半碱性植物的转录组和小RNA的整合分析monochasma savatieri.寄主-寄主协会建立前后

背景

monochasma savatieri.是一种药物根部偏瘫草，可通过HAULTORIUM从宿主植物中提取水和营养素。M. Savatieri.在建立寄生-寄主关系后表现出增强的生长，但对此的分子机制知之甚少。本研究对内源激素、RNA测序和小RNA测序进行分析M. Savatieri.建立寄生-寄主协会的前后。

结果

随寄主生长，番茄叶片茉莉酸(JA)和吲哚乙酸(IAA)含量降低，脱落酸(ABA)含量升高M. Savatieri.与建立的寄生关系。当用宿主生长时，在比较之间确定了46,424个差异表达基因（DEGS）和162个差异表达的miRNA（DEMIR）M. Savatieri.有寄生关系和没有寄生关系。Gene Ontology (GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)分析表明，这些DEGs和deirs的靶标主要参与植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、碳水化合物代谢、细胞生长和死亡以及运输和分解代谢。此外，通过mRNA和miRNA的相关性分析发现，来自novel_mir65、novel_mir40、novel_mir80、miR397-5p_1、novel_mir36、novel_mir25和novel_mir17的10对miRNA靶对可能在调控猪的寄生发育中发挥重要作用M. Savatieri.．

结论

我们的研究不仅扩展了对增强生长的理解M. Savatieri.建立寄生虫 - 主机协会后，还首先为未来的分子和遗传研究提供丰富的资源M. Savatieri.．

monochasma savatieri.法兰治（姓氏）Orobanchaceae的Ex Maxim是一种多年生的根偏瘫草本植物，在日本阳光明媚的地球和九州（Amakusa群岛），在阳光明媚和丘陵地带中增长了很好[1那2那3.］．干燥后，其整个植物是延宁糖浆（一部专用中药）所必需的，这通常适用于治疗尿路感染，上呼吸道感染和扁桃体炎[4.］．目前,野生M. Savatieri.资源急剧减少，主要是由于野生资源的不可持续使用[3.］．目前主要采用组织培养技术进行微生物繁殖M. Savatieri.已在少数研究中报道[5.那6.，缺乏对寄主-寄主关联的研究，限制了其成功的人工栽培体系的建立。在以前的研究中，我们研究了生长和解剖特征M. Savatieri.与寄主建立寄生关系前后的幼苗[7.］．但是，研究了分子机制和监管网络的研究M. Savatieri.在建立与主机的寄生关系之前和之后的植物尚未进行。这种知识缺乏限制了改善成功寄生的研究M. Savatieri.通过使用可靠的技术。因此，需要探索分子机制来促进进一步研究寄生虫宿主协会的研究，以满足日益增长的市场需求。

吸器作为寄生植物的一种特殊器官，被认为是寄生的本质[8.］．除了吸器诱导因子，植物激素也吸器的形成中发挥作用。在吸器的形成的过程中Cassytha filiformis(樟科)，细胞分裂素吲哚丙酸(IPA)和玉米苷核苷(ZR)含量分别比对照高20倍和4倍[9.］．一项研究Cuscuta japonica显示合成的细胞分裂素与吸器的发育密切相关[10］．在吸器形成区积累了大量的生长素五角并由表皮分泌细胞排出[11］．

转录组测序(RNA-seq)作为一种经济可行的测序技术，已被广泛用于扩展序列数据库，并在转录和基因组水平上了解差异表达基因(DEGs)。近年来，RNA-seq在了解寄生植物的特性方面显示出巨大的潜力。通过对寄主特异性基因的rna序列分析，揭示了寄主特异性基因的显著表达模式Triphysaria杂色的和它的主人Medicago Truncatula.或Zea Mays.[12］．此外，羚羊属植物三种寄生植物的比较转录组分析表明血血管岩中叶绿素合成的保守[13］．Ranjan等人[14对寄生杂草的转录组进行了测序Cuscuta Pentagona.研究发现，在寄生过程中，寄生物编码转运蛋白和酶的基因被上调，而与植物激素相关的基因则有差异表达。RNA-seq还用于根半寄生植物吸器发育的研究檀香，这表明人类信令对于出血启动至关重要[15］．Kim等人[16]，利用转录组测序来表征mRNA之间的转移c . pentagona和拟南芥或以双向方式的番茄主机。

