成熟D1的缺失会导致CP43在体内的组装受损拟南芥蒂利亚纳

背景

电极系统II（PSII）是一种高度保守的整体膜多亚基颜料 - 蛋白质复合物。PSII中的蛋白质，颜料，脂质和离子需要精确地组装以确保适当的PSII生物发生。D1是PSII核心反应中心（RC）的主亚基，通常合成为前体D1。D1通过C末端加工蛋白酶CTPA成熟对于PSII组件是必不可少的。然而，到目前为止，还没有明确阐明D1成熟如何影响PSII组件的详细机制。在这项研究中，拟南芥CtpA突变体（atctpa：SALK_056011）缺乏D1成熟过程的缺乏D1成熟过程，以研究更多细节在PSII组件上的这种过程的功能。

结果

没有前体D1的c端加工，PSII组装，包括PSII单体、二聚体，特别是PSII超配合物(PSII SCs)，如之前报道的那样，很大程度上受到损害。通过BN-2D-SDS PAGE进行Western blotting检测发现，虽然PSII核心蛋白D2、CP43和CP47的组装受到D1成熟过程缺失的影响，但CP43的加入受到的影响最大，这表明CP43在PSII SCs中的组装效率降低最大。此外，与成熟D1和CP43共转化的酵母细胞相比，与pD1和CP43共转化的酵母细胞生长较慢，证实D1 c端尾部的存在，阻碍了D1与CP43的相互作用效率。说明D1成熟过程对PSII组装和生物健康生长的生理重要性。

结论

淘汰赛Arabidopsis atctpa.突变体是研究D1成熟和PSII SCS组件之间意外链接的良好材料。D1成熟的损失主要影响Psii核心蛋白Cp43，内部天线结合蛋白的掺入，其在LHCII复合物的结合期间在PSII SC的形成期间在PSII二聚体中起作用。我们的调查结果提供了D1成熟在高等工厂中PSII SCS组件期间D1成熟的作用的详细支持。

光合作用利用阳光来吸化二氧化碳，生产几乎所有生命都必须的生物量。光合作用的初始步骤是PSII催化的水塑醌氧化氧化氧化。PSII是一种高度保守的整体膜多亚基颜料 - 蛋白质复合物，在蓝藻，藻类和植物中发现。PSII组分包括核心蛋白，低分子量（LMM）蛋白，外部氧化复合物（OEC）蛋白，以及光收获复合物（LHC）蛋白[1，2，3.，4，5，6]．为了确保适当的psii生物发生，至少20种不同的亚基蛋白，以及不同的颜料，脂质和离子需要精确地组装[7]．PSII在高等植物中的DE Novo组装是流量：首先组装由D1，D2，PSBE，PSBF和PSBI组成的核心“反应中心”（RC）复合物。随后，CP47模块随着内天线蛋白CP47和LMM蛋白的附着而组装，例如PSBH，PSBM，PSBT，PSBR，RC。接下来，随着CP43，OEC蛋白和LMM蛋白如PSBK，PSBW，PSBZ，RC47复合物的后续结合，转化为PSII核心单体。后来，随着PSII单体的二聚化和LHCII的附着，形成PSII-LHCII超复合物[7，8，9，10.，11.，12.]．

D1蛋白，由叶绿体基因编码PSBA.，是PSII的核心亚基，涉及PSII光局部和修复周期。PSII修复是叶绿体免受过度照明引起的损伤的保护机制。在此过程中，最常损坏的D1劣化并用新副本替换为形成新的RC [13.]．虽然小PSBA.基因家族中存在3 ~ 4个基因拷贝，D1蛋白是由单个基因编码的PSBA.塑料中的基因[14.，15.]．所有光合生物体均以C末端的各种长度延长为前体形式（PD1）作为前体形式（PD1）。D1的成熟形式是Mn的先决条件₄曹₅簇形成和外部蛋白质与psii的结合[16.]．

