叶片伤害后全球大蒜基因表达及其含量的平行分析GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

大蒜GydF4y2Ba大蒜是一种重要的经济食物来源和药用植物，富含硫化物和其他保护物质，如大蒜素，大蒜素生物合成的前体。半胱氨酸、丝氨酸和硫是alliin生物合成的前体。然而，人们对非生物胁迫下大蒜素的含量及其合成机制知之甚少。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

结果表明，大蒜根中大蒜素含量最低，芽中大蒜素含量最高。损伤后成熟叶片中蒜氨酸水平降低。损伤后的转录组数据进一步揭示了成熟大蒜叶片中与半胱氨酸和丝氨酸生物合成途径相关的基因显著上调。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

研究结果表明，大蒜中蒜氨酸及其前体的半胱氨酸、丝氨酸和硫化物相关基因的差异表达是大蒜中蒜氨酸及其前体积累的基础，为进一步分析蒜氨酸的生物合成提供了基础。GydF4y2Ba

蒜GydF4y2Ba(大蒜L。GydF4y2Ba)，是一种二倍体(2n = 2x = 16)植物，是葱属植物中最重要的药用和经济成员之一，已被广泛栽培了5000多年[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．研究显示了来自强抗氧化潜力的许多生物学功能[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]，稳定血压[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，降低癌症风险[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba，心血管保护[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba，降低高脂血症[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]，根，鳞茎，叶子和豆芽都拥有重要的农艺性状。其中，由特征瓣形状的几个异常腋芽组成的灯泡是最经济上的重要性[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．大蒜的一个关键特征是产生富含硫的次生代谢物，如s-甲基- l-半胱氨酸亚砜(MCSO, methiin)， s-丙基- l-半胱氨酸亚砜(PCSO，丙氨酸)，s-反式-1-丙烯- l-半胱氨酸亚砜(PECSO, isoalliin)，以及最重要的s-烯丙基- l-半胱氨酸亚砜(ACSO, alliin) [GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．这些硫化合物也是味道前体，调节发育灯泡的风味和气味[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．大蒜素是从大蒜素中提取出来的另一种硫化合物，是大蒜中关键的生物活性分子[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba］．各种体内和体外研究表明大蒜素具有抗凋亡和抗氧化的潜力[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba］．然而，由于其快速分解成二烯丙基二硫化物和二氧化硫，AlliCIN在室温下也非常不稳定[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．大蒜素是由位于细胞质中的大蒜素通过大蒜酶[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]，位于液泡中。因此，当细胞被破坏或损坏时，就会释放蒜素酶，诱导蒜素转化为蒜素[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

Alliin是新鲜大蒜中最丰富的非蛋白质硫磺氨基酸，占其硫化合物的90％以上[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．稳定和无味的分子[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba， alliin具有重要的营养和药用价值[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]，表现出抗氧化剂[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba和消炎[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]活动，促进心血管功能[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]并对某些肠道疾病产生有益影响[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．Alliin在叶子中合成，然后转移到灯泡中[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba[在此过程中，根部吸收来自土壤的硫酸盐并将它们运送到叶子上。然后将这些硫酸盐用于在叶绿体中合成谷胱甘肽，然后通过血管系统转移到显影泡。储存在叶子中的Alliin也被运输到豆芽，保护它们免受微生物和草食动物的攻击[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

