通过将硝酸盐还原在运输过程中通过将黄瓜幼苗对低温应力进行调整GydF4y2Ba

低温抑制不GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba净NH增加GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba米子，横向静脉和黄瓜幼苗射尖中的流出率GydF4y2Ba

Hessini等人。[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]的研究结果表明，黄瓜优先吸收NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-n而不是nhGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N作为正常环境条件下的复合N源。本研究结果证实在NT治疗下，NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-N是黄瓜幼苗使用的主要n形式。以前的研究表明，低温对NO吸收的影响GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-n和nh.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-n是不同的。根温会影响NO的动力学参数GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba吸收量大于NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在吸收GydF4y2BaCeratonia长角果GydF4y2Ba[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］.对于大麦，Q10温度系数没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba比NH高GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]. 低温下the NO_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba在吸收GydF4y2BaSecale cerealeGydF4y2Ba和GydF4y2Ba甘蓝型油菜GydF4y2Ba减少(GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba目前的研究结果表明，与26°C下生长的黄瓜幼苗相比，NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-n和nh.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba- 在低温下被黄瓜幼苗（8°C）吸收显着下降，特别是没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba），表明抑制低温没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba对氨氮的吸收大于对氨氮的吸收GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba吸收。这可能是因为吸收NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba能量依赖[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］.吸收和同化NO的能量需求GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba比NH高的几倍高GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］.随着低温应力的发生，叶片吸收和利用的能量显着下降[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］.因此，在LT处理下，NO的摄取GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba由于能量限制，根本受到严重抑制。GydF4y2Ba

运输没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba是由NO诱导的GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba本身并由光合作用促进[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]. 低温下the xylem sap transport in cucumber is reduced severely [39.GydF4y2Ba］.Laine等人[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]研究表明，低温降低了木质部N的运转，导致根系N的积累GydF4y2BaSecale cerealeGydF4y2Ba和GydF4y2Ba甘蓝型油菜GydF4y2Ba. 结果表明，低温不仅能抑制NO的吸收GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-n和nh.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N，但也抑制了他们向上的运输。抑制的程度GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba- 向上运输几乎与NH的运输几乎相同GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-n低温下。最近，Anwar等人。[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]报道低温降低了黄瓜幼苗根部的N含量，但不显著降低地上部的N含量。这种冲突可能是由于使用了不同的检测方法。全氮含量由Anwar等人检测[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]，而GydF4y2Ba^15.GydF4y2Ba本实验测定了氮浓度。GydF4y2Ba

网络没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2BaNMT检测到的通量速率表明，与NT处理相比，净NO的变化GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba/ NH.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在LT处理下茎和叶柄中的通量速率与叶静脉和枝尖的叶片不同。与网的变化相比GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba净NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba通过治疗增加了中间体，侧静脉和枝尖的助焊剂速率（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和GydF4y2Ba2GydF4y2Ba). 这一结果与细菌的吸收和分布不一致GydF4y2Ba^15.GydF4y2BaN-NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在叶片和茎尖(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）．我们选择了叶柄和中间剂作为靶组织，以研究低温对硝酸盐和铵转运基因的相对表达的影响。GydF4y2Ba

植物对硝酸盐的吸收受转录调控[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］.温度和营养浓度这两个环境因素显著影响营养转运基因的表达[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba］.然而，很少有研究检测过黄瓜N运输司机的功能[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba］.关于低温对黄瓜N转运蛋白基因表达影响的调控途径的报道很少。在硝酸盐转运体中，NRT1.1 (nfp6.3)被认为是一种双亲和硝酸盐转运体，参与硝酸盐的吸收和转运[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］.研究结果表明GydF4y2BaCsNRT1.1GydF4y2Ba可能不是参与黄瓜叶柄和中脉硝酸盐运输的显性基因。在拟南芥GydF4y2BaAtNRT1.8GydF4y2Ba与压力引起的没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba再分配(GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］.在LT处理下，相对表达GydF4y2BaCsNRT1.8GydF4y2Ba在叶柄和米德里布中上调。该响应可以允许增加硝酸盐到根部的硝酸盐，从而降低了叶柄和米子中的净离子通量速率。在拟南芥GydF4y2BaAtNRT1.4GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtNRT1.7GydF4y2Ba负责硝酸盐和叶片[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]. 我们鉴定了两个GydF4y2BaAtNRT1.4GydF4y2Ba在黄瓜,GydF4y2BaCsNRT1.4aGydF4y2Ba和GydF4y2BaCsNRT1.4bGydF4y2Ba．与NT治疗下的相比，表达GydF4y2BaCsNRT1.4aGydF4y2Ba在LT处理下的叶柄和米子下降下调，而表达GydF4y2BaCsNRT1.4bGydF4y2Ba上调。这些基因对低温相对表达水平的不同反应可以反映其不同的功能。GydF4y2BaCsNRT1.7GydF4y2Ba涉及NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba黄瓜的循环利用[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]. 低温下GydF4y2BaCsNRT1.7GydF4y2Ba叶柄和中脉中表达上调。这种反应可能会减少NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba在一定程度上向上运输到叶片。GydF4y2BaATCLCA.GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtCLCeGydF4y2Ba对于拟南芥的硝酸盐是硝酸盐的态度至关重要[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba］.在本实验中，相对表达水平GydF4y2BaCsCLCaGydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCLCeGydF4y2Ba在黄瓜幼苗的叶柄和中间细胞中由低温上调。该反应可能导致低温下耐水溶液中的硝酸盐储存增加。拟南芥的AMT1亚家族在NH的阶段起着重要作用GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba吸收[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］.MEP亚家族（GydF4y2BaAtAMT2型GydF4y2Ba)可能在NH的运输中起作用GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba从外质体到共质体[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba］.在本实验中，上调GydF4y2BaCsAMT1.2aGydF4y2Ba-GydF4y2Ba1.2C.GydF4y2Ba可能是造成高净NH的原因GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba低温下的通量率。GydF4y2Ba

低温下的较高比例的否GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba减少到nhGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在其在茎和叶柄的运输过程中GydF4y2Ba

在低温下，虽然NO的总量GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-n和nh.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N被黄瓜幼苗吸收并从根部运输到枝条下降，净NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba助焊剂速率在中间静脉，侧静脉和射尖上增加。为了阐明负责机制，研究了运输过程中N的形态变化。GydF4y2Ba

硝酸还原酶是硝酸盐还原的关键限速酶[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.在高等植物中，NR的活性在磷酸化和转录水平下调节[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]. 低温下那全国步枪协会GydF4y2Ba_{马克斯GydF4y2Ba}而NRA则相反GydF4y2Ba_{行为GydF4y2Ba}没有显着变化，这表明低温降低了酶蛋白的量，但对酶的表观活性没有显着影响（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）．因此，根中NR蛋白的量可能是多余的。全国步枪协会GydF4y2Ba_{行为GydF4y2Ba}和步枪协会GydF4y2Ba_{马克斯GydF4y2Ba}在茎和叶柄上显着增加，这表明酶蛋白质含量的变化与酶明显活性的变化一致，和NRAGydF4y2Ba_{行为GydF4y2Ba}在茎和叶柄中主要由转录水平的低温定义。与NT治疗下的人相比，NAGydF4y2Ba_{马克斯GydF4y2Ba}而NRA在低温下对中脉和叶片无明显影响GydF4y2Ba_{行为GydF4y2Ba}中骨和叶片明显下降。这表明低温对NRA的影响GydF4y2Ba_{行为GydF4y2Ba}在中脉和叶片可能主要通过蛋白质磷酸化。总的来说，低温对NRA没有影响GydF4y2Ba_{行为GydF4y2Ba}而NRA显著增加GydF4y2Ba_{行为GydF4y2Ba}在黄瓜幼苗的茎和叶柄中。这些变化可能是NO比例增加的原因GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba减少到NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在茎和叶柄的运输过程中。GydF4y2Ba

NR基因表达及NRA的qRT-PCR分析GydF4y2Ba_{马克斯GydF4y2Ba}分析表明了GydF4y2BaCsNR1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsNR3GydF4y2Ba可以是根和叶中的显性NR基因，分别是黄瓜幼苗（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一种，GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa，c）。GydF4y2Ba

NET NH增加的生物学意义GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在低温下剧烈生长组织的助熔剂GydF4y2Ba

在不合适的环境条件下植物转移到年轻组织和种子的营养物[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba］.这一过程是陆生植物进化过程中重要的适应策略。在本实验中，虽然NH的吸收和向上运输GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在低温条件下，净氨氮含量降低GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba中间体，横向静脉和射尖中的通量速率显着增加。这种响应可能是由于没有的转变GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba在运输。NO的比例较大GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba减少到nhGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在没有的向上运输过程中GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba在低温度。N个运输过程中的能量消耗相应地减少。该策略可以是在低温应激下对植物N运输到能量供应减少的调整。根据Han等人。[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]在低温胁迫下，没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-N番茄叶中的内容和NR活动显着下降，而NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N内容显着增加。在干旱压力下，NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba营养可以限制水缺损对渗透调节的影响，从而限制氧化损伤[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba］.因此，假设nhGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在预防应力诱导的过氧化作用，NH的增加GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba叶片和年轻组织中的内容不仅有利于利用N营养，而且还提高了植物的应力耐受性。GydF4y2Ba

黄瓜的主要态源是没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-n和nh.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N。与单一的没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-N源或单个NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N源，复合N源更有利于氮素吸收和植物生长[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba］.植物偏好没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba- n或NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N与物种相关，受环境条件和生长阶段的影响[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba60GydF4y2Ba]. 康德[GydF4y2Ba61GydF4y2Ba]考虑改善硝酸盐摄取和运输将增强植物生长，导致作物产量改善。在未来，通过提高NO的比例，进一步深入研究硝酸盐幼苗根系中的硝酸盐和铵转运和提高植物的N营养状态GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba- n, NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba要求在低温下使用-N。GydF4y2Ba

本研究结果为黄瓜幼苗降低NO的比例提供了证据GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba对NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在NO向上运移的过程中，NO的浓度升高GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba在低温度。这一作用可以减少氮转运对能量的依赖，使植物能够适应低温胁迫下能量供应的减少。相比之下,没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba，NH的吸收GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N和净NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba根毛区域中的通量率，血管束的原束，茎通过低温抑制较少（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）．在低温下，净NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba中脉维管束、侧脉维管束和茎尖的NO通量速率增加，与净NO的响应相反GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba流量。根据这些响应，在低温下，的相对表达GydF4y2BaCsNRT1.4aGydF4y2Ba在叶柄和中脉表达下调，而在GydF4y2BaCsAMT1.2aGydF4y2Ba-GydF4y2Ba1.2C.GydF4y2Ba在中脉是上调的。全国步枪协会GydF4y2Ba_{行为GydF4y2Ba}在茎和叶柄上显着增加，其在通过低温下在转录水平处主要受调节。鉴于黄瓜作为温室蔬菜作物的重要性，这项研究提高了对嗜热植物的低温耐受性的理解，并有助于改善温室嫩蔬菜的冬季培养技术。GydF4y2Ba

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

本研究的所有实验均在受控环境舱(Memmert ICH L260)中进行。黄瓜种子(GydF4y2BaCucumis sativusGydF4y2Ba‘鑫泰米奇’（中国蔬菜种子科技有限公司，北京，中国）在黑暗中孵化，直到28岁发芽 摄氏度。幼苗生长在蛭石-沙子混合物（1:2，v/v）中，并在26℃下供应半强度改良霍格兰营养液 摄氏度/17 °C（白天/晚上）[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba］.光合光子流密度、光周期和相对湿度(RH)均为350 μmol·mGydF4y2Ba^{- 2GydF4y2Ba}·S.GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}，12 h / 12 h（光/暗）和70-80％。当幼苗的子叶完全膨胀时，幼苗被含有4 mm Ca的全强度改性的Hoagland的营养溶液（pH6.0）供应（没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba）GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，5毫米的knoGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba，1毫米NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba不GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba，1毫米khGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba宝GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba2. mM MgSO公司GydF4y2Ba_4.GydF4y2Bah·7GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO, 40 μM EDTA-Fe, 4 μM HGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba博GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba， 2 μM MnSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Bah·4GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO, 2 μM ZnSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Bah·7GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO、 1个 μM铜GydF4y2Ba_4.GydF4y2Bah·5GydF4y2Ba_2GydF4y2Bao和0.5μm（nhGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba）GydF4y2Ba_6.GydF4y2Ba莫GydF4y2Ba_7.GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_24.GydF4y2Bah·4GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.当第二叶完全扩张时，幼苗用于以下实验。在本研究中进行的所有实验中，根据Lee等人将低温设定为8°C。[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

实验1：低温对NO净助焊剂的影响GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba黄瓜幼苗NR和NiR活性及基因表达GydF4y2Ba

将幼苗分为两组，分别置于常温（NT；26 °C）或低温（LT；8. °C）5分钟 H在处理过程中，光照强度和相对湿度与幼苗生长条件基本一致。处理后，采集幼苗进行生理和遗传分析。GydF4y2Ba

实验2:低温对NO吸收的影响GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-n和nh.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N在黄瓜幼苗中GydF4y2Ba

吸收的GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-n和nh.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba-N按照Garnett等人描述的方法进行测量[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba进行了一些修改。简单地说，将幼苗移栽到矩形水培容器中，并在分析前1天提供全强度改良Hoagland营养液。容器上装有气泡以确保足够的氧气供应。在取样日，植株被转移到补充了GydF4y2Ba^15.GydF4y2BaN-labeled没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba或NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba．处理方法如下:GydF4y2Ba

1. (1）GydF4y2Ba

   NT：26°CGydF4y2Ba^15.GydF4y2BaN-labeled没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba（GydF4y2Ba^15.GydF4y2Ban 25％）GydF4y2Ba

2. (2）GydF4y2Ba

   LT: 8°CGydF4y2Ba^15.GydF4y2BaN-labeled没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba（GydF4y2Ba^15.GydF4y2Ban 25％）GydF4y2Ba

3. （3)GydF4y2Ba

   NT：26°CGydF4y2Ba^15.GydF4y2BaN-labeled NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba（GydF4y2Ba^15.GydF4y2BaN 100%）GydF4y2Ba

4. （4）GydF4y2Ba

   LT: 8°CGydF4y2Ba^15.GydF4y2BaN-labeled NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba（GydF4y2Ba^15.GydF4y2BaN 100%）GydF4y2Ba

暴露5h后，取幼苗进行测定GydF4y2Ba^15.GydF4y2Ban不GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和GydF4y2Ba^5.GydF4y2BaN-NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba内容。GydF4y2Ba

净值的测量GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba通量GydF4y2Ba

网络没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba使用NMT系统（NMT100系列，Yesserala，LLC，Amherst，Ma，Ma，USA; Xuyue（北京）科技有限公司，北京，中国）和Imfluxes v2.0软件（年轻人，LLC）。这种方法遵循Lei等人。[GydF4y2Ba64GydF4y2Ba进行了一些修改。从顶点切除根样品约2cm。在图1所示的位置处采样初级根，茎，叶柄，米子，侧静脉和射尖。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba．一株幼苗只用了一次。样品用皮带固定。每个取样器官的横切面立即在测量液(1.625 mM Ca (NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba）GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba， 0.25 mM NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba不GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba， 0.1 mM MgSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba和0.3 mm mes;pH 6.0）以平衡15分钟，因为没有的快速和大的缺口GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba发生在样本切除后。在15min内，流量逐渐下降并趋于稳定。然后吸出溶液，注入新鲜的测量溶液。吸收的GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在根毛区域中测量（图。GydF4y2BaS1GydF4y2Ba那GydF4y2BaS2GydF4y2Ba）．没有运输GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在器官的横切面上测量。微传感器固定在维管束的中心（图。GydF4y2BaS2GydF4y2Ba那GydF4y2BaS3.GydF4y2Ba）．在整个实验中，将切除的部分在测量溶液中孵育。GydF4y2Ba

首先将预拉式硅硅微传感器(Φ4.5±0.5 μm, XY-CGQ-01, YoungerUSA)填入回填溶液(NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba: 10毫米知道GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba；NH.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba：100毫米NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba(Cl)到距离叶尖约1.0厘米的长度。微管前端填充50 ~ 80 μm选择性液体离子交换鸡尾酒柱(NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba:不GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2BaLix，XY-SJ-NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba；NH.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba：LIX，XY-SJ-NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba；年轻人）。将AG / AGCL线微传感器保持器（YG003-Y11，幼术）插入微传感器的背面，以与电解质溶液进行电接触。微传感器支架用作参考微传感器。在含有NO浓度不同的培养基之前和之后校准微传感器。GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba(没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba：5.0毫米和0.5毫米;NH.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba：0.5毫米和0.1毫米）。只有一个具有绝对值的内部值的微传感器> 50 mV十年GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}是使用。如果测试后校准失败，则丢弃数据。网络没有GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba使用JCal V3.3软件计算通量(免费的MS Excel电子表格;YoungerUSA LLC)。GydF4y2Ba

没有测量GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba-n和nh.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba- n吸收GydF4y2Ba

处理5 h后，将实验2幼苗的根用相同的、未标记的改良Hoagland营养液冲洗2 min。根的表面用吸水纸干燥。此外，还采集了根、茎、子叶、第一叶柄、第一叶片、第二叶柄、第二叶片和茎尖。所有样品在105°C下去叶，并在55°C下干燥至恒重。样品的鲜重、干重和含水量按照Oliviero等[GydF4y2Ba65GydF4y2Ba］.样品被磨成细粉。N和总GydF4y2Ba^15.GydF4y2BaN含量采用连续流同位素比质谱测量方法，使用vario PYRO立方体元素分析仪与isopprime 100同位素比质谱联用[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba］.在分析过程中，12个样品与一个实验室样品穿插进行校正。GydF4y2Ba

检测NR和NIR活动GydF4y2Ba

NR活性的测定GydF4y2Ba

使用Reda和Klobus描述的方法测量NR活性[GydF4y2Ba67GydF4y2Ba进行了一些修改。植物组织(鲜重1.0 g)用5 mL提取缓冲液在冷冻砂浆中研磨。将混合物均质，在15000℃离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba10分钟 4分钟 摄氏度。上清液用于在存在和/或不存在MgCl的情况下测量NR活性GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba按照Glaab和Kaiser的方法[GydF4y2Ba68GydF4y2Ba］.将反应介质在27℃温育10分钟，然后通过测量NO来记录NR活性GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba生产。GydF4y2Ba

近红外活性测定GydF4y2Ba

按照Liu等人描述的方法测量NiR活性[GydF4y2Ba69GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

存在分析GydF4y2Ba

标本切除液氮冷冻，−80℃保存，定量检测硝酸盐转运蛋白家族基因(GydF4y2BaCsNRT1.1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsNRT1.2a级GydF4y2Ba-GydF4y2BaCsNRT1.2c型GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsNRT1.3GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsNRT1.4aGydF4y2Ba-GydF4y2BaCsNRT1.4bGydF4y2Ba那GydF4y2BaCsNRT1.5aGydF4y2Ba-GydF4y2BaCsNRT1.5cGydF4y2Ba,GydF4y2BaCsNRT1.7GydF4y2Ba-GydF4y2BaCsNRT1.10GydF4y2Ba)，氯通道蛋白家族基因(GydF4y2BaCsCLCaGydF4y2Ba-GydF4y2BaCsCLCgGydF4y2Ba），缓慢阴离子通道相关同源物（GydF4y2BaCSSLAH1GydF4y2Ba-GydF4y2BaCSSLAH4.GydF4y2Ba），铵转运蛋白家族基因（GydF4y2BaCsAMT1.2aGydF4y2Ba-GydF4y2BaCsAMT1.2cGydF4y2Ba那GydF4y2BaCsAMT2GydF4y2Ba,GydF4y2BaCsAMT3.3GydF4y2Ba），NR家族基因（GydF4y2BaCsNR1GydF4y2Ba-GydF4y2BaCsNR3GydF4y2Ba)和一个NiR基因(GydF4y2BaCsNiRGydF4y2Ba）．GydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用RNAPREP纯植物套件（天根，北京）提取总RNA。通过分光光度测量测量RNA的浓度在λ= 260nm，并在琼脂糖凝胶上检查RNA完整性[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba］.在制造商的说明之后，使用快速的RT试剂盒（天根）合成第一链cDNA。通过QRT-PCR使用Hieff QPCR Sybr Green Master Mix（11203ES03，Yeasen）对ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems）进行分析cDNA [GydF4y2Ba71GydF4y2Ba］.成绩单GydF4y2Ba提示41.GydF4y2Ba（GydF4y2BaPP2A磷酸酶活化剂GydF4y2Ba；GW881871)对不同基因的cDNA样本进行标准化，因为其表达对低温不敏感[GydF4y2Ba72GydF4y2Ba］.使用Primer Premier 5软件设计了特定的引物[GydF4y2Ba73GydF4y2Ba和黄瓜基因组数据库[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]. 使用的寡核苷酸在附加文件中列出GydF4y2Ba1GydF4y2Ba（表S1）。GydF4y2Ba

数据分析GydF4y2Ba

进行双向差异（ANOVA），然后进行最低差异试验。鉴定了所有统计上显着的差异GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05。Graphpad Prism 5用于图形演示。GydF4y2Ba

在当前研究期间使用和分析的数据集可从合理的请求中获得相应的作者。GydF4y2Ba

NT:GydF4y2Ba

常温，26℃GydF4y2Ba

LT:GydF4y2Ba

低温，8℃GydF4y2Ba

NMT：GydF4y2Ba

非侵入性的微观检测技术GydF4y2Ba

NR:GydF4y2Ba

硝酸还原酶GydF4y2Ba

德尼尔：GydF4y2Ba

亚硝酸盐还原酶GydF4y2Ba

NRT编号：GydF4y2Ba

硝酸盐运输器GydF4y2Ba

AMT:GydF4y2Ba

铵转运蛋白GydF4y2Ba

议员:GydF4y2Ba

甲基铵渗透剂GydF4y2Ba

步枪协会:GydF4y2Ba

硝酸还原酶活性GydF4y2Ba

全国步枪协会GydF4y2Ba_{行为GydF4y2Ba}：GydF4y2Ba

实际硝酸还原酶活性GydF4y2Ba

全国步枪协会GydF4y2Ba_{马克斯GydF4y2Ba}：GydF4y2Ba

最大硝酸还原酶活性GydF4y2Ba

NRT1:GydF4y2Ba

硝酸盐运输器1家庭GydF4y2Ba

nrt2：GydF4y2Ba

硝酸盐转运体2家族GydF4y2Ba

CLC：GydF4y2Ba

氯化物通道家庭GydF4y2Ba

砰的一声：GydF4y2Ba

慢阴离子通道相关同源物GydF4y2Ba

我们感谢YoungerUSA徐悦(北京)生物功能研究所(中国北京)对NMT测试的支持。我们还要感谢来自Edanz编辑中国的Robert McKenzie博士GydF4y2Bawww.liwenbianji.cn/acGydF4y2Ba），编辑本手稿草稿的英文文本。GydF4y2Ba

中国（NSFC）（NSFC）的国家自然科学基金（31801909），中国（2018YFD0201207），中国近代农业技术研究系统的专用基金（Cars-25-C-01），中国农业科学院的科技创新计划（CAASastip-IVCAAS），以及中国农业部园艺作物生物学和种质创新的重点实验室。融资机构在研究中没有作用，在学习，分析，分析和解释中，以及写作稿件。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 2 .中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081GydF4y2Ba

   刘玉梅，孙敏涛，王军，苗丽，闫燕，何朝兴，于宪昌，李延苏GydF4y2Ba

2. 山东省菏泽大学农业与生物工程学院，山东274000GydF4y2Ba

   Yumei刘GydF4y2Ba

3. 山西农业大学园艺学院，Taigu，030801，山西GydF4y2Ba

   龙强白GydF4y2Ba

4. 2 .赣南师范大学生命科学学院，江西赣州341000GydF4y2Ba

   李淑珍GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

XCY、YSL和YML构思并设计了这项研究。YML完成了大部分实验。LQB, MTS, JW协助设计实验，并撰写和修改文章。YSL、YML、LQB和MTS对数据进行分析。YML起草了手稿。XCY和YSL对稿件进行了修改。所有作者阅读并批准最终稿件。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba仙昌玉GydF4y2Ba或GydF4y2Ba李延苏GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准并同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

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