CIPK11gydF4y2Ba：钙调磷酸酶B-类蛋白相互作用蛋白激酶gydF4y2Ba白刺tangutorumgydF4y2Ba，对盐和干旱有耐受性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

的gydF4y2BaCIPKsgydF4y2Ba是一组响应钙信号的植物特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在植物对不利环境的生理和发育适应中发挥重要作用。然而，盐生植物的功能派生gydF4y2BaCIPK.gydF4y2Bas的仍然知之甚少，限制的潜在应用gydF4y2BaCIPKsgydF4y2Ba从盐生植物提高糖叶植物对非生物胁迫的耐受性。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，我们描述了gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba基因来自盐生植物gydF4y2Ba白刺tangutorumgydF4y2Ba并分析了其在耐盐、耐干旱胁迫中的作用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba作为转基因模式系统。gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba表达在上调gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba盐或干旱治疗后的根，茎和叶片组织。过度表达gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在不同NaCl浓度的培养基上提高种子的萌发率。与野生型相比，转基因植株在盐胁迫下生长更旺盛，在盐或干旱条件下生长的根更长。此外,gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba过表达改变了脯氨酸代谢关键酶基因的转录gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba然而，暴露在盐度下，这些基因在转基因中表现出相对较弱的表达gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba接受甘露醇处理，一种类似干旱胁迫的情况。脯氨酸积累显著gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba-过表达的转基因植株在NaCl处理下与野生型相比，但在甘露醇干旱胁迫下未观察到这一现象。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们得出结论gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba通过调节控制脯氨酸积累的基因的表达，促进植物生长并减轻与盐胁迫相关的损害。这些结果扩展了我们对盐生植物衍生的功能的认识gydF4y2BaCIPK.gydF4y2Ba并表明gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba可作为通过基因工程提高糖植物耐盐耐旱性的候选基因。gydF4y2Ba

土壤盐碱化和干旱是植物发育的关键环境威胁，通过对养分和水分的可用性、运输和分配产生负面影响，限制植物生长。这些影响有可能导致全球农作物产量下降，加速土壤沙漠化的步伐，进一步影响生态平衡[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．因此，了解盐生植物对盐和干旱胁迫是通过培育新抗逆植物保持农业生产率的关键可能与非生物胁迫应对[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba属白刺科gydF4y2Ba白刺gydF4y2Ba在中国西北广泛分布的Sapindales [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba是一种适应严重干旱和高盐度的沙漠烟灰，一般在干旱或高盐度中生长[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．此外，该物种还能有效缓解土壤盐度，固定流沙，在环境平衡中发挥重要的生态作用[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．先前的研究表明gydF4y2Ba白刺gydF4y2Ba可以通过增加抗氧化酶活性，脯氨酸积聚，可溶性碳水化合物水平并减少细胞内Na来适应非生物胁迫条件gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba比率 [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．然而，其生理适应性的分子机制gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba对各种压力需要进一步研究[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了感知盐度和干旱胁迫，植物进化出了各种胁迫传感器、信号通路、转录因子和启动子，通过改变它们的新陈代谢、生长和/或发育来引发必要的响应[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．加利福尼亚州gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}在各种信号转导网络中作为普遍存在的信使，以诱导特定的细胞反应，例如对非生物应激信号的反应[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．之前的研究已经确定了能够感知钙的蛋白质gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}水平,包括gydF4y2Ba凸轮gydF4y2Ba，gydF4y2BaCDPKgydF4y2Ba和gydF4y2BaCBLgydF4y2Ba．gydF4y2BaCBLgydF4y2Ba通过与互动进行函数gydF4y2BaCIPK.gydF4y2BaS来激活特定目标和传递信号[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2BaCIPK.gydF4y2Bas包含一个高度保守的n端激酶结构域和一个独特的c端调节区域，该区域具有一个保守的NAF氨基酸基序，已被发现通过调节各种生理反应来促进耐受性[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．过度的gydF4y2BaOsCIPK12gydF4y2Ba通过诱导脯氨酸和可溶性糖的积累提高水稻对冷、干旱和盐胁迫的耐受性[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2BaCaCIPK6gydF4y2Ba从鹰嘴豆中提取的生长素已被证明可以调节烟草幼苗的耐盐性[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．过度的gydF4y2BaBrCIPK1gydF4y2Ba通过增加水稻脯氨酸生物合成增强非生物胁迫耐受性[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．此外，gydF4y2BaCIPKsgydF4y2Ba可能通过调节活性氧清除剂POD、SOD和CAT的活性来降低HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和丙二醛，提高抗压力能力[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba或控制离子和水的稳态以提高耐盐性[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．这些发现不断揭示了gydF4y2BaCIPK.gydF4y2BaS IN调节可以改进植物的胁迫耐受性生理因素。gydF4y2Ba

