甲基-CPG结合蛋白基因的过度表达GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba导致较大的分蘖角度降低了水稻中的光周期敏感性GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

甲基- cpg结合域(MBD)蛋白在植物表观遗传基因调控中发挥重要作用，具有多种分子、细胞和生物学功能。MBD蛋白已经在多种植物中进行了功能表征，包括GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，小麦，玉米和番茄。在水稻中，17个序列被生物信息预测为推定的MBD蛋白。然而，关于水稻中MBD蛋白的功能很少。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

我们探索了水稻的表达模式GydF4y2Baosmbd.GydF4y2Ba家庭基因并确定13GydF4y2Baosmbds.GydF4y2Ba在水稻各组织中均有活性表达。我们进一步分析了水稻I类MBD蛋白OsMBD707的功能，并证明OsMBD707是组成型表达并定位于细胞核。转基因大米overexpressingGydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba分蘖角增大，光周期敏感性降低，短日照下开花延迟，长日照下开花早。RNA-seq分析显示GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba导致水稻中的光周期敏感性降低和开花调节因子基因的表达变化GydF4y2BaEHD1-HD3AGydF4y2Ba/GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba途径。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究的结果表明，OSMBD707在水稻增长和发展中起重要作用，并应进一步研究欧姆布德蛋白在水稻中生长，发育或其他分子，细胞和生物过程中的osmBd蛋白的功能。GydF4y2Ba

DNA甲基化是动植物基因组中一种保守的表观遗传修饰，在基因组稳定性、基因组印记、基因表达调控等方面发挥着重要作用，并对动植物细胞和发育过程的各个方面产生影响[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．甲基CpG结合结构域（MBD）蛋白作为DNA甲基化标记的重要解释器出现[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．MBD蛋白可以与甲基化DNA结合并募集染色质重塑因子，组蛋白脱乙酰酶和甲基酶来调节基因表达[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．对哺乳动物的大量研究表明，MBD蛋白的突变或异常表达发生在许多神经系统疾病和癌症中[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．例如，人甲基-CPG结合蛋白2（MECP2）中的突变导致出生后神经发育障碍RETT综合征[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba，表明MBD蛋白在维持正常的表观遗传和细胞内稳态中发挥重要作用。GydF4y2Ba

基于与哺乳动物MBD蛋白的氨基酸序列相似性，植物MBD蛋白已被鉴定[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．的GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba基因组编码13个MBD结构域蛋白[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．的研究GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Bambd表明植物mbd可以与甲基化或未甲基化的DNA结合[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]，并与染色质 - 修饰或转录复合物相互作用，例如组蛋白脱乙酰化酶Athda6 [GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba，组蛋白甲基转移酶AtPRMT11 [GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]、组蛋白乙酰转移酶IDM1和α -晶体蛋白结构域蛋白ROS5/IDM2 [GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]，RNA结合蛋白ATRPS2C，ATAGO4和ATNTF2参与RNA介导的基因沉默途径[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]或染色质重塑剂CHR11 / CH11和染色质重塑复合SWR1亚基PID1和ARP6，其参与组蛋白H2A.Z沉积[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]．的GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaMBD在不同的分子和生物过程中发挥重要作用。例如，敲低GydF4y2BaAtMBD6GydF4y2Ba或GydF4y2BaATMBD10GydF4y2Ba导致核仁优势紊乱GydF4y2Ba拟南芥suecicaGydF4y2Ba[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba];突变GydF4y2BaAtMBD8GydF4y2Ba导致C24 Ecotype中的延迟开花[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba];突变GydF4y2BaAtMBD9GydF4y2Ba促进早花和提高芽分枝GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba];和击倒GydF4y2BaATMBD11GydF4y2Ba结果是GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba具有形态学和发育异常的植物[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

除了模型植物中的研究GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba然而，最近的几项研究表明MBD蛋白在不同植物物种中的重要作用。小麦GydF4y2BaTAMBD2.GydF4y2Ba通过盐胁迫显着诱导同种型基因，表明它们在应力响应中的潜在功能[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．GydF4y2BaTAMBD6.GydF4y2Ba高度响应于长时间冷却，这表明TAMBD6可能参与调节植物生殖阶段的发育转型对小麦的生殖阶段[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba]．玉米ZmMBD101被鉴定为维持玉米中Mutator (Mu)元素染色质所需的基因[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]．在番茄中，鉴定SLMBD5以与CUL4-DDB1-DET1复合物相互作用，该复合物涉及下游基因的转录激活[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．Overexpressing的GydF4y2BaSlMBD5GydF4y2Ba基因导致转基因植物中的暗水果颜色和矮化表型[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．一些人GydF4y2BaMBD.GydF4y2Ba在果实发育或非生物应激反应期间，已经观察到四种不同的溶碱基物种中的基因差异诱导或抑制，表明他们参与这些过程的角色[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