尽管蒜素在大蒜的商业潜力中具有重要意义，但蒜素生物合成的细节在很大程度上仍是未知的。根据放射性示踪剂实验和化学分析的结果[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]据认为，Alliin生物合成途径涉及半胱氨酸。简而言之，该途径涉及谷胱甘肽中半胱氨酸残基的S-Alk（Zh），然后除去甘氨酸以形成中间体γ-谷氨酰胺-SAlk（Zh）Yl-L-半胱氨酸。通过ASFMO1（ASFMO1是含有黄素的单氧基酶，在大蒜中，其负责Alliin生物合成中的S-氧化反应）催化得到Alliin。然而，其他人还支持丝氨酸 - 硫醇途径的参与：丝氨酸与乙酰辅酶粘接到生产GydF4y2BaO.GydF4y2Ba- 乙酰丝网，然后缀合GydF4y2BaO.GydF4y2Ba- 乙酰丝氨酸与烯丙基硫醇化合物GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- allylylysteine，最后，GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-烯丙基半胱氨酸的ACSO氧化。γ-丝氨酸乙酰转肽酶被认为催化第一步，而s -半胱氨酸乙酰转肽酶催化第2步，导致形成s -烯丙基半胱氨酸[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba］．因此，了解半胱氨酸和丝氨酸的生物合成途径在确定Alliin生物合成的途径方面是重要的。GydF4y2Ba

大蒜(2n = 2x = 16)有一个很大的基因组[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．据估计为15.9g和无菌品种，因此没有进行经典育种或遗传研究[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba］．因此，尽管其农艺重视，但大蒜仍然在很大程度上是令人不不染的，阻碍了其商业潜力。刘[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]的研究报告指出，大蒜在染色体水平上的基因组组装，使其成为世界上第一个大蒜物种GydF4y2Ba葱GydF4y2Ba属的属。根据这些测序结果，大蒜近期出现了转换元素的爆发。据认为在转换元件的爆破期间迅速地扩增了偶联酶基因和含量。这有助于解释含有含有含有含有含有联合蛋白生物合成相关基因的演变。还鉴定了四种GSH1-正交基因，一种GSH2 - 正非基因和一种PCS - 正交基因，表达在大蒜泡沫发育过程中上调。因此，这些基因是Alliin生物合成途径的潜在候选者。GydF4y2Ba

尽管基因组测序是一种有效的工具，但它既耗时又昂贵。相比之下，转录组分析具有高速，低成本和基因组复杂性的限制的优点[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba］．近年来，转录组学被用于不同性状的相关分析，帮助研究遗传关联，特别是在复杂的多倍体物种中[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]， 如GydF4y2Ba萨尔维亚米尔蒂希萨GydF4y2Ba[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]，GydF4y2BaPinellia Ternata.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba),而GydF4y2BaCicer Arietinum L.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba与此同时，Jun [GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]对大蒜鳞茎进行了转录组分析，并确定了22个具有复杂相互作用的候选转录本。Mitrova [GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]的转录组分析也揭示了大蒜素酶在整个生长周期中相应的遗传变化，同时报道了发芽期间两种特定酶的转录最高。此外,Einat [GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]对大蒜花和花粉进行转录组和蛋白质组分析，发现了影响雄性不育的潜在分子标记。刘[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]还对大蒜鳞茎重量、鳞茎直径和大蒜数量3个产量性状进行了关联作图，发现17个单核苷酸多态性(SNPs)显著相关。GydF4y2Ba

然而，尽管有上述研究，大蒜叶伤后蒜素生物合成的转录组分析尚未开展。在本研究中，我们对被认为参与蒜素伤后代谢的关键通路进行了转录组分析。研究结果为物理胁迫下大蒜素的生物合成机制提供了依据。GydF4y2Ba

测量同种异体含量GydF4y2Ba

为测定蒜瓣、内芽、根、芽中蒜素含量的差异，建立了茚三酮后柱衍生法。结果显示，大蒜鳞茎中大蒜素含量最高(1.474 mg.mlGydF4y2Ba^1,GydF4y2Ba而根的含量最低(0.019 mg.mlGydF4y2Ba^1,GydF4y2Badw）。GydF4y2Ba

为测定大蒜伤后叶片中蒜素的含量，将伤后不同时间点的大蒜叶片取样，采用相同的方法进行分析。每个时间点取样3个生物重复(T1/3、T4/6、T7/9、T10/12分别代表0、3、6、12 h的伤害处理)。如图所示。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC，在受伤的叶片中随着时间的推移，Alliin的含量降低。GydF4y2Ba