在这里，我们确定了一个新的成员gydF4y2BaCIPK.gydF4y2Ba基因家族从gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba，gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba，并描述其在耐盐和耐旱分子调控中的作用。我们发现了gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Bawas induced in root, stem and leaf tissues by 500 mM NaCl or 200 mM mannitol, with transcripts preferentially accumulating in leaves. To further explore howNtCIPK11gydF4y2Ba可能在分子上起作用，我们在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．在NaCl和甘露醇处理后，转基因植株的发芽率高于野生植株，生长状况也优于野生植株。此外，我们发现参与谷氨酸衍生脯氨酸生物合成的基因[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba在转基因植物中受到调控。此外，转基因植株的脯氨酸积累量显著高于野生型幼苗。相反，HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容显示较少的水平gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba我们的数据表明gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba能否通过调控特定生化过程中关键基因的表达来调控脯氨酸的积累gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，从而提高应对非生物胁迫植物耐受性。gydF4y2Ba

n tangutorumgydF4y2Ba生理学上响应盐处理gydF4y2Ba

作为一种适应盐环境的盐生植物，gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba已成为利用生化方法研究耐盐机制的研究重点[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]及分子生物学技术[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba］．为了更好地了解耐盐性，我们观察到了生长形态gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba400mm NaCl处理时(图4)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.用自来水浇灌幼苗18 d后，生长状态保持不变(0 mM NaCl处理)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba啊）。然而，用400mM NaCl处理的植物表现出存在的动态变化。底部叶片逐渐枯萎，变为黄色，处理延伸。在一周之后，盐胁迫条件下的幼苗与未处理的幼苗显着不同，特别是底叶（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA-F）。然而，用盐处理一周的植物在自来水再次恢复另外10天并显示比未处理的植物更剧烈的生长。更多的新叶片出现在盐处理幼苗的尖端（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag，h和h'）。为了进一步研究耐盐性的生理机制，在400mM NaCl处理后在植物中测试抗氧化剂酶POD，SOD和猫的活性（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bai (k)。结果表明，盐度对这些抗氧化酶活性有不同程度的影响。在400 mM盐浓度下，POD和SOD活性在处理第1天显著升高(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在我们的实验中，CAT对盐处理没有明显的响应(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba此外，我们还发现游离脯氨酸在植物对干旱和盐度等环境胁迫的响应中起着积极的作用[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]，显着积累gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba盐处理后（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bal).此外，MDA含量，表明膜的完整性[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]，盐处理（图过程中稍有改变。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba因此，这些数据综合起来表明gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba显著提高抗氧化酶的活性和脯氨酸含量，保护细胞膜，从我们的实验条件下被极大地受到盐胁迫。gydF4y2Ba

