葡萄种子和结实果实的体细胞变异

背景

葡萄的繁殖发育直接影响产量。它还影响浆果和葡萄酒的品质，如无核、浆果和束大小、簇紧致性和浆果皮与果肉的比例。产量、果实成分和葡萄酒属性的季节性波动主要由气候因素驱动，是全球鲜食葡萄和葡萄酒行业面临的主要挑战。因此，更好地了解生殖过程，如配子发育、受精、种子和结实率，对管理产量和质量至关重要。为了在这一领域提供新的见解，我们在两个种质集合中寻找种子含量不同的克隆。

结果

我们发现了8对变异对，它们似乎只在种子相关特征上有差异，但在使用GrapeReSeq_Illumina_20K_SNP_chip和几个微卫星测试时显示出相同的基因型。我们对来自不同授粉处理的种子和结果进行了多年的观察，特别强调了由Sangiovese和当地命名为Corinto Nero的无籽变种组成的对。Corinto Nero的花粉在离体培养中萌发失败，用于授粉其他品种时，果实结实率较低。大多数开放授粉和异花授粉的果粒都不含种子。通过对Corinto Nero正常种子的遗传分析，发现少数Corinto Nero功能配子大多未还原。此外，三种基因型，包括Sangiovese和Corinto Nero，意外地发现了没有花粉贡献的果实，偶尔显示正常的种子。从转录组数据中发现Corinto Nero和Sangiovese之间存在5个错义单核苷酸多态性。

结论

我们的观察使我们能够将无核类型归因于一些文献中没有记录的变体。有趣的是,VvAGL11在白Gouais Blanc的无籽突变体中也发现了引起Sultanina stenospermocarpy的突变。我们认为Corinto Nero的孤雌性是由花粉和/或胚囊缺陷驱动的，这两种事件都可能是由减数分裂异常引起的。在Sangiovese和Corinto Nero之间鉴定的单核苷酸多态性适合作为繁殖材料的可追溯标记和无籽表型的功能候选。

坐果是指静止的子房向快速生长的幼果的转变[1］．是否结实通常取决于授粉的成功完成，而果实的进一步生长则取决于启动种子发育的受精[2，3.］．在没有授粉和受精的情况下，子房停止细胞分裂并发生脓肿。例外是一个物种内的孤雌性物种或变种，它们的子房能够在没有受精的情况下发育，产生无籽果实。孤雌性对农民很有吸引力，因为它可以规避授粉和施肥的环境限制。同时，无籽水果既有利于食品加工业，也有利于生鲜消费。水果作物中广泛发生的孤雌性很可能是在它们的驯化和育种过程中对无籽性的选择压力的影响[4，5］．

在葡萄中，无籽是鲜食葡萄最珍贵的品质性状之一，世界对无籽品种的需求日益增长证明了这一点[6］．无籽也可能有助于降低群集密度，增强对病原体感染的抵御能力[7，8使浆果的成熟期协调一致。此外，孤雌葡萄可以确保多年来更稳定的产量，特别是考虑到气候变化[9，10]，当极端温度(冷热)和多雨条件会损害花粉粒和胚珠的育性[11，12］．当涉及到有限但仍然足够的果木时，没有种子也可能对葡萄酒质量有有利的影响。研究发现，在浆果总重量中，无籽浆果的比例较高，通过改变浆果皮/果肉的比例，避免未成熟种子的单宁所带来的令人不快的涩味，从而对葡萄酒的特性(颜色、口感和香气)产生积极的影响[13，14］．

葡萄有两种无核表型:孤雌型和窄精型[15，16］．通过孤雌果，产生了真正的无籽浆果。与此相反，在窄精子壳中，胚珠受精发生，但胚和/或胚乳流产，而胚珠珠被继续生长到某一点后停止。破裂越早，成熟的果实中就有更小和更原始的种子痕迹。

孤雌性主要观察在一个品种组，其突出的代表是“黑科林斯”或“黑加仑”(别名Korinthiaki)。它们绝大多数的浆果完全没有种子，非常小，呈球形;它们主要用来制作葡萄干。分子分析表明，孤雌科林斯型品种，包括黑科林斯、白科林斯(有一个粉红色变种称为红科林斯)、角醋栗和Corinto Bianco，在基因上没有亲缘关系[17，18］．与此相对应的是，上述品种在胚珠、胚囊和花粉等方面出现了不同的生殖缺陷[15，16，19，20.，21］．

窄ospermocarpy是一种古老的东方品种的特征，被称为“Kishmish”(在西方国家称为Sultanina或Thompson无籽)。这个品种与其他通常由它衍生而来的品种共享Kishmish(或类似名称)的名称，并且具有不同的基因型，通常来自东方[22，23］．在世界各地的鲜食葡萄育种项目中，Sultanina一直是无核的主要来源[17，24］．窄子莓含有部分发育的种子或种子痕迹，因此在商业用途上通常被认为是无籽的;它们的大小，虽然小，但符合新鲜水果的消费要求，并可通过激素喷雾增加。

研究了孤雄和窄精葡萄的无核遗传决定论。

在Pedro Ximenez的无籽变种Corinto Bianco中，孤雌性与减数分裂受损有关，减数分裂终止于缺乏成熟胚囊和花粉不育[21］．在基因组水平上，发现了区分这两个系的单核苷酸多态性(SNPs)，其中7个专门针对Corinto Bianco的突变被认为是孤雌性责任突变[21］．据我们所知，目前还没有其他研究揭示其他品种/变异的孤雌表型的分子基础，这些独立的体细胞突变可能影响有性繁殖。

在此基础上，研究人员对小鳞小蜂的遗传结构进行了广泛的研究。1996年,(25]提出了三个独立的隐性基因，它们由一个主要的显性抑制基因座调节，命名为SDI（种子发展抑制剂，根据[26)，控制种子发育。不同的QTL(数量性状位点)研究定位SDI在连锁组(LG) 18上，解释了高达70%的种子含量表型变异[27，28，29，30.，31］．根据遗传连锁和同源性假设，种子形态发生调控基因AGAMOUS-LIKE 11（VvAGL11)被提议为SDI候选基因(29，30.］．最近的综合遗传学和基因组学方法发现了一个错义多态性(一个在chr18:26,889,437位的SNP导致Arg197Leu替换)VvAGL11在所有与sultanina相关的无籽鲜食葡萄品种中导致种子流产的功能性突变[32］．在过去的二十年里(自从[33] [34])，其他一些基因也被认为在窄精子胚珠/种子流产或正常种子发育中起作用。尽管如此，如果这些转录本专门积累在种子中，那么在有籽和无籽整个果实的比较中检测到的这些基因的差异表达可能是无籽综合征(与种子相关的组织比例同时较低)的结果(而不是原因)[32］．根据结构变异和无籽性之间的联系，发现了更多的候选基因(如[35])。

尽管做出了努力，也取得了积极的科学进展，但葡萄的无籽现象仍有待进一步研究，特别是在新的无籽来源方面。除了科学推测之外，这类研究还可能揭示出人们对鲜食葡萄和酿酒葡萄育种的实际兴趣。

本研究旨在从表型和分子水平对葡萄种子和果实形成的调控机制进行研究。导致葡萄体细胞变异的机制可能包括疾病的变化(如病毒载量)、表观遗传差异、遗传改变或这些影响的各种组合[36］．在多年生植物物种中，突变体很难产生和筛选，自然体细胞变异为理解目标性状的遗传控制提供了独特的资源，因为它们可能是在给定遗传背景下的单个突变或表观事件的影响[36，37］．体细胞变异会影响浆果的主要特征，如颜色、无核或香气，在整个葡萄栽培历史中已经被发现和利用[38］．在本研究中，我们检测了8对种子含量不同的体细胞变异。所有被调查的基因型都是古老的品种，以有许多无性系变异而闻名。高水平的体细胞变异可能有遗传基础(例如，更不稳定的遗传背景)，也可能只是反映了较长的栽培历史或较大的生长扩展，从而产生显著数量的无性繁殖周期。

桑吉奥维塞有着悠久的历史记录，正如在1590年Soderini的专著《La coltivazione delle viti》中首次提及的那样。有71,558公顷的葡萄树[39]，桑吉奥维塞是目前意大利种植最多的葡萄，是生产基安蒂、蒙塔奇诺布鲁内罗和蒙普尔恰诺诺等著名葡萄酒的基础。桑吉奥维塞表现出巨大的表型异质性，是意大利国家葡萄品种目录中注册无性系数量最多的品种(128个)[40］．在我们的研究中评估的桑乔维塞无核体细胞变异，错误地命名为Corinto Nero，最初是在意大利南部卡拉布里亚的Librandi酒庄收藏中发现的[41］．西西里岛的埃奥利安群岛也发现了其他带有桑吉奥维塞人DNA图谱的科托·尼禄葡萄酒，过去他们在那里使用当地的葡萄干，现在在当地的混合葡萄酒中使用的比例非常小。42］．在意大利的其他地区还发现了桑娇维塞的无籽变种。来自Emilia Romagna的所谓的Termarina Nera被包括在这项研究中。其他桑吉奥维塞无籽变种存在于坎帕尼亚(意大利南部)，如Acinella(小浆果)(Antonella Monaco，个人交流)和皮埃蒙特。“Corinto Nero”这个名称指的是一种类似于Korinthiaki(加利福尼亚的黑色科林斯/法国的黑色科林斯)的表型，这是一种来自希腊的著名的单性果性栽培品种。

Moscato Bianco(全名:Muscat à Petits Grains Blancs)被认为是Muscat家族的创始人之一[43］．在VIVC数据库中[44，45它有327个同义词。马斯喀特的红色孤雌性变异体à Petits Grains blans被报道[17以“科兰特角”为名。在这项研究中出现的无核形式被鉴定为皮埃蒙特一个商业葡萄园的单一运动。

