非目标代谢组学揭示了差异Rh。翘曲在树冠下生长和开放栖息地的植物

背景

生（Rh。翘曲）是一家重要的中药植物，“Dahuang”，它含有生产性代谢物，并占据青藏高原的含水栖息地。占栖息地的植物通常在表型中变化，例如形态和新陈代谢，从而发展成不同的生态型。在树冠下，开放的栖息地是一对拥有的异种栖息地Rh。翘曲植物。然而，很少有研究集中在生境的影响Rh。翘曲生长，特别是形态学和代谢变化结合。这项研究侧重于Rh。翘曲利用非靶标的代谢方法量化了在树冠和开放栖息地下，植物生长的植物和开放的栖息地进行量化。

结果

结果表明，两种生境的差异导致Rh。翘曲形成两种不同的生态型，形态和代谢同时发生变化。在冠层生境下培育的形态较小Rh。翘曲31种植物中有22种含有较高水平的代谢物，其中包括5种类黄酮、4种异黄酮和3种蒽。另一方面，开放的生境在形态上更大Rh。翘曲植物具有较高水平的代谢物（31个中的9个），包括四种类黄酮。预计31种代谢物中的6种具有效应靶标，包括4个代表冠层栖息地和2个用于开放栖息地。完全连接了208个目标，其中42个是冠层和开放栖息地下的公共目标代表化合物，100和66分别是冠层优质化合物和开放栖息地优质化合物的独特靶标。此外，芦荟 - 大素，大黄素，氯氰酸丁醇，物理液，夏状甙A和夏状蛋白B都累积在冠层栖息地下，并且在其中Canopy栖息地下面的芦荟 - 大蛋白，大黄素，甲醇和物质显着高。

结论

这项研究确定了Rh。翘曲在树冠下和开放的栖息地生长为两种不同的生态型，具有形态学和代谢差异。网络药理学研究的结果表明，来自不同栖息地的“大杭”，如冠层和开放栖息地，效果目标不同，因此可能具有不同的药用用途。根据目标代谢组科，根据树冠栖息地可能会变得更好“Dahuang”。

生格言。ex balf（Rh。翘曲)属于聚糖科家庭(1，2]．以前的研究报道有许多次生代谢物感冒物种 [3.]．干根Rh。翘曲由于其强大的通便能力，已被列为许多国家的官方药典草药[4，5，6]．根据这一点中国药典(2015),Rh。翘曲，Rh。Palmatum.和Rh。药用都被归为“大黄”。“大黄”在长期的中药使用历史中被证明有多种作用，主要作用包括通便、清热、解毒、破瘀、解黄疸[4]．据报道，这三种物质含有100多种化学成分感冒物种 [7]．在中国，Rh。翘曲主要分布在青海，四川，甘肃省和地区西藏自治区以东，高度从2000米到4600米。研究表明质量Rh。翘曲不同地质来源之间变化[8，9]，它可以归因于海拔高度的环境变化[10.或其他气候和土壤因素[11.]．

据报道，研究在特定栖息地生长的植物在其表型表现中变化[12.，13.]，植物占据更广泛的栖息地，其表型具有更多变化[12.，14.]．例如，一项研究报告说，由于树叶和空气之间的温差，生长在大范围纬度地区的植物的叶子大小会发生变化[15.]．除了形态学之外，趋化型还可作为代谢组水平的植物表型的直接指示剂[16.]，它揭示了植物如何在复杂的生态环境中存活[17.]．植物代谢组学提供了一种强大的工具，用于观察植物的巨大化学品，它有助于了解化学物质[18.]．例如，一项研究报告了橙肉甘薯和白肉甘薯生态型的代谢差异，其中分别鉴定出148和126个代谢物为这两个生态型的特征化学型代谢物[19.]．类似地，五种化学类型ovinganum vulgare.(L.)采用代谢组学方法鉴定[20.]．此外，一些研究报告指出，不同生态类型的植物通常以不同的方式对环境变化作出反应[21.，22.，23.]．