NtCIPK11gydF4y2Ba识别和生物信息学分析gydF4y2Ba

大量的植物基因在不同的胁迫下表现出不同的反应，这已经被认为是基因工程的潜在资源。然而，这些候选基因大部分是从糖胞体中分离出来的，糖胞体对环境压力的耐受能力相对较差[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．因此，来自卤素物的分子信息可用于分析应力耐受性的机制是有限的。作为结果，gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba选择了我们研究中的功能基因探索。我们使用了5'和3'种族来确定新型基因的完整cDNA核苷酸序列，发现它的长度为1677bp，236bp 5'UTR和127bp 3'UTR。编码区域是1314bp长，并用计算的分子量为49.4126kDa编码438个氨基酸多肽。BLASTP搜索和多个对准分析表明，该克隆的推导蛋白质序列与其他物种中的CIPK脱节表显示出高度同一性（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).蛋白序列同源性为73.48%gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2BaCIPK11（XP_021639925.1），与CIPK11（XP_006431996.1）的72.62％的身份gydF4y2Ba柑橘克莱门蒂娜gydF4y2Ba与AtCIPK11 (AAK16686.1)的同源性为67.34%gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba（无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。相似，其同系物，此推导的蛋白质具有与ATP结合位点，活性位点和C端调节结构域（310-369个氨基酸）具有N-末端丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域（26-279 AA）CBL相互作用NAF / FISL模块（图gydF4y2Ba2gydF4y2Baa），在CIPK家族中高度保守的主题。疏水性印迹和跨膜结构域预测表明，NTCIPK11的最疏水区段位于氨基酸残基210和221之间（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab和c).此外，系统发育分析gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2BaCIPK蛋白和26gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaCIPK蛋白表明，新的烟道CIPK作为ATCIPK11的姐妹分支到无内含子亚组[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba];因此我们称它为gydF4y2Ban tangutorum CIPK11gydF4y2Ba（gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

NtCIPK11gydF4y2Ba在gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba积极回应盐处理gydF4y2Ba

为了研究是否gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba表达受盐的调节gydF4y2Ba白刺gydF4y2Ba，我们用500 mM NaCl处理幼苗2小时。qPCR表达谱显示未经处理gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在根，茎和叶中表达，后两组织表达比根部高1.4-和1.8倍的组织（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa). 500mm NaCl处理后，我们发现gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba与未处理的根相比，根中转录量增加了7倍，茎中转录量增加了17倍，叶中转录量增加了118倍。这一发现表明gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba盐处理后，转录本优先在叶片组织中积累(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）。gydF4y2Ba

NtCIPK11gydF4y2Ba过表达导致提高耐盐性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

调查如何gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在分子层面上，我们克隆并过度表达了该基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．转基因种子gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在½MS无盐培养基上，植株的平均发芽率为95.66%，接近WT种子的96.05%;然而,gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba- 转化的种子显示出88％或57％的萌发速率，分别在50毫米NaCl或150mM NaCl处理后，大约两倍的WT萌发率为45％和25％在相同的盐条件下（图．gydF4y2Ba4gydF4y2BaB和c）。20天后，gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba-过表达的植株根系较长(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)和更高数量的叶片(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa和c)和根(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad）比WT植物，差异特别大，在用150mM NaCl处理的培养基处理的植物之间。因此，我们得出结论gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba过度表达显着促进了种子萌发并诱导耐盐性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

过度的gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba改变了参与脯氨酸代谢和积累的基因的转录模式gydF4y2Ba