Gouais Blanc(作曲家Heunisch Weiss;Liseiret(本研究中的Liseiret)是数百个传统葡萄品种的始祖，自古以来几乎在所有温带欧洲葡萄种植国家都有栽培[46因为它的产量高，而且耐寒。事实上，异体Weiss无性系在形态学上有相当大的可变性。此外，在JKI葡萄育种研究所Geilweilerhof发现了一种窄精子carpic变种，被历史上的德国葡萄酿酒师错误地称为“Aspirant”[47］．本著作中所分析的加入与此变体相对应。

Chasselas主要生长在中欧，是一个古老的葡萄品种，包括大量的同义词和运动，在本研究中研究了一个名为“Chasselas Apyrène”的无核形式[24］．

窄精子品种Sultanina也是一个非常古老的品种，受到体细胞变异的影响。浆果较小且无败育种子的突变体("孤雌" Sultanina) [48]或有更大的圆形浆果和更大的种子痕迹(" Gigas ") [49已经被观察到。种子体细胞变异也被报道为“汤普森种子”[33]或" Sultanine Monococco " [44，45］．Dastatchine主要被描述为Sultanina的推定祖先/后代[17也可作为Sultanine Monococco的继承[50］．在这里，我们分析了达斯达奇属的一个继承，即Sultanine Monococco的种子变种，而不是它的原代或子代。

Corinto Bianco以前曾被报道为古代种子品种Pedro Ximenez的孤雌性果性变种[18]，而Termarina则是种子品种Sciaccarello (syn. Termarone)的孤雌性变异体[51］．我们还在分析中纳入了《黑色科林斯》(syn. Korinthiaki/黑色科林斯)作为孤雌性的参考。

除了Corinto Bianco和Sultanina，其他变种的种子和果实形成的变异的基础到目前为止还没有得到研究。桑乔维塞和它的无籽变种Corinto Nero在这里进行了更详细的研究。

的基因变异对

为了评估从同一品种区分体细胞变异的可能性，每一对克隆(表1)用SSRs(简单序列重复)和snp进行基因分型。

属于每一对的访问共享相同的微卫星配置文件(附加文件1:表S1)。Liseiret/Aspirant被证明与Heunisch Weiss相同，是Gouais Blanc的同义词[47， corthesin Noir到Korinthiaki，黑色科林斯的同义词[18和Termarone/Termarina Rosa到Sciaccarello，同义词Mammolo/Verano/Termarina [51］．

经过SNP数据集过滤，对Sangiovese/Corinto Nero、Termarone/Termarina Rosa、Chasselas Blanc/Chasselas apyrène和Pedro Ximenez/Corinto Bianco的GrapeReSeq_Illumina_20K_SNP_chip的所有经过位点进行了相同的SNP谱分析。PCR产物的Sanger测序未证实其他体细胞变异间潜在的不同snp(数据未显示)。

总之，本文分析的克隆无法通过微卫星和来自GrapeReSeq_Illumina_20K_SNP_chip的snp进行区分。

开放授粉的表型变异对

种子形成，坐果和浆果/束特征

考虑到所研究的8个体细胞变异体是根据它们的种子形成受损来识别的，首先将它们与原始品种的种子含量进行比较。其他性状被评估为受种子形成的潜在影响。特别是，种子的形成和发育水平会影响坐果和浆果的大小;这些反过来又会影响束的发育、重量、大小和密度。

对于大多数性状，无籽和有籽变异的差异行为在不同季节/地点是稳定的2:图S1)。

正如预期的那样，根据两年(2017年和2018年)对大多数配对的分析，所有无核无核无性系的种子浆果比例明显低于野生型无性系(图1)。1a和附加文件1:表S2)。特别是，Aspirant、Moscato Bianco突变体、Termarina Rosa、Sultanina和corinthenoir被证明完全没有正常的种子(然而，2019年在Moscato Bianco突变体和corinthenoir中注意到一些种子浆果，它们也比正常的大，如“检查种子和繁殖结构的痕迹”一节所述)。对于其他无籽系，有籽浆果的比例从1% (Corinto Bianco)到45.6% (Termarina Nera)不等(附加文件)1:表S2)。Corinto Nero的种子浆果的平均百分比为9.3%，这与之前从更多浆果中计算出的值一致(分别在2008年、2009年和2010年收集的2133、1539、1456个浆果中，有种子浆果的比例为5.0、3.1和4.3%)。我们可以很容易地注意到，桑乔维塞的两个无籽变种，Corinto Nero和Termarina Nera，表现出相当不同的表型，特别是在开放授粉时，中等浆果和有籽浆果的比例更高。2c).无籽组的种子浆果与有籽组的浆果大小相当(数据未显示)。

无籽种子的浆果平均含有一颗明显正常的种子。1b和附加文件1:表S2)。特别是，来自Chasselas apyrène和Corinto Bianco的所有种子浆果都有一颗种子，而来自Corinto Nero和Termarina Nera的一些种子浆果有第二颗种子。然而，根据空种子率(数据未显示)，这些种子中的大多数都不能存活。例如，这一比率(根据可浮性估计)被证明是来自Corinto Nero的种子浆果的11倍多(72.3%)，而桑娇维塞的种子浆果的比率(6.3%)(表2)2)．从有籽材料中获得的种子浆果平均具有一到两个正常种子。在各种子系中，Dastatchine种子数最少，Liseiret/Sangiovese种子数最多(图1)。1b和附加文件1:表S2)。大部分发育完全的种子在大浆果(A类)中发现，如图所示。2在附加文件中3.:图S2。Corinto Nero和Sangiovese种子的平均种子鲜重差异不显著，而Termarina Nera种子的种子重显著。在种子品种中，Liseiret和Moscato Bianco的种子最轻，而Dastatchine的种子最重，表明这些基因型的种子数与重量呈负相关(图1)。1c和附加文件1:表S2)。

在大多数情况下，除了正常发育的种子外，还发现了各种雏形种子、种子痕迹和微小残余(可能是胚珠痕迹)。3.)．对于Sangiovese/Corinto Nero案例研究，2018年，我们量化了有籽浆果、只有痕迹的浆果(归因于本文后面的胚珠)和没有任何雏形的浆果的比例，如附加文件所示4:图S3。在开放授粉的情况下，所有桑娇维塞浆果都包含至少一颗明显正常的种子，而大多数Corinto Nero浆果没有任何雏形，一小部分含有痕迹，只有2.5%含有种子。

为了评估种子发育对果实发育的可能影响，将每个无籽变种与原品种在坐果率方面进行比较。该参数仅在2018年进行了评估，因此，以下报告的数据不能被视为结论性的。作为初步结果，我们验证了在坐果期测量的坐果率与采收时无显著差异(数据未显示)。除Aspirant外，所有无籽变种的坐果率(在收获时估计)都比有籽变种的坐果率低，除了Corinto Nero/Sangiovese和Termarina Nera/Sangiovese外，所有被分析的对都观察到统计学上显著的差异(图1)。1e和附加文件1:表S2)。尽管如此，在IPSP自花授粉条件下，Corinto Nero和Sangiovese之间的坐果率差异显著(数据未显示)。Dastatchine的坐果率由于有效花序数量较少而无法计算，Corinto Bianco的坐果率由于开花后所有的花序都干燥而无法计算。

进一步研究了决定坐果率的两个因素，即每花序花数和每束浆果数。重要的(P数对无籽/有籽组合的每花序平均花数差异< 0.05。1d和附加文件1:表S2)。特别是，无籽变种Corinto Nero、Chasselas apyrène和Corinto Bianco的每花序花数明显高于有籽变种。虽然由于缺少种子参考资料(达斯达chine没有产生足够的花序)，我们无法进行任何统计比较，但很明显，额外的无籽材料(Sultanina和corinthenoir)显示出较高的花数。而对于花数明显低于Liseiret的Aspirant来说，这种普遍行为是相反的。同样，每束浆果数与种子含量没有明显的关系，而是表现为基因型依赖。特别是，无籽变种Corinto Nero和Corinto Bianco与有籽变种相比，每簇浆果的数量显著增加。这一趋势在无籽Moscato Bianco上相反，它的浆果数量明显低于野生类型(图1)。1f和附加文件1:表S2)。

更明显的是种子形成对果实大小和簇特征的影响，这是根据2年的分析(2017年和2018年)对大多数对和多达4个Corinto Nero/Sangiovese的情况所揭示的。

结果表明，与相应的有籽无核无性系相比，无籽无性系的果实明显较轻。1g和附加文件1:表S2)。在IPSP资源的集合中(其中浆果的长度和宽度都被测量)，无籽系的浆果比有籽系的浆果更短更窄，作为一个总体趋势，它们的形状更圆(图2)。4)．这些数据证实了平均浆果重量与平均每浆果种子数之间存在显著相关性(R = 0.79)。结果表明，仅在种子资源池中，平均浆果重与平均种子重显著相关(R = 0.67)。例如，Dastatchine (Pedro Ximenez在较小程度上)的种子和浆果都最重。

作为一种规则，来自无籽变种的簇明显比来自相应种子系的簇轻。1h和附加文件1:表S2)。在大多数情况下，它们也更短更窄，长宽比更大。1i j,无花果。5和额外的文件1:表S2)。根据OIV 204描述符和1年或更多情况下2年的评估，大多数无籽变种与有籽变种相比具有更松散的束。最明显的例外是Termarina Rosa(附加文件1:表S3)。与此同时，当考虑同一分析中的所有材料时，簇紧密性被证明与种子含量(种子浆果的百分比和每个浆果的种子数)、坐果率、浆果大小(重量)和簇大小(重量、长度和宽度，以及重量与大小的比值)呈正相关。除蔷薇野生型(Termarone，别名Sciaccarello)外，大部分基因型的簇紧性与上述性状的关系相似。当对每个基因型进行单独分析时，发现束紧度和浆果数(以及浆果数和束长之间的比例)之间存在额外的正相关，这可以证明使用浆果数作为束紧度的指标(附加文件)1:表S4)。

总之，我们的数据表明，种子发育水平对坐果率有潜在影响，并对浆果/束的特征有显著影响。

变种种子和繁殖结构痕迹的检查

为了确定发生在每个无核变异中的无核类型，有必要了解在无核浆果中发现的痕迹的性质:未受精的胚珠(孤雌果)或受精后在某个时间点流产的种子(窄胚珠)。为此，我们在2019年检查了所有基因型(除了三种)种子和变种的痕迹。事实上，在这个物候阶段，葡萄种子已经达到了梨的形状和大小(从结构的角度来看，它们是完全发育的)，比成熟时更容易提取和分析痕迹。

除Sultanina外，所有无籽品种都观察到两种不同的浆果大小类别(小和大)，而在有籽品种中只有Liseiret(表)3.)．

首先，对无籽基因型中最大的浆果和所有有籽基因型的浆果进行种子检测。除了Aspirant和Termarina Rosa，在所有的双大小无籽变种中，少数恢复的大浆果含有种子(表3.和额外的文件5:数字S4-S8)。悬浮试验表明，Corinto Nero和Moscato Bianco突变体的种子是至关重要的，而Chasselas apyrène和collins Noir突变体的种子大部分不是。当可能存活的种子被解剖时，通常观察到发育良好的胚乳，而胚胎则没有。这可能是由于所做切片的类型，因此不能排除胚胎的存在。有抱负的最大的浆果只具有繁殖结构的痕迹，但是种子成分的开始通常可以在比小浆果发育的更高级的阶段观察到5:图S4)。在Termarina Rosa的案例中，大浆果显示了与小浆果中含有的相似的痕迹5:图S7a-c)。与其他无籽变种不同，Aspirant和Termarina Rosa浆果大小的差异可能是由于从一串不同部分或不同串的浆果采样之间的物候延迟。到收获的时候，所有的浆果可能都达到了相同的大小。事实上，这也被观察到在Aspirant种子对应(Liseiret)，其大小成熟的浆果都有发育良好的种子。从每个种子基因型提取的种子的详细描述显示在附加文件中5:图S9。在分析的无籽/有籽对中，发现了种子长度和宽度的显著差异，这是Corinto Nero/Sangiovese和Moscato Bianco突变体/Moscato Bianco1:表S5)。值得注意的是，Corinto Nero的种子比所有其他品种的种子平均更大更宽。

然后，对无籽材料的无籽浆果进行了繁殖结构的观察。我们假设，如果在孤雌果(黑麒麟)和窄子果(苏塔尼亚)的参考品种的无核浆果中观察到痕迹，它们可能分别是未受精卵和种子痕迹的残余。在分析的这两个基因型浆果中发现了柔软的痕迹(附加文件5:图S8)。然而，在它们的长度和宽度上发现了显著的差异1:表S6)。特别是，事实证明，黑科林斯的痕迹比绝大多数Sultanina的痕迹要小得多。6a).在分析的其他无核变异中，Moscato Bianco突变体的浆果中完全没有任何痕迹，Corinto Nero和Termarina Rosa的痕迹与collins Noir的浆果聚集在一起，而Chasselas apyrène和Aspirant的痕迹主要分布在Sultanina的大小范围内(图1)。6b).事实上，在黑科林斯(corthesin Noir, Corinto Nero和Termarina Rosa)和苏丹娜(Sultanina, Aspirant和Chasselas apyrène)组的品种之间发现了显著的痕迹长度和宽度差异，但在每组内的品种之间没有差异(附加文件)1:表S6)。基于这些结果，我们假设Corinto Nero和Termarina Rosa的大部分痕迹可能是未受精的胚珠，而在Aspirant和Chasselas apyrène的无籽浆果中发现的那些可能是在发育早期或后期流产的种子残留物。在Aspirant和Chasselas apyrène中发生受精的一些证据也存在结构，如厚壁组织和/或胚乳，一个大的退化的珠心，以及从它们的无籽浆果中提取的明确的梨形种子痕迹5:图S4及S5)。相反，在Corinto Nero和Termarina Rosa的无籽浆果的检测痕迹中，没有任何这些结构或特征的种子形状5:图S6和S7a-c)。在分析从开花到辣椒玉米大小浆果的六个阶段时，桑娇维塞无籽变种的胚珠基本上保持在相同的长度和宽度范围内，这进一步证实了上面的假设，即它们是未受精的胚珠。相反，桑乔维塞野生型的胚珠随着物候期的进展而增大，也就是说，它们很可能是受精卵演变成种子的胚珠(图1)。6c和附加文件6:图S10)。

我们的集体观察表明，在Corinto Nero、Moscato Bianco突变体和Termarina Rosa中，在Aspirant和Chasselas apyrène中发生了单性果性。

了解种子发育变异的基础

为了找出影响所研究材料种子形成的变异的基础(特别强调Corinto Nero)，我们研究了一个可能的驱动因素，即配子功能。

雄配子(花粉)功能的评价

花粉活力与萌发

在2014年、2016年和2017年三个季节，Corinto Nero花粉粒的体外活力和萌发率均为零或接近零。反之，桑娇菊花粉活力和发芽率平均分别为20%和40%。Corinto Nero的花粉行为与Corinto Bianco非常相似，我们观察到Corinto Bianco在1年(2018年)中没有活力和萌发能力，而它的种子对手(Pedro Ximenez)的花粉颗粒却表现出了很高的萌发能力。相反，Chasselas apyrène和Sultanina在同一年都有功能花粉(图1)。7a - b)。在2017年和2018年两个季节，黑科林斯花粉的活力和萌发率也很高(平均值为79%和44%，数据未显示)。

授粉的治疗方法

通过自花授粉和异花授粉试验，研究了无籽变型花粉的体内性能。

A)自花与开放授粉:花粉源对桑娇维塞及其无籽变型种子形成的影响不同。特别是，根据2013年和2018年进行的试验，尽管桑娇维塞开放和自花授粉的浆果簇显示出相同的种子浆果比例，但自花授粉后，具有正常种子的Corinto Nero浆果的比例明显较低。预计Termarina Nera也会有类似的结果，但由于2018年评估了一束自花授粉植物，因此没有任何静态测试支持这些结果。相反，在分析的2018年结子的无籽变种中，Chasselas apyrène在有籽浆果的百分比上不受授粉处理的影响(附加文件1:表S7)。

与结实率的发现类似，事实证明，位于IPSP的Corinto Nero在自花授粉条件下的坐果率(根据2018年的估计)显著降低。相反，对于其他可进行统计比较的无籽材料(Chasselas apyrène, Sultanina和corinthenoir)，授粉处理之间没有差异。根据2013年和/或2018年的评估，每束浆果的平均数量也得到了相同的结果1:表S7)。

B) Nebbiolo/Trebbiano Toscano与Corinto Nero花粉的授粉:与Nebbiolo自花花序的坐果率相比，Nebbiolo与Corinto Nero花粉的异花授粉浆果坐果率较低。当Trebbiano Toscano与Corinto Nero花粉交叉授粉时，也得到了类似的结果。从Nebbiolo和Trebbiano Toscano与Corinto Nero花粉的异花授粉中获得的几乎所有种子都不发芽4)．

C)一些对和其他品种的去雄:本实验最初是为了评估Corinto Nero的单性生殖潜力，考虑到该加种在没有功能花粉的情况下仍能在自花授粉条件下坐果，然后扩展到其他加种。虽然大多数处理过的基因型中被阉割和覆盖的花序干燥，但Sangiovese、Corinto Nero和Gamay被证明在去除花药(当测试时，也去除柱头)后可以坐果。这种能力在不同的季节和地点得到证实，但桑娇维塞在最早期进行去雄/去毛时失去了坐果能力(E-L 15)，而加美伊显然没有受到影响(表5)．2019年，Sangiovese和Corinto Nero在阉割后的坐果率分别为42%和21%(相比之下，开放授粉时为66%和50%)(数据未显示)。

由去势花序衍生的桑乔维塞簇只有少量的带种子的大浆果(a类)(从所有簇中收集浆果时为1.9 - 8.2%)。与对照组相比，大多数浆果明显更小(B类和主要是C类)，而且含有生殖结构的痕迹。这些痕迹包括非常小的残余(胚珠或种子痕迹)以及显著的原始种子。Corinto Nero的簇由去势的花序衍生而来，与对照的簇相似:很少有携带种子的大浆果发育出来(从0.4%到7.6%)，而大多数浆果是小的(C类)，含有微小的痕迹(可能是未受精的胚珠)。去雄后形成的Gamay簇和浆果比对照小。只有少数浆果(2015年0.6%)具有正常种子，而大多数浆果具有雏形种子(图。2c,无花果。8和额外的文件7:图S11)。

所有的幼苗都来自于从阉割的植物束中提取的偶尔正常种子，其中四株来自Gamay，三株来自Sangiovese，一株可能来自Nebbiolo，它们的微卫星图谱完全兼容自花授粉。有趣的是，去势后的Gamay幼苗的SSR标记是纯合子的1:表S8)。一些幼苗的叶子有斑驳的绿色和白化部分。

雌配子(胚囊)功能的评价

用Nebbiolo花粉人工授粉的Corinto Nero的四个阉割花序结果7:图S12)。大多数浆果为中、小型(97.3%)，不含种子(95.5%);少数恢复的种子未能发芽。

探索配子无功能的潜在原因

2016年，从偶尔通过开放授粉获得的Corinto Nero种子浆果中提取了629颗种子。大约28% (Sangiovese的95%)被保留用于播种，因为它们可能是可行的(非漂浮的)。Sangiovese(54%)和Corinto Nero(51.5%)的离体萌发率相近(表2)2)．共对67株Corinto Nero幼苗进行了倍性水平分析，并在未连接的微卫星位点上进行了基因分型1:表S9)。流式细胞术分析表明，这些植物具有不同的倍性水平。其中42株为4C(可能是四倍体)，14株为3C(可能是三倍体)，8株为2C(可能是二倍体)，3株为6C(可能是六倍体)。Corinto Nero后代表现出三种不同的基因型:48个个体(72%)表现出与Sangiovese/Corinto Nero植物相同的基因型(Corinto Nero-like, type 1，根据[21]);14例(21%)与Sangiovese/Corinto Nero基因型相同，在多个位点上附加外源等位基因(Corinto Nero-like +外源等位基因，2型);5株(7%)植株在一个或多个微卫星位点上表现出Sangiovese/Corinto Nero杂合子缺失，并在多个位点上表现出额外的外源等位基因(Corinto Nero分离体+外源等位基因，类型3)。

倍性和微卫星数据的重叠显示，48个1型后代中有42个是4C，这表明它们是二倍体Corinto Nero雌配子与二倍体Corinto Nero雄配子受精产生的，或者作为一种替代，它们来源于四倍体Corinto Nero卵细胞。在剩下的六种类似Corinto Nero的基因型中，两种是2C(可能是无混合)，一种是3C(可能是二倍体Corinto Nero的卵子与单倍体Corinto Nero的精子核受精，或者相反)，三种是6C(可能是二倍体和四倍体配子的融合)。14株2型植物中有13株为3C，说明二倍体卵细胞与非corinto Nero单倍体精细胞受精，1株为2C，有待进一步了解。最后，5株3型植物均为2C，这与单倍体非corinto Nero精细胞使单倍体卵子受精一致。虽然没有发现Corinto Nero自交后代植株，但上述基因型表明，只有在少数情况下(最多6个)，Corinto Nero的常规单倍体雌配子可能通过减数分裂还原形成。

根据花粉粒径与倍性水平之间的普遍相关性，收集的花粉形态测量数据显示，Corinto Nero的花粉粒径具有很大的变异性，这是由于异质和极值(15-36 μm，图5)。7C)通常在葡萄品种中观察不到的[55，56］．大约一半的Corinto Nero花粉粒直径小于22 μm，与Corinto Bianco类似，它们平均比其他品种的花粉粒更小，包括桑娇维塞。此外，一些Corinto Nero的花粉颗粒被破坏和/或损坏。

综上所述，我们的研究结果表明，Corinto Nero的无籽表型是由花粉和/或胚囊缺陷驱动的，可能的机制是配子不还原。

无籽表型的分子基础研究

为了识别可能隐藏在研究的变种的无籽表型的基因，我们进行了两个实验。首先，我们检测了所有基因中的窄精子因果突变的材料VvAGL11以了解在与Sultanina不同的窄精子的遗传背景中是否也需要。然后，我们利用[生成的转录组数据]来搜索Sangiovese和Corinto Nero之间的单核苷酸多态性。52］．最后在Sangiovese/Corinto Nero和其他基因型的附加无性系和亲本上进行验证变异的测试。

VvAGL11

cap -26.88标记的基因分型证实，本研究中使用的Sultanina有导致窄精子卡皮病相关Arg197Leu替换的点变异(G > T)VvAGL11基因。除Aspirant外，其他所有材料的种子等位基因均为纯合子(G/G)。对该位点进行了多次基因分型，证实了G/T基因型。这种多态性将Aspirant与它的种子对手Liseiret区别开来(数据未显示)。

桑乔维塞和科托尼洛之间的snp验证基因

共有71,557个SNPs和37,121个indel满足初始过滤条件。从这个列表中，任何职位都需要被认为是SNP候选人，至少在两个图书馆中存在，并且在Corinto Nero和Sangiovese之间不同。这种方法确定了1670个snp。结合变异效应预测和功能基因注释，筛选出99个错义snp进行Sanger测序。其中，5个被证实为真正的多态性(表6和额外的文件1:表S10)。除1个外，其余都是从桑乔维塞(克隆R10和VCR4)和Corinto Nero(4个来自西西里岛的品系)的其他植物中提取的。唯一的例外是6号染色体上的4148 C > T变体，它是在卡拉布里亚的Corinto Nero继承中唯一发现的，本研究对其进行了深入研究(数据未显示)。

从Corinto Nero的根/浆果果肉或皮肤组织中分离出的DNA也获得了相同的序列(数据未显示)。

本研究旨在了解影响葡萄种子和果实发育的一些变异的基础。为此，研究了8对种子含量不同的体细胞变异。

表现型变异对

为了尽量减少环境条件和葡萄栽培方法对它们繁殖发育的影响，每一对的成员在同一个葡萄园和多个生长季节进行表型分析[11，57］．例如，微量营养素(特别是锌和硼)缺乏可能导致孤雌果结实[58，59］．此外，浆果的一些基因型如桑娇维塞(Sangiovese)的转录组可塑性很强。60］．

首先，通过计算种子浆果的数量和在立体显微镜下观察种子和繁殖结构的痕迹，将无籽变种与有籽变种的种子含量进行比较。这使我们第一次确认或将无核类型归为大多数变种:孤雌型为Corinto Nero, Moscato Bianco突变体，Termarina Rosa和Corinto Bianco，窄ospermocarpy为Aspirant, Chasselas apyrène和Sultanina。在Termarina Nera事件中，有必要进行进一步调查。Moscato Bianco突变体中完全没有未受精卵的残留表明其孤雌性为营养型[15］．类似于在Korinthiaki/黑科林斯观察到的情况[19，20.和在Corinto Bianco [21]， Corinto Nero和Moscato Bianco突变体的孤雌性表型被证明不是均匀表达的，这从几个簇中偶尔出现的具有正常大小和种子的单个浆果中可以看出。即使我们从未在Termarina Rosa中检测到正常大小和种子的浆果，我们也不能排除它们也可能发生在这种孤雌性生殖变异中，正如[51］．

然后，我们研究了种子含量对坐果率、浆果大小和束果特征的影响。与已报道的坐果率与有籽浆果数或每个浆果的种子数呈正相关[61，62]，结果证明，与有籽的对应物相比，检测的无籽变种的坐果率有所降低，唯一的例外是Aspirant(图1)。1e和附加文件1:表S2)。除了花密度(在所有无籽变种中，除了Aspirant和Moscato Bianco突变体，花密度更高)，无花果。1d和附加文件1:表S2)，推测影响坐果率的因素为花育性和授粉效率[63，64，65]，减少可能会影响种子集(如Corinto Nero)。

在无籽系中，我们观察到较轻和较小浆果的明显优势。1g和无花果。4)，结果是更轻、更小、通常更松散的束。1h-j和附加文件1:表S3)。事实上，平均浆果重量被证明与种子数量和种子重量呈正相关，这与以前的报告一致[61，66，67，68］．普遍接受的解释是，种子含量通过激素机制影响浆果生长(特别是影响细胞分裂)，更多或更大的种子比更少或更小的种子产生更多的激素[2，69］．在测量了两种直径的无籽变种中，减少的浆果重量与一个明显的球形有关(图。4)．这可能是由于水果大小和形状的多效性效应。值得注意的是[37结果表明，果实肥力指数与果实性状负相关，尤其是果实形状指数(长径比)。

去势后发生浆果结块

未授粉和未受精的花通常会脓肿，桑娇维塞、科托尼罗和加梅的花序是阉割和袋装花序，反复观察到坐果(表5)．在所有三种基因型中，只有少数正常大小的浆果含有种子，而大多数浆果都很小，含有雏形种子或未受精的胚珠。2c,无花果。8a-b和附加文件7:图S11)。这一现象并未被报道为葡萄的特征性特征[70，并建立潜在的生物机制是特别有趣的。

去雄是在花仍然闭合时进行的;因此，由风或昆虫介导的异花授粉必须被排除在外，这一点已被由发芽的活种子衍生的少数幼苗的自花授粉兼容微卫星剖面所证实1:表S8)。SSR等位基因的分离，以及可育种子的缺乏，也不利于无混合生殖的参与，无混合生殖是通过种子进行无性繁殖[71］．

闭花授粉(不脱落花萼的自花授粉)或花蕾授粉(花开放前自花授粉)都可能发生。这些现象在一些品种中已经被假设出现，而在另一些品种中则没有出现。72］．例如,[73]报告说，在开放时，Müller-Thurgau和黑比诺的所有花的花药都已经开裂。大约16-18%的黑比诺花和60-63%的Müller-Thurgau花在花粉管开放和生长之前已经被证实授粉。［74]观察到，在开花前2周左右，赤霞珠的花药膜已经降解，成熟的花粉粒已经被释放出来，而花帽仍然附着在花上。在这个阶段，一个早期的种子结构已经开始发育。考虑到闭锁交配和花蕾授粉所确定的种子，以及桑娇维塞(此工作)和加梅花粉的活力[75]，这些在去势前触发的自花授粉方法可能最终在去势后的坐果中发挥作用，特别是对少数正常大小的种子浆果。然而，我们认为这种假设不太可能，因为在花去势的时候，花药还是绿色的，还没有开裂。

同样，我们不能排除，在阉割时，一些花药破裂，使花粉逃逸，正如[76，77］．如果此时一些花粉已经成熟，它可能会保持其活力，直到雌蕊开始接受，特别是在开花前阉割的花。

无论如何，我们认为，在无籽基因型(Corinto Nero)和桑娇维塞(Sangiovese)和加麦(Gamay)中，在花序阉育后形成浆果(主要是小的和无籽的)的普遍机制应该是孤雌果。这也被在去势过程中去除花药和柱头后花序坐果的发生所证实5)．事实上，葡萄具有兼性单性果性的特征，包括营养型(不需要授粉)和刺激型(需要授粉)，当适当的授粉被阉割或不利的环境条件阻止时，这一现象会加剧[2，57，78，79］．此前的报告显示，通过去皮和套袋花簇产生的孤雌果为白科林斯、黑蒙奴卡、无籽希姆罗德、苏塔尼纳、红全球、坎贝尔和亚历山大麝香。特别地，观察到最后一个品种产生了一些没有种子的浆果，一些没有种子的浆果，一些有胚乳的种子的浆果，以及一些含有胚胎的种子的浆果。2，78，80，81］．这种孤雌性的潜力可能是葡萄的一种内在特性(不限于特定的基因型)，只在某些条件下没有受精的情况下表现出来。在阉割的情况下，无论这些特殊条件是否存在，这一过程的成功结果可能会受到阉割时机的很大影响(见Sangiovese，表)5)．在本研究中，值得注意的是阉割后坐果的品种(Sangiovese、Corinto Nero和Gamay)均为早开花品种。可以想象，在这些基因型中，发育过程已经进展到足以导致卵巢在去除雄蕊的抑制信号或感知到生殖结构损伤的其他响应信号后生长为果实。相反，在开花较晚的品种(Grenache, Nebbiolo, Trebbiano Toscano等)中，阉割很可能是在生殖器官发育方面过早进行的。事实上，由E-L尺度决定的花序发育阶段并不一定反映可育器官(配子)的发育阶段，特别是在减数分裂等关键步骤。特别是，从减数分裂到开花之间的生殖器官发育时间是品种依赖性的[82，83］．发育时间对坐果的影响也得到了如下观察的支持:由于生长素的极性运输，同一簇中最先开放的花比较晚开放的花发生脓肿的可能性更小[84］．但是，我们不能排除个体基因型在这一现象中起作用，在某些品种中这种作用可能会增强。例如，一项评估十个葡萄品种繁殖性能的研究[79]的研究结果表明，桑结维葡萄的特点是簇重高，坐果率高，有籽和无籽浆果数多，活的绿子房占花总数的比例低，败色指数(花既不发育为浆果也不发育为活的绿子房的比例)低。同样，另一项评估120个品种繁殖性能的研究[62]将桑娇维塞和加美伊分类为一个组，其特征是相对于其他类较高的坐果率和较低的库雷值，较少的花数量和中等数量的种子浆果。上述特征表明这两个品种具有内在的坐果倾向。与我们在Sangiovese、Corinto Nero和Gamay中观察到的类似，在拟南芥生态型、几个番茄系和甜辣椒基因型中，也可以看到去势后存在一定程度的单性生殖，以及心皮周围花轮抑制信号的同时消除。85，86］．需要进一步的实验来区分这些假设(葡萄固有的或基因型依赖的特性)。

了解种子发育变异的基础

无籽的原因可能与开花前胚珠形成异常、花粉育性水平低、开花时授粉和受精不足、受精后胚/胚乳流产等有关。

在番茄，拟南芥和甜椒［86，87，88，89，90孤雌性已被发现与早期胚珠发育的改变有关(胚珠生长缺陷和不规则的减数分裂减少了存活的雌性配子的产生)。葡萄的孤雌性与胚珠缺陷也有一定的联系;胚珠发育异常可发生在大孢子发生之前(在白科林斯和红科林斯根据[20.])，在大孢子发生末期(在Corinto Bianco到[21])或在巨形形成期(在黑科林斯到[20.])。在目前的研究中，大多数来自Corinto Nero x Nebbiolo杂交或Corinto Nero开放授粉的浆果都没有种子。这表明，可活花粉(来自Nebbiolo或其他开放授粉栽培品种)的可用性不足以促进Corinto Nero的正常种子发育，而雌性缺陷有助于阻碍这一过程。我们假设，在开花时，Corinto Nero胚囊缺失或处于不同的退化阶段，很少能在受精中发挥作用。事实上，Corinto Nero幼苗的倍性水平证明了大孢子发生减数分裂过程中的异常。因此，Corinto Nero的无核可能是由于缺乏功能性的雌性配子，加上另一种不依赖于受精的果实发育过程。

此外，在番茄和苹果的突变体和转基因系中，孤雌性也与雄性不育有关，主要涉及控制花器官识别和发育的基因[87，91，92，93，94，95，96］．一直以来，在葡萄中记载了种子结实率和花粉活力或萌发之间的关系，低花粉肥力导致低结实率，这是由于授粉失败的概率增加[21，64，97］．本研究进行的体外试验表明，桑娇维塞花粉是活的，能够发芽，即使在葡萄品种报告的变异范围的最低水平([61，65，75和其中的参考文献，[98])。相反，它的无籽变种Corinto Nero表现出微不足道的花粉活力和萌发，如孤雌性的Corinto Bianco。7a - b和[21])。Corinto Nero中存活的花粉粒非常少，这可能解释了在很少有功能胚珠的情况下，自受精后只有偶尔形成种子浆果的原因1:表S7)。Corinto Nero花粉的非功能性也得到了体内授粉实验的支持，即自我授粉和开放授粉的比较1:表S7)和内比奥罗和特雷比亚诺·托斯卡诺的异花授粉(表S7)4)．我们排除了用Corinto Nero花粉授粉这两个高产品种后的浆果结实差是由供者和受者生殖发育的时间转移决定的，因为Nebbiolo和Trebbiano Toscano有不同的开花时间。

与Corinto Nero和Corinto Bianco的发现相似，可以假设Moscato Bianco突变孤雌性的基础是花的育性降低。这是典型的“星形”花，花瓣从萼状体顶部自由开放，而不是从基部脱落，随后融合在一起形成“帽”。雄蕊短，花药粘在花萼上。这种构象早前在许多品种中被观察到，它与雄性不育、胚珠异常和胚珠不完整有关(等同于白科林斯和红科林斯的胚珠，描述为[20.])、坐果不良和孤雌果实发育不良[99，One hundred.］．不幸的是，我们没有足够的数据来得出关于Rosa码头的任何结论或假设。在所有研究过的雌雄配子都受到影响的孤雌性生殖变异中，很可能是单一的突变导致了这两种影响。

对于窄子葡萄，Sultanina和相关无籽鲜果葡萄品种的种子流产之前被归因于VvAGL11中的Arg197Leu取代。Arg197Leu突变破坏含有VvAGL11蛋白的多聚物功能的工作模型已经被提出。反过来，这又阻碍了种皮的正常分化，最终导致胚乳退化和胚胎发育停滞[32，101］．鉴于对Aspirant的窄精子表型的观察和对相同突变的检测VvAGL11，我们假设发生在Sultanina的相同事件导致了Aspirant无核。相反，我们设想了另一个窄ospermocarpy来源的Chasselas apyrène，不携带Arg197Leu突变。就像Sultanina的情况一样[61]和另一种窄穗植物品种(Parvana [98])，我们排除了Chasselas apyrène无核与花粉无功能有关(图。7)．

配子无功能的潜在原因

非功能配子可能是发育过程中不同阶段失败的结果。特别是在孢子发生、绒毡层和珠心等周围结构的发育或配子发生的最后步骤中可能发生不规则现象。

据Corinto Bianco的报道，涉及微孢子和大孢子发生的减数分裂缺失或流产可能是Corinto Nero不育和种子形成受阻的原因[21]在较小程度上也适用于其他品种[97，102］．事实上，Corinto Nero幼苗的遗传分析(附加文件1:表S9)揭示Corinto Nero罕见功能雌雄配子多为未还原配子(从67株幼苗中的62株推断)，未还原配子的主要部分为二倍体(源自至少58株幼苗)。这些散配子可能源于无融合分裂(抑制或不完全减数分裂)，这是配子体无融合的第一步[103］．事实上，两个二倍体Corinto Nero-like幼苗(类型1)的存在支持了这两种情况下无融合的参与。尽管它们在无融合体中是典型的更为频繁的事件，但未减少配子的形成和未受精卵的孤雌发育都是有性物种中被广泛记录的现象[104］．可以想象，发生在这里的雌性配子中的无染色体分裂类型是双孢子的。尽管外交配子可能源于各种不同的减数分裂异常，但它们都是由两个取决于核恢复模式的基本过程之一产生的:第一分裂恢复(FDR)和第二分裂恢复(SDR)，这两个过程分别发生在第一和第二减数分裂的异常发育过程中。FDR产生的配子含有非姐妹染色单体，保留了亲本杂合性的全部或大部分[105，106］．相反，SDR配子拥有姐妹染色单体[107］．因此，为了进一步阐明Corinto Nero雌蜂的个体发育，我们将重点放在Corinto Nero中杂合微卫星位点上的三倍体幼苗的遗传组成上，如[21］．在本研究获得的三倍体幼苗中，没有观察到Corinto Nero等位基因的分离，仅有的3型(分离体+外源等位基因)Corinto Nero后代为二倍体。这一结果与FDR的发生是一致的，但它不排除与后代无染色体分裂有关。需要进行细胞组织学研究来确定二倍体前体细胞的起源。此外，由于在四倍体和六倍体Corinto Nero后代中，减数分裂分离事件产生的杂合子性的潜在损失被染色体复制所掩盖，我们不能排除可能发生额外的2n配子诱导机制(如SDR)，正如在其他植物中观察到的那样[108］．正如Corinto Bianco的假设21]， Corinto Nero可能是一个带有隐性纯合突变的减数分裂突变体，或者更有可能是一个体细胞突变体中的显性杂合突变体[109］．