米 （GydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2BaL.）是全球最重要的作物之一。在水稻基因组中，预测17个基因被生物信息，以编码推定的MBD蛋白并被指定为GydF4y2BaOsMBD701GydF4y2Ba到GydF4y2BaOsMBD718GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．然而，关于水稻中OSMBD蛋白的功能很少。在这项研究中，我们探讨了预测的表达模式GydF4y2Baosmbd.GydF4y2Ba家族基因和检测到13GydF4y2Baosmbds.GydF4y2Ba在水稻各组织中均有活性表达。我们进一步对水稻类MBD蛋白，OSMBD707进行了功能研究，并显示出过度表达GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba导致较大的分蘖角和降低水稻的光周期敏感性。我们的结果表明，OSMBD707在水稻生长和发展中发挥生物团体。GydF4y2Ba

差异表达模式13GydF4y2Baosmbd.GydF4y2Ba水稻组织中的家庭基因GydF4y2Ba

生物信息学分析已经确定了稻米中17个推定的OSMBD蛋白[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．在过去几十年中，考虑到水稻基因组的注释更新，在这项研究中，我们验证了预测的GydF4y2Baosmbd.GydF4y2Ba通过搜索国家生物技术信息中心（NCBI）和MSU稻基因组注释项目（RGAP）数据库来源基因。我们的搜索在NCBI和RGAP数据库中展示了15个基因与以前预测的匹配GydF4y2BaOsMBD701GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD703GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD704GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD705GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD706GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD708GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD709GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD710GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD711GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD713GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD714GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD715GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD717GydF4y2Ba,GydF4y2BaOsMBD718GydF4y2Ba，分别（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。但是，没有发现NCBI RAP基因座或MSU RGAP基因座与GydF4y2BaOsMBD712GydF4y2Ba或GydF4y2BaOsMBD716GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。此外，RAP基因座GydF4y2BaOS04G0192775GydF4y2Ba和MSU RGAP位点GydF4y2Baloc_os04g11510.GydF4y2Ba被推测为编码mbd蛋白的基因(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。GydF4y2Ba

的表达式模式GydF4y2Baosmbd.GydF4y2Ba家庭基因，我们首先搜索数字表达值GydF4y2Baosmbds.GydF4y2Ba在RGAP数据库中（GydF4y2Bahttp://rice.plantbiology.msu.edu/GydF4y2Ba）.在17个推定的OSMBD编码基因中，GydF4y2BaOsMBD701GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD704GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD705GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD706GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD708GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD709GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD710GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD711GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD715GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD717GydF4y2Ba,GydF4y2BaOsMBD718GydF4y2Ba在不同组织中表达差异。然而，没有可检测到的表达值GydF4y2BaOS04G0192775GydF4y2Ba和GydF4y2Baloc_os04g11510.GydF4y2Ba在所有13种不同的组织中，以及预测的GydF4y2BaOsMBD703GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD713GydF4y2Ba,GydF4y2BaMBD714GydF4y2Ba仅在愈伤组织、授粉后5天种子(DAP)和花药中，FPKM值(每百万片段测序的转录本每kilbase的预期片段数)均很低，但在其他组织中未检测到FPKM值GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：表S2）。我们进一步进行了定量RT-PCR（QRT-PCR）以验证表达模式GydF4y2Baosmbd.GydF4y2Ba家庭基因在根，茎，叶，小米基磷，种子和水稻植物穗轴。QRT-PCR结果与数字表达式数据库几乎一致。在17个推定中GydF4y2Baosmbds.GydF4y2Ba，没有预测的文字记录GydF4y2BaOsMBD703GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD713GydF4y2Ba那GydF4y2BaOS04G0192775GydF4y2Ba， 要么GydF4y2Baloc_os04g11510.GydF4y2Ba在测试组织中检测到（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。尽管GydF4y2BaOsMBD704GydF4y2Ba和GydF4y2BaOsMBD714GydF4y2Ba被检测到优先在种子中表达，GydF4y2BaOsMBD701GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD705GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD706GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD708GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD709GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD710GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD711GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD715GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsMBD717GydF4y2Ba,GydF4y2BaOsMBD718GydF4y2Ba观察到在各种组织中差异表达（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

OSMBD707在核中组成型表达和局部化GydF4y2Ba

水稻osmbd可分为六类[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．在本研究中，我们专注于OSMBD707的功能分析，属于ISMBD707，属于I类，是I类的唯一成员[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．系统发育分析表明，OsMBD707与ObMBD11-like in聚类GydF4y2Baoryza brachyantha.GydF4y2Ba，假设蛋白质TVU48968.1GydF4y2Ba伊格拉蒂斯曲面GydF4y2Ba，simbd10和simbd11在GydF4y2BaSetaria italicaGydF4y2Ba，zmmbd105和zmmbd106GydF4y2BaZea Mays.GydF4y2Ba，bdmbd11GydF4y2BaBrachypodium distachyonGydF4y2Ba的sbbmbd10和SbxP2GydF4y2Ba高粱双色GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.QRT-PCR分析表明mRNAGydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba在不同的组织中表达，尽管在小穗中转录水平相对较低(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.的翻译起始点上游的1931-bp启动子片段GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba被克隆并与之融合GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba报告基因。用米植物的组织化学染色转化GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba启动子-GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba融合构建结果表明，GUS在根、茎、叶、小穗等组织中均有表达，但表达量较弱GydF4y2Ba35年代GydF4y2Ba启动子-GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba转基因植物（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).总的来说，这些结果表明GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba在各种水稻组织中组成型表达。GydF4y2Ba

OsMBD707GydF4y2Ba预计会产生两份替代转录物，GydF4y2BaXM_015764399.1 / LOC_Os12g42550.1GydF4y2Ba,GydF4y2BaXM_015764400.2GydF4y2Ba/GydF4y2Baloc_os12g42550.2GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：图S1a，b）。我们进行了RT-PCR以克隆cDNA片段GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba，但只获得GydF4y2BaXM_015764399.1 / LOC_Os12g42550.1GydF4y2Ba．使用引物的RT-PCR(附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba(图S1A)进一步进行了设计，以区分两个预测的备选转录本。坚持,只GydF4y2BaXM_015764399.1 / LOC_Os12g42550.1GydF4y2Ba在所有测试组织中检测到，包括根，茎，叶子，小穗，种子和穗轴（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：图S1C，D），表明只有一个同种型，OSMBD707的ISOoform，LOC_OS12G42550.1。为了探讨OSMBD707的亚细胞定位，我们执行了暂态表达GydF4y2BaGFP-OSMBD707.GydF4y2Ba水稻原生质体的融合构建。显微镜下显示GFP-OsMBD707的荧光信号位于细胞核区域内，并与细胞核DsRed-OsH2B标记信号合并[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab).这一结果表明OsMBD707是一个核定位蛋白，与甲基- cpg结合蛋白的功能一致。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba导致水稻分蘖角增大，光周期敏感性降低GydF4y2Ba

探究…的作用GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba在水稻中，我们产生过表达和RNAi敲低转基因植物。对于每种类型，超过40个独立的转基因T.GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba产生了植物，并选择了5个独立的植物进行初步分析。qRT-PCR分析结果显示GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba在植物转化的植物中显着高GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba-过表达结构(约12 ~ 43倍)和更低GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba与野生型植物相比，-RNAI构建体（约11至27％）（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa，b），确认过表达和击倒GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba分别在转基因植物中。此外，我们生成了CRISPR / CAS9淘汰植物GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba．对CRISPR/Cas9转基因植株进行基因分型，鉴定出9个独立的T基因GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba在至少一种单一引导RNA（SGRNA）靶向部位中的至少一种纯合的植物GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba，其中七个携带的纯合型突变突变：MBD707-＃6，MBD707-＃9，MBD707-＃12，MBD707-＃15，MBD707-＃22，MBD707-＃25和MBD707-＃28（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC）。初始表型观察表明GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba-过表达植株(简称OX707)分蘖期后的分蘖角比野生型大。野生型与野生型之间没有明显的形态差异GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba-RNAI植物（称为707i）和CRISPR / CAS9编辑的架构植物。GydF4y2Ba

OsMBD707GydF4y2Ba-overexpression，-knockdown和-frameshiftlines达到tGydF4y2Ba_3.GydF4y2BaTGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba选择几代和两个独立的过度表达线，一个敲除线和一个突击型突变线进行进一步分析。与初始表型观察一致，两者GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba- 与野生型，敲击管线707i-＃30和FrameShift线MBD707-＃6相比，OX707-＃20和OX707-＃21显示较大的分蘖角。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。此外，我们观察到在短日（SD）条件下生长的两条过度表达株线的开花的显着延迟（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).我们进一步调查了标题日期GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba-Overexpression，-knockdown和-FrameShift在SD和漫长的一天（LD）条件下的生长室中的线条。如图所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaB在SD下，与野生型，707i-＃30或MBD707-＃6相比，OX707-＃20和OX707-＃21的开花时间显着延迟（约15-17天）（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab）。相反，在LD下，与野生型707i-＃30或MBD707-＃6相比，OX707-＃20和Ox707-＃21的开花时间显着（约10.5-12.5天）（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bac），表明过度表达GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba转基因水稻植物中的光周期敏感性降低。GydF4y2Ba

全局转录组分析显示过表达诱导的关键开花调节因子基因的转录变化GydF4y2BaMBD707.GydF4y2Ba

采用基于rna序列的转录组分析来研究整体转录组的变化GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba-overexcression转基因线Ox707-＃21在SD和LD条件下。在SD下，鉴定约1026个基因，其在OX707-＃21和野生型之间差异表达，其中616个基因被上调，而410基因在OX707-＃21中调节下调（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：图S2A，附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：表S3）。在LD下，在OX707-＃21和野生型之间鉴定约1653个差异表达基因（DEG），包括997个上调基因和OX707-＃21中的656个下调基因（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：图S2A，附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba：表S4）。总共在SD和/或LD下识别了大约2353只（附加文件）GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：图S2B）。GydF4y2Ba

这些2353次DEG的基因本体（GO）分析表明，重要的生物过程类别与翻译，肽生物合成，肽代谢，酰胺生物合成和细胞酰胺代谢过程有关;显着的细胞组分类别是核糖体，核糖核蛋白复合物，非膜有界细胞器，细胞内非膜 - 有界细胞器和细胞质部分;显着的分子函数类别涉及核糖体，结构分子活性，丝氨酸型内肽酶抑制剂活性，内肽酶抑制剂活性，肽酶抑制剂活性，肽酶调节剂活性，内肽酶调节剂活性，转移酶活性/转移糖基，N-乙酰转移酶活性，N-酰基转移酶活性（附加文件GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba:图S3，附加文件GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba：表S5）。基因和基因组（KEGG）分析的京都百科全书显示，核糖体和苯丙醇化生物合成途径显着富集了所鉴定的含量（附加文件GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba:图S4，附加文件GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba:表S6)。GydF4y2Ba

我们进一步调查了具有涉及分蘖角度或开花时间调节的已知或推定功能的参观。植物与植物相互作用因子样蛋白基因GydF4y2BaOSPIL15.GydF4y2Ba（GydF4y2BaOS01G0286100.GydF4y2Ba）负面调节分蘖角度[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba在SD和LD下OX707-#21中，]显著下调(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：表S3，附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba：表S4）。然而，没有将其他已知的耕作角调节基因鉴定为可℃。值得注意的是，在DEG中确定了许多具有控制开花时间的功能的基因，包括GydF4y2BaFlavin结合，Kelch重复，F-Box 1GydF4y2Ba（GydF4y2Baosfkf1.GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba早期日期1GydF4y2Ba（GydF4y2BaEHD1GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba染色体的日子2GydF4y2Ba（GydF4y2BaDTH2GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba标题Daty3a.GydF4y2Ba（GydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba） 和GydF4y2Ba水稻开花位点t1GydF4y2Ba（GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]，GydF4y2Baosmads14.GydF4y2Ba和GydF4y2Baosmads15.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Ba开花轨迹T.GydF4y2Ba基因同源染色体GydF4y2BaFT-L7GydF4y2Ba那GydF4y2BaFT-L8GydF4y2Ba和GydF4y2BaFT-L12GydF4y2Ba促进开花，和GydF4y2Ba谷物数，植物高度和标题Date2GydF4y2Ba（GydF4y2BaGHD2.GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]抑制开花。在SD下，GydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba那GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba那GydF4y2BaFT-L7GydF4y2Ba那GydF4y2Baosmads14.GydF4y2Ba,GydF4y2Baosmads15.GydF4y2BaOX707-#21基因表达下调。相比之下,GydF4y2Baosfkf1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaEHD1GydF4y2Ba那GydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba那GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba那GydF4y2BaFT-L8GydF4y2Ba那GydF4y2BaFT-L12GydF4y2Ba,GydF4y2Baosmads14.GydF4y2Ba上调，而且GydF4y2BaGHD2.GydF4y2Ba在LD下OX707-#21基因表达下调(图2)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa，b）。Ox707-＃21中这些开花调节剂基因的转录变化与延迟的开花和早期开花表型相一致GydF4y2BaMBD707.GydF4y2Ba在SD和LD下的一端，除了次要效应标题促进基因之外GydF4y2BaDTH2GydF4y2Ba在LD下则相反地下调(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa, b). 5个关键开花调节基因的转录谱，GydF4y2BaEHD1GydF4y2Ba那GydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba那GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba那GydF4y2Baosmads14.GydF4y2Ba,GydF4y2Baosmads15.GydF4y2Ba通过QRT-PCR验证，结果与RNA-SEQ数据一致（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac).将移码突变株mbd707-#6也纳入qRT-PCR, 5个基因在mbd707-#6中的表达模式与野生型植物相似(图2)。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

MBD家族蛋白已在多种植物中进行了功能表征，包括GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba)、小麦(GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba)、玉米(GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]和番茄[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．MBD蛋白在植物生长，发育和应力反应中起着枢轴作用。在本研究中，我们在大米中表征了OSMBD707，并在调节耕作建筑和开花时间方面证明了其作用。GydF4y2Ba

将十七个序列预测为来自水稻基因组的推定MBD蛋白（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。在本研究中，13人预测GydF4y2Baosmbd.GydF4y2Ba检测到基因以在根，茎，叶，穗状花转果，种子或穗轴中主动表达（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.然而，在其他四种预测序列的任何测试组织中均未检测到转录本(附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。这四个序列的数字表达值在RGAP数据库中无法检测或几乎无法检测(附加文件)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：表S2）。无论这四个序列是否是伪原，或者它们的表达限于其他特定组织或发育阶段，还仍有待进一步阐明。植物MBD分为八个课程，但其中，IV级和VI类仅存在于Dicots [GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．OSMBD707属于I类MBD蛋白[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．以前的研究已经证明GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaI类MBD蛋白质ATMBD10和ATMBD11在调节核仁优势方面具有重要功能[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba和形态学发展[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．RNAi-mediated击倒的GydF4y2BaATMBD10GydF4y2Ba揭示了核心优势中的RRNA基因需要ATMBD10 [GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]和敲门声GydF4y2BaATMBD11GydF4y2Ba导致空中玫瑰花葫芦，锯齿状叶子，异常的花位置，晚开花，减少生育率GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．在本研究中，我们观察到过度表达GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba导致水稻分蘖角增大，光周期敏感性降低。相反，基因的敲除和移码突变GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba没有导致水稻植物形态的可观察变化。虽然它们可以将其生物信息分组为不同的类别，因此可能是OSMBD707和其他OSMBD之间的功能冗余。GydF4y2Ba

分蘖结构和开花时间都是水稻种植的重要特征。在过去的几十年中，已经确定了分蘖角的几个钥匙/主要调节器，例如懒惰1 [GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba，舵柄角度控制1 (TAC1) [GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]，匍匐增长1（PROG1）[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba， Loose Plant Architecture 1 (LPA1) [GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]，工厂建筑和产量1（Pay1）[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]、TAC3及D2 [GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]，热应激转录因子2D（HSFA2D）[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]，分蘖倾斜增长1（TIG1）[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba] Tiller角度控制4（TAC4）[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba)等。然而，RNA-seq分析并没有发现这些分蘖角调节基因中的任何一个是DEGsGydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba-overxpression线OX707-＃21和野生型，除了一个GydF4y2BaOSPIL15.GydF4y2Ba基因负极调节分蘖角度[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]在OX707- 21中表达下调。由于RNA-seq是使用从完全展开的叶片中提取的rna进行的，所以在DEGs中很少检测到关键/主分蘖角度调节基因的一个原因可能是这些基因在涉及分蘖的组织(如茎、分蘖基部和分蘖节)中大量表达，但在成熟叶片中不表达或以非常低的水平表达[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．为了验证这一点，我们采用qRT-PCR方法，研究了这些已知的分蘖角调节基因在OX707-#21和野生型成熟叶片中的表达模式。尽管GydF4y2BaHSFA2D.GydF4y2Ba被检测到高度成熟的叶子表达，没有成绩单GydF4y2BaLAZY1GydF4y2Ba那GydF4y2BaPROG1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaLPA1GydF4y2Ba和GydF4y2BaTig1.GydF4y2Ba，非常低的表达GydF4y2BaTAC1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPay1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaTAC3.GydF4y2Ba那GydF4y2BaD2GydF4y2Ba,GydF4y2BaTAC4.GydF4y2Ba被检测到（附加文件GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba：图S5）。总体而言，这些基因成熟叶片中的表达模式，除外GydF4y2BaOSPIL15.GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba：图S5B），与较大的分蘖角表型没有相关GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba超表达植株。然而，OsMBD707调节舵角的机理还有待进一步研究。GydF4y2Ba

米饭是一种SD植物，其开花在SD下促进，但在LD下推迟。大米开花时间主要通过光周期灵敏度决定，该敏感性由SD下的开花促进的拮抗遗传网络的复杂遗传网络控制，以及LD下的镇压[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]．在本研究中，将许多开花时间基因鉴定为OX707-＃21和野生型之间的氨（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa, b).在这些开花时间差异表达基因中，GydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba那GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba,GydF4y2BaEHD1GydF4y2Ba是光周期信号的初级积分器。GydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba和GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba是两个稻米和米和GydF4y2BaEHD1GydF4y2Ba促进表达GydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba和GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba诱导标题[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．通过RNA-seqGydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba和GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba发现在SD下在OX707-＃21中抑制，但在LD下调节上调（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.GydF4y2BaEHD1GydF4y2Ba在LD下鉴定在OX707-＃21中升调（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa)，虽然RNA-seq未检测到GydF4y2BaEHD1GydF4y2Ba作为SD下的DEG，QRT-PCR验证了这一点GydF4y2BaEHD1GydF4y2BaSD胁迫下OX707-#21基因表达下调(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab）。此外，RNA-SEQ揭示了三种开花促进基因/同源物参与其中GydF4y2BaEHD1-HD3AGydF4y2Ba/GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba通路,GydF4y2Baosmads14.GydF4y2Ba那GydF4y2Baosmads15.GydF4y2Ba,GydF4y2BaFTL7.GydF4y2Ba在SD下在Ox707-＃21中调节;和四个基因/同源物GydF4y2Baosfkf1.GydF4y2Ba那GydF4y2Baosmads14.GydF4y2Ba那GydF4y2BaFTL8.GydF4y2Ba,GydF4y2BaFTL12.GydF4y2Ba在LD下的OX707-＃21中调节（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa，b）。虽然A.GydF4y2BaDTH2GydF4y2Ba具有诱导促进标题的功能的基因GydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba和GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba在LD下的OX707-＃21中矛盾地下调（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa，b），它的效果似乎没有改变上调GydF4y2BaHD3A.GydF4y2Ba和GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba．总的来说，RNA-SEQ结果表明过表达GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba导致关键开花调节因子基因的转录变化GydF4y2BaEHD1-HD3AGydF4y2Ba/GydF4y2BaRFT1GydF4y2Ba途径。在本研究中，我们观察到GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba本身在SD或LD下以类似的水平表示(附加文件GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba:图S5C)。我们的研究结果表明，过度表达GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba可能导致某些与这些关键开花调节基因表达相关的表观遗传变化。然而，我们尚未深入研究OsMBD707与开花调节基因之间的具体联系，其调控光周期敏感性的机制还有待进一步研究。GydF4y2Ba

在这项研究中，生物信息学预测GydF4y2Baosmbd.GydF4y2Ba家族基因得到验证GydF4y2Baosmbds.GydF4y2Ba被鉴定为在各种水稻组织中积极表达。我们进一步对OSMBD707进行了功能研究，并证明了OSMBD707体组成型和局部地在核中。过度表达GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba导致较大的分蘖角，在水稻中的SD和早期开花下延迟开花。RNA-seq分析显示GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba通过在LD下的SD和Up-Consemating开花促进基因下降低水稻中的光周期敏感性降低了水稻。我们的研究结果表明OSMBD707在水稻生长和发展中的生物学作用，并为未来的研究基础奠定了对水稻中OSMBD蛋白质分子，细胞和生物过程的功能。GydF4y2Ba

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

奥雅萨苜蓿GydF4y2Bal . ssp。GydF4y2Bajaponica.GydF4y2Ba(简历。日本晴(Nipponbare)，由福建省农业科学院生物技术研究所维护。水稻植株在温室中进行部分调节，温度为26-32°C，光照14小时/暗10小时。为了研究开花时间，水稻植株分别在SD (9.5 h光照，28°C/14.5 h黑暗，26°C)和LD (14.5 h光照，28°C/9.5 h黑暗，26°C)环境控制生长室中生长。GydF4y2Ba

QRT-PCR基因表达分析GydF4y2Ba

使用TRIzol试剂(Invitrogen公司，美国)从水稻组织中提取总rna。RNA样品用DNase I (Takara，中国大连)处理。用日本TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT试剂盒从0.5 μg RNA中提取第一链互补DNA。qRT-PCR在ABI QuantStudio 6 Flex系统(应用生物系统，美国)上使用FastStart Universal SYBR green Master (ROX)(罗氏，德国)进行。每个样品重复3次。用于分析的引物列在附加文件中GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba：表S7。GydF4y2Ba

系统发育分析GydF4y2Ba

OSMBD707的全长氨基酸用作查询以防范Plaza数据库（GydF4y2Bahttps://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/GydF4y2Ba）.检索到的序列针对NCBI非冗余（NR）蛋白质数据库（GydF4y2Bahttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/GydF4y2Ba）.使用Clustal X程序对同源物进行比对[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba]，使用MEGA X中带有1000个bootstrap重复的邻居连接算法构建系统发生树[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

质粒建设GydF4y2Ba

ATG起始密码子上游的1935年BP DNA序列GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba通过Nipponbare基因组DNA通过PCR扩增。将扩增的片段克隆到GydF4y2BaPCXGUS-P.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]，导致含有融合的二元载体GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba启动子和A.GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba报告基因。开放阅读框（ORF）的GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba用特异性引物扩增，克隆到GydF4y2BaPCXUN.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]，导致二元载体GydF4y2BaPCXUN-OSMBD707.GydF4y2Ba其中GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba由玉米泛素-1启动子驱动。一个213bp DNA片段GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba和388-bp填料DNA片段GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba通过使用特异性引物扩增基因。使用作为模板的两个扩增片段进行重叠PCR。将得到的发夹rnai片段克隆到GydF4y2BaPCXUN.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba，得到一个二进制RNAi向量GydF4y2BaPCXUN-OSMBD707-RNAIGydF4y2Ba．靶向编码区域的两个SGRNA序列GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba都是根据单田芳的计划设计的[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]．如前所述进行CRISPR / CAS9载体的构造[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]．合成了对应于设计的SGRNA的DNA寡核苷酸，并将二聚体克隆到GydF4y2BapYLgRNA-OsU6aGydF4y2Ba和GydF4y2BapYLgRNA-OsU6bGydF4y2Ba， 分别。因此将得到的SGRNA表达盒克隆到GydF4y2BapYLCRISPR / Cas9Pubi-HGydF4y2Ba[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]．生成的亚细胞定位结构GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Ba的ORFGydF4y2BaGFP.GydF4y2Ba基因被扩增并克隆到GydF4y2BaPCXSN.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]，导致二元载体GydF4y2BaPCS-NGFP.GydF4y2Ba．的GydF4y2BaOsMBD707GydF4y2Baorf消化从GydF4y2BaPCXUN-OSMBD707.GydF4y2Ba经过GydF4y2BaBAMGydF4y2Ba嗨然后克隆到了GydF4y2BaBAMGydF4y2Ba嗨消化GydF4y2BaPCS-NGFP.GydF4y2Ba用框架融合GydF4y2BaGFP.GydF4y2Ba基因。用于质粒构建的所有引物或寡聚物在附加文件中列出GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba：表S7。GydF4y2Ba

水稻原生质体转染和稳定的转化GydF4y2Ba

以2周龄黄化幼苗的鞘和茎组织为原料制备原生质体。的GydF4y2BaGFP.GydF4y2Ba独自一人和GydF4y2BaGFP-OSMBD707.GydF4y2Ba融合构建物分别与细胞核标记物共转染GydF4y2BaDsRed-OsH2BGydF4y2Ba[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba通过如前所述的PEG介导的方法进入水稻原生质体[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba]．如前所述进行了水稻稳定转化[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]．引入了二进制向量GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2BaEHA105和转化体菌株用于转化CV的愈伤组织。nipponbare。纯合转基因植物在t中筛选GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba自花授粉产生的后代GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba植物，并维持到tGydF4y2Ba_3.GydF4y2BaTGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba一代又一代。GydF4y2Ba

GUS染色和GFP检测GydF4y2Ba

GUS组织化学染色按照[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba]．将水稻组织浸入X-Gluc（Thermo Fisher Scientific，USA）染色溶液，过夜，随后在室温下在70％乙醇中漂洗1或3天。用奥林巴斯SZX12立体声显微镜进行图片。将转染的水稻原生质体在室温下温育16-20小时。荧光显微镜在Leica DMI8激光扫描共聚焦显微镜（Leica，Germany）上进行，具有激励/发射波长488/535nm，用于绿色荧光。GydF4y2Ba

RNA-SEQ分析GydF4y2Ba

在播种后约50天收集过表达线OX707-＃21和野生型的完全扩张的叶子。从叶组织中提取的总RNA在诺二烯（北京，中国）进行RNA-SEQ分析。每种样品的三到四个生物重复用于RNA-SEQ分析。简而言之，使用NeB的Next UltraTRNA文库预备套件来制造illumina（Neb，USA），以制造商的说明，产生测序文库。该文库在Illumina Novaseq平台上测序。通过内部Perl脚本处理原始读取，并使用Hisat2 v2.0.5映射到参考基因组的过滤的清洁读数。计算每个基因的FPKM值，用于估计基因表达水平[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba]．所有基因计数和FPKM值都可以在附加文件中获得GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba：表S8。使用DESEQ2进行OX707-＃21和野生型之间的基因表达差异[GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba]．具有Padj <0.05和log2foldchange> 1的基因被分配为差异表达。GO和DEGS的KEGG浓缩分析由集群分析器实施[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

原始数据以SRA登录方式保存在NCBI数据库:SRP303927 (GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/srp303927GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

MBD：GydF4y2Ba

Methyl-CpG-binding域GydF4y2Ba

NCBI:GydF4y2Ba

国家生物技术信息中心GydF4y2Ba

RGAP：GydF4y2Ba

水稻基因组注释项目GydF4y2Ba

FPKM:GydF4y2Ba

每百万片段中转录本的预期片段GydF4y2Ba

DAP：GydF4y2Ba

几天后授粉GydF4y2Ba

QRT-PCR：GydF4y2Ba

定量RT-PCRGydF4y2Ba

SD：GydF4y2Ba

一天短的一天GydF4y2Ba

LD:GydF4y2Ba

漫长的一天GydF4y2Ba

可见：GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

去：GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

KEGG:GydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组的百科全书GydF4y2Ba

子:GydF4y2Ba

开放阅读框架GydF4y2Ba

sgRNA:GydF4y2Ba

单引导RNAGydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

省部共建国家重点研发计划项目(2016YFD0102103)和福建省农业科学院科技创新项目(ZYTS2019014)资助项目(MW)资助资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿准备方面没有作用。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 闽江大学海洋研究所海洋与农业生物技术重点实验室，福州350108GydF4y2Ba

   蒙宇曲，廷明亮，古都志和松面陈GydF4y2Ba

2. 福建省农业科学院生物技术研究所，福州，350003GydF4y2Ba

   张祝建，梁廷民，牛培培，吴明基，陈自强，陈再杰GydF4y2Ba

3. 福建农林大学农学院，福建福州350002GydF4y2Ba

   Zhujian Zhang，Peipei Niu＆Shubiao ZhangGydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

SZ和SC构思并设计了实验。MQ、ZZ、TL、PN和ZQC进行了实验。MQ、MW、WC、SC对数据进行了分析。MW和ZJC提供试剂和工具。该手稿由MQ和SC撰写。所有作者均已阅读并批准本稿件。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaShubiao张GydF4y2Ba或GydF4y2Ba宋彪陈GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。GydF4y2Ba

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