在植物中，脯氨酸已被报道在暴露于各种胁迫后积累，包括盐、干旱和冷胁迫[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．如图所示在以前的研究，gydF4y2BaCIPK.gydF4y2Ba过表达促进了脯氨酸的积累，提高了植物对寒冷和干旱胁迫的耐受性[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．探讨异位表达的可能机制gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba增加耐盐性，脯氨酸代谢的四个关键基因，gydF4y2BaP5CS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaP5CS2.gydF4y2Ba，gydF4y2BaP5CRgydF4y2Ba［gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba),gydF4y2BaProDH1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]，通过qPCR对WT和转基因植株进行检测。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，与脯氨酸合成有关的基因具有显着更高的表达水平gydF4y2BaNtCIPK11-gydF4y2Ba在盐胁迫条件下，过表达的植株比野生型植株中表达的植株多(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA-C）。然而，gydF4y2BaProDH1gydF4y2Ba调节脯氨酸分解代谢的转子在转基因植物中的表达水平低于WT植物（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad)。重要的是，在100 mM NaCl处理下，转基因植株的脯氨酸含量显著高于野生型植株(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae)。此外,HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在转基因植物根部观察到浅棕色，特别是在OX-1幼苗中，但在100mM NaCl处理下WT植物中的深褐色（gydF4y2Ba无花果S1。gydF4y2Ba）.这些结果表明gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba过表达影响了脯氨酸代谢相关基因的表达和脯氨酸的积累，这可能介导了ROS的减少，从而减轻了盐胁迫对植物的伤害。gydF4y2Ba

NtCIPK11gydF4y2Ba对干旱处理有积极反应gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba

研究…的作用gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在干旱耐受性中，我们通过用200mM甘露醇治疗2小时来模拟干旱胁迫，观察到了gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba表达改变。我们发现了gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba甘露醇处理后，根、茎和叶组织的转录水平分别增加了15倍、20倍和38倍，但增幅略小于盐处理。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).综上所述，这些结果表明，在对至少两种非生物胁迫(盐和干旱胁迫)的响应中，gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba表达增加。gydF4y2Ba

过度的gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba增强发展gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba干旱胁迫下的幼苗gydF4y2Ba

学习如何gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba影响干旱应激反应，转基因种子gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba并且WT植物的肥华播种在含有各种浓度的甘露醇的½MS-琼脂平板上。与暴露于盐处理的幼苗相比，WT和转基因植物的种子萌发不受甘露醇治疗的影响（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).然而，我们发现WT幼苗的发育比转基因植株慢，这可以从萌发后4天形成两个子叶的幼苗的百分比来说明(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在½MS培养基中添加甘露醇导致大量WT种子发育受阻，在浓度为100 mM、150 mM和200 mM的甘露醇下，分别有31%、20%和5%的幼苗达到双子叶期(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab）。相比之下，多达91％，80％和70％gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba- 转化的种子开发了两个子叶（图gydF4y2Ba7gydF4y2Bab）。因此，这些结果表明gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在植物生长初期，在干旱胁迫条件下能促进幼苗发育。gydF4y2Ba

过度的gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba提升gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba干旱胁迫下的根系生长gydF4y2Ba

为进一步研究gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在干旱治疗过程中，我们观察到植物生长20天对含有不同浓度的甘露醇的培养基。的gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba-过表达植株在甘露醇处理后比野生型植株表现出更好的生长(图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa).转基因株系的主根比WT株系长，特别是在150 mM或200 mM甘露醇处理后(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa和b).确定是否gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba与其正代的功能调节与脯氨酸介导的干旱耐受性有关的基因的表达，四种基因的转录物（gydF4y2BaProDH1gydF4y2Ba，gydF4y2BaP5CS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaP5CS2.gydF4y2Ba,gydF4y2BaP5CRgydF4y2Ba）通过QPCR测量，结果将结果与WT和WT的转录模式进行比较gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba-overmentring植物。我们发现了gydF4y2BaProDH1gydF4y2Ba甘露醇处理后，转基因植株的转录水平低于野生型植株，这表明转基因植株对脯氨酸积累有正向作用(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Baa).然而，与盐处理下的基因相比，脯氨酸合成基因表现出不同的表达模式gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba（无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba罪犯)。同时，我们观察到在甘露醇处理下，WT和转基因植株的脯氨酸含量都有所增加(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Bae）。转基因幼苗的脯氨酸含量明显低于与WT更高。然而，这一结果并没有显示WT之间的差异显著gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba-overexpressing幼苗(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba这些结果表明gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba通过影响脯氨酸代谢调节剂和脯氨酸积累但对不同程度的表达来参与干旱和盐胁迫信号传导。gydF4y2Ba