Corinto Nero配子体倍性水平的变异性很好地反映在花粉大小的广泛变异性上。7C)，与普遍接受的花粉粒大小与倍性水平之间的相关性一致[105，107］．特别地，较大的花粉粒可能对应于存活的二倍体花粉粒，正如Corinto Bianco的情况所提出的那样[75］．基于以上的讨论，我们也很容易推测Corinto Nero偶然种子的尺寸比所有其他在版本中被检查的种子都要大(附加文件1:表S5)是未减少配子参与受精的结果。

花粉无功能的其他原因可能是形状异常和缺乏沟或发芽孔，这意味着形态不育[110，111］．在目前的工作中，几个Corinto Nero花粉粒被发现塌陷，可以想象的是，额外的结构畸变可能是Corinto Nero花粉粒微不足道的活力/萌发的原因。然而，需要更集中的微观调查来证明这一点。

这些基因可能是无籽表型的基础

VvAGL11

根据cap -26.88标记的基因型，我们认为Aspirant stenospermocarpy与该基因的Arg197Leu错义取代有关VvAGL11，与Sultanina的发现相似[32］．一方面，这可能表明一个非常特定的突变是需要的窄精子carpy基于VvAGL11基因。另一方面，Iordan的无籽变种(Gouais/Liseiret后代)为纯合的种子等位基因。这可能意味着同一基因的其他突变可能涉及(因为它们在目前的工作中没有被丢弃)，或者无籽的另一个来源也存在，正如Chasselas apyrène所想象的那样。不同的无核机制(不涉及VvAGL11)也有望在这里分析的孤雌性生殖变异中出现。

桑乔维塞和科托尼洛之间的snp验证基因

在过去的几年里，不同的分子机制导致了体细胞变异，包括点突变，转座元件的插入/删除和染色体重排(综述见[109])。基于这些知识，我们利用了[52]对桑乔维塞和科托·尼禄之间的单核苷酸多态性进行初步研究。验证了5个SNPs，它们可能参与了品种内表型变异。即使在没有任何功能作用的情况下，这些多态性也可能有助于区分桑吉奥维塞人和科托·尼罗人。

考虑到桑乔维塞和黑皮诺都是种子品种，最有趣的基因(可能有致病snp)是桑乔维塞中显示PN40024-like基因型和Corinto Nero中显示变异核苷酸的基因，分别是VIT_06s0004g03800 (4148 C > T)， VIT_11s0016g03590 (3340 a > G)和VIT_11s0016g05820 (949 G > a)(附加文件)1:表S10)。表型效应可能来自功能获得突变或功能缺失突变，导致单倍体功能不足[36］．然而，根据provan评分，这些变异被预测对蛋白质功能有中性影响(表6)．

VIT_06s0004g03800编码与kappa-b结合蛋白相关的核因子。拟南芥同源基因的产物是INO80染色质重构复合体的组成部分。SWR1(SWi2/snf2-Related 1)/ ino80复合物在核活性中的作用从双链断裂修复到调控基因表达都有很大的不同。有趣的是，一些核心SWR1/INO80-c亚基已被证明在拟南芥的生殖发育中起作用，如雌性减数分裂[112］．4148 C > T SNP决定了Thr1383Met的变化，这对应于氨基酸极性的变化。

VIT_11s0016g03590编码转导蛋白;变异氨基酸属于一个保守的WD40重复序列。众所周知，重复的WD40基序作为蛋白质-蛋白质或蛋白质- dna相互作用的位点，含有WD40重复序列的蛋白质作为蛋白质复合体组装的平台或其他蛋白质之间短暂相互作用的中介。这些蛋白质参与多种功能，从信号转导和转录调节到细胞周期控制和凋亡[113］．在含有SNPs的5个基因中，VIT_11s0016g03590是唯一一个在Sangiovese和Corinto Nero之间存在差异表达的基因，这是仅在无籽无性克隆中从e - l15到e - l27的显著上调[52］．

VIT_11s0016g05820的产物是CCR4-NOT复合体的组成部分，CCR4-NOT复合体是细胞中主要的mRNA死酶之一，与多种过程相关，包括mRNA降解、mirna介导的抑制、翻译抑制和一般转录调控[114］．有趣的是，最近研究发现，CCR4-NOT复合体的支架蛋白NOT1在拟南芥雌雄配子体发育过程中发挥着重要作用，其破坏表现出异常的种子结实率[115，116］．令人惊讶的是，变异949 G > A也在窄ospermocarpic Chasselas apyrène中以纯合子状态被发现1表S10)，这使得理解它是否在无籽表型中发挥作用变得更加有趣。

两个经验证的桑乔维酶特异性snp位于基因VIT_02s0025g03330和VIT_14s0083g00910中。值得注意的是，根据provan评分，这些变异被预测会对蛋白质功能产生有害影响6)．

VIT_02s0025g03330编码自抑制H⁺atp酶(AHA)和变异氨基酸位于保守的e1 - e2_atp酶结构域。一些AHA亚型被认为在雄性配子体的形成和功能中起着重要作用[117]，特别是在小孢子发育方面，例如[118]和花粉管生长([119]及参考资料)。AHA家族的其他成员已被证明参与种皮内皮细胞的发育和胚胎活力[120］．该基因在簇重、簇紧度、轴长、肩长qtl的置信区间内[121］．

VIT_14s0083g00910的产物是一种focusyltransferase，在花粉管生长中具有潜在作用[122］．该基因构成种子质量qtl的置信区间[28，32，每簇浆果数[123，124，轴长[125，集群中心轴的节点数[124和开花时间[126］．

在四个SNP位点上，所有五个分析的Corinto Nero克隆都共享相同的等位基因，这暗示了共同的起源和传播历史。在一个Corinto Nero克隆体(这里深入研究的来自卡拉布里亚的克隆体)中出现的4148 C > T突变反而表明该突变是相对较近的(数据未显示)。

基于从不同器官提取的DNA分析(分层特异性方法)，可以排除已识别突变的克隆的嵌合性质。这一结果与在葡萄无性系中报道的相当常见的体细胞嵌合现象([36，127]和其中的参考文献)，可以用细胞层重排导致植物基因型的均质化来解释[128，129］．

本研究表明，葡萄种质资源中保存的遗传多样性对研究目标性状的调控具有重要意义。在这里，独立无籽变异在分子和表型水平上进行了表征。对不同授粉处理产生的种子和坐果的多年观察使我们可以将每种基因型归结为导致无籽的生物学机制，介于孤雌果和窄精果之间。错误的替换VvAGL11在本研究评估的无籽变种中，除了一个明显独立的白Gouais Blanc突变体外，没有检测到导致sultanina衍生无籽品种种子败育的基因。对于Corinto Nero (Sangiovese无籽变种)的案例研究，在微观和宏观配子体中发现了特定的缺陷，这些缺陷协同作用促进孤雌性。此外，还发现有证据支持桑娇维塞和科托·尼洛的内在倾向，即在没有受精的情况下也能结实。基于RNA-Seq序列数据，对Corinto Nero的遗传功能可能发生改变提出了一些假设。

植物材料

七个播种葡萄选择其相应的无籽体细胞变异进行遗传和表型表征(表1)．这些植物目前生长在意大利北部的两个葡萄种质资源集合中:Grinzane Cavour (http://www.ipsp.cnr.it/grape-collection/?lang=en)，位于库尼奥省，由CNR-IPSP(意大利国家研究委员会-都灵可持续植物保护研究所)维护;FEM集合(https://www.fmach.it/eng/Farm/Crops/Corporate-bodies/Giaroni-San-Dona)，它位于特伦托省(圣米歇尔阿德吉的“Giaroni”实验区)，由FEM (Edmund Mach基金会)管理。本研究中调查最多的品种Sangiovese和Corinto Nero已经在另外两个地点进行了繁殖和种植，一个是Grugliasco(都灵)的试验田，另一个是San Michele all 'Adige。在所有的葡萄园里，葡萄藤都种植在垂直的棚架上，盖约修剪过。

Corinto Nero最初被鉴定为采集于卡拉布里亚地区(意大利南部，准确地说是科森扎省的Scalea)的Sangiovese的无核体细胞变种，并引入Librandi酒庄收藏，如[41］．另一种桑娇维塞无籽突变体在Emilia Romagna (Sesso, Reggio Emilia)中被发现，命名为Termarina Nera。桑乔维塞的主要参考种子是克隆R24。

Moscato Bianco的无籽变种是在Piemonte(准确地说是库尼奥的阿尔巴)地区的Moscato Bianco商业葡萄园中发现的。desire -false是白Gouais Blanc/Heunisch Weiss的无籽变种，由德国的JKI Geilweilerhof酒厂好心提供。

通过微卫星分析，从意大利Emilia Romagna地区采集了Termarone及其无籽变种Termarina Rosa。

通过研究在22个微卫星位点上具有相同轮廓和可能与无核有关的名称的组内的种子表型(2011年和2012年随机抽样的25个浆果的种子的数量和类型)，发现了FEM集合中生长的品种的体细胞变异[130］．当时鉴定出了三对体细胞变异:白切子和白切子apyrène, Dastatchine-false (Sultanine Monococco)和Sultanina, Pedro Ximenez和Corinto Bianco。第四对被发现的包括Sori-false加名和corinthenoir(希腊语Korinthiaki)。然而，Sori-false被排除在表型表征之外，作为推定的种子形式的黑科林斯，因为在接下来的季节，当所有的浆果串被检查时，大多数浆果都是小的和无籽的。结果表明，这两种品种均易发生浆果反复枯萎。当表型数据可以收集，黑色科林斯保留作为参考孤雌果。

以上引用的其他品种、无性系或亲缘系以及其他品种的分析是为了特定的目标，如手稿中详细描述的那样。它们包括:桑娇维塞克隆R10和VCR 4;四种来自西西里岛(埃奥里亚群岛)的科托·尼禄血统;白樱桃(Chasselas Blanc)的种子浆果色变体;蔷薇Sultanina Rosa，无籽Sultanina的浆果色变种;Gouais/Liseiret后代Iordan及其无籽变种Iordan;最后，加迈、歌海娜、内比奥洛和特雷比亚诺·托斯卡诺进行授粉处理。

为了简单起见，我们通常省略了“假”这个词，用于错误标记的条目。

的基因变异对

SSR和SNP基因分型从表中报告的所有材料中收集幼叶1．总基因组DNA按照[130］．

此前，Sangiovese和Corinto Nero在葡萄基因组的19条染色体上进行了58个SSRs的基因分型。52］．其余的资料用这58个标记中的32个进行分析1:表S1)。

此外，每个添加物都使用商业GrapeReSeq_Illumina_20K_SNP_chip进行基因分型[131包含18,071个snp。SNP基因型的评分见[132］．使用内部Perl脚本对每对有籽和无籽材料筛选后的基因型位置进行两两比较。

通过PCR扩增和Sanger测序验证体细胞变异间的潜在多态性。在少数情况下，根据变量效应预测(使用SNPeff v3.6c程序[133])和功能基因注释。引物按12X设计。2version of the reference genome sequence using Primer3Plus [134］．PCR产物用Eurosap PCR Enzymatic cleanup kit (Euroclone S.p.A, Pero MI, Italy)进行纯化，然后用PCR中相同的引物进行毛细管电泳测序。色谱图与MEGA6软件对齐[135]并用BioEdit v7.2.0进行目视检查[136］．

表现型变异对

表中报告的入选情况1(与他们各自的地理位置)在一个或多个季节开放授粉的花和果实性状表型。根据改进的Eichhorn-Lorenz格式确定发展阶段[54］．

花数和坐果率

2018年，两地的坐果率均以每束浆果与花的比例进行评估，这是[认可的唯一有效方法]62］．在E-L阶段评估每个花序的花数17(12片叶子分离;花序发育良好;根据开发人员的规格，使用VitisFlower移动应用程序分离单花)[137，138］．作为初步步骤，该应用程序的可靠性是通过在实验室中比较估计的花数和人工计数的6个不同大小(R²= 0.90)。对于大多数材料，从不同的植株和植株内的不同位置选择5到10个花序，以尽量减少分枝水平和花序位置对花数的潜在影响。11，139］．每个花序拍摄三张照片(从不同角度)，并计算平均值。每束浆果的结实数在收获时在实验室手工计数(e - l38)。对于FEM收集的植物，也在E-L 31阶段(豌豆大小的浆果)通过用固定笔标记每个浆果在田间手工计数。活的绿色卵巢不包括在内，因为它们不符合浆果的定义。140］．

束，浆果和种子特征

在1个或多个季节(Corinto Nero/Sangiovese最多4个季节:2013年、2016-2018年)收集的技术成熟(e - l38阶段)的簇上评估束、浆果和种子性状;2017年和2018年的所有其他入选都是两个)。

簇特征包括以下OIV描述符:长度(OIV202)、宽度(OIV203)、平均簇密度(OIV204)，以及簇重、长宽比和浆果数。用精确的平衡对聚类进行加权。用尺子测量束的长度和宽度。每束浆果的数量是手工计算的。

浆果性状包括浆果大小、平均浆果重量和种子浆果百分率。每束果实分为A或大(浆果宽度> 15 mm)、B或中(12 mm≤浆果宽度≤15 mm)和C或小(浆果宽度< 12 mm) 3个大小类别。Berry宽度(OIV221)通过应用于图片的数字卡尺测量(在2017年和2018年的IPSP上)，或通过1毫米步骤(在2018年的FEM上)从9毫米到20毫米的专用铝大小测定卡测量。在IPSP，浆果长度(OIV 220)被另外调查。用精确平衡法对相同大小类别的浆果池进行加权，得到每个簇的平均浆果重量。用刀片打开浆果，目测正常发育的种子后，计算每簇种子的百分率。

种子性状包括平均每粒种子数和平均种子重。从相同大小的浆果中提取正常发育的种子，手工计数。种子在室温下清洗干燥后，用精密天平测量新鲜种子重量。得到每个聚类的平均计数和权重。

变种种子和繁殖结构痕迹的检查

2019年，除了Chasselas Rose、Pedro Ximenez和Corinto Bianco之外，根据每种基因型的不同版本，从不同穗子的不同部分随机收集了一池浆果。在立体显微镜下，每个基因型的大小类别(有大小时)随机选取10个浆果进行检测。从每个浆果中提取出胚珠或种子的痕迹和发育良好的种子，并分别计数。发育良好的种子的潜在生命力通过水中漂浮试验进行了测试:下沉的种子被认为是可能存活的。先后解剖痕迹和种子，观察其结构。将一台数码相机(AxioCam ERc 5s, ZEISS)连接到立体显微镜(Stemi 2000-CS, ZEISS)上，并同时连接到一台计算机。采用AxioVision Rel. 4.8软件(ZEISS)对样品进行“现场”观察，得到数字图像。分析的浆果的大小范围，以及痕迹和种子的长度和宽度，通过数字测量从图片。

此外，对于桑吉奥维塞及其无籽变种Corinto Nero，在同一天(19/06/2019)采集了不同花序或不同物候期开花的单一花序的雌蕊。然后，在开花(阶段1)和浆果辣椒玉米大小(阶段6)之间的四个中间阶段采样。对于每个基因型，每个阶段选择一个雌蕊进行连续解剖、提取和在体视显微镜下检查胚珠/种子痕迹。它们的长度和宽度是用上面引用的软件测量的。

表型数据的统计分析

使用PAST v3.14软件进行统计检验[141］．采用参数检验(T-student和Welch在方差不等的情况下)和非参数检验(Mann-Whitney和Kolmogorov-Smirnov)来检测浆果数的体细胞变异或阶段之间的显著差异。采用Kruskal-Wallis检验(结合Dunn’s post-hoc检验和Bonferroni平差)检验不同基因型间差异是否显著。的显著性水平P所有病例均< 0.05。用Spearman 's rs检验评估各性状之间的两两相关性，并考虑在0.05水平上的显著性。

了解种子发育变异的基础

卫生状况评价

在2011年和2012年，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)对来自葡萄藤的木质材料是否存在最有害和传播最广的葡萄藤病毒进行了检测，如[142，143］．已在附加文件中报告所调查资料的病毒状态1:表S11。值得说明的是，收集的单株葡萄藤繁殖的母株进行了有害病毒载量测试。当嫁接时，还使用认证的砧木，以防止有害病毒。由于植株年龄不超过4-6年，所有被调查的藤蔓保持相同的病毒株分布是合理的。此外，收集葡萄园定期监测潜在的病媒发生。

雄配子(花粉)功能的评价

花粉活力与萌发

分别在Sangiovese/Corinto Nero和Chasselas/Chasselas apyrène、Dastatchine/Sultanina、Pedro Ximenez/Corinto Bianco以及corthesin Noir cv上进行花粉活力和萌发试验。在改良的Eichhorn-Lorenz方法的e - l23阶段(去除50%花冠)收集花序[54］．没有对花序和芽的位置进行选择，因为在同一基因型内花粉活力已被证明高度一致[75］．分析了三个季节(2014、2017和2018年)的花粉活力和萌发情况。对于每一个加入，一个由不同植物的花序组成的集合样本被测试。

活力:用1% TTC(2,3,5-三苯基四唑氯化钠)试验测定新采花序的花粉活力[144］．TTC，通常是无色的，在脱氢酶(活花粉)的存在下变成不溶性福马甲，并呈现红色。对于每个样品，进行了三到四次技术重复，将花粉颗粒撒在不同的载玻片上。在37°C的黑暗中孵育1小时后，在显微镜下(Leitz Diaplan)评估花粉活力:花粉粒变红被认为是可育的，变黄或未染色的被认为是不可育的。在每片约300粒的随机样本中计数活花粉粒和非活花粉粒。

萌发:为了保证花粉从花药囊中脱落并与花的其他部分分离，对花序进行筛选。在培养皿中收集自发释放的花粉粒，加入萌发培养基(20%蔗糖，100 mg/L硼酸，300 mg/L硝酸钙)[145］．25°C孵育24小时后[146]，每个样品制备3个载玻片，并在显微镜(Leitz Diaplan)下使用连续扫描法和随机扫描选择进行检查。当花粉管长度至少为粒径的两倍时，认为花粉粒已萌发。每个载玻片观察到至少100粒花粉。

授粉的治疗方法

进行了以下授粉处理:

1. 一)

   自交vs开放授粉:在大多数有籽/无籽对的自交和开放授粉条件(分别为SP和OP)下评估种子和坐果。唯一的例外是Termarina Rosa、Dastatchine和Corinto Bianco，因为2018年的花序太少或干燥。自花授粉组在开花前将花序装入纸袋内，以避免异花授粉，并允许开花和自花授粉。浆果结实期一周后，覆盖的果实簇在果实发育和成熟过程中暴露在充分的阳光下(B和C也是如此)。

2. B)

   Nebbiolo/Trebbiano Toscano与Corinto Nero花粉的授粉:Nebbiolo和Trebbiano Toscano (cv。花期早、花期晚，既可育又有籽)分别用手去刺，用细尖钳子阉割，用Corinto Nero花粉手工授粉，用纸袋包好。实验在不同季节(2012-2014年)和不同地点(IPSP和FEM)重复进行。自花授粉的花簇(花萼脱落前置于袋内的花序)为阳性对照。对两种授粉条件下的种子和坐果进行了评价。

3. C)

   一些对和其他品种的阉割:Sangiovese/Corinto Nero、Gouais Blanc、Chasselas/Chasselas apyrène、Pedro Ximenez/Corinto Bianco和其他基因型(Nebbiolo、Trebbiano Toscano、Gamay和Grenache)的脱毛前花序被人工去毛，用细尖镊子阉割，并用纸袋覆盖。目的是检查最终浆果的结实率和发育，排除任何花粉的作用。实验在不同季节、不同地点和不同发育阶段重复进行。最早的阶段(第一阶段)对应E-L 15阶段，最晚的阶段(第二阶段)对应E-L 18阶段。在一些试验中还进行了柱头去除。未剥落的自花授粉花序作为对照。对两种授粉条件下的种子和坐果进行了评价。阉割后形成的偶有正常种子被放入花盆中发芽。通过对18个微卫星位点进行基因分型，明确其来源。

雌配子(胚囊)功能的评价

2013年，采用上述方法，对Corinto Nero的四个花序进行阉割，与Nebbiolo的活花粉进行异花授粉。在收获时对种子和果实性状进行评价。

探索配子无功能的潜在原因:孢子发生的缺陷

2016年，采集了开放授粉条件下获得的Corinto Nero和Sangiovese种子浆果。从浆果中提取种子，在4℃下保存2个月，以克服休眠。然后对两种材料的种子萌发性进行评估。体外胚胎拯救按照[描述的方案]进行。21］．从获得的幼苗中采集嫩叶，并将其分为两批。第一批用于10个不相关的微卫星位点的基因分型(在一些可疑的案例中有15个)。第二批叶子被送往植物细胞仪(https://plantcytometry.com/)用于流式细胞术测定倍性水平。每一株植物的倍性水平被记录为一种相对于具有已知倍性水平(2C)的同一物种的植物的指数，这些植物包括Corinto Nero, Sangiovese和赤霞珠(叶子从木本插枝中收集，放在有水的花盆中)。

同时，在Sangiovese/Corinto Nero(2014年、2016年和2017年)和其他三个变异对(2017年和2018年的一两个季节)中记录了花粉粒形态，以验证不同的花粉粒大小可能与不同的倍性水平相关。在光学显微镜下，用眼测微计测量了各季节各基因型随机采集的50粒花粉的极轴和赤道轴。

无籽表型的分子基础研究

在一个或多个变异对中鉴定/分析无籽表型的候选基因:

VvAGL11

采用CAPS-26.88标记的引物对研究的所有材料进行基因分型。32]进行PCR扩增和Sanger测序。

桑乔维塞和科托尼洛之间的snp验证基因

对Sangiovese(克隆R24)和Corinto Nero(来自卡拉布里亚)之间单核苷酸多态性(SNPs)的初步研究通过两步过程进行。为此，我们利用了[使用的RNA-Seq校准]52]，用于两两比较两系(共6个文库，分别对应三个发育阶段和两个基因型)发育阶段的差异表达分析。在第一步中，寻找Sangiovese和/或Corinto Nero和12X之间的多态性。葡萄参考基因组0版本。使用Samtools v0.1.17调用变体[147］．使用VCFtools v4.1进行初始筛选[148]使用的窗口为10bp，最小读取深度为5，最小质量为10。然后，为了识别Corinto Nero和Sangiovese之间可能对种子表型有影响的差异单核苷酸变异，我们采用了以下方法:

A)通过VCF过滤，要求备选碱基至少有3个读支持，根据区域上对齐的读对总数计算备选等位基因的频率≥0.75;

B)编写了一个专门的Perl脚本，分别在Sangiovese和Corinto Nero的至少两个库(对应于两个开发阶段，可以被视为副本)中获得通过过滤标准的共识位置;

C) B的假定突变被注释葡萄使用变异效应预测器SNPeff v3.6c程序预测V1基因[133];

D)使用一个专门的Perl脚本在Sangiovese和Corinto Nero之间对所有被注释为非同义的假定snp进行两两比较;

E)进一步选择来自D的两个克隆中不同的99个假定SNP位点进行验证。该集合包括三个文库支持的所有非同义snp，以及三个文库中两个文库支持的非同义snp的选择(基于基因功能)(由于来自一个文库的基因型缺失或不一致)。

为了验证所选的snp，我们首先对两个无性系和黑皮诺(Pinot Noir)幼叶的基因组DNA进行PCR扩增和Sanger测序，方法参考“基因分型变异对”章节。引物序列可在附加文件中获得1: S10表。从RNA-Seq中推断的个体基因型与Sanger法进行一致性检验。

对于已验证的snp，使用prove应用程序估计对蛋白质功能的预测影响值[149］．NCBI网站提供的光碟搜寻工具[150]被用来检查这些突变是否影响保守位点或结构域。

然后在Sangiovese/Corinto Nero的其他克隆和附件上测试验证的变种。通过比较从叶子/浆果皮(L1 + l2来源的组织)和从浆果果肉/不定根(l2来源的组织)中分离的基因组DNA中Corinto Nero的遗传组成，也研究了嵌合性[151］．

最后，对Sangiovese/Corinto Nero之间的验证变异在其他野生型/变异对和黑色科林斯中进行了分析。利用Unipro UGENE v1.32的“Sanger数据分析”工具[152质量过滤的默认设置，放大器对齐葡萄包含每个SNP的V1基因预测。

在本研究过程中产生的所有数据都包含在文章及其补充信息文件中，或者可以根据合理要求从相应作者处获得。生物样本元数据可在生物样本数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/)，注册号为SAMN17282791-SAMN17282807。VIT_02s0025g03330、VIT_06s0004g03800、VIT_11s0016g03590、VIT_11s0016g05820和VIT_14s0083g00910的部分核苷酸序列可在GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)注册号为MW464209-MW464218。

啊哈:

Autoinhibited H⁺腺苷三磷酸酶

参数:

精氨酸

帽子:

裂解扩增多态序列

CCR4-NOT:

碳分解产物抑制-对TATA-less负

背景:

脱氧核糖核酸

E-L:

Eichhorn-Lorenz

ELISA:

酶联免疫吸附试验

罗斯福:

第一部门返还

有限元法:

基金会埃德蒙·马赫

INDEL:

INsertion-DELetion

INO80:

INOsitol-requiring 80

IPSP:

可持续植物保护研究所

低浓缩铀:

亮氨酸

格林:

连锁群

满足:

甲硫氨酸

microrna的:

微

信使rna:

信使核糖核酸

人事处:

开放

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

QTL:

数量性状位点

RNA:

核糖核酸

RNA-Seq:

RNA-Sequencing

SDI:

种子发展抑制剂

特别提款权:

第二部门返还

SNP:

单核苷酸多态性

SP:

自我

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

SWR1:

SWi2 / snf2-Related 1

刺:

苏氨酸

TTC):

2、3、5-Triphenyl四唑氯

VIVC:

葡萄属国际品种目录

VvAGL11:

葡萄AGAMOUS-LIKE 11

我们要感谢Librandi Estate (Cirò Marina, Italy)提供Corinto Nero (Sangiovese无籽变种)的繁殖材料。我们也感谢来自JFK Geilweilerhof(德国)的Erika Maul提供Aspirant-false (Gouais无籽变种)、Iordan/Iordan无籽样品，并感谢Pietro Colosi提供来自埃奥利安群岛的Corinto Nero样品。

感谢Stefano Meglioraldi和Marisa Fontana分别推出了桑乔维斯无籽Termarina Nera和Termarone/Termarina Rosa。我们最后要感谢朱利亚·塔鲁奇在建立胚胎拯救培养、丹尼拉·库奥佐在授粉试验、克里斯蒂娜·维奥拉在测试花粉活力和萌发、丹尼尔·佩德里在种子的显微镜观察、米凯拉·贝尔尼尼在实验室协助、以及Pierluigi Magnago在管理从去毛束产生的幼苗方面的帮助。

这项工作得到了特兰托自治省(Accordo di Programma)和CARITRO基金会(APIRENIA博士后项目，int)的财政支持。ref。2017.0349)。

作者指出

1. Laura Costantini和Paula Moreno-Sanz对这项工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. 研究和创新中心，埃德蒙·马赫基金会，Via E. Mach, 1338010，圣米歇尔阿迪热，意大利

   Laura Costantini, Paula Moreno-Sanz, Chinedu Charles Nwafor, Silvia Lorenzi, Annarita Marrano, Fabiana Cristofolini, Elena Gottardini和Maria Stella Grando

2. 特伦托大学农业食品环境中心(C3A)。E. Mach 1, 38010，圣米雪儿阿迪吉，意大利

   Paula Moreno-Sanz和Maria Stella Grando

3. 内布拉斯加-林肯大学植物科学创新中心和生物化学系，美国东北林肯

   奇纳查尔斯Nwafor

4. 加州大学植物科学系，加州戴维斯，95616

   Annarita Marrano

5. 意大利可持续植物保护研究所-意大利研究委员会，Largo P. Braccini 2,10095，意大利Grugliasco

   Stefano Raimondi, Paola Ruffa, Ivana Gribaudo和Anna Schneider

贡献

AS和MSG构思项目，AS、IG、LC、MSG和PMS设计实验。AS、CCN、IG、LC、PMS、SL和SR对传粉试验和表型表征有贡献，LC和PMS对传粉试验和表型表征有贡献。AS评价了植物材料的卫生状况。PMS对种子和种子痕迹进行了显微观察。EG和FC提供了花粉活力和萌发的数据。IG进行胚胎拯救。AM、AS、CCN、IG、LC、MSG、PMS、PR、SL和SR对材料进行基因分型并对结果进行解释。CCN和PMS起草了一些章节，而LC是写手稿的主要贡献者。AS、CCN、EG、FC、IG、LC、MSG和PMS对稿件进行了修改。LC编写了最终版本，并由所有作者阅读和批准。

相应的作者

对应到劳拉Costantini．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

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