大蒜叶片伤后转录组分析GydF4y2Ba

大约，0.03%的原始读，包括低质量和短读，在适配器序列过滤后被删除，结果是T1/3的34,855,947个干净读，T4/6的30,830,543个，T7/9的29,001,419个和T10/12的34,278,922.33个(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．3个重复× 4个大蒜样品的Pearson相关系数表明测序数据具有较高的重复性(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa).同时，对照组与各治疗组之间的个体基因比较，发现基因之间的可靠性存在显著差异。GydF4y2Ba

所有读数都使用Trinity组装[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]，得到194,627个转录本(N50:1667)，平均长度为1157.22 bp(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab)， 94,144个unigenes (N50:1394)，平均长度933.08 bp。unigenes和转录本的大小分布如图所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab.总体来看，15.38%的reads长度为> 2000 bp, 28.78%的reads长度小于1000 bp。11.56%的转录本的最小读长为200 ~ 300bp，只有10.36%的ungenes长度为> 2000 bp，大多数在200 ~ 500bp之间。Swiss-Prot数据库共注释16882个unigenes, Nr数据库共鉴定26662个unigenes, Pfam数据库有19,206个与已知蛋白有显著相似性，KEGG数据库有9677个，KOG数据库有16,197个unigenes。GydF4y2Ba2GydF4y2BaC）。外阴物种注释的分布如图2所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba天。GydF4y2Ba

在大蒜叶样品中鉴定差异表达的unigenes（egs）GydF4y2Ba

将许多unigenes分为Kegg代谢和信号通路。S.ix KEGG pathways, ‘Protein processing in endoplasmic reticulum’, ‘Plant hormone signal transduction’, ‘Circadian rhythm-plant’, ‘Pentose and glucuronate interconversions’, ‘Photosynthesis - antenna proteins’ and ‘Photosynthesis’, were the most enriched (Fig.3.GydF4y2Bac;附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．与对照相比，Venn图也用于表示每种治疗中的差异表达基因的数量（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。通过这个标准（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)in the pathways. Accordingly, 1714 unigenes were found to be up-regulated and 1135 were down-regulated in T1/3 vs. T4/6, while in T1/3 vs.T10/12688 highly-expressed unigenes were up-regulated and 1375 were down-regulated (Fig.3.GydF4y2BaB;附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

这些途径（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bae），与T4 / 6相比，T1 / 3中的四种途径显着富集（P <0.05）。同时，与T7 / 9和T1 / 3相比，与T10 / 12相比，只有三种途径显着富集。为了预测可能的功能和陈述分类，还使用COG数据库进行比较了Unigenes。结果，与T4 / 6的T1 / 3中的12,375个序列分配到25个COG类别。通常只有一类功能预测。这里，一般官能预测（2191; 17.71％）代表最大的组，然后复制，重组和修复（1350; 10.91％）;转录（1099; 8.88％）和信号转导机制（909; 7.35％）。用于COG分类的其他样本在附加文件中详述GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

与Alliin生物合成途径相关的DegsGydF4y2Ba

alliin生物合成途径的详细步骤目前尚不清楚[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．然而，已经确定了一些相应的分子，包括其前体:谷胱甘肽、甘氨酸、丝氨酸[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]，半胱氨酸[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba硫磺[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]，其喂养一系列烃基化，烷基化和氧化反应（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad).在本研究中，转录组分析揭示了5个与alliin生物合成相关的GO术语:'硫化合物生物合成过程' (GO:0044272)， '硫氨基酸代谢过程' (GO:0000096)， '半胱氨酸生物合成过程' (GO:0019344)， ' l -丝氨酸生物合成过程' (GO:0006564)和'谷胱甘肽过氧化物酶活性' (GO:0004602)，为进一步分析蒜素生物合成相关基因在叶伤过程中的差异表达提供依据。损伤后，GO:0044272通路中的基因，如c119107。graph_c0 c132382。Graph_c0, significantly changed gradually over time. Moreover, genes encoding sulfur compounds (c49698.graph_c0, c86971.graph_c0, and c114534.graph_c0) were expressed at high levels. The most highly expressed were involved in cysteine biosynthesis: c107612.graph_c1 and c95022.graph_c0. To prove the significantly changed of these seven genes. We conducted qPCR experiments, and the results showed a positive correlation with the heat map.(Fig.4.GydF4y2Bab、c、f)。GydF4y2Ba

转录组族分析分析途径相关基因的差异GydF4y2Ba

根据转录组分析，八个与半胱氨酸相关的GO术语，' d -半胱氨酸分解代谢过程' (GO:0019447)， '半胱氨酸生物合成过程' (GO:0019344)， '半胱氨酸生物合成过程from serine ' (GO:0006535)， '半胱氨酸脱硫酶活性' (GO:0031071)， ' d -半胱氨酸脱硫酶活性' (GO:0019148)，鉴定了‘谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性’(GO:0004357)、‘肽基-半胱氨酸修饰’(GO: 0018198)和‘半胱氨酸代谢过程’(GO:0006534)。GO: T1/3与T4/6、T1/3与T7/9、T1/3与T10/12比较分别为0.00168、0.0013和0.00012，差异有统计学意义。同时，T1/3与T4/6、T1/3与T7/9、T1/3与T10/12的比较也有显著差异:0006535，分别为0.46558、0.45829和0.23682。T1/3、T4/6、T1/3、T7/9、T1/3、T10/12半胱氨酸相关基因差异见图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa和附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

据认为，Alliin合成途径涉及半胱氨酸途径，因此相关差异基因的上述差异。随着时间的推移在伤害后，半胱氨酸合成途径中不同基因的富集变得越来越重要，进一步证实了半胱氨酸在同种异体合成中的参与。我们还基于与半胱氨酸生物合成相关的差异基因的热图，进一步突出了样品之间的差异（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bag，附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

丝氨酸途径相关基因差异转录体分析GydF4y2Ba

丝氨酸也被认为在Alliin合成途径中发挥重要作用[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba］．Based on transcriptome analysis, seven serine-related GO terms were identified: ‘protein serine/threonine/tyrosine kinase activity’ (GO:0004712), ‘protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity’ (GO:0008138), ‘L-serine biosynthetic process’ (GO:0006564), ‘L-serine metabolic process’ (GO:0006563), ‘serine-type endopeptidase inhibitor activity’ (GO:0004867), ‘serine family amino acid biosynthetic process’ (GO:0009070), and ‘D-serine metabolic process’ (GO:0070178). Significant differences in GO:0008138 were observed in all comparisons (Fig.4.GydF4y2Bae)，而GO:0004712在T1/3 vs T4/6和T1/3 vs T7/9之间观察到显著差异。在GO中，T1/3与T4/6、T1/3与T7/9、T1/3与T10/12之间也观察到显著差异:0008138，分别为0.01758、0.01673和0.01689。相比之下，0.01939年和0.01911年，只有T1/3与T4/6、T1/3与T7/9之间的GO:0004712存在显著差异。T1/3、T4/6、T1/3、T7/9、T1/3、T10/12丝氨酸相关基因的差异见Additional fileGydF4y2Ba7.GydF4y2Ba．如上所述，我们还绘制了丝氨酸代谢相关基因的热图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bah;附加文件GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

硫相关差异基因的转录组分析GydF4y2Ba

在大蒜中，硫化合物是最重要的有机化合物。如前所述，它们包括蒜素，以及许多其他参与蒜素生物合成的硫化合物。通过转录组分析，鉴定出6个与硫相关的氧化石墨烯术语:' sulfate transmembrane transporter activity ' (GO:0015116)， ' sulfate transport ' (GO:0008272)， ' sulfur compound transport ' (GO:0072348)， ' ligase activity, formation carbon-sulfur bonds ' (GO:0016877)， ' sulfur compound transmembrane transporter activity ' (GO:1901682)， and ' sulfur compound metabolic process ' (GO:0006790)。T1/3与T4/6、T1/3与T7/9、T1/3与T10/12之间的GO:0015116差异显著，分别为0.13427、0.13008和0.03515。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad).相比之下，只有T1/3与T4/6、T1/3与T7/9分别在0.02281和0.02219处观察到GO:0016877的显著差异。硫相关基因T1/3、T4/6、T1/3、T7/9、T1/3和T10/12的差异见Additional fileGydF4y2Ba9.GydF4y2Ba．构建了硫相关基因的热图，如图所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bai和附加文件GydF4y2Ba10GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

鉴定Alliin中的转录因子（TF）家族GydF4y2Ba

许多转录因子被认为在alliin生物合成中起重要作用。本研究分析了47个主要TF家族的452个可能的TF编码基因。其中，40例入选BHLH家族，36例入选FAR1家族，36例入选NAC家族。为了筛选alliin生物合成的关键调控因子，我们选择了其中8个TF进行进一步分析(附加文件GydF4y2Ba11GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

大蒜素是大蒜中关键的亚砜，是大蒜素的前体，在蒜氨酸酶的作用下产生的。不同的组织和受伤的叶片含有不同种类的氨基酸，包括半胱氨酸、丝氨酸和蒜氨酸。然而，如图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC, alliin的含量在不同组织间存在显著差异，在根中含量最低，在内束和叶中含量最高，这与之前的研究结果一致[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．同时，伤口后叶片中的外素的含量随时间减少（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bac). Alliin在细胞质中合成，alliinase储存在液泡中。当大蒜的叶子被破坏，细胞被破坏时，蒜氨酸酶将蒜素转化为蒜素。损伤细胞中蒜氨酸含量降低。了解伤害胁迫后大蒜素前体生物合成相关基因的表达，有助于确定大蒜素的生物合成机制。GydF4y2Ba

在该研究中，在伤害后的不同时间点的比较中鉴定了大量的DEG（T1 / 3 Vs.T4 / 6，T1 / 3 Vs.T7 / 9和T1 / 3 Vs.T10 / 12）富集12个主要途径。C107612.Graph_C1，C95022.Graph_C0，C114534.Graph_co，C112358.Graph_co和C122199.Graph_co全部调节，而C119009.Graph_co和C129962.graph_co在伤口后下调，如图2所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab.此外，T1/3与T4/6之间的蛋白质加工差异显著，而T1/3与T7/9之间和T1/3与T10/12之间差异不显著。半胱氨酸是alliin生物合成的有效前体，在本研究中，通过比较T1/3与T4/6、T1/3与T7/9、T1/3与T10/12(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaB），富集了大量的“半胱氨酸生物合成过程”下的含量。这些发现表明在伤口后激活半胱氨酸合成。同时，“肽基半胱氨酸改性”也显示出变化，表明许多肽基团也参与了所有肽生物合成。基于上述研究结果，我们还创造了一种热图，以进一步突出相应的差异基因，为在此外，为半胱氨酸相关基因的作用提供基础。GydF4y2Ba

两个硫(GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]和丝氨酸[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]也是大蒜中大蒜素生物合成的前体。硫在葱属植物CSOs的合成中起着重要作用，是葱属植物风味的重要决定因素。此外，alliin本身是一种硫化物[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba］．在本研究中，伤后(T4/6、T7/9、T10/12)和未伤样本(T1/3)中‘硫化合物跨膜转运体活性’和‘硫酸酯跨膜转运体活性’途径的基因表达存在显著差异。这些发现表明，当细胞膜被破坏时，含硫化合物(包括alliin及其前体)的运输活性被激活。“蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性”和“蛋白酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性”途径的基因表达在伤后(T4/6、T7/9和T10/12)和未伤样本(T1/3)之间也有显著差异。激酶和磷酸酶催化两个相关的过程。磷酸酶在细胞应激反应中被激活，产生大量的游离羟基和游离离子，这些游离羟基和游离离子被激酶用来促进alliin及其前体的合成。GydF4y2Ba