盐和干旱胁迫是威胁农业生产力和生态平衡的主要环境因素。作为自然选择和适应高压环境的结果，盐生植物已经进化出特定和多样化的高耐受性调节机制，这导致了环境适应的显著可塑性[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．因此，盐生植物适应恶劣环境的基本机制值得进一步研究。此外，了解盐生植物对各种胁迫条件响应的遗传学对开发转基因处理策略至关重要[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在我们的研究中，我们得出了三个主要结论gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba基因的分离gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba增加耐盐性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．第一，过度表达gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba结果表明，NaCl处理显著提高了种子的发芽率(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab和c)。其次，在盐处理下，转基因植株比野生型植株生长得更好(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.第三，gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在盐胁迫下，过表达引起的脯氨酸积累量高于野生型(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.这些结果表明，来自盐生植物的这个新基因在耐盐方面的功能与之前的研究结果非常一致[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba］．耐盐性诱导的机制gydF4y2BaCIPK.gydF4y2BaS以前已被确认:gydF4y2BaCIPK.gydF4y2Ba小号介导编码多种转运基因重要的离子平衡的表达[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]，增加抗氧化剂代谢物的量[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba]或促进相容性渗透细胞的积累，例如可溶性糖和脯氨酸[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba在盐胁迫条件下。此外，上一份报告还讨论了gydF4y2Ban tangutorum P5CSgydF4y2Ba对盐胁迫[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba，这有助于解释脯氨酸的积累gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba我们在我们的研究中观察过。因此，我们假设这一点gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba通过脯氨酸的积累功能，以保护植物高盐度条件下。其结果是，发现了调节脯氨酸水平的关键基因的差异表达gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba- 在盐胁迫下进行抑制植物和WT植物。上调调节脯氨酸合成的基因（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA-C）;相比之下，下调基因调节脯氨酸分解代谢（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD)，理论上可以提高脯氨酸含量。脯氨酸含量的增加进一步支持了盐处理下脯氨酸代谢相关基因的差异表达。gydF4y2Ba

在NaCl处理下，转基因植株中调控脯氨酸含量的特定基因的转录水平与野生型植株存在显著差异，表明了本研究的重要性。然而，我们发现gydF4y2BaP5CS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaP5CS2.gydF4y2Ba在正常条件下(无NaCl处理)，转基因植物OX-1表达下调，OX-2表达上调。此外，我们还观察到OX-1在对照条件下的脯氨酸含量低于WT，这进一步支持了脯氨酸合成相关基因在转基因幼苗中的低表达。这一结果可能与CBL-CIPK复合物的同一性有关。CBL传感器蛋白需要结合CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}并激活下游靶CIPKs，从而调节特定的生化过程[gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba］．换句话说，钙的相对低浓度的gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}在正常情况下可能会在CBL-CIPK信令网和其它下游靶基因的激活的调控因子。因此，不同浓度的钙gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}在WT和两个转基因植物可能是出于奇表达的潜在原因gydF4y2BaP5CS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaP5CS2.gydF4y2Ba在控制条件下。然而，尽管基因的低表达导致转基因幼苗中的低脯氨酸积聚，但植物没有患有非生物胁迫，因此在正常情况下与WT植物相比，没有任何显着变化的外观（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

相反，非生物胁迫诱导高浓度的CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}信号需要高活性的CBL-CIPK信号网络来激活下游靶基因对胁迫的响应。与非生物胁迫相关的特殊基因在钙离子中起调控元件的作用gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}转导。在我们的研究中，过度表达gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba调控盐胁迫下脯氨酸代谢相关基因的差异表达。此外，转基因细胞中ROS的减少gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba进一步解释了积极的功能gydF4y2BaCIPK11gydF4y2Ba从gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba关于植物处理盐胁迫的研究(gydF4y2Ba无花果S1。gydF4y2Ba）.我们的调查与研究共享部分要点gydF4y2BaCIPK.gydF4y2BaS源自rice [gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．米的异位表达gydF4y2BaOsCIPK03gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsCIPK12gydF4y2Ba导致脯氨酸在冷、干旱胁迫条件下显著积累[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．因此，我们认为我们的盐生植物来源gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba通过诱导基因表达，增强植物在盐胁迫下的脯氨酸积累，增强植物的耐盐性。gydF4y2Ba

脯氨酸被认为是一种相容的渗透剂[gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba]，一种活性氧清除剂[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba，以及酶和细胞结构等大分子的保护剂[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba，从而影响植物对逆境的适应性。Salt-inducedgydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba与脯氨酸积累相关的基因调节导致我们对对该基因的能力应对干旱胁迫的猜测。令人惊讶的是，通过100mm，150mm和200mM甘露醇应用模拟的干旱状况不影响种子萌发但苗木发育有限（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).相应地，脯氨酸合成酶在转基因植物中没有上调(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba罪犯)。然而，导致脯氨酸降解的酶的转录水平在WT幼苗中高于在gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba-overexpressing幼苗(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba这些结果似乎表明gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在干旱胁迫下对脯氨酸水平没有显着影响。这种结果的可能原因可能归因于植物在适应盐度和干旱方面的不同策略。虽然应力调节剂具有多种功能，但它们具有响应于不同应力的相同容量的概率很低。例如，gydF4y2Ba拟南芥CIPK11gydF4y2Ba已被报告为通过控制转录因子Di19-3表达的干旱胁迫响应的负调节物，基因报道参与在非生物胁迫反应[gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba］．gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba在甘露醇处理引起的干旱胁迫下，过表达导致幼苗萌发后发育提前(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.因此，我们建议gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba可以促进耐旱性，但该机制可能在干旱条件下涉及脯氨酸积累。gydF4y2Ba

综上所述，我们确定了应激反应的基因gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba来自哈尔菲特gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba．异位表达gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba促进种子萌发和幼苗生长gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba盐处理后。而且，过表达gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba结果表明，NaCl处理后，幼苗中脯氨酸代谢相关基因转录发生变化，脯氨酸积累量较高。尽管在甘露醇处理下，与盐胁迫下相比，脯氨酸合成基因的转录模式受到了不同的调控，gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba过度表达仍然诱导幼苗对干旱胁迫的耐受性更高的耐受性。因此，它得出结论gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba是一个新的盐生植物基因，在植物对盐和干旱的响应中发挥积极作用。该基因可作为一种候选基因用于经济植物的分子育种，以获得更好的抗逆性。gydF4y2Ba

植物培养和处理gydF4y2Ba

n tangutorumgydF4y2Ba

的种子gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba是由中国林业科学研究院内蒙古磴口沙漠林业实验中心采集的。提供种子的研究机构gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba与南京林业大学有合作关系。作者张景波，属专业研究者gydF4y2Ba白刺gydF4y2Ba，承担正式的鉴定gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba谁收获了完全遵守制度指南的种子。我们不幸的是，我们无法找到一个凭证标本gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba存放于任何公共植物标本室。gydF4y2Ba

对于成功的发芽，gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba种子在4°C、相对含水量为7%的沙土中保存8周。种子在相对湿度为55% ~ 60%、26°C ~ 28°C、光照16小时/暗光照8小时的环境中混合土壤和沙子(1:1)的花盆中萌发。采用2月龄幼苗进行生化参数测定和qPCR分析。gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba

的种子gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(哥伦比亚生态型)野生型由Thomas Laux教授(德国弗莱堡大学生物学院信号研究中心BIOSS和CIBSS)提供。转基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba使用花浸法获得植物[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba］．为了产生种子进行表型分析，gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba筛选过表达植物直至获得纯合子种子。每个实验一式三份进行，每种基因型的至少120种种子。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba种子是表面灭菌并播种在含有不同浓度的NaCl或甘露醇的1/2 ms上，然后使用16-H光/ 8-H-暗循环在23℃下在生长室中培养。萌发后四天，观察植物的萌发率和幼苗开发;随后，分析生长状态20天后发芽后。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba种子萌发后20天立即用液氮冷冻，−80℃保存，进行qPCR检测。gydF4y2Ba

生化参数分析gydF4y2Ba

两个月大gydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba用400 mM NaCl浇灌幼苗进行形态学观察和生化参数测定。酶活性、脯氨酸含量和丙二醛含量分析采用Janmohammadi et al. (2012) [gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba， Zhou et al. (2014) [gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba］．1周gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba收获幼苗以测量脯氨酸含量。对每种生化参数测试进行三种技术和生物重复。单向ANOVA测试结合LSD多次比较用于统计分析。gydF4y2Ba

NtCIPK11gydF4y2Ba基因克隆gydF4y2Ba

从叶子中提取总RNAgydF4y2Ban tangutorumgydF4y2Ba幼苗使用总RNA纯化试剂盒(Norgen, Thorold, ON，加拿大)，然后使用DNase I去除基因组DNA污染物(TaKaRa，日本)。用紫外分光光度法测定总RNA浓度，用凝胶电泳法评价其完整性。按照制造商说明书(Invitrogen, Carlsbad, USA)，用逆转录酶合成双链cDNA。简并引物对gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba以杨树为材料，进行了碎片分离设计gydF4y2BaCIPK.gydF4y2Bahomeodomain。引物用于gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba片段隔离列于补充表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．全部长度gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba用5 '和3 ' RACE引物克隆序列gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba，如在SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒用户手册（BD Bioscience公司Clontech，美国）来表示。的完整编码序列gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba根据RACE序列，利用引物gydF4y2Ba补充表3gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

NtCIPK11gydF4y2Ba序列分析gydF4y2Ba

NtCIPK11gydF4y2Ba从NCBI Blastp搜索来自其他物种的正交。分子量的gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba，由在线软件包ExPASy (gydF4y2Bahttps://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/gydF4y2Ba）.的多序列比对gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba采用DNAMAN 6.0进行校正。中的特征主题和域gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba使用InterProScan在线软件(gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/InterProScan/gydF4y2Ba）.用于比对的序列和物种的登录号列于gydF4y2Ba补充表4gydF4y2Ba．使用ProtScale工具对NtCIPK11蛋白进行疏水分析和跨膜结构域预测(gydF4y2Bahttp://ca.expasy.org/tools/protscale.htmlgydF4y2Ba）和TMHMM服务器2.0（gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/gydF4y2Ba）.用的氨基酸序列进行系统发育分析gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba和26.gydF4y2BaCIPKsgydF4y2Ba从gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba使用Mega 6的NJ方法与1000 bootstrap复制和JTT模型。用于系统发生树的序列的登录号列于gydF4y2Ba补充表5.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

实时荧光定量PCR分析gydF4y2Ba

确认…的反应gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba利用2月龄的根、茎和叶组织的总RNA进行qPCRgydF4y2BaN.Tangutorum.gydF4y2Ba用500 mM NaCl或200 mM甘露醇处理幼苗2小时。gydF4y2BaNtCIPK11gydF4y2Ba-overexpressing和WTgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba用100 mM NaCl和200 mM甘露醇培养基进行脯氨酸相关基因的转录分析。如前所述，总RNA被逆转录。qPCR使用SYBR-Green PCR Master Mix在LightCycler®480实时PCR检测系统(罗氏，巴塞尔，瑞士)上进行，根据制造商说明。目的基因的表达水平通过管家基因actin in的转录标准化gydF4y2Ba白刺gydF4y2Ba［gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba),gydF4y2BaUBQ10gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba］．每个实验的三种技术复制在三个生物学重复中进行。用于QPCR分析的引物用Primer3设计gydF4y2Bahttp://frodo.wi.mit.edu/gydF4y2Ba）.列入每个基因的特定引物的序列gydF4y2Ba补充表6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

检测H.gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba积累gydF4y2Ba

1周gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba幼苗已用于hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba积累的分析。将每个株系(WT和2个转基因株系)的18株植株浸泡在DAB (Sigma-Aldrich，目录编号:D12384)染色液中检测HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba］．用徕卡M165FC显微镜对染色4小时的幼苗形态进行成像。gydF4y2Ba

NtCIPK11gydF4y2Ba序列数据已提交到NCBI数据库，并附上否则。MW014363。支持本文结果的所有其他数据都包含在纸张及其补充文件中作为数字或表格。gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

反应性氧气gydF4y2Ba

荚：gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

猫：gydF4y2Ba

催化剂gydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

P5CS：gydF4y2Ba

吡咯啉-5-羧酸乙酯合成gydF4y2Ba

p5cr：gydF4y2Ba

Pyrroline-5-carboxylate还原酶基因gydF4y2Ba

PROSH1：gydF4y2Ba

脯氨酸脱氢酶基因gydF4y2Ba

qPCR:gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

JTT：gydF4y2Ba

Jones-Taylor-ThorntongydF4y2Ba

UBQ10：gydF4y2Ba

泛素10gydF4y2Ba

凸轮:gydF4y2Ba

钙调蛋白gydF4y2Ba

CDPK：gydF4y2Ba

Calcium-dependent蛋白激酶gydF4y2Ba

CBL:gydF4y2Ba

钙调磷酸酶b蛋白gydF4y2Ba

CIPK:gydF4y2Ba

CBL相互作用的蛋白激酶gydF4y2Ba

氟化钠:gydF4y2Ba

Asn-Ala-PhegydF4y2Ba

FISL：gydF4y2Ba

Phe-Ile-Ser-LeugydF4y2Ba

种族：gydF4y2Ba

cDNA结束的快速扩增gydF4y2Ba

WT：gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

牛：gydF4y2Ba

超表达gydF4y2Ba

轻拍:gydF4y2Ba

3, 3-diaminobenzidinegydF4y2Ba

作者感谢中国林业科学研究院沙漠林业实验中心的支持。感谢Thomas Laux教授提供的种子gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba野生型。作者感谢编辑和审稿人提供的有用的评论和建议。gydF4y2Ba

本研究得到了中国自然科学基金（31770715），江苏省重点研发计划（BE217376），江苏林业局（Lykj [2017] 42），江苏省清兰项目，江苏省自然科学基金（BK20181176），江苏高等教育机构（PAPD）的优先学术计划发展，以及南京林业大学博士学位（批准163010107）。资金组织在研究设计，数据收集和分析，数据解释或写作稿件中没有发挥任何作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 陆鲁和西宁陈同样为这项工作进行了贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 南京林业大学森林遗传与生物技术教育部重点实验室，南方可持续林业协同创新中心，江苏南京210037gydF4y2Ba

   陆璐，陈新英，王鹏凯，陆烨，程铁龙，史吉森，陈金辉gydF4y2Ba

2. 南京林业大学生物与环境学院，江苏南京210037gydF4y2Ba

   卢卢gydF4y2Ba

3. 中国林业科学研究院荒漠林业实验中心，内蒙古灯口gydF4y2Ba

   镜泊湖张gydF4y2Ba

4. 2 .中国林业科学研究院国家林业和草原局盐碱地研究中心，北京100091gydF4y2Ba

   岫岩杨gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CJH和SJ促成了这项研究的设计;WPK，LY，ZJB，YXY和CTL进行了统计分析;LL和CXY执行了稿件的实验并写下了稿件的部分。所有作者均致力于手稿修订并批准提交的版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba金惠陈gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba