水稻对稻瘟病菌反应的全基因组关联鉴定了高氮条件下抗稻瘟病基因座

背景

众所周知，施氮会增加疾病易感性，这种现象被称为氮诱导易感性（NIS）。在水稻上，这种现象已在稻瘟病菌感染中观察到稻瘟病菌.以前的古典遗传学研究揭示了一个基因座（NIS1）在高氮肥中提高对稻瘟病的易感性。为了进一步应对施肥后对稻瘟病敏感性的可塑性的潜在遗传，我们在139个温带粳稻菌株面板中分析了NIS。通过比较高氮气条件下鉴定的易感性基因座，识别基因组 - 范围的关联分析以鉴定潜在参与NIS的基因座，允许在不同氮环境中验证的基因座的方法。我们还使用了新的NIS指数来识别不同氮肥制度下易受敏感性的基因座。

结果

在群体中观察到一个整体的NIS效应，在高氮条件下，病斑密度平均增加8%。三个新的QTL，除了NIS1，被确定。一种罕见的等位基因RRobN1型6号染色体上的位点在高氮和低氮环境中具有很强的抗性。一个常见的等位基因NIS2染色体5上的基因座在高氮条件下加剧了稻瘟病的易感性。最后，一个NIS3，在染色体10上，缓冲了氮肥引起的易感性增加，但增加了全球易感性水平。这个等位基因在温带日本血吸虫中几乎是固定的，这可能是基因搭车的结果，该基因座与冷应激适应有关。

结论

我们的结果延伸到整个稻米亚种，最初发现氮气增加了稻瘟病敏感性。我们证明了在不同氮素制度下鉴定鉴定稻米响应的新型基因座的可塑性的有用性。

米 （奥雅萨苜蓿）在欧洲种植占45万公顷，平均收益率为6.5 T / HA [1.]. 在欧洲种植的75%的品种来自温带粳稻亚种，即适应短季和低温的品种。为了改良不同性状的优良品种，建立了欧洲水稻种质资源库（ERGC）[2.］．在靶向性状中，抗稻瘟病是研究最多的性状之一。稻瘟病是由真菌引起的稻瘟病菌（同步。蓬松景是法国和世界范围内的主要水稻病害[1.,3.]. 该病导致光合活性下降，营养循环不良，并可导致叶片死亡[4.］．杀菌剂应用是主要的管理方法之一[5.］．

作为绿色革命的一部分，育种计划已经建立了完全抗烟草的品种m . oryzae[5.]. 目前已鉴定出100多个主要抗性基因座和500多个数量性状基因座，克隆了35个抗性基因[6.,7.］．全基因组关联研究(GWAS)的应用增加了我们对稻瘟病抗性遗传的认识[8.,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18］．然而，温带japonica仍然是具有最高易感性水平的亚种[19]和在育种计划中整合抗性仍然是必要的[11］．此外，在采用抗药品种后的2 - 6年，毒株通常会出现，完全抗性往往不持久[20,21］．由于这些原因，部分（定量）抗性降低了易感性水平，似乎是互补的选择[20］．然而，部分阻力对管理措施尤其敏感[3.,22,23]. 在水稻中，高水平的氮输入有利于疾病的发展，这种现象称为氮诱导敏感性（NIS）[24,25］．NIS的特点是表现出部分抗性/易感性的品种的病变数量增加，而完全抗性似乎对氮输入很强健[24,26］．我们之前提出了一个模型，在高氮施肥条件下，植物表现出增强的植物防御诱导，然后通过增加真菌致病程序的表达来克服防御，从而导致更大的易感性[26］．为了处理这种有害现象，有必要鉴定不受氮水平影响的强大抗性，或鉴定控制NIS的遗传因素。我们之前已经确定了来自Aus Kasalath品种的等位基因NIS11号染色体上的一个基因座，当导入温带日本粳稻品种时，在高氮肥条件下显著提高对稻瘟病的易感性[24]. 尽管已经确认NIS1在水稻和其他植物中，NIS的遗传机制仍不清楚。