Alliin Biosynthesis途径的细节仍然很大程度上是未知的;然而，已经鉴定了大蒜（半胱氨酸，丝氨酸和硫化物）中的所有素的前体。这些前体的代谢途径也是已知的，为Alliin生物合成的研究提供了基础。该研究揭示了在伤害后，在大蒜叶中患有半胱氨酸合成和代谢，丝氨酸合成，酶活性，丝氨酸合成和酶活性，丝氨酸合成和酶活性，硫磺形成和运输的差异表达。这些调查结果深入了解对与Alliin生物合成相关的基因的调节，并强调未来进一步分析的候选基因。GydF4y2Ba

植物材料和RNA提取GydF4y2Ba

大蒜样品被收集到中国普州市（缩写：PW），并在测试农场（江苏省）培养的面积超过100米GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba．用游标卡尺测量了表型相似的大蒜成熟期叶片的长度、宽度和厚度。分别于伤后0、3、6、12 h取样。同时采集大蒜根、蒜瓣、内芽和芽的样品(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa）然后立即在液氮中冷冻并在80℃下储存直至使用。根据制造商根据植物总RNA分离试剂盒（中国vazyme）提取总RNA。将DNase I（vazyme，中国）加入混合物中以防止DNA污染。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析纯化的RNA，并使用RNA 6000纳米Labchip试剂盒（Agilent，Santa Clara，Ca，USA）确认了总RNA的质量，具有RNA完整性数> 7.0。GydF4y2Ba

文库制备和转录组分析GydF4y2Ba

每个RNA分别在伤后0 h、3 h、6 h、12 h制备3 μg总RNA样品，3个生物重复。文库构建方法如下:Oligo (dT)磁珠富集真核表达rna。然后使用片段缓冲液(Biomarker, China)将mRNA随机片段化，并作为cDNA第一链合成的模板。然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I，再合成第二链cDNA。用AMPure XP beads (Biomarker, China)纯化cDNA，用纯化的双链cDNA进行修复，并添加A-tails连接测序珠。然后使用AMPure XP beads (Biomarker, China)选择片段大小，然后在PCR富集后构建cDNA文库。使用Qubit 2.0(Biomarker，中国)和Agilent 2100 (Agilent，美国)来确定文库浓度和插入大小。为保证文库质量，采用Q-PCR方法对有效浓度进行准确定量。然后使用HiSeq2500(Illumina, San Diego, USA)进行高通量测序，测序长度为PE125。然后对原始数据进行过滤，获得高质量的干净读取。 Trinity software [42.GydF4y2Ba用于组装在不同治疗组水平的遗传鉴定和表达分析中的清洁数据[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。原始序列数据已提交给ENA短读取存档，并使用Incession Number PrJeb33852。GydF4y2Ba

功能注释与分析GydF4y2Ba

采用NCBI BLAST搜索方法，将unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG和KEGG等数据库进行比对。KEGG Orthology注释使用KOBAS 2.0，使用HMMER和PFAM对注释信息进行序列比较。GydF4y2Ba

差异表达的Unigene（DEGS）分析GydF4y2Ba

领结 [GydF4y2Ba11GydF4y2Ba[将每个样品的测序读取与Unigene库的测序读取，然后使用RSEM估计表达水平[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]基于比较结果。相应的unigenes的丰富由FPKM值表示。这里，根据以下标准筛选DEGS：FDR <0.01和折叠变化（Fc）≥2。所有转录物的丰度值被标准化，然后使用多种观察者（4.9.0版）来构建基于热图在转换值上。在这些映射中，列表示不同的样本，行代表不同的基因。GydF4y2Ba

同源性分析和CDS预测GydF4y2Ba

利用TransDecoder软件将开放阅读框长度、对数似然函数值和氨基酸序列与pam数据库中的蛋白质结构域序列进行比较。预测的关键基因全长序列被认为参与alliin合成途径，然后用于比对。GydF4y2Ba

分析Alliin内容GydF4y2Ba

制备了大蒜根、鳞茎、鳞茎内、蒜苗和伤叶样品，用于大蒜素含量的测定。样品在液氮中研磨后加入4%磺基水杨酸和ddHGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba然后在25°C保存30分钟。12000 rap离心20 min，取上清液分析蒜氨酸含量。为确保数据的准确性，每个组织样本至少要获得3个重复。数值表示平均值±标准误差。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

本杰明尼河贝格方法用于纠正GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 值。然后使用调整后的p值来确定假发现率（FDR），差异表达基因的关键指标以及降低假阳性表达的重要方法。使用SPSS软件版本22.0进行所有统计分析。使用异常的单向分析（ANOVA）进行比较差异。GydF4y2Ba

在当前研究期间生成和分析的数据集可在ENA短读取存档中提供，其中包含登录号PRJEB33852。GydF4y2Ba

Sykam s - 433 d:GydF4y2Ba

氨基酸测量仪GydF4y2Ba

MCSO：GydF4y2Ba

S-methyl-L-cysteine亚砜GydF4y2Ba

PCSO:GydF4y2Ba

S-丙基-1-半胱氨酸硫氧化物GydF4y2Ba

ACSO：GydF4y2Ba

S-allyl-L-cysteine亚砜GydF4y2Ba

PECSO:GydF4y2Ba

S-Trans-1-丙烯基-L-L-半胱氨酸硫氧化物GydF4y2Ba

T1 / 3-T4 / 6：GydF4y2Ba

T01/02/03-T04/05/06GydF4y2Ba

T1 / 3-T7 / 9：GydF4y2Ba

T01/02/03-T07/08/09GydF4y2Ba

T1 / 3-T10 / 12：GydF4y2Ba

T01/02/03-T10/11/12GydF4y2Ba

NR:GydF4y2Ba

冗余蛋白质GydF4y2Ba

去：GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

齿轮:GydF4y2Ba

直际蛋白质群体GydF4y2Ba

Kog：GydF4y2Ba

真核生物的同源组GydF4y2Ba

Kegg：GydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书GydF4y2Ba

cys：GydF4y2Ba

半胱氨酸GydF4y2Ba

系列：GydF4y2Ba

丝氨酸GydF4y2Ba

PW:GydF4y2Ba

邳州市白色大蒜GydF4y2Ba

感谢蔡润(上海交通大学)和朱立黄(中国科学院遗传与发育生物学研究所)的技术支持、审稿和建议。GydF4y2Ba

本研究由国家自然科学基金(31672148,31770613)、江苏师范大学江苏省优秀青年后备人才基金(HB2016016)、江苏省大学生创新训练计划(SJKY19-2046)资助，苏北科技专项(XZ-SZ201839);徐州市科技计划项目(KC20040)。GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. 杨旭勤和苏毅仁对这一工作的贡献相当。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 2 .江苏师范大学生命科学学院江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州221116GydF4y2Ba

   徐琴杨，伊仁苏，嘉营吴，温湾，小莹曹，君娟王，钟章和金红江GydF4y2Ba

2. 2 .徐州诺特化工有限公司，江苏徐州221137GydF4y2Ba

   陈慧建，王友志，马德良GydF4y2Ba

3. 爱丁堡大学生物科学学院分子植物科学研究所，爱丁堡，EH9 3JH，英国GydF4y2Ba

   G. J. Loake.GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

JJ和GJ参与了这项研究的设计和起草稿件;YQ，YS，JW和WW参与数据采集和分析，稿件修订;HC，XC，JW，ZZ，YW和DM参与了数据分析和注释，以及稿件修订。所有作者均阅读并批准了稿件的最终草案，并同意出版。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba江江GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用线中另有说明。如果材料没有包含在文章的创作共用许可证中，而您的预期使用不被法律法规允许或超过允许的使用，您将需要直接获得版权持有人的许可。如欲浏览本许可证的副本，请浏览GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．“创作共用公共领域”豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba