超氧化物歧化酶(SOD)作为干旱胁迫下小黑麦籽粒产量的选择标准:基因组学和表达谱、生物信息学、遗传力和表型变异的综合研究

背景

本研究的主要目的是寻找酶抗氧化剂活性与小黑麦籽粒产量之间可能的结构关联，并确定可能对这种关联有效的基因型变异。因此，通过测定超氧化物歧化酶(SOD)同工酶(Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD)的表达水平来区分SOD表达与小黑麦抗旱性之间的可能关系。提出了一种基于测量特征的精英基因型鉴别方法。在此基础上，提出了一种基于sas语言(IML)的综合方差分析模型(线性混合模型)遗传参数估计方法，该方法可用于除现有研究外的其他领域研究。

方法

在6年的时间里(3个不同地点)，在正常和干旱胁迫条件下对30种小黑麦基因型进行了研究。据此，基于遗传变异、热图分析、双标图和聚类技术的结果，筛选出遗传距离最高的2个基因型，对3种SOD同工酶在茎和根器官中的差异表达谱进行了评价。

结果

田间试验和生物信息学结果表明，超氧化物歧化酶(SOD)是小黑麦抗旱性中影响最大的抗氧化剂;因此，它可作为早期区分抗旱基因型的间接选择指标。此外，Mn-SOD和Fe-SOD在干旱胁迫下的表达水平基本相似。但是，Cu/Zn-SOD在耐药基因型根和茎部的表达量高于敏感基因型。

结论

热图分析是首次用于筛选合适基因型的方法，结果表明，热图分析能够很好地识别出优秀基因型，并为筛选标准指出合适的特征。生物信息学结果表明，SOD比其他酶抗氧化剂更能作为转基因的筛选标准或候选基因。根据表达结果，Mn-SOD被认为是一种一般同工酶，可能在大多数物种中都有高表达，而Cu/Zn-SOD被认为是一种基因型特异性同工酶，可能在耐受性基因型中表达较多

人口增长对农产品的高需求促使研究人员应用和审查改变的程序和方法，以增加作物的产量和可采用率[56］．为了将不同植物种类的不同能力结合成一种独特的植物，人们做了许多努力。随后，100多年前，科学家们通过在小麦和小麦之间进行杂交，制造并释放了一个新的植物物种。小麦属植物sp。)和黑麦(Secale cereale)植物[10］．作为世界上最重要的粮食来源之一，小麦的目的是提高其抵御干旱等恶劣环境条件的能力。多倍体水平改变的黑麦和小麦之间的不同杂交导致不同类型的植物具有不同的特性，遗传自不同的基因组[53］．黑小麦(×Triticosecale Wittmack)是一个六倍体品种，由四倍体小麦(t .硬质Desf;2n = 28: AABB)，即硬粒小麦和二倍体黑麦(2n = 14: RR)。最终释放的小黑麦继承了其祖先的有利特征和特性，如与小麦植株相比具有更高的抗旱性和更高的植株产量[37］．

对干旱胁迫的抵抗是一个复杂的过程，涉及不同类型的生理和分子网络和反应，尚未得到适当的揭示和解决[40，57］．干旱胁迫与大多数其他环境胁迫相似，通过扰乱氧自由基产生和解毒之间的平衡，间接引起植物的氧化应激[7，11，48］．在这种情况下，植物的防御系统和抗胁迫机制被激活，诱导更多的氧自由基解毒[27，54］．因此，植物细胞中抗氧化剂的含量随着激活和/或增强相关基因的表达谱而增加[26，47，50］．超氧化物歧化酶(SOD)是一种基因家族，其酶产物能使超氧化物自由基(O₂⁻)在不同植物的细胞器中[17，23］．根据众多科学报道，SOD家族包含三个主要成员，即镁-SOD (Mn-SOD)、铜/锌-SOD (Cu/Zn-SOD)和铁-SOD (Fe-SOD)。许多研究证实，在不同的植物种类中，每种SOD同工酶在不同的环境和胁迫下的表达率都会发生改变[3.，20.，48]甚至物种内不同的基因型[12，17，54］．因此，深入研究SOD在其响应通路中的活性表达机制以及相关调控元件的鉴定，将为理解和认识植物的抗性机制提供新的思路。此外，发现干旱胁迫条件下SOD表达率与植物生产力之间的真正联系将有助于育种人员更简单地识别抗性基因型，并提高育种计划的效率[34］．

本研究的主要目的是通过先进、新颖的统计方法，寻找小黑麦酶抗氧化剂活性与籽粒产量之间的结构关联，并确定在正常灌溉和干旱胁迫条件下，小黑麦不同优良基因型间SOD活性的基因型变异性。并对酶促抗氧化剂SOD、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血过氧化物酶(APX)进行启动子分析，评价这些抗氧化剂调控网络的变化，以确定这些途径中的关键调控元件。此外，还选取遗传距离最高、相似度最低的小黑麦基因型，检测SOD同工酶(Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD)表达率的差异，探讨其表达率与小黑麦植株抗旱性之间的关系。将在干旱胁迫条件下仍能保持高产的小黑麦耐旱基因型作为候选基因型引种，作为新的优良品种。

方差分析和遗传变异

实地研究的前三年在一个地点(设拉子)进行，第四年在另一个地点(扎尔甘)进行，最后两年在一个单独的地点(萨南达杰)进行;因此，在组合方差分析中，作为方差来源的位置效应实际上嵌套在年份效应中，无法将这两种效应分开。随后考虑年份的影响，作为年份和地点的代表，同时考虑各年内条件(胁迫)、正常灌溉或干旱胁迫条件的影响，以及最终ANOVA模型中基因型的影响作为主要变异来源(表1)3.)．年份的影响有统计学意义(p小黑麦中H₂O₂、MDH、叶绿素、类胡萝卜素、蛋白质、脯氨酸、POD、CAT、APX、GR、SOD和籽粒产量，反映了这些特征在不同年份和地点的总体差异。同样，在正常灌溉和干旱胁迫条件下，表中的所有特征都存在显著差异3.．而胁迫×年互作对叶绿素含量、蛋白质含量、POD和APX活性无显著影响。除脯氨酸含量外，基因型的主效应以及年份×基因型、胁迫×基因型和胁迫×年份×基因型的互作效应对所有其他测量特征均具有统计学意义(补充表)3.)．

以年份和基因型为随机效应，分别计算每种胁迫条件下ANOVA混合模型中各变异源的期望值，估计遗传参数1)．因此，从数据中提取环境、基因型和表型方差，并转化为标准指标，即遗传力、表型变异系数(PCV)和基因型变异系数(GCV)。在正常灌溉和干旱胁迫条件下，类胡萝卜素含量(62%)和超氧化物歧化酶活性(61%)遗传率最高。蛋白质含量在正常灌溉和干旱胁迫条件下遗传率最低，分别为6.81%和4.15%。在正常灌溉条件下，脯氨酸含量的PCV最高(70%)，GR活性的GCV最高(26.6%)。另一方面，H的PCV(7.5%)和GCV(1.6%)最低₂O₂在正常灌溉条件下。MDH和CAT活性是干旱胁迫下PCV最低(33.6%)的特征。干旱胁迫条件下，APX活性的PCV百分比最高。干旱胁迫下SOD活性最高(46.4%)，蛋白质含量最低(2.19%)。

由于干旱胁迫条件下的遗传力和遗传变异性最高，因此SOD活性是本研究最重要的变量，所有小黑麦基因型的平均值以及所有6年试验的籽粒产量在每种胁迫条件下的标准误差均翻了一番，见表2．基因型21 (849.5 g/m²)和17 (625.1 g/m²基因型19 (380.6 g/m)²)和7 (257 g/m²)在干旱胁迫条件下产量最高，产量最低。基因3型在正常灌溉条件下产量高于平均水平，而在胁迫条件下产量低于平均水平;而在正常和胁迫条件下，基因型28的籽粒产量均高于平均值。基因型28在正常灌溉(17.5 u/mg蛋白)和干旱胁迫(49.9 u/mg蛋白)条件下均表现出最高的SOD活性。在正常和应激条件下，基因型1 (4.4 u/mg蛋白)和基因型3 (16.4 u/mg蛋白)的SOD活性最低(表2)2)．

特征选择和启动子分析

为研究生化特征对小黑麦基因型籽粒产量的影响，找出影响最大的生化特征，对正常灌溉条件和干旱胁迫条件进行逐步回归分析(表1)3.)．结果表明，在正常灌溉条件下，总蛋白质含量是影响籽粒产量的唯一特征。模型决定系数r-平方达到89%，表明总蛋白含量对粮食产量的影响较大。在正常灌溉条件下，蛋白质含量的回归系数为负(b =−27.79)，表明该特征对籽粒产量的影响逐渐减小。另一方面，干旱胁迫条件逐步回归模型选取游离脯氨酸含量、SOD活性和GR活性作为该条件下小黑麦籽粒产量的影响特征(表2)3.)．在干旱胁迫条件下特征选择的第一步，将SOD活性插入模型，表明该特征是对小黑麦籽粒产量影响最大的自变量。在此之后，将脯氨酸和GR活性分别作为第二和第三个影响变量插入逐步模型中。该回归分析的最终模型解释了干旱胁迫条件下粮食产量总变率的81%。

由于基于回归分析的特征选择方法在一定程度上偏向于依赖变量之间的相关性，即共线性，因此通过绘制热图对小黑麦基因型籽粒产量的影响特征进行了更深入的研究，显示了正常和胁迫条件下测量特征的聚类分析(图2)。1)．正常灌溉条件下(图;1A)，指出了三个特征聚类。随后，APX, H₂O₂SOD、MDH含量与产量属于同一类，而蛋白质含量与产量属于不同的一类。这一结果验证了特征选择和逐步模型的结果，蛋白质含量对籽粒产量呈负斜率关系。同样，在干旱胁迫条件下，SOD、MDH和APX与籽粒产量具有相同的聚类关系(图2)。1b).与此同时，GR和脯氨酸在胁迫条件下对籽粒产量均表现出负回归系数，归为同一聚类，与籽粒产量聚类明显分离。干旱胁迫条件下的热图分析结果证实了特征选择模型的结果，其中SOD对籽粒产量有正向影响。利用主成分分析(PCA)的前两个分量(PC1和PC2)进行双标图分析，同时找出测量特征与基因型之间的几何和结构关系。在正常灌溉条件下，PC1和PC2解释了所有特征之间大约64%的总变化(图2)。2a).二维(2D)图显示，正常情况下，APX, MDH, H .₂O₂SOD、POD和CAT与籽粒产量放在同一个四分之一，其余特征放在另一个四分之一。因此，正常灌溉条件下总蛋白含量箭头的角度最钝(最宽)，产量箭头表明该特征与其他变量呈负相关关系，再次验证了特征选择模型和热图分析的结果。在与正常灌溉条件相似的情况下，干旱胁迫下各特征间总变异的61%左右可以由PCA提取的PC1和PC2解释。但干旱胁迫条件下的测量特征分布明显大于正常灌溉条件下;特征分散在所有四分之一的双标图(图。2b).籽粒产量、MDH、SOD、APX均分布在双标图的同一四分之一，表明各变量间存在正相关关系。CAT、GR、脯氨酸含量为同一季度特征，与籽粒产量箭头直接相反，表明这些特征与产量呈负相关关系，再次验证了干旱胁迫条件下特征选择模型和热图分析的结果。

在本研究所考虑的酶促抗氧化剂中，SOD、POD、GR、CAT和POD均采用先进的统计学方法，均认为SOD是对籽粒产量影响最大的酶。然而，通过适当的统计方法所获得的结果被表型特性清楚地表明，因此，分子和基因型调查将使我们能够测试这些结果。因此，对本研究中使用的酶促抗氧化剂进行启动子分析，以寻找其调控机制的不同或相似模式，以解释和/或测试SOD在干旱胁迫条件下的实际影响。遗憾的是，目前还没有小黑麦基因组序列的生物信息学数据库，因此我们对与小黑麦具有相同AA和BB基因组的亲本小麦基因组进行了启动子分析的生物信息学研究。在酶促抗氧化剂的启动子区域中鉴定的调控元件及其相应的载体基因组集见表4．结果表明，酶促抗氧化基因最多分布在A和D基因组组。SOD基因的调控元件与其他抗氧化基因的调控元件存在显著差异。SOD基因启动子区域的大量调控元件与昼夜节律调节、脱落酸产生、生长素反应途径、MYB结合位点和茉莉酸甲酯反应基因有关，这些基因是植物胁迫反应的重要化合物[4]且主要分布在A染色体组。此外，赤霉素和光响应相关调控元件在SOD启动子区分布较多，特别是在A基因组组。SOD启动子区域的调控元件总数(1441)显著高于任何其他被认为的抗氧化剂(表4)．

基因型选择用于表达分析

根据遗传力、基因型变异性，采用先进的生物统计学方法和不同的多变量模型，结合生物信息学方法，阐明SOD是小黑麦在干旱胁迫下最有效的抗氧化剂。因此，在干旱胁迫条件下，SOD活性可以作为小黑麦增产的间接指标，用于小黑麦育种。因此，为了对参与SOD反应途径的基因进行差异表达分析，本研究对所有使用的小黑麦基因型进行了评估，以寻找遗传距离最高的基因型。因此，基于欧几里得距离法考虑30个小黑麦基因型对之间的相似性和距离，然后将它们转化为两个单独的聚类树状图，分别代表正常和胁迫条件(图2)。3.)．在正常灌溉条件下，可以区分出三个不同的簇。3.a).该聚类树状图显示，基于所有测量特征，基因型28和基因型1是遗传差异或距离最高的两个病例。然而，基因型2和3与基因型1归为同一聚类，是与基因型28(而不是基因型1)显示出最高遗传距离的两种备选基因型。在干旱胁迫下，基因型28和基因型3的遗传距离最高(图2)。3.b).与正常条件下的结果相似，干旱胁迫条件下，基因型1、2与基因型3处于同一聚类中。因此，基因型28的替代品可能是基因型17和基因型19，它们与基因型28在同一聚类中。因此，基因型1、2和3与基因型17、19和28相比，是在表达研究中可以考虑的遗传距离最高的基因型。从热图分析中得到的结果清楚地验证了这些结果(图。1)，其中基因型1、2和3对几乎所有测量特征显示出相似的颜色，而它们与基因型28、17和19显示出非常不同的颜色。1a和无花果。1b).此外，考虑这两种基因型组的热图颜色饱和度，发现它们在SOD酶活性方面表现出最大的不相似性。然而，我们不得不选择两个被提名的基因型作为差异表达研究的最高差异。这一要求引起了我们对SOD与粮食产量的双线图和均数比较的注意。双标图显示，在正常灌溉和干旱胁迫条件下，基因型28与SOD最接近，与籽粒产量相近。2a).相反，在正常和胁迫条件下，基因型1、2和3与SOD和籽粒产量的距离相似。作为寻找遗传变异性最高的最合适的基因型的最后选择，我们考虑了SOD和产量的平均比较(表1)4)．最后，根据两种胁迫条件下小黑麦基因型的平均比较结果，选择基因型28和基因型3用于SOD同工酶差异表达的研究。

SOD同工酶的差异表达分析

采用real-time PCR方法对两种基因型(基因型28和基因型3)进行了含Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD同工酶的相对表达分析。以基因型和诱导干旱后的时间跨度为实验因素，通过析因实验对SOD同工酶进行方差分析。基因型对Mn-SOD和Cu/Zn-SOD基因表达的主要影响在茎和根组织中均显著，但对这些组织中Fe-SOD基因表达的影响不显著(图2)。4)．根系组织中Mn-SOD和Cu/Zn-SOD不受时间主效应的影响，而根系组织中这两种同工酶与根系和茎部组织中的Fe-SOD同工酶对干旱胁迫后时间跨度的效应有显著的响应。除了Fe-SOD在茎和根组织中的表达率外，其他两种SOD同工酶对基因型×时间跨度的互作效应无显著响应(图2)。4)．

两种小黑麦基因型中Mn-SOD的相对表达量在干旱胁迫后较长时间内均呈上升趋势(图2)。4a). Mn-SOD在茎部的表达率高于根组织的表达率。基因型28在根和茎的Mn-SOD同工酶表达率均显著高于基因型3。Cu/Zn-SOD基因的表达率在两种小黑麦基因型的茎部和根部组织中表现出不同的模式(图2)。4b).在基因3型中，将时间从12 h延长到36 h, Cu/Zn-SOD在茎部的表达率增加，但在36 h和72 h之间无显著差异。与其他两个时间段相比，36 h在基因3的根组织中Cu/Zn-SOD的表达率最低。与此相反，在28基因型中，Cu/Zn-SOD同工酶在根和茎组织中的表达率随着干旱胁迫后较长时间的延长而呈增长(诱导)模式。在两个基因型的茎和根组织中，Fe-SOD的表达率随着时间的延长而降低，但基因型28的下降速度慢于其他基因型(图2)。4c).比较三种SOD基因同工酶在基因型上的表达率，基因型28中Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的表达率显著高于基因型3。而Fe-SOD的相对表达量在两种基因型间无显著差异。

值得注意的是，在胁迫诱导后的较长时间内，两种基因型茎和根组织中SOD活性的测定均呈上升趋势。也就是说，干旱胁迫持续时间越长，SOD酶活性越高。但基因型28的SOD活性明显高于基因型3。茎部组织SOD酶活性高于根部组织。

在本研究中，小黑麦籽粒产量及各生化性状均显著响应环境和基因型的影响，这是组合方差分析的主要变异源。这一结果说明了小黑麦基因型对环境变化的响应存在差异，暗示了引进高潜力基因型的筛选方案的熟练程度。因此，遗传参数的估计在不同条件下会发生变化。结果表明，小黑麦基因型在干旱胁迫下的遗传力、PCV和GCV均显著高于正常灌溉条件下的遗传力，表明该基因型在干旱胁迫下的筛选和育种方案更为有效。另一方面，本研究的主要目的是寻找耐干旱胁迫的高潜力基因型。因此，在正常和胁迫条件下都进行了评价，但如果这两种条件的结果之间存在冲突，如选择对产量有影响的特征或找到最高遗传特征，则干旱胁迫条件的结果优先于正常灌溉条件的结果。两种条件的遗传参数估计表明，SOD活性和GCV在干旱胁迫下遗传力最高，而在正常条件下遗传力较低。这些结果表明，该酶在缺水条件下小黑麦基因型中的重要性，因为GCV在基因型之间具有较高的变异性，具有较强的寻找合适基因型的筛选能力，而且其高遗传力表明，在后代中基于该特征的筛选效率较高，选择反应(RS)也高于其他特征。与遗传变异结果一致的是，热图分析清楚地显示，在干旱胁迫条件下，小黑麦基因型之间的颜色变异与SOD活性有关。此外，籽粒产量的遗传力和遗传变异性明显低于其他大部分生化性状，尤其是SOD活性。 Consequently, direct screening for grain yield would not confidently result in higher grain yield in the next generation of breeding program, but using an indirect selection criterion such as SOD for yield would be highly efficient, on condition that it shows a high collinearity and genetical association, either positive or negative, with grain yield. In concordance with heatmap results that showed similar color patterns and saturations for grain yield and SOD activity, and also the result of biplot in which SOD was the closest feature to the grain yield in drought stress condition, the results of the feature selection pointed out that SOD was the most influential feature, with positive impact, on grain yield of triticale. As a result, the capability of SOD for being used as an important indirect criterion for grain yield is verified by all used biometrical and biostatistical methods. To put it simply, genotypes that show higher SOD activity under drought stress condition probably have higher grain yield.

迄今为止，关于环境胁迫对小黑麦植株影响的研究较多，但很少关注生物化学特性对籽粒产量的影响及其作为间接指标的能力;据我们所知，目前还没有研究考虑小黑麦基因型生物化学特征的遗传力和遗传变异性。此外，目前还没有基于不同年份和地点的组合方差分析来估计遗传力和遗传变异性等遗传参数的相关程序或源代码;因此，在目前的研究(补充材料)中用于估计生物识别参数的SAS编程代码是第一个编写并实际用于这方面的程序。这段代码得到的结果被手工计算的结果成功地测试了，两个结果都是一致的，除了由于小数舍入不同而产生的一点差异。还需要指出的是，在本研究中应用热图和使用颜色饱和度来识别产量和生化特征之间的关系，以寻找可能的选择标准，这在以前的任何其他研究中都没有应用过。因此，我们的结果显示了热图分析在筛选和育种计划中的效率，也显示了特征、基因型之间的关系以及特征和基因型之间的交叉关系的组合。根据我们关于SOD活性重要性的研究结果，在Saed-Moucheshi的研究中建立了小黑麦生化特征与籽粒产量的关系[45]，未估算其遗传力和其他基因型参数，结果表明MDH、脯氨酸含量和SOD是影响小黑麦grin产量的重要性状。类似地，Riasat等人。43]认为SOD活性是获得高耐受性小黑麦基因型的最合适性状。此外，在生物化学特征作为选择标准的重要性方面，有几项针对不同作物的研究与我们的结果一致[1，33，44，54，58］．Saed-Moucheshi等人。[47]的结果表明，SOD、CAT和脯氨酸含量是影响大麦基因型籽粒产量的有效生化性状，并将这些性状作为可作为间接育种指标的候选特征。然而，在Vosough等人的研究中[58]， SOD不能作为影响小麦地方品种籽粒产量的重要特征。

遗传参数估计、特征选择、热图分析和双标图分析结果表明，SOD是干旱胁迫下小黑麦最重要的抗氧化剂。然而，这些结果是基于表型和基因作用的间接可能产物，并不能显示细胞内部的分子变化。因此，为了在基因组和分子水平上评价抗氧化基因，并揭示其调控机制中可能存在的相似或不相似模式，我们使用生物信息学工具对抗氧化基因的上游序列进行了评价。通过这种方法，一个基因的上游序列被评估，被称为启动子分析。启动子分析结果显示，SOD启动子区与其他抗氧化基因有明显差异。SOD启动子区调控元件数量显著高于其他抗氧化剂，大多是其他抗氧化剂调控元件的两倍。此外，SOD启动子区大部分调控元件是与胁迫反应通路相关的化合物。SOD启动子区大量的调控元件表明该基因可以通过多种响应途径进行调控，并且很可能比其他抗氧化剂对环境变化的反应更活跃。此外，该区域大量的胁迫相关元件表明该基因对胁迫条件具有高度的响应性，并可能随着胁迫条件的发生而显著增加。结果还显示，SOD基因启动子区存在大量MYB结合位点，显著高于其他抗氧化基因。 MYB elements are specifically acting in the responses to water shortage condition, verifying the importance of SOD under drought stress condition.

结合田间研究结果表明SOD在干旱胁迫下具有较高的遗传力和影响，以及启动子分析结果表明该基因具有较多的胁迫响应调控元件，明确了SOD对提高植物在干旱胁迫下的耐受性的重要性。SOD是氧自由基变性途径中的活性抗氧化酶之一。这种酶协调超氧自由基(O₂⁻)转化为过氧化氢(H₂O₂)在不同的细胞器中[20.，29，46］．由于超氧自由基在某些细胞器中最为丰富，如叶绿素细胞[16，25，28，42]，也可以说SOD是植物对抗氧化应激发生的第一个防御水平[48]，这与目前的研究结果一致，即大量的应激调节元件使SOD能够快速响应环境的变化。林等人。[32]报道，研究任何编码基因启动子区域内的调控元件是研究植物对不同环境的分子响应的重要策略之一。干旱胁迫在植物组织中发生后，植物开始根据胁迫类型产生一些信号成分，并引导它们向高响应基因伸出[41］．这些响应性基因再次产生一些其他的调控蛋白和化合物，并将它们转移到所需的基因上。这些信号蛋白和化合物被称为顺式作用调节元件[21］．此外，植物基因的大部分表达调控机制位于转录起始位点上游区域的1000个碱基对内[13］．因此，为了调节SOD基因的表达，必须在该基因的启动子区域存在大量顺式作用的调控元件，根据细胞内的变化来调节其表达。因此，启动子区域能够与调控基序结合的调控元件数量越多，相应基因对细胞内变化的敏感性就越高，如本研究中SOD启动子的情况。最近一项研究[24]对SOD基因在葡萄酒中的表达模式进行了研究，结果表明，SOD基因的调控机制在转录、转录后和翻译三个层面都有活性，其功能主要集中在植物发育过程中对胁迫的响应，这与我们的研究结果一致，表明SOD在环境胁迫条件下表达的高度重要性以及该途径中调控元件的作用。

生物计量学、生物统计学和生物信息学分析的总体结果表明，SOD是干旱胁迫条件下最重要的抗氧化剂。此外，结合最终的聚类、双线图和热图分析结果以及SOD活性和小黑麦籽粒产量的平均比较，选择了遗传距离最高的两种基因型，即基因28和基因3，以评估小黑麦SOD基因的顺从表达谱。从SOD酶活性来看，在两个基因型中，SOD酶活性在从干旱起始点开始的较长时间范围内均有升高，但基因型28的升高速度是基因型3的3倍多。与基因型3相比，基因型28 Mn-SOD的相对表达率约为3倍，Cu/Zn-SOD的相对表达率约为2倍。Fe-SOD的表达水平在两种基因型间无显著差异。这些结果表明，在干旱胁迫条件下，SOD酶活性较高可能是由于Mn-SOD和/或Cu/Zn-SOD同工酶表达水平较高，而Fe-SOD似乎不显著参与干旱胁迫的响应。此外，与Mn-SOD和Cu/Zn-SOD相反，Fe-SOD的表达模式随着干旱起始点时间的延长而降低。这一结果表明，Fe-SOD可能对非胁迫信号通路更敏感，干旱胁迫下Fe-SOD的表达水平降低，从而使其他两种SOD同工酶发挥作用，表达水平更快增长。此外，Mn-SOD与Cu/Zn-SOD的比较表明，在两种基因型中，Mn-SOD的表达水平随着时间的延长而持续升高;Cu/Zn-SOD随时间的变化而变化。 Therefore, these results are possibly pointing out that Mn-SOD is a general responsive isozyme that its expression level is, somewhat, quite independent of the genetic differences between the genotypes within a species, on the other hand, Cu/Zn-SOD is more dependent on genotypic differences between the two genotypes. In addition, the result related to the expression levels of Cu/Zn-SOD made us to announce it as a genotype specific isozyme, meaning that its expression level is highly correlated with the genetic contents and background of its carrier individual and is likely more expressed in the genotypes tolerant to drought stress. Furthermore, the expression level of Mn-SOD in shoot and root tissues was roughly equal. Contrarily, the expression rate of Cu/Zn-SOD in genotype 3 was higher in shoot than that in root, while its expression level in genotype 28 was significantly lower in shoot than that in the root tissue. The first organelles that are affected by drought stress are normally those in the shoot [15，35]，因此，这导致Mn-SOD在茎部的表达水平显著升高。干旱胁迫持续时间越长，根系受胁迫程度越高，根系细胞器受胁迫程度越高，根系组织中Cu/Zn-SOD同工酶表达量增加，主要表现在耐旱基因型中。相反，根系中Fe-SOD的表达水平持续高于茎部组织。这一结果增加了Fe-SOD同工酶参与非胁迫响应途径的可能性，因为如前所述，根细胞器受干旱胁迫负面影响的可能性小于茎细胞器。

据报道，SOD是在缺水条件下氧化应激下调节细胞内ROS水平和维持正常生理状态的关键酶[30.，36］．赵等人的研究结果。[61]的结果表明，SOD的表达水平与水稻中丙二醛含量呈显著相关，且对热胁迫敏感的水稻品种中SOD表达水平的活性远低于抗性品种。此外，与我们的结果一致，Mohammadi等人。[38结果表明，Cu/Zn-SOD在干旱胁迫下在普通豆科植物中显著表达，但在耐旱基因型中其诱导率显著高于易感基因型。与我们关于Cu/Zn-SOD作为一种更特异性同工酶的重要性的结果一致，其表达水平最有可能由其携带者个体的遗传内容改变，Xie等人。[60]的研究表明，Cu/Zn-SOD在应激条件下对SOD总活性和ROS解毒具有重要的调节作用。此外，通过基因转移机制调控植物叶绿体中Cu/Zn-SOD水平的尝试，导致目标基因表达改变的转基因植物。据报道，过度表达Cu/Zn-SOD基因可提高烟草转基因植物的抗逆性[55］．在这项研究中，转基因烟草植株的SOD活性比非转基因植株高约30倍。在Sheoran等人的研究中[51]，在干旱胁迫条件下，C306和KAW3717基因型的Mn-SOD基因表达显著增加;本研究Mn-SOD的表达率与较高的SOD总体酶活性之间具有显著的一致性，这与目前有关干旱胁迫条件下Mn-SOD较高表达水平的研究结果一致。因此，一些研究人员，如Awan等人。4Sheoran等人[51]和王等。[59]，提示Mn-SOD是一种在抗旱性应答中起重要作用的重要因子，然而，我们的结果表明Mn-SOD可能是一种一般应答同工酶，其对干旱胁迫的响应与其他胁迫条件相似(或相同)。

总体结果表明，由于在整个6年的研究中，使用基因型的差异很大，筛选有利和潜在的基因型作为小黑麦新品种的可能性很大。此外，利用SAS语言编写的编程代码，首次成功实现了基于组合方差分析结果的遗传参数估计。在干旱胁迫条件下，SOD活性的遗传参数具有较高的遗传力和遗传变异性。特征选择、热图分析和双标图分析结果表明，SOD对干旱胁迫下小黑麦产量有显著影响。在这方面，热图是基于不同颜色的饱和度，它显示了变量和案例(基因型)之间的关联以及它们的交叉关系，在本研究中首次成功使用，它被证明非常适合于筛选有利的基因型，并处理适合于育种计划中间接选择的特征。抗氧化酶启动子分析结果显示，SOD与其他抗氧化剂在启动子区可用基序和调控元件的数量和类型上存在显著差异。生物信息学研究表明，SOD启动子区大部分调控元件与胁迫响应途径有关，尤其是干旱胁迫作为MYB的结合位点。因此，选择两个遗传距离最高的基因型，考虑小黑麦基因型茎部和根部三种不同SOD基因同工酶的差异谱图。结果表明，耐药基因型(基因28)Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的表达水平显著高于敏感基因型(基因3)，而Fe-SOD的表达水平在两种基因型之间不显著。Mn-SOD在地上部的表达量高于根部，而Fe-SOD在根部的表达量则相反。 Whereas, the expression level of Cu/Zn-SOD in tolerant genotype was higher in root while its level in sensitive genotype was lower in root, in comparison with shoot. Finally, it could be stated that Mn-SOD is a general isozyme that responses positively to stress condition in probably most of the plant species with different genetic backgrounds, while, Cu/Zn-SOD is a genotype specific isozyme that is likely more expressed in some genetic content such as the tolerant genotype of triticale in the current study. Furthermore, genotype 28 can be introduced as a favorable genotype for being selected for further assessments regarding its potentials in drought stress condition.

本研究总体上包括三种不同类型的实践研究:第一类是考虑表型特征的田间实验，第二类是考虑小黑麦植物SOD同工酶表达水平的温室实验，第三类是抗氧化基因的生物信息学评价和启动子分析。

野外研究

本研究的现场研究部分包括12项独立的试验，在连续六个生长季节(2014年至2019年)在三个不同的地点:设拉子、扎尔汗和萨南达杰，采用两种不同的灌溉制度:正常灌溉和干旱胁迫。设拉子地区的田间试验于2014 - 2016年在伊朗法尔斯省设拉子市(52°46′E, 29°50′N，海拔1810 m)设拉子大学农学院研究站进行，扎尔汉地区的田间试验于2017年在伊朗法尔斯省扎尔汉市(52.7135°E, 29.7642°N，海拔1600 m)扎尔汉农业与自然资源研究教育中心研究站进行。2018年至2019年，在伊朗库尔德斯坦省农业与自然资源研究教育中心(47.8038°E35.1679°N，海拔1900 m)研究站进行了Sanandaj地点的田间试验。设拉子(Shiraz)、扎尔甘(Zarghan)和萨南达吉(Sanandaj)地区的气候条件分别为温和到温暖(干燥)、温暖到炎热(干燥)和温和到凉爽(潮湿)，这为研究提供了高度的环境条件变动性。相应年份的平均降水量为2014年(设拉子)187毫米，2015年143毫米，2016年240毫米，2017年145毫米(扎尔汗)，2018年495毫米(萨南达杰)，2019年515毫米。各试验现场土壤理化性质见补充表1．

每年都有28个来自国际CIMMYT中心的先进精英基因型和2个小黑麦商业品种(Sanabad和juanilo)(补充表)2)于11月中旬(10日至20日)分两次试验播种。每年，在同一地点的两个不同地点分别进行正常灌溉和干旱胁迫两种不同条件的试验。在所有试验中，灌溉计划都是根据消耗40%左右的有效土壤水分容量(SWC)来确定的。SWC为萎蔫点(WP)与场容量(FC)之差，由下式[19]:

SWC:土壤水分容量，FC:田间容量，WP:萎蔫点。

每年播种前一天准确测定土壤的WP和FC，计算土壤有效含水量。对于FC和WP的测量，采用Samarah等方法[49]，土壤样品在105°C烘箱干燥24 h前后称重。另外，为确定灌溉时间，每天采集5个固定实验单元0-40 cm深度的土壤样品，每次灌溉后第二天开始，转移到土壤科学实验室，定期测定SWC。干旱胁迫处理从抽穗期开始到收获期止灌。在所有试验中，小黑麦种子播种前均施用正常灌溉或干旱胁迫试验150 kg尿素和100 kg三联过磷酸肥。所有试验，包括正常灌溉试验和干旱胁迫试验(共12项试验)，均采用随机完全区组设计(RB)，每组重复3次。各试验小区(单元)为4行，行间20 cm，行长2 m(宽1 m ×长2 m)。在收获季节，每个地块中间的两行用于测量粮食产量。

温室的研究

在田间试验六年(2020年)的第二年，在设拉子大学农学院作物生产与植物育种系温室进行温室试验，选用基因型28和基因型3两种小黑麦，测定干旱胁迫条件下SOD同工酶(Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD)的相对表达率。小黑麦种子(每盆10粒)播种在含有250克土壤的塑料盆中。出苗后，每盆苗数减少至3株。在温室试验中，为了安排灌溉时间，播种前准确确定土壤的RWC和WP。塑料罐达到100% FC时的水分含量是通过称量罐子(罐子+ 250克土壤+ 100% FC的水分含量)来测量的。试验期间，每天随机称重8个花盆，测定土壤水分含量，当含水量达到80% FC时，再次灌溉至100% FC。在四叶期，让相应单元的含水量达到60% FC，施加缺水胁迫。在这一阶段，为了获得准确、精确的相对基因表达，实验单元分为两组:处理组为18个盆栽(2个基因型× 3个时间跨度× 3个生物重复)，用于缺水胁迫;对照组为6个盆栽(2个基因型× 3个时间跨度)，用于每个基因型在每个采样时间内的所有3个重复的对照。之所以这样划分，是因为在每个实验单元(花盆)中，对植物的嫩枝(最嫩的叶子)和根进行采样的方式具有破坏性。在施加缺水胁迫后12小时、36小时和72小时(FC含水量达到60%后)对胁迫植株进行采样。 Sampled tissues were frozen by liquid nitrogen immediately after their separation and transferred to the genetic lab and kept under 80 °C.

生物信息学研究

为了研究本研究中测定的抗氧化剂活性相关基因的启动子区域，即超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)的序列，我们从NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)．这些序列的登录号分别为APX的AF387739.1、Cat的X94352.1、GR的D85751.1、POD的AY857755.1和SOD的JX398977。之后，每个序列被上传到PlantEnsemble网站(https://plants.ensembl.org/index.html)，并对小麦的整个基因组进行了猛烈的攻击，以寻找任何显示超过10E-11相似分的序列(e值小于10-11)。然后下载PlantEnsemble位点每命中1000个上游碱基对作为上述基因的启动子区域。最后，每个下载的序列(启动子区域)在PlantCare数据库站点(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)，以区分任何可能的规管要素。为了进一步研究和更准确地区分调控元件，RSAT数据库(https://rsat.ulb.ac.be/rsat)用于同时在所有序列中搜索所有基因。然后将所有不同的监管元素导入excel文件进行进一步的调查和分析。

测量

在本研究的所有田间试验中(6年分2个胁迫水平)，在干旱胁迫诱导后25天，对旗叶进行生化和抗氧化相关特征的测定。旗叶立即用液氮冷冻，转移到温度低于80℃的冰箱中，直至特征测量。过氧化氢(H₂O₂) [2]，丙二醛(MDH)含量[22]，即叶绿素总量(TChl) [31]，游离脯氨酸[5]和总蛋白(Prtn) [8]含量，同时测定抗氧化酶，即谷胱甘肽还原酶(GR)的活性[52]，抗坏血过氧化物酶[39]，过氧化氢酶[14]，过氧化物酶[9]、超氧化物歧化酶(SOD) [6］．H的含量₂O₂叶绿素和蛋白质含量以毫克/克(mg/g) FW表示，脯氨酸含量以微摩尔/克(μmol/g) FW表示。酶抗氧化剂的活性被报道为在样品中总蛋白的mg中分解的自由基的微摩尔(u/mg Prt)。另外，在收获期，每块地中间两排的粮食产量按公斤/平方米(kg/m)进行收获期记录²)．

在各时间跨度对温室研究植物的幼叶进行取样，在干旱胁迫诱导后，测定SOD酶活性及SOD同工酶的相对表达量。从叶片样品中提取RNA使用Dena Zist分离试剂盒。提取后，用纳米滴法测定提取的RNA含量。RNA定量测定后，用DNase处理去除DNA污染，然后对每个样品中的RNA进行阳性和阴性质量控制(QC);积极的QC检查了3毫升提取样本的直接电泳凝胶(1%的0.5此种缓冲),观察两个独立和夏普乐队的凝胶代表每个16和24年代RNA样本,同时,消极的QC检查通过观察电泳凝胶上没有带后的聚合酶链反应(PCR)样品进行了使用内部控制的底漆(管家:延长因子1)基因是用于这项研究。然后，利用Fermentas Co.试剂盒将提取样品的RNA转化为互补DNA (cDNA)。利用RT-PCR方法测定SOD基因Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD三种同工酶的相对表达量。根据小麦基因组同工酶序列，在AlleleID软件中为每个同工酶设计相应的引物对。在此过程中，将伸长因子1 (EF1)作为内控(管家)基因。分别用正向(F)和反向(R)引物对Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、EF1进行表达分析:

为了完成相对表达量的测定，分别属于处理组和对照组的每个样品中同工酶和EF1的周期阈值(Ct)值(由StepOnePlus™系统自动计算)彼此相减，得到ΔCt值(ΔCt = Ct_草皮- - - - - - Ct_EF1）;处理集样本的ΔCt值与对照样本ΔCt值的比例(ΔΔCt = ΔCt)转换为相对表达式_泰爱泰党——ΔCt_ctrl)．

统计分析

对获得的现场实验相关数据进行组合方差分析(组合方差分析)和均值、标准误差等描述性统计量的分析。然后，利用正常灌溉和干旱胁迫试验的组合方差分析得到的均方(MS)分别估计残差(res)方差、块(blk)年(yr)方差、基因型(gn)年方差、基因型方差、环境方差、表型方差、广义(一般)遗传力、基因型变异系数(GCV)和表型变异系数(PCV)，计算公式如下[18，45］．基于LSD检验的平均比较(p= 0.05)，在SAS软件的PROC GLM中使用MEANS语句进行。

分别采用SAS统计软件9.4版中的proc. GLM和proc. MEANS进行方差分析和描述性统计分析。另一方面，由于没有相关的程序可以估计上述的生物识别和育种参数，所以由第一作者在SAS软件中编写了直接计算这些参数的代码，并在补充材料部分提供。此外，在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中，作为Excel (' xlsx ')格式的补充信息文件，其中包含正常和应激条件下的数据，分为两个单独的表格(' Normal_Irrigation '和' drought t_stress ')。

采用SAS软件中的proc. GLM，基于完全随机化设计的析因方差分析对表达数据进行分析。然后采用最小显著性差异(LSD)法进行表达数据的平均比较。使用Excel软件包绘制有关平均比较的图表，并评估与启动子分析相关的生物信息学数据。在正常灌溉和干旱胁迫条件下，采用逐步特征选择方法建立小黑麦基因型各年份的平均值。采用proc. REG在SAS软件中对逐步回归模型进行估计。在R统计软件(R 3.5)中使用“gplots”和“agricolae”(用于标准化数据)库进行热图，使用“factoextra”库进行主成分分析(PCA)的双线图，使用“Nbclust”库进行基于Ward法和欧氏距离的聚类分析。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章[及其补充信息文件]中。

SOD:

超氧化物歧化酶

猫:

催化

圆荚体:

过氧化物酶

格:

谷胱甘肽还原酶

APX型:

抗坏血过氧化物酶

过氧化氢:

过氧化氢

MDH:

丙二醛

TChl:

总叶绿素含量

汽车:

类胡萝卜素含量

Prtn:

总蛋白质含量

光杆载荷:

游离脯氨酸含量

收获率:

粮食产量

作者在此感谢设拉子大学、扎尔甘研究中心和库尔德斯坦大学为本研究提供所需材料的合作。作者还高度赞赏由M.P.博士所做的科学和语法编辑

设拉子大学资助了在设拉子进行的实地实验。库尔德斯坦大学资助了在库尔德斯坦进行的实验。所提供的资料及其他所需费用由AAM的学术拨款资助。

从属关系

1. 伊朗萨南达杰库尔德斯坦大学农学院园艺系

   Armin Saed-Moucheshi和Ali Akbar Mozafari

2. 伊朗克尔曼沙农业和自然资源研究与教育中心(AREEO)园艺和作物研究部

   阿明Saed-Moucheshi

3. 伊朗设拉子大学农学院植物生物技术系

   今天Sohrabi

4. 伊朗德黑兰Tarbiat Modares大学农学院植物病理学系

   Elham Fasihfar

5. 伊朗赞赞大学农学院园艺科学系

   今天Baniasadi

6. 伊朗设拉子法尔斯省农业与自然资源研究与教育中心自然资源厅

   Mehrnaz Riasat

7. 农业研究、教育和推广组织(AREEO)，伊朗德黑兰

   Mehrnaz Riasat

贡献

AS直接参与了该研究的所有试验(6年)。FS帮助在设拉子地区进行测量，并在库尔德斯坦大学进行生物信息学和表达分析。最后的数据分析和编写sas语言软件的编程代码由AS完成，EF和FB合作测试。EF和FB在生物信息学部分提供和收集数据。以MR管理为主的扎尔干位置试验也有助于扎尔干位置的测量和数据分析。AAM在Sanandaj地区进行实验，同时测量特征和撰写手稿。最终手稿的撰写由AS进行，AAM进行适当的编辑。所有作者都已阅读并批准了最终版本的手稿。

相应的作者

对应到阿明Saed-Moucheshi．

伦理批准并同意参与

作者同意本研究的任何伦理，并提及在这项工作中的任何合作。

发表同意书

所有作者都同意出版法。

相互竞争的利益

本研究不存在利益竞争或利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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