在RC复合物形成过程中，pD1的c端延伸被c端加工蛋白酶(CtpA)加工，生成成熟的D1。CtpA是一种丝氨酸内肽酶，具有丝氨酸/赖氨酸催化二联体[17.，18.，19.]．在SyneChocystis PCC 6803.在美国，已经发现了三个Ctp同源物(CtpA、CtpB和CtpC)，只有CtpA可以裂解pD1的c端延伸。SyneChocystis PCC 6803.缺乏pD1 c端加工的突变体更容易受到光损伤[20.，21.]．符合SyneChocystis PCC 6803.，三个假定的CtpA同系物(At4g17740, At3g57680, At5g46390)也在拟南芥．损失功能ctpa.导致PSII活性和氧气演化受损[16.，22.]．D1蛋白的成熟形态缺失，其他PSII核心蛋白的丰度降低Arabidopsis atctpa.缺乏D1成熟过程的突变体[23.]．基于分歧，需要进一步探索D1成熟的分子功能。

在本研究中，我们从actpa.null突变体拟南芥蒂利亚纳并更详细地研究了D1成熟在PSII组装过程中的作用。我们的结果表明，成熟D1蛋白的缺失导致PSII SCs的组装受损，这是由RC复合物的异常组装引起的，特别是CP43亚基的异常组装，揭示了D1成熟过程在PSII SCs组装过程中独特而重要的功能。

CTPA的损失导致PD1的积累拟南芥

我们之前的工作表明，PD1蛋白不能在没有CTPA功能的情况下加工成熟的D1蛋白[23.]．进一步研究D1成熟过程的生理作用，先前使用的拟南芥本文分别插入突变体atctpa.（AT4G17740，Salk_056011）在我们目前的研究中使用了D1成熟过程。4周龄atctpa.与WT相比，在生长条件下，突变体在生长条件下表现出广泛的缺陷，包括发育不良的生长和黄叶（图。1一种）。接下来，我们确认了D1蛋白的形式atctpa.突变和WT蛋白质印迹。结果表明，只有PD1形式被检测到atctpa.突变体，而WT中存在的D1蛋白是成熟的形式（图。1一种）。所有这些结果与上一份报告一致[23.]．基于此，我们认为atctpa.突变体是研究D1成熟在PSII组装中的作用的理想材料拟南芥．

PSII SCS的组装是不成熟D1的异常

D1蛋白的C末端加工对于青霉菌和高等植物中的PSII组装是必不可少的拟南芥［17.，20.，21.，23.，24.];然而，尚未明确阐明关于PSII组装，特别是在高等植物中的D1成熟过程功能的机制。为了更详细地研究D1成熟功能，通过使用WT和使用WT的蓝色天然凝胶分析检查具有和不具有D1成熟过程的类囊体膜复合物的组装状态。atctpa.突变体，然后进行定量分析。结果表明，除了PSII单体和二聚体存在组装缺陷外，这与之前的研究结果一致[17.，20.，24.]发现PSII SCS的显着降低atctpa.突变体与WT相比，根据两种分析，基于相等的新鲜称重（图。1c)或相同的叶绿素(图。1d)。

为进一步评估缺乏D1成熟过程的PSII SCs组装缺陷，对蓝色天然凝胶片进行2D SDS- PAGE双向电泳和CBB染色。如图所示，与PSII SCs组装缺陷一致。1c、d, D1 (PsbA)、D2 (PsbD)、CP43 (PsbC)、CP47 (PsbB)在PSII SCs中的组装效率显著降低atctpa.与WT相比的突变体，当基于相等的鲜重进行分析时（图。2a，b）或等同的叶绿素（图。2C，D）。

为了确认上面观察到的更改，执行了2D-SDS-PAGE之后的免疫印迹。始终如一地，PSII主亚单元的组装效率的变化与图2所示相同。2．作为对照，细胞色素b的组装₆/f复合物(Cyt b₆/ f），psi和cf_ocf₁根据在等同叶绿素的基础上进行的分析，复杂亚基保持不变（图。3.a，b）。结果是使用在不同温室种植的植物具有相同的生长环境（图S1a, b和Tab。年代1)．

成熟D1流程损失通过损害CP43组装来扰乱PSII SCS组件

正如我们之前提到的那样，PSII SCS组装是一个良好的组织和顺序过程，涉及精确的蛋白质 - 蛋白质相互作用和许多辅助蛋白的援助[7]．为了解PSII核心亚基和缺失pD1 c末端的LHCII蛋白的组装模式，利用ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/） （桌子1)．蓝色天然凝胶分析分为六个部分：泳道1，psii scs;泳道2，PSI单体（PSI-M），PSII二聚体（PSII-D）和PSII单体（PSII-M）与LHCII三聚体（LHCII-T）结合;泳道3，psii-m和cyt b₆/F;泳道4，LHCII组装，PSII核心缺乏CP43;泳道5，LHCII-T;泳道6，LHCII单体（LHCII-M）。结果，PD1可以几乎不能组装到PSII SC中而没有PD1的C末端加工，并且主要累积在PSII-M和RC47中（分别在PSII-M和RC47中的分布比为49.63和30.42％）（表1)．有趣的是，在其他PSII核心蛋白中，仅CP43显示了类似的组装图案作为PD1，而D2和CP47可以在PSII SC中保持一定水平的组件，尽管与WT中的组装效率较低。

因此，LHCII的组装效率显示出与CP43相似的趋势，PSII SCs的积累较少，并且在LHCII-T中的增加。在PSII de Novo组件期间，D1将D2结合到D2，然后插入CP47以形成RC47复合物。只有在插入CP47之后，CP43可以以正确的方式插入以形成PSII RC复合体[7，8，9，10.]．综上所述，pD1的c端存在主要影响CP43的组装，这导致LHCII蛋白组装形成PSII SCs的效率较低，因为LHCII复合物主要通过天线结合蛋白与PSII二聚体复合物结合，如CP43 [27.]．

D1成熟过程的丧失阻碍了D1与酵母 - 两个杂化分析表明的D2和CP43的相互作用

为了确认我们上面提到的假设，我们使用了交配的酵母分裂泛素系统，其可以识别积分（囊体）膜蛋白之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用[28.来检测D1与PSII其他核心亚基之间的互作效率是否受c端影响。采用全长成熟D1(氨基酸1-344)和pD1(氨基酸1-353)作为诱饵，全长D2、CP43和CP47作为猎物。结果表明，虽然成熟D1和pD1均可与CP43和D2互作，但D1 / pD1与D2的互作效率低于与CP43的互作效率，说明成熟D1 / pD1与CP43的结合强于与D2的结合(图2)。4一种）。此外，表达成熟D1和CP43 / D2的酵母细胞比表达PD1和CP43 / D2的合成定义的（SD）培养基的CP43 / D2的酵母细胞增长得更快，缺乏TRP，Leu，他和腺嘌呤（SD-TRP Leu His Ade）（无花果。4a），表明PD1的C末端的存在阻碍了D1与CP43 / D2的相互作用。为了鉴定与上述基因的转化酵母细胞中的差异更清楚，我们接下来监测转化的酵母细胞的生长曲线，如图2所示。4B和标签。年代2．实际上，具有PD1的转化酵母细胞的生长速率比用成熟D1转化的转化酵母细胞的生长速率较慢，确认没有D1成熟过程的受影响的相互作用效率。

在蓝杆菌中SyneChocystus 6803.，去除PD1的C末端尾部是锰簇组装的粗遗传术，这对于一个完全官能的PSII复杂是必不可少的[10.，17.，29.]．还指出，D1成熟过程对于将PSII外本蛋白结合到PSII中是必要的[16.]．然而，在高等植物中丧失D1成熟过程引起的缺陷并不与上述完全相同。在atctpa.突变体，其D1成熟过程丧失，尽管水氧化锰簇变得具有氧气进化的缺氧减少表明的功能失调，但外蛋白（PSBO，PSBP和PSBQ）的结合不受影响[23.]．最明显的变化是PSII SCs组装的减少(图2)。1，2），在蓝藻中不存在SyneChocystis.PCC 6803 sp。

PSII是一个多亚单元复合体，其装配是一个精确控制的顺序过程。如图所示。5，PD1与PSII引发复合物相互作用，该粘合复合物包含D2以形成PSII最小RC复合物。稍后，招募CP47以形成PSII RC47复合物。然后组装CP43以产生PSII单体，并且PSII二聚体形成为PSII单体的二聚化[7]．在血管植物中，PSII主外周天线蛋白形成LHCII三聚体，其通过与PSII核心蛋白的关联以强烈或中等界定的方式借助于次要的LHCII物种（CP24，CP26和CP29）与PSII二聚体结合CP43 / CP47 [24.，30.，31.]．

它指出，PD1可以与D2-CYT B559复合物相互作用以形成D1-D2复合物，而CP47和CP43在PD1的C末端处理之后结合到D1-D2复合物中[12.]．始终如一地，我们还发现，D2的有效组装不受PD1的存在影响。但是，CP43的有效组装显然是影响。有趣的是，尽管在CP47的适当组装之后仅发生CP43的插入时，CP47的组装并不多大于D1成熟的影响（图。3.、表1和图.. s1选项卡。年代1)．这是可解释的，因为CP47定位于D2，而CP43根据PSII SCS结构定位为D1 [27.，32.，33.，34.]．此外,无花果。4与成熟D1和CP43之间的PD1和CP43的较低的相互作用效率进行了比较，与用PD1和CP43共转化的酵母细胞的较慢生长速率表示，与用成熟D1和CP43共转化的酵母细胞的较慢生长速率。总的来说，这些数据表明，没有D1成熟的PSII SCs的有缺陷组装主要由CP43的令人不安的高效组装引起，从而影响随后的PSII SCS组装过程。例如，将LHCII的差异与PSII二聚体的关联（图。3.、表1和图.. s1选项卡。年代1)，其与PSII的关联主要涉及内触角蛋白，如高等植物中的CP43 [27.，35.]．另外，作为PSII缺乏的二次效果，降低了PSI组分和ATPα水平（图。3.)．

已经获得了许多信息，关于CP43与PSII RC复合物的结合。两个研究的CP43装配因子是低PSII积累2（LPA2）和低PSII积累3（LPA3）[36.，37.]．LPA2是一个小的固有类囊体膜蛋白，而LPA3没有跨膜结构域。虽然它们不同源，但它们被鉴定为通过与类囊体膜蛋白Albino 3(一种cpSRP转位酶)的相互作用来协助CP43进入PSII。我们的研究结果表明，pD1的c端加工蛋白酶AtCtpA也在CP43有效融入PSII SCs中发挥重要作用。从当前工作中总结出的D1成熟工艺功能方案如图所示。5: pD1与D2-cyt b559配合物结合形成RC配合物，RC配合物由pD1、D2、PsbE、PsbF和PsbI组成。在RC复合物形成过程中，pD1在其c端被AtCtpA延伸，生成成熟的D1。在D1未成熟的情况下，虽然对内天线蛋白CP47的结合影响不大，但形成的RC47复合物功能失调。接下来，CP43以低得多的组装效率插入到功能失调性RC47复合物中，形成功能失调性单体PSII (PSII [1]）。最后，功能失调PSII [1]形成功能障碍二聚体psii（psii [2]）。在此过程中，PD1的C-Terminus延伸将改变PD1-RC47复合物的空间构象，其影响CP43的正确组装和随后的其他亚基组装。除此之外，PSII SCS亚基的关联由于PD1的存在而变得松散地变得松散，这导致在洗涤剂存在下的囊膜膜隔离和溶解过程中从PSII SCS的某些亚基的更容易地脱离，这包括减少psii scsatctpa.我们发现的突变体（图。2，3.，4和表格1)．

通过使用该细节的更多详细研究PSII SCS组装atctpa.缺乏PD1的C末端加工过程的突变体，我们发现PSII SCS组件中的缺陷由D1成熟的损失引起的主要位于PSII核心蛋白CP43，内部天线结合蛋白的缺乏掺入中PSII SCS形成过程中LHCII复合物与PSII二聚体的关系。我们的发现表示D1成熟过程如何在高等工厂中PSII SCS组装过程中的功能。

植物材料和生长条件

拟南芥(Columbia-0)和T-DNA插入突变株(SALK_056011, locus At4g17740)拟南芥资源中心（哥伦布，哦）。在16小时光/ 8h暗循环的条件下含有3.0％蔗糖（pH5.7）的1/2 ms培养基中的1/2 ms培养基中生长4周，20μmol光子m^{- 2} s^{- 1}光周期期间的光强度。

蓝色本机PAGE和2D SDS-PAGE

分别从50株野生型和50株野生型中提取叶绿体atctpa.- 植物。如前所述进行蓝色天然凝胶电泳[25.，38.]．对于2D SDS-PAGE，用剃刀刀片切除蓝色天然凝胶泳道，并在75℃下孵育2×SDS样品缓冲液20分钟，然后在75℃下孵育20分钟。在25°C下20分钟。将具有变性蛋白质的泳道置于12％SDS凝胶的顶部，然后进行第二尺寸分离。

免疫印迹分析

对于免疫印迹，在12％SDS凝胶上分离蛋白质样品并转移到硝化纤维素膜（Biotrace TM Nitrocellulose，Mexico），然后进行Western印迹分析。在用5％牛奶封闭后，随后将膜与针对所指示的蛋白产生的一抗孵育，并使用Super Simply TM West Pico Plus化学发光底物试剂盒（Thermo Scientific，USA）检测。

酵母双杂交测定和生长曲线分析

酵母双杂交试验使用分裂泛素系统(DUAL membrane, Dualsystems Biotech)进行，如前所述[39.，40]．将成熟氨基酸D1(氨基酸1-344)和pD1(氨基酸1-353)克隆到编码Cub-LexA-VP16片段的pCCW-STE载体中，作为相互作用的诱饵。将CP43、CP47和D2克隆到pDSL-Nx载体(编码NubG片段)中进行检测。酵母菌株NMY32分别与诱饵和猎物结构体共转化。用不含或含2 mM 3-氨基- 1,2,4 -三唑(3-AT)的合成定义(SD)培养基(SD-Trp Leu His Ade, FunGenome)测定酵母细胞在琼脂平板上的相互作用。在600 nM (OD)处测定吸光度，得到液体培养酵母细胞的生长曲线₆₀₀)．每种转化的六种菌落在SD-TRP Leu含有30μg/ ml卡那胺的ADE培养基中培养。od.₆₀₀在不同的时间点记录值。使用Pds1-NX载体作为阴性对照，NUBI被用作阳性对照。

统计分析

imagej（https://imagej.nih.gov/ij/)来确定PSII亚基在不同亚配合物中的分布比例。

本研究中产生或分析的所有数据都包含在本文及其补充材料中。在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。本研究中使用的生物材料可从合理的请求后从相应的作者获得。

LHCII：

聚光复合物

LHCII-M:

LHC单体

lhcii-t：

LHCII三角形

LMM：

低分子量亚基

描述:

Oxygen-evolving复杂

PSI：

光系统I

psii：

拍照II

psii scs：

Psii超级复合物

psii-d：

psii二聚体

PSII-M:

Psii单体

PSI-M：

PSI单体

RC:

反应中心

我们感谢Aigen Fu博士在稿件修订中的富有洞察力和贡献。

该工作得到了国家重点研究和发展计划（2016YFD0100604）的支持。资金机构在设计的研究，收集，分析和解释方面没有发挥作用，并撰写稿件。

隶属关系

1. 武汉大学生命科学学院杂交水稻国家重点实验室，武汉430072

   Yafei Shi，Yukun Wang＆Xin Hou

2. 加州大学植物和微生物生物学系，伯克利，加州，美国94720

   Yufen Che＆Sheng Luan

贡献

YFC，SL和XH设计了实验，YFS，YFC，YKW和XH进行了实验，YFS起草了稿件，YFC和XH修订了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

对应到鑫侯．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

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