表型可塑性定义为在不同环境中显示不同表型的基因型，而其相反的鲁棒性是这样的现象，其中给定表型在环境中类似地表达。在特定干扰存在下的鲁棒性得到了广泛研究[27,28]. 稳健性是通过比较两个环境之间的平均表型或通过测量两个环境之间表型的方差来衡量的[28］．第一方法涉及基于大规模多环境表型的模型来量化基因组X环境影响[29,30］．然而，这种方法的缺点来自寻找相关性状的可靠模型及其环境驱动程序的困难[29]. 对于病原体抗性，第二种方法可以是利用遗传方法研究环境干扰对免疫特性的影响[31,32,33］．大多数情况下，育种人员使用的策略是通过评估多环境田间试验中的抗性来评估抗性的稳健性[13,34因此，限制可塑性，或者管理特定应力的试验[25］．这些方法有效地识别鲁棒性，但不允许识别可以有助于鲁棒性/可塑性的基因座而不赋予耐受性。虽然植物在某些环境中优先抑制耐药性的分子机制开始被理解[35]为了增加对NIS的认识，我们需要鉴定更多缓冲环境对抗性影响的基因座。

实际上，很少有遗传学研究已经鉴定了大米中的稳健疾病抵抗基因座[36,37或其他病例[38,39,40］．为了研究给定扰动对抗扰性的影响，开发一种鲁棒性的定量度量可能是有益的[41]可能与基因型有关。许多耐逆性指标是通过估计胁迫和控制条件之间的变化来绘制产量在干旱或盐干扰下的稳健性[42,43,44]. 这些指标按基因型对表型稳健性进行评分。据我们所知，这种指数还没有用于影响抗病性的非生物干扰的情况。

在本研究中，我们开发了一个指标来确定在有或没有氮肥的情况下对稻瘟病的敏感性的稳健性。我们的目标是绘制出在使用氮肥的农艺环境中健壮的抗病位点，这可能对欧洲育种家有用。本研究以两种不同施肥条件下的温带粳稻群体为研究对象，通过全基因组关联的方法确定了在两种环境下共享或不共享的qtl。利用一个新的抗稻瘟病稳健性指标，我们能够确定一个额外的缓冲氮肥对稻瘟病敏感性影响的QTL。

植物材料与实验装置

从欧洲水稻种质收集获得的一组331个温带粳稻基因型[2.]在苗期对其易感性进行了筛选m . oryzae分离CD203和Cl26（图。1.和附加图。4.). 其中159株和117株分别对CD203和CL26敏感，并对其进行部分抗性研究m . oryzae在不同的施氮环境下(附加文件1.和2.)．使用先前描述的实验程序在温室中进行实验[24]. 实验的19个重复区组采用完全随机设计，每个试验包括一个对照基因型，即GINES。在添加蒲公英的Neuhaus S土壤（2）中，每个塑料地（9x9x9cm）播种两次，每次4粒种子 70升 五十） 是的。种植水稻28株 摄氏度/20 摄氏度，16 h灯。植物在标准施肥下生长了三周。第四周和接种前一天，N0（除氮以外的所有营养素）和N1（含氮50%NH4+/50%NO3的营养素）−; 40 mg/L）处理如前所述[24］．一种统计单元对应于一种条件的一种基因型的一片。真菌菌株CD203和Cl26用于接种四周龄植物（4-叶阶段），其中50,000孢子/ mL悬浮液如前所述[45］．

疾病评估

接种7天后，每片受感染的叶子都以相同的分辨率（每英寸600像素）进行扫描。图片由LeAFtool（病灶区域查找工具）分析，LeAFtool是一个内部开发的R包，可在github上获得(https://github.com/sravel/LeAFtool)．该计划测量病变数和叶面积。用于图片分析的参数为叶子和50像素用于病变区域的50像素，3.为了考虑异常值和软件错误，从分析中取出了异常大小的病变。最后，叶易感性估计每厘米的病变数量^2.叶面积。

所有数据都应用了以下固定模型，以评估基因型，治疗和与之交互效应lme4R包(46］．方差分析（ANOVA）和最小二乘意味着（LSMENES）计算是从该模型完成的lsmeansR包(47]. 对数据进行对数变换得到参数分布。

与Y表型,μ.作为理论的意思，γ._K审判效果，α._我基因型效应，β_J氮效应(αβ)_伊吉基因型x氮互作效应，以及ε._IJK.作为残留物。使用差异分析，单独计算广泛的感知遗传性，使用方差分析，H.^2.= σ^2.g /（σ^2.G +σ.^2.E / n），其中σ^2.G和σ^2.E是遗传和剩余方差的估计。

我们改编了先前描述的干旱易感性指数（DSI）[44]，计算氮诱导敏感性指数(NISI):

在哪里？\ ({LSM} _i ^ {N0} \)和\ ({LSM} _i ^ {N1} \)对应于基因型的lsmean我分别在N0和N1条件下。倪为氮对实验中所有基因型的影响(改编自初始DSI的胁迫强度)，计算公式为:

因此，NISI是相对于氮对群体影响的每个基因型的NIS估计值。在稳健性方面，该指数评估了在两种施肥制度中观察到的给定基因型的疾病易感性稳健性与面板总稳健性的关系。如果氮诱导全球对稻瘟病的敏感性增加，那么NI将为负，反之亦然，氮则降低敏感性。当NI为负时，更健壮的基因型NISI值将小于1并接近零，表明这些基因型的易感性受氮素条件的影响较小。不太健壮的基因型的NISI值将大于1。当面板上存在统计上显著的氮效应时，我们使用NISI（意味着NI）≠0). 如果没有发现整体效应，我们将使用调整后的NIS指数，该指数对应于相同的计算，但没有除以NI。NISI的遗传力是根据GWA研究中观察到的遗传方差除以总方差来估计的。

本研究使用的基因型数据来自CIRAD [48]. 在我们的小组中，我们筛选了呼叫率低于75%，杂合率高于20%或次要等位基因频率（MAF）的标记< 2.5. 该矩阵采用比格犬4.0（窗口=250重叠=25 ne=200）进行插补。最终的矩阵包括19997个单核苷酸多态性和331个基因型。

连锁不平衡和全基因组关联分析

我们使用基因型矩阵G，19997个SNPs，共331个粳稻温带利用流苏软件5.2.59计算连锁不平衡（LD）、亲缘关系矩阵和主成分分析[49]. 连锁不平衡由亲缘关系矩阵估计为等位基因状态相关的平方（r^2.）在每种染色体上的所有成分之间。r的情节^2.值和遗传距离用R包LDheatmap做[50］．如[中的中心IBS方法）估计了亲属矩阵克。51]. 用主成分分析法（PCA）对种群结构数据进行了估计。GWAS采用加权混合线性模型（MLM）对159个表型基因型中的139个基因型子集进行分析。每个GWAS使用相同的G、K和PCA数据，针对三个表型数据集：LSM^N0，每种基因型的N0条件易感性的lsmean，LSM^N1与N1条件和NISI相同，使用上述公式计算。

声明重要关联的阈值设置为–log10P=5。如果在同一个LD区检测到5个A–log10P接近5的SNP，则可确定一个定量位点。在附加数据文件（附加数据文件8）中报告了孤立的重要SNPs，但没有进一步研究。使用Orygenesdb基因组浏览器查看的日本温带粳稻参考基因组，对所选基因座进行基因注释[52］．对于最重要的QTL，使用SNP-Seek来确定单倍型组[53[则与我们的基因型数据集相关联。我们运行了一个新的模型，包括单倍型效果，以测试具有Tukey调整的对比度测试，以估算单倍型组效应。SNP-Seek数据库用于鉴定携带两种相应单倍型的水稻品种NIS3以从四个不同的亚种中产生26个基因型的验证集：16个具有NIS3-1单倍型和10NIS3-3表在附加文件3.). 该验证小组在与GWAS相同的条件下接种（高氮和低氮，然后接种m . oryzaeCD203孤立）。

NIS在温带粳稻基因型中是罕见的、弱的和孤立依赖的

在两种施氮水平(低水平:N0;高级别:N1-见方法)从最小二乘均值(Lsmeans)分析爆炸损伤的密度。我们发现117温带粳稻（附加文件）3.)对稻瘟病菌敏感的基因型分离物CL26，但没有证据表明氮肥处理对敏感性有整体影响（附加文件）4.). 氮处理互作存在显著的基因型效应，4个基因型（3%）表现出氮处理下的敏感性增加，10个基因型（8%）表现出降低。

我们发现159个水稻品系对稻瘟病菌分离物CD203敏感。在这项分析中，氮肥处理、基因型和基因型与处理间的互作都是显著的（另附文件）5.). 基因型互作对氮素处理的显著影响表明，氮素对稻瘟病易感性的影响取决于该群体中的水稻基因型，因此这些数据适用于全基因组关联分析。

在N1条件下对CD203的敏感性的平均增加为8％（图。1.)．有19种基因型(11%)在N1条件下显著高于N0条件，有5种基因型显著低于N0条件(3%)。病变数量增加最多的是TRAMONTO基因型，N1的病变数量是N0的4倍。相反，MARENY基因型在N1条件下的病变比在N0条件下的病变少3倍。因此，我们的结果表明，在温带粳稻种群中，NIS相对罕见(14%)，且较弱(平均增加8%)。在N0和N1条件下，Lsmeans抗稻瘟病遗传力分别为0.43和0.426.)，允许在每个施肥条件下进行GWA分析。

使用N1和N0条件的最小二乘平均值计算新的NIS指数（NISI，见方法）。这个指数允许检测基因型，对于这些基因型，受精后的易感性变化偏离了在面板水平上发现的8%的标准值（图。1.). NISI为1的基因型的易感性增加与总体增加（8%）相等。更健壮的基因型NISI得分接近零，而不那么健壮的基因型NISI得分更高。27%的基因型表现出相当强的易感性，NISI介于− 1和1，30%的人NISI高于3（附加文件）7.)．

不同氮肥条件下水稻抗稻瘟病的GWA分析

GWA分析在N0环境中发现了14个显著snp，在N1环境中发现了3个显著snp(图1)。2.分别为a和b，以及附加文件8.). 为了定义一个QTL，我们只考虑几个紧密连锁的显著和亚显著snp检测到的位点（见方法）。这排除了在7号染色体上发现的5个分散的SNP，附近没有其他亚显著的SNP。相比之下，在5号染色体上发现的单核苷酸多态性似乎代表一个位点(NIS2）含有四个亚有效的SNP。另一个轨迹，RRobN1型在第6染色体上，由11个显著的SNPs定义。

使用NIS指数得分作为表型（NISI的遗传率=0.1），在全基因组关联中确定了21个显著的SNP（图。2.c和附加文件8.). 其中2号染色体上的4个snp和3号染色体上的3个snp分布在染色体上，因此没有进一步考虑。一个QTL(NIS3)，由12个显著的SNPs组成，在10号染色体上被鉴定。值得注意的是，在病变密度的GWA分析中未检测到该QTL，进一步证明了NIS指数的有效性。

