4y2Ba八氢番茄红素desaturase (GydF4y2BaZM.GydF4y2Bachli-isph-pdsGydF4y2Ba

中收取:GydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默GydF4y2Ba

VPI:GydF4y2Ba

血管穿刺接种GydF4y2Ba

我们感谢美国农业部的简·托德和马克·琼斯对约翰逊草样本的实地采集，乔迪·利弗赛的技术援助，北卡罗来纳州立大学的蒂姆·西特博士对GFP克隆的帮助，以及已故的雷蒙德·路易博士对血管穿刺接种技术的建议。GydF4y2Ba

这项研究由美国国防高级研究计划局（DARPA）赞助，并根据合作协议HR0011-17-2-0054完成。在项目目标的框架内，实验设计、收集、分析、解释和写作完全由作者完成，而不是由资助实体完成。所表达的观点是作者的观点，不应被解释为代表美国政府的官方观点或政策。美国政府有权为政府目的复制和分发再版，尽管此处有任何版权标记。这项研究得到了美国农业部农业研究局的部分支持。本出版物中提及商品名称或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部的建议或认可。美国农业部是一个机会均等的提供者和雇主。GydF4y2Ba

作者指出GydF4y2Ba

1. 谢文双和迪·玛丽·马蒂对这项工作做出了同样的贡献。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 俄亥俄州州立大学植物病理系，哦，44691，USAGydF4y2Ba

   谢文双，徐俊欢，Nitika Khatri & Wanderson Bucker MoraesGydF4y2Ba

2. USDA-ARS玉米大豆和小麦质量研究单位，哦，哦，44691，美国GydF4y2Ba

   迪玛丽·马蒂、克里斯汀·威利和露西·R。斯图尔特GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

LRS领导项目设计、数据解释和手稿准备。WX设计了克隆策略并构建了病毒结构，NK测试了结构的传染性，并用NK进行了DM诱导的表达和稳定性分析。JX测试了蚜虫的遗传性。LRS、WX、DM和JX设计实验；WX、DM、JX、NK和KW执行工作，分析数据并协助撰写手稿。WBM进行了统计分析。所有作者都已阅读并批准了最后的手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba露西R。斯图尔特GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

从该地区的公共财产和私人土地所有者处采集了样本。尽管尽可能获得口头许可，但在采集时并未记录获得克隆的MDMV OH5分离物的土地所有权。收集符合国家指导方针，不限制在访问地点收集；材料的使用符合美国农业部APHIS批准的遏制措施。收集的材料不适用任何许可证。植物样品被用来破坏性地分离RNA和植物病毒，而不是标本室保存。GydF4y2Ba

出版许可GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

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