在树冠上或开放栖息地下的种植植物对植物的形态和代谢表型具有显着影响[24.]．这可以归因于环境因素的变化，例如光条件[25.]及土壤状况[26.]．发现覆盖机栖息地下的葡萄园在其花序中具有较高的花滴百分比和较低的一些主要代谢物[27.]．先前的研究报告说，LMP-HPM的含量在不适应中Pteridium arachnoideum在阳光下生长的植物比在树冠下生长的植物的含量要高得多[28.]．一般来说，阳光是影响植物生长和发展的重要因素[29.]．光合作用因光可用性和光学组成的变化而变化，研究报告了在减少光线上生长的大豆植物的光合作用容量[30.]．先前的研究表明，Canopopy下的植物越来越多地导致浅色成分变化[29.]．光线变化会影响热带幼苗的许多生理和形态参数羊蹄甲属藤本植物［31.]和候选，生长和生物量Sacha Inchi.［32.]．另一项研究表明这些效果在物种中不同[33]．此外，在树冠栖息地和开放栖息地下植物的表型差异也可以通过土壤条件差异贡献[26.]．这是因为土壤氮含量如土壤条件[34，35]土壤湿度[36]影响植物生长的关键因素。此外，一些诸如湿和全有机化合物的物质有利于调整植物在遮篷遮阳下生长[37]．

一般来说，Rh。翘曲植物有广阔的生境，它们原产于一系列生境，包括树冠环境和开阔的土地，如草地[38，39栖息地的差异促使这个物种表现出不同的表型。在本研究中，两种生态型Rh。翘曲观察到种植的底盖内适应和开放式栖息地。底盖内适应的植物相对小，根部稀释。目前，很少有研究专注于栖息地对质量的影响Rh。翘曲以及树冠下的代谢变化和开放栖息地之间的代谢变化Rh。翘曲植物尚未阐明。

因此，本研究的目的是找出两种生态型之间的差异Rh。翘曲形态和非靶标代谢在哪Rh。翘曲从开放和冠层下的生境进行了探索。两种特定的生境被引入Rh。翘曲在栖息地生长的植物是从青海，四川和甘肃省收集的。这项研究的假设是两种不同的栖息地培育了两种生态型Rh。翘曲关于形态和嗜型。从两种特定的栖息地获得的结果可以导致研究人员询问阳光或土壤条件的影响，从而导致对次级代谢组学的潜在驱动因素，及其与观察到的形态变化的关系。

形态的差异Rh。翘曲植物生长在两种不同的栖息地

在植物高度，根长，根直径，叶片长度和叶片长度中发现了显着差异，但在叶片裂片百分比中未发现（图。1）.可见，HA(冠层生境)的植株和根系大小显著低于HB(开放生境)，表明生境对植物的生长有影响Rh。翘曲．但在叶裂率分析上，两种生境的叶裂率差异不显著。值得注意的是，叶裂片百分比通常用来表示不同的物种感冒家庭。

整体代谢分析Rh。翘曲使用UPLC-MS-MS的样品

30个根样本Rh。翘曲从青海，甘肃和四川省分发的两种不同栖息地收集的植物（表1）分析了。为每个栖息地选择三个地点，每位网站都挖掘了五种植物。然后将植物用于非靶标的代谢组科分析以研究代谢物差异Rh。翘曲从两种不同的栖息地获得的植物。2016年8月从一个地点收集植物，而另外两个地点是在2018年8月收集的，在树冠下，开放的栖息地在栖息地均可最小化储存时间的影响。此外，两个栖息地所选地点的平均相对高度没有显着差异，其中相对高度计算为高度+（纬度 - 30）* 111 [40]．使用UPLC-QTOF-MS进行广泛提取和分析代谢物^E在正极和负离子模式中。

正极和负扫描模式的总离子色谱图如图1所示.S1．分别以正和阴性模式检测了总共22,310和15,290个离子峰。当缺失的值与QC样品进行比较时，峰值分别减少到19,828和12,218峰值，然后使用最小值的一半填充原始数据的缺失值。通过根据精确的质量，MS / MS片段和同位素分布进行评分来鉴定代谢物，其中每个项目占20分。保留得分超过45（共60秒）的峰值。最后，410和302峰分别以正和阴性模式注释。

两种不同生境的主成分分析

进行多变量数据分析以分析代谢组科剖面Rh。翘曲采集自两种不同生境的植物。主成分分析(PCA)首次用于揭示样本的总体分类，其中使用7倍交叉验证来检验模型。第一个原则占品种总数的16.3%，第二个原则占品种总数的10.2%。QC样本在坐标原点附近聚为一个小集合，表明实验的准确性得到了保证。将HA和HB样本分为不同组(图1)。2）表明代谢物的显着差异Rh。翘曲从两种不同的栖息地获得的植物。

两种不同栖息地的HCA

进行分层聚类分析（HCA）以进一步确定代谢物的簇模式。所获得的HCA结果表明，将HA样品作为一个组聚集，同时将Hb样品与QC样品一起聚集，与其它组聚集（图。3.）.第二组QC样本聚为小集，与PCA结果相似。

两种不同生境的OPLS-DA

监督OPLS-DA方法用于最大化样品分离。所获得的OPL-DA结果表明，HA样品在X轴的左侧聚集，而HB样品被聚集在X轴的右侧部分（图。4a). 7倍交叉验证应用于R²问：²分别为0.761和 - 0.469（图。4b）表示模型中没有过度拟合。接下来是进行响应置换测试200次。获得的R.²完全三种化合物和q²分别为0.991和0.934，表明该模型能够解释样品的差异。

从OPLS-DA模型中提取VIP值p使用方差分析和学生t检验计算值，以进一步确定两种生境的关键代谢物。筛选出31个代谢产物，分别作为VIP > 4和VIP > 4时的不同代谢产物p使用值<0.05，其中在正离子模式下检测到其中13，而在负离子模式下检测18。

HA和HB代谢产物的热图

30样品的热爱介于31种代谢物（VIP> 4和p绘制值<0.05）以更好地概述两种不同栖息地之间代谢物的差异（图。5）.根据所有样品的颜色系列，同一栖息地内的样品共享类似的代谢物的内容物，其中九个代谢物在Hb下较高，而在HA的22代谢物较高时（图。5）.Hb的九个代谢物包括无碱酸3-o-（6-碘酰葡糖苷），7-α-（4-羟基氨基酰基）黄芪，1-羟基-3,7-二甲氧基吡啶，Epiafzelechin 3-O-gallate-（4beta- > 6)-epigallocatechin 3-O-gallate, 6″-p-Coumaroylprunin, Lindleyin, Isorhamnetin 3-O-[b-D-glucopyranosyl-(1- > 2)-a-L-rhamnopyranoside], Coumarin, and (−)-trans-3,4-Dihydro-4,8-dihydroxy-3-methyl-1H-2-benzopyran-1-one. On the other hand, the 22 metabolites higher at HA include Aloe-emodin, Sennoside B, (S)-2,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-2-oxo-3-indoleacetic acid 5-[glucosyl-(1- > 4)-b-D-glucoside], Persicogenin 3′-glucoside, (−)-Epigallocatechin, Floribundoside, 1-O-Galloyl-beta-D-glucose, Terniflorin, Quercitrin, 6-Cinnamoyl-1-galloylglucose, Isogenistein 7-glucoside, Di-2-furanylmethane, 3,4-Dihydro-2H-1-benzopyran-2-one, Myricatomentoside I, 6″-Malonylgenistin, 6″-O-Acetylgenistin, Genistein 4′-rhamnoside, (E)-2-Methyl-2-buten-1-ol O-beta-D-Glucopyranoside, Emodinanthranol, Coriandrone E, Methyl (Z,Z)-10-hydroxy-2,8-decadiene-4,6-diynoate, and Eugenitol.

形态的差异Rh。翘曲来自两栖栖息地

六种形态特征Rh。翘曲在这项研究中探讨了结果，结果显示，其中五种栖息地之间存在显着差异（图。1）.这些差异表明，两种异种栖息地之间存在两种生态型形态表达。植物生长在开放栖息地中较高，植物具有明显较大的叶子和更多根的根，而不是在树冠栖息地下。当考虑青藏高原的高海拔时，UV-B辐射显着提高。因此，这是Rh。翘曲植物可能已经形成了保护机制，如加强光合作用和水分利用效率，以保护它们免受UV-B和光的损害[41]．但在冠层下生境中，阳光被冠层植物过滤，UV-B光、蓝光、红光和红远红光比均降低[29.]．所有这些光线质量和数量的变化都可以放下光合作用。所以，Rh。翘曲冠层下生长的植物明显小于开放生境。这些结果与对大豆进行的一项研究的结果相一致，在该研究中，尽管光减少，但大豆的一般光合能力却降低了，导致大豆的光捕获能力提高[30.]．

此外，一项研究报告说，土壤性质受到土着栖息地的影响，这可能影响植物的生长和发展[26.]．得到的结果表明，土壤湿度，土壤总氮含量和土壤有机碳含量较高，在冠层栖息地下较高（图。3.），两种栖息地之间的土壤有机碳和土壤总氮含量的差异显着。在冠层栖息地下提供比公开栖息地更多的营养和潮湿的土壤，这有助于植物的耐受性[37，因此，扩大了生态位Rh。翘曲．

是否会的Rh。翘曲来自两个栖息地

样品可以基于PCA分成两组（图。2）和HCA（图。3.)，表明两种生态型之间的代谢差异。结果支持了我们的假设，即两种生境除了不同的形态外，还产生了两种不同的化学类型。生境诱导的化学型在植物中已被广泛报道。例如，在野生和野外生境中生长的西洋参在代谢方面有显著差异[42]．药物化合物Rh。翘曲已被广泛研究，因为它被用作药草。以前的研究表明，药物化合物与高度有关[10.],赛季[43，44，或一些环境因素[11.]．然而，各种研究之间几乎没有兼容性，表明单个因素可能不会归因于质量的变化Rh。翘曲，并提出了导致最大栖息地差异的环境因素，以便进一步研究大黄如何实现更好的质量。Rh。Palmatum.复杂，包括Rh。生Rh。palmatum, Rh。药用已经发现与少数其他物种一起与代谢物相关的地质起源有关[8，45揭示了青海省、甘肃省和四川省不同地质成因的不同化学类型。然而，虽然行政区域可以揭示相对大尺度的气候梯度，但不能揭示确切的生境影响，如冠下或开放。此外，形态学变异与化学型之间没有联系。在这项研究中，形态学和代谢物揭示了对栖息地变化的同时响应模式。我们之前的研究也揭示了冠层和草地生境中总蒽酮含量的差异[38]．

在这项研究中，冠层阴影归因于植物栖息地生长的植物的灯节变化[29.]．土壤湿度和营养素如土壤条件也有助于变化。天篷结构可以导致低UV-B辐射，低蓝色和红光，并将红色光线减少到远红光比。红色和蓝光被植物的植物的光合色素吸收[29.]．冠层下的草本植物已经进化出耐阴策略，例如减少自阴[46，增加叶的膨胀[47]，具体的叶面积和照相II：我的比率[48，49]．这是因为他们无法避免留下栖息地，因为它们无法超越木质植物。土壤湿度，土壤总氮含量和土壤有机碳含量也不同，在树冠栖息地下，土壤湿度外显着高出（图。3.）.这些结果也可能导致两种生态型之间的代谢差异[17.]．

显着改变了代谢物

滤出31种代谢物，因为使用VIP和vip和p价值观。结果表明，31种代谢物中的22个在冠层栖息地中更积累，而只有九个代谢物在开放栖息地中累积。次要代谢物数量明显增加，表明植物在压力环境中生长[50]．包括在树冠下和开放的栖息地生态型Rh。翘曲面临着不同的环境压力。具体地，大多数光通过上层覆盆子造成的顶层栖息地过滤，这与开放栖息地相比导致光合速率较低[29.[因此它可能是最紧张的因素。另一方面，土壤营养素或土壤湿度受到开放栖息地的限制（图S3.），因此它们可能是最紧张的因素。

在冠层生境下，22种代谢物积累较多，主要为黄酮类化合物、异黄酮和蒽类化合物。此外，包括4种黄酮类化合物在内的9种代谢产物在开放生境中含量较高。结果表明，黄酮类化合物是代谢产物中变化最大的一类。一些研究集中在叶子中的类黄酮上，因为它们含有吸收紫外线的化合物，可以保护叶子免受紫外线辐射的有害影响。51，52]．然而，不同类型的类黄酮可能具有不同的对光变化的反应，这可能归因于其不同的功能。全光诱导氯化叶片在茶叶植物上进行的研究中，其中具有邻二羟基化的B环的黄酮类化合物的增加，而总黄酮减少[53]．由于黄酮类化合物对紫外线的保护作用，一般以叶为研究对象。本研究结果表明，根中黄酮类化合物在冠层和开放生境下也存在差异，说明光照条件的变化也会影响根中黄酮类化合物的含量。在本研究中，冠层生境中较多的是结构相对简单的黄酮类化合物，如terniflorin、槲皮苷、floribundoside，而在开放生境中较多的是结构复杂的黄酮类化合物，如Isorhamnetin 3-O-[b-D-glucopyranosyl-(1- > 2)-a- l- rhamnopyranoside]、6″-p- coumaroylprunin、表没食子儿茶素3- o -没食子酸酯-(4 - > 6)冠层下生境表现为光质量和光量较低，土壤湿润，富含有机化合物。因此，黄酮类化合物也被认为与其他环境压力有关，如水、盐、氮缺乏和寒冷[54]．

在31种变化最大的代谢物中，芦荟大黄素被列入《中国药典》[4]作为用于判断“大旺”质量的主要医疗成分之一，夏状索德B也是一种常见的使用指数来获得质量。两种组分都在覆盖栖息地的内部累积，这表明在树冠栖息地下可能有利于促进药物质量Rh。翘曲．结果与先前的研究一致，据报道，芦荟大蛋白在树冠下或森林边缘栖息地下方[38]．此外，该结果与另一项研究一致，即在中光照条件下，番泻叶(sona品种)中番泻叶苷B含量较高[55]．然而，Senna（Alft Forminar）的其他品种在全阳光条件下具有最高的夏状内酯B含量，表明不同的物种甚至品种对代谢组科水平的环境变化具有明显的反应。此外，已发现Quercitrin具有生物活性，例如抗氧化剂，抗炎和增强骨盆[56]．它累积了更多的树冠栖息地，并且还在种子中鉴定和量化Rh。Palmatum.［57.]．但是，林德林[58.Coumarin [59.]，在开阔生境中积累较多，已从大黄中鉴定，并被证实有保护神经、抗氧化或抗炎作用，并有少量药理作用[58.，60.，61.]．冠层下与开放生境代谢产物的差异可能揭示了不同生境下“大黄”的药用效果存在差异。

目标代谢分析Rh。翘曲

作为一个重要的医疗药草，一些组分已被发现以不同的药理作用，以及一些化合物，例如芦荟 - 大素，莱茵，大黄素，汉霉素，物理，夏状A和塞内纳苷B是常用于“Dahuang”的质量。［4，5]．为评价药用价值的差异，采用靶向代谢分析对上述7种化合物的含量进行定量分析(图1)。6）.结果表明，除了莱茵之外，6种有效化合物全部累积在冠层栖息地植物下（图。6）.芦荟 - 大黄素，大黄素，甲醇和物理含量明显高于覆盖型栖息地植物，而且，显着的Anthraqunones的总和累积了更多的栖息地植物植物。夏状透明剂A，塞内西亚州B和晨索的总和在冠层栖息地下较高，而差异则不显着。Rhein在开放栖息地显着高。这些结果与非靶标代谢物结果一致（图。5）.结果表明，在树冠栖息地下面有益Rh。翘曲积累更有效的化合物。在中医中，四川的“大杭”质量良好，这可能是由于有很多山脉，大部分“大杭”都在树冠栖息地发展。

差异代谢物的网络药理学分析

中药通常具有复杂的治疗效果[62.]．研究来自不同环境的“大杭”之间的治疗效果差异。在31种显着不同的代谢物上进行了进一步的网络药理学研究，这可能揭示效果目标的差异[63.]．在ADME（吸收，分布，代谢和排泄）过滤过程之后，选择12种代谢物用于靶预测，预计它们中的6个具有大于0的潜在靶标，其中4个代谢物累积较高冠层栖息地（（e）-2-甲基-2-丁烯-1- ol，3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-一度，大黄蒽和丁香醇）和2种代谢物在开放中累积较高栖息地植物（1-羟基-3,7-二甲氧基X蒽和香豆素）（图。7;表S.1）.除两种生境化合物预测的42个共同靶标外，在冠层生境中积累较多的4个化合物指向100个独特靶标，而在开放生境中积累较多的2个化合物指向66个独特靶标。代谢产物中HB1(1-羟基-3,7-二甲氧基山酮)含量最高，其次为HA3(大黄烷醇)。这一结果指出，生长环境在形成中药疗效方面起着至关重要的作用[64.，65.]．

在该研究中，应用非靶代谢组合方法与形态学观察相结合，检查形态学和代谢差异Rh。翘曲生长在一对不同的生境，在冠层和开放生境下。结果表明，两种生境之间的形态和代谢物同时发生变化，从而决定了不同生境之间的差异Rh。翘曲植物分为两种生态型。六种形态指标中的五种表现出不同栖息地生长的植物之间的显着变化，与开放栖息地相比，植物栖息地培育植物较小。共有410和302峰分别以正面和负模式注释，并且它们中的31个被确定为显着改变代谢物。Rh。翘曲植物栖息地生长的植物具有31种代谢物中的22个含量较高，而在开放栖息地的植物生长的植物具有较高的31种代谢物中的9个。31种代谢物中的12种通过ADME过滤器，预计它们中的最终6个具有大于0的概率的效果靶标。网络研究表明，大黄蒽和1-羟基-3,7-二甲氧基X蒽的反应程度较高在树冠下和开放栖息地。芦荟 - 大黄素，大黄素，克莱酚，物理，夏状A和塞内纳德B在冠层生长的植物下积累了更多，这表明在树冠下可以培育更好Rh。翘曲质量作为药草。本研究可以在形态学和代谢组学中提供有价值的信息，以了解栖息地对重要传统草药的影响Rh。翘曲．

用于分析的植物材料和样品准备

根Rh。翘曲从青海，甘肃和四川省收集植物。在每个省份被选中为每个省份的抽样网站，其中五个整体Rh。翘曲从每个地点挖掘植物以作进一步分析(图。8）.从2016年到2018年的一段时间内从8月到9月收集了样品，其中收集日期和表格中所示的地理信息1．采掘后测定植株株高、根长、根径、叶长、叶裂片长、叶裂片百分率(叶裂片长叶长比)．所有样品都是由王周教授确定的，并将根部洗涤并空气干燥。然后将标本储存在中国科学院西北高原生物学研究所的植物标本中。

化学品和试剂

本研究使用的化学药品和溶剂均为HPLC级。水、乙腈、甲醇、甲酸购自CNW Technologies GmbH (Düsseldorf, Germany)， l -2-氯苯丙氨酸购自上海恒创生物科技有限公司(中国上海)。采用大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、番泻苷A、番泻苷B的参比标准品进行含量计算[66.]．

土壤性质

使用便携式TDR-100土壤湿度探针(Spectrum Technologies, Inc.， Plainfield, IL, USA)测量土壤湿度。土壤样品随植物根系采集，深度为0 ~ 10 cm。风干的土壤样品通过2mm的筛网筛分，然后研磨成细粉。采用半微量凯氏定氮法测定干土样品的总氮含量[67.]，土壤有机碳含量采用Walkley-Black法测定[68.]．

未确定的UPLC-MS提取和分析

称量80mg植物样品粉末，并将含有甲醇和水（7：3 V / V比）的1ml溶剂引入。然后在甲醇中加入20μl1-2-氯苯基丙氨酸（0.3mg / ml），甲醇中的20μlC-17（0.01mg / ml），其作用为内标。然后加入两种小钢球，然后在60 Hz的自动样品快速研磨机（JXFSTPRP-24/32，上海）以60 Hz进行2分钟前进行预冷在-20℃下进行2分钟。然后将样品置于超声波清洁器（SB-5200DT，宁波，浙江，中国），然后在-20℃下冷却20分钟。然后将样品以13000rpm（TG1-16ms，上海，中国）离心10分钟，在4°C下。使用注射器吸入200μl上清液，然后将上清液通过0.22μm有机膜过滤到LC样品注射小瓶中并储存在-80℃。用于萃取的所有试剂在使用前在-20℃预冷地预冷。另一方面，将所有样品用相同的体积混合到质量控制（QC）样品中，并且所有QC样品都具有与所用样品相同的体积。

UPLC-QTOF-MS^E使用ACQUITY UPLC系统（Waters Corporation，Milford，Ma，USA）和Waters Xevo G2-XS Qtof Mass Spector System（Waters Corporation，Milford，MA，USA）进行分析，加上电电离电离（ESI）界面，其中在ESI阳性和ESI负离子模式中检测结果。UPLC系统配备了ACQUITY UPLC BEC C_18.柱（1.7μm，2.1×100 mm）。由移动A（水，V / V）和流动B中的移动A（0.1％甲酸）和移动B（乙腈中0.1％甲酸，v / v）组成的流动阶段。洗脱条件设定为：0分钟，1％B;1分钟，5％b;2分钟，25％b;30分钟，60％b;3.5分钟，60％b;7.5分钟，90％B;9.5分钟，100％B;12.5分钟，100％B; 12.7 min, 1% B, and 16 min, 1% B. The flow rate was set at 0.4 mL/min while the column temperature was 45 °C. The injection volume was 2 μL and all samples were kept at 4 °C throughout the analysis.

光谱条件是：源温度，120°C;源偏移，80 V;参考毛细管电压，2.5 kV;锥电压，40 V;脱溶化气体温度，450°C;DESOLVATION气体流动，800升/小时;和锥气流，50升/小时。另外，负模式的毛细管电压为-2 kV，而正模式的毛细管电压为+ 3kV。使用的碰撞解离气是氩气（99.999％），而DEROLVATION和CONE气体是氮气（> 99.5％）。数据在MS中从50米/ z到1000 m / z获取^E质心全扫描模式通过从低能量（CE 6 EV）扫描到高能（CE斜坡20-35eV）扫描，扫描速度为0.1 s /扫描。锁定质量校正的外部参考通过参考探针流入5μl/ min的流动，每个30s。用作250ng / mL标准溶液中的乙腈/水/甲酸（50：49.9：0.1，v / v / v）作为外部参考，进行亮氨酸 - Enkephalin。将QC样品注入每10个样品以增强数据重复性。

无目标UPLC数据处理

使用Unifi 1.8.1（Waters Corporation，Milford，Ma，USA）收集从UPLC-MS获得的原始数据，然后进口到后代QI软件（非线性动态，英国）。将参数设定为：5ppm的前体耐受性，用于片段耐受的10ppm，0.02分钟作为保留时间（RT）容差。另外，采用内部标准检测参数用于Perk RT对准，而分别设定噪声水平和最小强度，分别设定为10.00和15％的基峰强度以消除噪音峰值。结果，获得了用M / Z，峰值RT和峰值强度表示的3D矩阵。另外，排除了缺失值大于50％的峰。内标用于数据QC（再现性）。根据精确的质量，MS / MS片段和同位素标签，使用代谢物自动鉴定代谢物，通过搜索HMDB（http://www.hmdb.ca/), Lipidmaps (http://www.lipidmaps.org/）和梅林（http://metlin.scripps.edu.)公共数据库。

目标代谢物分析

目标代谢物分析由我们以前的研究中描述的Agilent 1260系统进行了[66.]．使用单一C18（4.6×250mm，5μm，ACCHrom）和Eclipse加上C18（250mm×4.6mm，5μm，安静）的柱。五种Anthraqunones的混合标准溶液，包括大素，芦荟 - 大蒜素，莱茵，汉霉素和物理（31.2μgml^{- 1}_，38.8μgml.^{- 1}_，22μgml.^{- 1}_，23.4μgml.^{- 1}_，和23.4μgml.^{- 1}）和夏状奈西A和夏诺甙B的混合标准（150μgml^{- 1}和84mgml.^{- 1})。用峰面积与标准溶液比较来计算含量。

数据分析

使用SIMCA软件包（版本14.0，Umetrics，Umeå，瑞典）分析包含负离子和正离子的数据。原理成分分析（PCA）用于揭示样品的概述分类，而在潜在结构判别分析（OPLS-DA）的正交突起用于确定HA和HB样品的最大分离。应用7倍交叉验证和响应排列测试（RPT）以避免过度拟合。R.²问：²在RPT的200倍后计算为0.761和 - 0.469，表明该模型是准确的。此外，进行单变量分析以进一步证实显着不同的代谢物。这p使用学生的T-TEST与折叠变化分析组合使用学生的T检验获得值和折叠变化值，并且使用火山图来可视化结果（图。2）.同时，投影的可变重要性（VIP）值与p使用值来选择不同的组件。代谢物，贵宾值> 4.0和p < 0.05 were considered relevant for group discrimination [69.]．

单向分析差异（ANOVA）与土耳其试验一起使用，以比较植物形态分析的平均值，其中显着水平设定为0.05。单向ANOVA还用于分析土壤性质。根据Mann-Whitney非参数测试，比较了靶向代谢物。

通过搜索31种变化最大的代谢物进行网络研究。瑞士ADME (http://www.swissadme.ch/）[70用于基于它们的ADME（吸收，分布，新陈代谢和排泄）评估来过滤代谢物。具有高Gatrointestinallinal Index（GI吸收）的代谢物和至少三个药剂率指数（分别为脂素，色素，VEBER，egan和Muegge）留下了目标预测。然后，使用瑞士靶预测工具来预测来自瑞士ADME工具的过滤的代谢物的潜在基因靶数[71.]．在网络贡献中使用概率大于0的目标及其共同名称。最后将包含6个代谢物和208个靶标的网络文件导入Cytoscape 3.8.2软件进行网络分析。网络数据由Cytoscape 3.8.2贡献[72.]．

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。

Rh。翘曲：

生格言。ex balf.

pH：

株高

RL：

根的长度

理查德·道金斯:

根径

二：

叶子长度

LLL：

叶片长度

LLP：

叶片裂片百分比

哈:

根据冠层栖息地

HB:

打开栖息地

HCA:

分层聚类分析

PCA：

原理成分分析

OPLS-DA：

潜在结构的正交投影判别分析

质量控制:

质量控制

ESI：

电喷雾电离

RT：

保留时间

RPT：

响应排列测试

VIP：

投影的变量重要性

Anova：

方差分析

Adme：

吸收，分布，新陈代谢和排泄

UPLC：

超高效液相色谱法

我们感谢Guoqiang Zhou，Shoulan Bao和Caidan Duojie进行材料收集和实验援助。审查人员承认他们对修订过程中提高稿件的贡献。

声明

作者声明，本文中描述的植物的实验研究工作符合机构、国家和国际指南。按照当地法规进行实地调研，并得到甘肃、青海、四川三省林草厅的许可。然后将标本储存在中国科学院西北高原生物学研究所的植物标本中。

本研究由国家重点研发项目(2019YFC0507404)、国家公园联合专项(LHZX-2020-09)和青海省高层次创新“千人计划”资助。资助方没有参与研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿的编写。

隶属关系

1. 西北高原生物学研究所藏药研究院重点实验室，西宁，810008

   熊峰，杨鲁存，王玲玲，周国英

2. 中国科学院大学资源与环境学院，北京，100049

   冯熊玲玲王

3. 北京林业研究所林业研究所的林业林园植物育种与培养重点实验室，北京100091

   Xiuqing聂

4. 中国林业学院自然保护区研究院，北京100091

   Xiuqing聂

5. 青海师范大学生命科学学院，西宁，810008

   晶晶李

贡献

这项工作是博士的一部分。FX论文，在GZ的指导下。FX和GZ制作了采样网站选择，FX和LY制作了野生采样的工作。JL，LW辅助FX与实验部件和数据记录。FX准备了稿件和XN促进了这份手稿的数据分析和结构改进。XN，JL，LW，LY和GZ精致了手稿。所有作者都读过并批准了稿件。

通讯作者

对应到Guoying周．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者宣布没有关于本条的出版物的利益冲突。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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