RRobN1，一个不受氮肥影响的部分抗性QTL

这个RRobN1型在GWA分析中，6号染色体上的11个SNPs在N0条件下显著，但在N1条件下不显著，尽管这个位点上的许多SNPs在该条件下是次显著性的(表附加文件)8.和9;和图。3.a).与抗性相关的单倍型只存在于四个品种中:IRAT 268、IAC 26、GIGANTE VERCELLI和RUBI。然而，仅考虑该位点的特别分析表明，它在N1环境下也具有抗性(图。3.一种）。该基因座赋予的抵抗水平与其他已知的主要抗性基因相似[54]在N0和N1两种情况下，病变数目减少了75%。然而，RRobN1型不赋予CL26孤立的阻力（附加文件10)．因此RRobN1型是分离特异性的，在高氮条件下具有强大的抗性，这是经典的主要抗性基因的两个特征[24]，表明该基因座是古典抵抗基因的基础。这个第1条染色体6上的基因座（650 kB介于23.90至24.2 MB之间）不含任何映射或克隆抗性基因[54在该地区的42个基因中，参考基因组Nipponbare中没有抗性基因类似物(Table Additional file .)11)．因此，与之相关的稳健性，电阻升高RRobN1型基因座可能不是由经典的抗性基因类似物赋予的。两个与抗病相关的磷脂酶D基因[55,56]可能是很好的候选人。

NIS2是一个与高氮胁迫下敏感性增加相关的QTL

第五号染色体上的第二个基因座NIS2，只在N1条件下对CD203分离物进行检测。没有明显的关联NIS2使用CL26隔离(附加文件10)．NIS2是由一个独特的单核苷酸多态性在一个强连接的LD块（LD r）中定义的^2.约0.9从27.55到27.96 Mb）含有5个亚显著的SNP（其中–log10p大于4）（图。3.b） 是的。事实上，可能有两个单倍型可以定义在这个位点，与第一个单倍型(NIS2–1号)发现于22个品种（占种群的26%）。用这个植物NIS2–1号单倍型从低至高氮条件下显示病变数增加17％（图。3.b） 是的。第二种单倍型，NIS2–2，表现出7%的适度增长，与群体中氮的平均效应相似（图。1.)．

为了调查所赋予的表型的基础功能基础NIS2所有69个基因都在这个基因座上进行了研究（附加文件11)．在众多可能的候选者中，保留了三个功能假说。首先，易感性的增加可能是由于存在的生物应激反应，如机架1B[57]，奥斯宁贾1[58,59] 和ossyp71.[60]. 第二，表型可能源于基因的拮抗多效性，如OsMATE2[60,61]，调节植物对氮的反应，同时对抗病性产生负面影响。第三，表型可能是由于调节新陈代谢的基因，如osmyb55，调节氨基酸代谢[61]，或奥斯纳德-戈加特2参与氮代谢[62］．

NIS3是一个受氮肥影响的部分抗性QTL

与…对比第1条和NIS2,NIS3用NIS指数（NISI；参见方法和以上）。NIS3位于染色体10上的800 kB的LD块中（图。3.c表和其他文件8.和9)．利用3000个水稻基因组中的19个SNPs，我们可以在这个位点定义3个单倍型(Table Additional file)13)．我们不能进一步表征NIS3-2单倍型，因为它在我们的小组中仅由四个基因型表示。这个NIS3-3单倍型在我们的样本中最多(112个基因型或79%)NIS3-1单倍型频率较低，出现在25个基因型中。线路的平均NISI值NIS3-1单倍型为3.46，显著大于有单倍型的品系NIS3-3单倍型，其平均NISI值接近零（图。3.c） 是的。NIS3-1基因型比NIS3-3基因型更具抗性，但在高氮条件下也更敏感，敏感性增加14.6%（图1）。3.c） 是的。

我们建立了一个新的水稻面板（见方法），专门测试单倍型是否在NIS3基因座在跨越大米多样性的表型预测。我们选择了来自不同亚种的二十六种基因型：十六有NIS3-1单倍型和10NIS3-3表在附加文件2.)．在GWA相同的条件下接种CD203分离物。本试验表明氮与基因型之间存在显著的互作效应(P值= 4.33 e^− 4.）但没有全局氮撞击（p值= 0.56）。我们没有使用NI，因为ANOVA中没有全局氮气效应（NI〜0，因此必须调整NISI;请参阅方法）。随着我们在原来的GWA中观察到的，具有NIS3-3单倍型的植物对氮处理的影响更加稳健，其平均调节NISI评分为0.68，与NIS3-1单倍型植物的调整后NISI得分为3.46.这些结果验证了参与NIS3在NIS至CD203分离物（图。4.)．各单倍型调整后的NIS指数无显著差异NIS3-3和NIS3-1（附加文件）14)在对CL26菌株敏感的117个基因型中。

为了了解观察到的高氮环境易感性的可能遗传基础，126个基因注释NIS3进行了调查（补充文件15)．我们认为生物应激反应(29个致病相关基因)、非生物应激反应(OsTIP3级；1，[63] 和RIPER6[64])两种应力的调节(OsGRXS17,[65] 和OsTPR1型[66]）或氮代谢（OsPORB公司，[67和聚聚谷氨酸合成酶[68]）。可能的调制m . oryzae致病性计划响应高氮环境也是基于我们以前的结果的假设[26］．有趣的是,OsTPR1型编码一种与真菌效应器竞争性结合的蛋白质摩契亚1使几丁质的自由积累和水稻免疫应答的重建m . oryzae相互作用 [66］．最后，NIS反应可能是由于该位点的初级代谢缓冲了免疫反应。在这方面,OsPORB多聚谷氨酸合成酶基因在稻瘟病感染期间被抑制[26］．

这个NIS3-3等位基因在温带日本常见(79%的面板测试，附加文件16)．我们在这个群体中寻找可能是固定的NIS3位点的有趣的等位变异基因。我们发现一个等位基因RIPER6(成熟相关家族蛋白)，与耐寒性相关[64，在90%的病例中观察到与NIS3-3。

在这项研究中，我们证明了氮肥对水稻部分耐药性的负面影响（平均8％）m . oryzae应变CD203。到目前为止，氮诱导易感性(NIS)表型只在有限数量的水稻基因型上观察到[24］．因此，我们将NIS的特性扩展到整个水稻亚种。我们也证明了这种表型不同的基因型，与一个显著的基因型x氮互作。我们提供的证据表明，极少数基因型在高氮条件下表现出更强的抗性1.）是对育种者的有希望的发现。我们还确定了一个QTL，RRobN1型等位基因即使在高氮环境下也能产生部分抗性。这些结果表明，水稻-温带日本血吸虫在氮环境中具有较强的抗稻瘟病性的遗传解决方案。

此外，除了已知的基因座NIS1[24]，我们鉴定了两个QTL(NIS2和NIS3)与NIS表型有关。最后，我们观察到QTL效应随病原菌菌株的不同而变化，表明氮素对植物抗性的影响可能因真菌-分离物相互作用的不同而不同，就像在其他病理系统中一样[69,70,71］．

在氮肥下对稻瘟病的敏感性的变化是携带的植物中的两倍。NIS2–1号等位基因比面板的平均反应高17%，而不是8%，图。3.b） 是的。类似地，植物NIS3-1氮气治疗后易感性均增加（15％）增加（15％）NIS3-3基因型（7％图。3.c） 是的。在这方面，NIS2–1号和NIS3-3等位基因对高氮胁迫下的敏感性也有类似的影响。然而,NIS3不同于NIS2因为它对敏感性的影响可以在氮环境中观察到。的确，植物与NIS3-1观察到单倍型比携带单倍型的人更不敏感NIS3-3独立于氮处理，而NIS2–1号不同于NIS2–2号只有在高氮条件下。

NIS指数（NISI）的使用被证明是有用的，以衡量变化的敏感性氮处理后，自2001年以来NIS3轨迹仅使用NISI作为我们的表型在GWA中检测到。实际上，NISI使我们允许我们识别基因型在与所有人口的平均反应相比，氮肥对施氮量的影响越来越稳健。当观察到单向效应时，这种指数特别有用，如干旱和盐度的情况，这通常在整个面板上具有类似的效果，但具有不同的强度[43,72,73］．在其他关联研究中使用了类似的指标对各种物种中非生物胁迫的稳健性进行了鲁棒性[44,74］．其他不考虑人口中的整体效果的稳健性的其他索引存在，并且在NIS等案件中检查其效用将会有趣[43］．我们的研究表明，使用稳健性指标在GWA研究中是有前途的，由环境扰动引起的疾病易感性。然而，CL26实验的结果需要谨慎。与上述非生物胁迫对产量的全球和单向影响相反，氮肥的添加并不总是引发群体内基因型的敏感性变化。相反，氮肥处理后，基因型在敏感性变化的幅度和方向上都可能发生变化。这些多向效应可能是由于在非生物胁迫模型中不存在的另一个关键因素，即病原体。受氮肥影响的不仅仅是植物的反应，而是寄主/病原体的相互作用。施氮对病原菌效应因子的表达有影响[26]. 病原体毒力的这种改变可能与其他病理系统一样依赖于分离物[75］．

理解NIS的潜在遗传控制很难确定，因为氮的作用相对较弱（8%），温带粳稻的NIS表型相对罕见（14%）。此外，NISI表型的遗传力相对较低（0.1）。在复合胁迫下测得的性状往往具有较低的遗传力，这给QTL的鉴定带来了困难[41］．因此，稳健性的高遗传性不容易达到，因为它可能与特定的基因或大或中等影响的基因无关，而是由于分散在基因组中的许多基因对应激产生了一定程度的稳健性[76]. 因此，本研究中可能还没有发现其他对表型影响不大的位点。例如，在一个健壮的基因型中，不同基因间功能冗余的存在可以缓冲对环境变化的免疫反应[76］．在N0环境下由一个基因授予抗性，在N1环境下由冗余基因授予抗性。

NIS表型在我们的研究小组中相对罕见（14%）。为了理解为什么温带粳稻对氮肥的抗性如此强烈，我们寻找了可能的原因NIS3-3等位基因在温带粳稻人群中普遍存在。这个新谢克尔3个轨迹包含RIPER6一个在温带粳稻群体中具有抗寒性的高频等位变异基因[64]. 在可供筛选的3000个基因组中，90%的温带粳稻中发现了RIPER6的等位变异NIS3–3等位基因（附加文件16)．因此，在温带杂志中，促进稳健性的等位基因可以与赋予温带环境中高适应度的基因的等位基因变异相关[77］．这表明对稻瘟病的稳健性可能是通过耐寒性选择的搭便车效应而产生的。

虽然缺乏研究尚未充分了解可变环境中抗性稳健性的机制，但是可以提出几个假设。第一家庭假设用于解释氮气存在下易感性的增加可能是可以通过氮气下调或可能调节初级代谢与防御反应之间的串扰的生物应激调节剂的存在。与后期机制一致，使用植物防御素1.2（PDF1.2）转录物表达的折叠变化的GWA研究鉴定了生物和非生物应激之间串扰的轨迹[40］．因为一些等位基因NIS3就其本身而言，该基因座可以通过这种机制调节氮胁迫下的稻瘟病敏感性。事实上，转录水平上的分子调控不一定是组合环境中每个条件反应的总和[78]. 如果一个等位基因的功能，使免疫反应总是超过一个足够的阈值，尽管某些干扰，这使得最终表型健全的干扰。

第二个假设是，NIS可能是由于存在一个主要代谢调节器，其作用靶点是m . oryzae增强其感染过程。NIS2包含的基因NADH-GOGAT2编码一种谷氨酸合成酶，一种在叶质体中具有活性的酶，可将谷氨酰胺转化为谷氨酸[79]. 反向反应由谷氨酰胺合成酶（GS）催化，使谷氨酸和NH4生成谷氨酰胺⁺[80］．几个观察结果表明NADH-GOGAT2酶可能是一个好的候选人NIS2. 事实上，GS/GOGAT循环已经被证明是植物-病原相互作用的决定因素，影响不同的植物防御策略[71]. 此外，我们之前已经表明GS1–2级在高氮条件下，该基因在稻瘟病侵染时有差异表达，并与NIS有关[26]. 另外，米饭NIS1授予NIS的轨迹包含NADH-GOGAT1基因[24］．最后，已显示谷氨酸诱导抗性m . oryzae在水稻中申请后[81.]而且在A.拟南芥[82.］．这些结果表明谷氨酸/谷氨酰胺循环对稻瘟病系统有强烈的影响。在接种前一天添加额外的氮可能会破坏这个循环，导致某些基因型的NIS。基因型与NIS2–1号该等位基因可能具有不同的NADH-GOGAT活性，因此对氮素输入更为敏感。与这一假说相一致的是，水稻Kasalath基因型(来自于NIS1众所周知，易感等位基因已知在N1条件下更易于稻瘟病，并且少于Nipponbare，含有氮气对抗性影响的基因型较少的NADH- Gogat蛋白质[83.］．

这个R冰爆/粳着温水水稻病毒系统受到NIS的影响。我们已经改编了传统上用于研究NIS研究的非生物胁迫的指数。该NIS指数用于GWA研究，与使用敏感性表型并行的传统方法。用不同的效果确定了三个新的QTL。一，R等位基因RRobN1型基因座提供对不同氮肥制度稳健的抵抗力，并应在育种计划中选择。第二，NIS2–1号等位基因增强的NIS，一种潜在的效应产生于aNADH_GOGAT2在育种计划中应避免使用基因。第三个NIS3利用NIS指数检测到的基因座本身就赋予了易感性，并增强了高氮条件下的易感性。有害的NIS3-3单倍型通过遗传携带抗性等位基因的遗传搭配可能增加了耐寒性的频率，导致温带杂草中的氮气易感性降低。

表型数据可按需提供。种子可以从蒙彼利埃的生物资源种子中心（BRC GAMèT）获得。

NIS:

氮致敏感性

非绝对的:

氮诱导敏感性指数

QTL：

数量性状位点

GWAS：

全基因组关联研究

n0：

低氮条件

n1：

高氮条件下

LSMeans:

最后一个方块表示

镍：

氮气冲击

氢气：

遗传

SNP:

单核苷酸多态性

LD:

连锁不平衡

主成分分析:

主成分分析

MLM：

混合线性模型

我们感谢Loïc Fontaine和Henri Adreit对植物的照顾，感谢Aurélie Ducasse对实验室的管理。我们感谢弗朗索瓦·邦诺、布里吉特·考托瓦和雅克·大卫对数据分析的支持。

这项工作得到了INRAE和西方地区的博士学位资助。表型鉴定的执行者得到了来自FSOV计划（植物育种支持基金）的SEPYA项目的支持。EB和JBM的工资由法国农业部提供支持。

从属关系

1. BGPI，蒙彼利埃大学，CIRAD，INRAE，法国蒙彼利埃农业研究所

   Mathias Frontini＆Elsa Ballini

2. 法国阿尔勒，法国里兹中心

   arnaud boisnard.

3. 蒙彼利埃大学农业研究所，法国

   朱利安Frouin

4. 阿尔及利亚阿尔及尔农业产品价格组（GVAPRO）

   Malika ouikene.

5. BGPI，蒙彼利埃大学，CIRAD，INRAE，法国蒙彼利埃农业研究所

   让·贝诺特莫雷尔

贡献

MF和MO负责植株、接种和病害症状分析。AB和JF提供了植物种群。MF进行了所有的统计分析、GWAS和LD计算。EB设计了实验。MF起草了原稿。JF创建并提供了基因组数据。EB和JBM指导实验设计、数据分析并参与撰写稿件。所有作者通过了最终稿件。

相应的作者

对应于艾尔莎·巴利尼.

道德认可和参与同意

不适用。

出版许可

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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