21-24个核苷酸的microRNA（miRNA）组成是一种小的非编码RNA，主要在翻译抑制或稳定化中起作用[17通过完全或部分结合目标信使rna [18］．在植物中，mirna代表了一组研究最好的小rna (srna)，它们在发育中的各种作用，包括叶的生长、开花和根的伸长，已经被报道[19那20.］．最近，mirna作为跨物种调控因子引起了人们的关注[21那22］．例如，在体外和体内的功能研究表明，外源植物miR168a在水稻中可以调节哺乳动物基因LDLRAP1的表达[21］．寄生虫的研究五角定-拟南芥对鉴定了27个22 nt长度的mirna，它们针对几个答:芥mRNA的，这是在界面采取斯尔纳测序技术的优势[上调22］．

在本研究中，我们利用RNA-SEQ和SRNA测序技术来配置MRNA和MIRNAM. Savatieri.根与寄主之间建立寄生关系，以了解寄主促进寄生的机制M. Savatieri.发展。因此，通过分析从成对比较获得的DEG和差异表达的MIRNA（DEMIR）来构建DEMIR和DEG之间的相互作用的调节网络。本研究的结果提供了有用的资源来探讨六磷酸盐的发展，并进一步扩展了我们对植物中miRNA-mRNA网络的理解。

内源激素含量

目的:探讨大鼠生长发育差异的机制M. Savatieri.寄生前后g . jasminoides(无花果。1a），我们分析了内源性激素含量M. Savatieri.幼苗。当用或没有宿主生长时，吲哚-3-乙酸（IAA）的含量，甲基吲哚-3-乙酸盐（ME-IAA）和吲哚-3-羧醛（ICA）在两个发育中显示出始终如一的降低趋势阶段，ICA的内容高于IAA和ME-IAA的内容（图。1B和C）。在8是，转蛋白（TZ）和CIS-ZEAPIN（CZ）的水平M. Savatieri.没有宿主生长的幼苗是最高的并且与任何其他样品中的水平显着不同（图。1d）。在主机中，茉莉酸（JA）在内容的存在M. Savatieri.寄生于g . jasminoides与茉莉酸含量相比下降了66.20%M. Savatieri.在建立寄生虫-宿主关联之前。二氢茉莉酸(H2JA)含量在建立寄主组合后呈下降趋势，但差异不显著(图2)。1e).在8 WAS时，各组间水杨酸(SA)含量无显著差异M. Savatieri.苗中的存在或不存在g . jasminoides．在16 WAS时，未生长的植株的SA含量g . jasminoides显着高于寄生术后植物的SA含量。此外，与植物生长的植物相比，寄生虫 - 宿主关联的建立显着增加了植物中的脱离酸（ABA）含量g . jasminoides8 WAS(图。1f)。

RNA-seq，序列组装和功能注释

图书馆共读了十二本M. Savatieri.由RNA-SEQ建造用于使用BGISEQ-500平台在寄生虫发育过程中暴露转录组差异。在本研究中，从根系中获得74.27 GB的序列数据M. Savatieri.在没有寄主或有寄主的情况下生长8或16个WAS。经组装和去冗余后，得到167,941个unigenes，总长度249,584,355 bp, GC含量为40.76%，N50长度为2474 bp，平均长度为1486 bp。这些unigenes的序列长度在200 ~ 3000 bp之间，其中大于1000 bp的unigenes高达86644个(占51.59%)(图S1)．所有cDNA文库中的清洁读数与总原始读数的比例超过95.85％，并且序列基地的质量呈现在表中1．Q20的最低值为97.62％，和Q30的最低值是89.72％。组装转录物的质量通过评估BUSCO，结果示于图：S2．Busco分析表明，在所有组装的unigenes中，其中22％是单拷贝完成，76％重复完整，1％碎片，1％缺失。

为全面了解所获得的unigenes的功能，将所有unigenes分别在KOG、SwissProt、NR、KEGG、NT和Pfam数据库中进行搜索。与已知基因序列相似的unigenes分别为116,572 (blast - NR数据库)、95,387 (blast - NT数据库)、94,681 (blast - KEGG数据库)和91,301 (blast - Pfam数据库)2)．通过GO分析，将62,227个unigenes注释并分为41个GO类别的41个功能组（图S2)．在GO项中，催化活性和分子功能在官能团和GO类别中所占比例分别最大。

的识别度

为了呈现不同比较中的DEG数量，构建了一个VENN图（图。2一种）。在这四个比较中，BZ / AZ具有最多的DEG（46,424），其次是AC / AZ（43,746）和BC / AC（38,111），BC / BZ具有最小的DEG（26,804）。此外，在所有四个比较中鉴定了4351次。与BC相比，在AC下检测到11,778个上调基因和26,333个下调基因。BZ与AZ的比较显示了27,098个上调基因和19,326个下调基因（图。2b和附加文件2)．为了直观地了解整个表达剖面，我们构建了一张热图(图2)。2c).通过基因表达分析发现，BC中较高表达量的基因中有很大一部分在AC中表达量较低。而且，大多数DEGs在BZ和AZ中的表达差异大于BC和AC。

DEGs的功能分类和富集分析

为了进一步了解DEGs，我们使用GO和KEGG途径分析来评估DEGs(图)。3.)．通过分析这三种比较，可以发现注释的deg在几个特定的GO术语上得到了丰富。在BZ与AZ比较中，deg的数量大于BC与AC和AC与AZ比较中的deg数量。在每次比较中，大多数的DEGs富集在细胞成分类别中，具有高度代表性的GO术语分为“细胞”、“膜”、“细胞部分”、“细胞器”和“膜部分”。氧化石墨烯术语在生物过程分类中明显分为“代谢过程”和“细胞过程”，在分子功能分类中明显分为“催化活性”和“结合”(图)。3.A-C和附加文件3.)．

为了获得更多关于代谢途径和DEG的生物学功能的洞察力，在KEGG数据库的基础上进行富集分析。在BC VS AC比较中检测到14,375只DEG，BZ VS AZ比较15,320次，AC VS AZ比较中的14,659次参数。在这些比较中，给出了由最重要的差异表达基因富集的前20个途径（图。3.d-f)。在BZ与AZ和AC与AZ的比较中，DEGs主要富集于“植物激素信号转导”、“淀粉和蔗糖代谢”、“苯丙素生物合成”、“MAPK信号通路-植物”、“半乳糖代谢”、“玉米素生物合成”和“植物-病原互作”。值得注意的是，“植物昼夜节律”和“类胡萝卜素生物合成”仅在BZ和AZ的比较中富集。在BC和AC比较中，DEGs在“光合-天线蛋白”、“吞噬体”、“丁酸代谢”、“核糖体”和“酮体的合成和降解”中显著富集。此外，“氮代谢”、“光合生物固碳”、“光合作用”和“角质、子叶和蜡的生物合成”仅在BC和AC比较中显著富集。

与寄主建立寄生关系前后的生物过程相关的转录因子

自从M. Savatieri.在增长期间与主机建立寄生关系g . jasminoides，然后选择BZ和AZ比较中与生物过程相关的DEGs进行进一步分析。在这里，我们鉴定了66个转录因子(TFs)，这些转录因子可能在建立寄主-寄主关联中具有公认的调节作用。TF家族包括WRKY、TCP、PBF-2-like、NAC、MYB、MADS、GRAS、G2-like、FAR1、C3H、C2H2、C2C2-GATA、C2C2-Dof、BES1、ARF、AP2-EREBP和ABI3VP1(表S)1)．在这些tf中，MYB家族含有最多的DEGs，其中7个推定MYB在BZ/AZ下上调。WRKY家族有8个DEGs，紧随MYB家族。此外，与BZ相比，AZ下8种wrky的表达量均降低，表明转录因子可能对寄主-寄主关联的建立起负调控作用。

与建立寄生关系有关的DEG网络和途径

来理解…的潜在机制M. savatieri-在“植物-病原体相互作用”、“类胡萝卜素生物合成”、“苯丙素生物合成”、“植物激素信号转导”和“胞内作用”中显著富集的DEGs与DIAMOND的STRING数据库进行了比较。基因间的相互作用是通过与已知蛋白的同源性得到的。在重建的基因网络中，从500个DEGs中共鉴定出50个基因之间的46个相互作用(图)。4.)．在50个鉴定的基因中，三次次数，即，MsPTI1那Mshal3a.,MsCURL3的相互作用更频繁，这表明它们可能在基因的建立中起关键作用M. Savatieri.- 健康协会。

通过映射到KEGG数据库，得到三个degMsPTI1那Mshal3a.,MsCURL3参与“代谢途径”和“植物激素信号转导”。M. Savatieri.与寄主建立寄生关系后表现出生长增强的趋势，以上结果表明植物激素在建立寄生关系中起重要作用M. Savatieri.- 以及关联。因此，仅在Bz VS AZ比较中特别表达的次数在“植物激素信号转导”和“柠檬酸循环”途径中列出以获得详细信息（图。5.)．在柠檬酸盐循环中，参与柠檬酸酯，顺式敏氨酸和异柠檬酸酯之间的循环过程中的8℃（4个上调和4个下调）和乙酰-COA的生物合成。在植物激素信号转导中，疾病信号转导的基因的数量是最高的，并且在与宿主建立寄生关系之后，这些基因的表达水平上调。另外，2MSCRE1.推测的靶基因(CL11524。Contig2 CL9853。在细胞分裂素信号转导中鉴定到Contig1)。

度的视角的定量RT-PCR验证与寄生虫发展有关

与寄主建立寄生关系是通过一系列的过程实现的，这些步骤涉及许多基因。在实验中，我们通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对筛选出的14个deg进行了验证。预测所选的DEGs在淀粉和蔗糖代谢中发挥作用(Unigene11723那Unigene28565那Unigene25653那Unigene35991那Unigene32595.)、激素信号转导(Unigene9451.那Unigene21852那Unigene29438那Unigene60184)和细胞部分(Unigene36901.那Unigene470那Unigene5067.那Unigene10023那Unigene25917)．QRT-PCR分析表明，这些基因的表达模式与相应的转录组数据的表达模式一致（图S3.)．

在与淀粉和蔗糖代谢相关的基因中(图S3.a和b），表达水平Unigene11723和Unigene28565与BZ和AC相比，在AZ下表达增加Unigene25653那Unigene35991和Unigene32595.与寄主建立寄生关系前后，参与激素信号转导的4个基因的表达水平存在显著差异(图S3.C和D）。此外，QRT-PCR分析显示Unigene9451.那Unigene21852和Unigene29438表现出AZ高得多的表达水平比其它三组，而关于Unigene60184，其表达水平降低至少20倍。在细胞部分，四个基因(Unigene36901.那Unigene470那Unigene5067.和Unigene10023)在AZ中表达量高于ACUnigene25917在AZ中表现出显着较低的表达水平（图。3.e和f）。

小RNA测序和分类注释

共有十二个SRNA库（BC，BZ，AC和AZ，每次重复三次）M. Savatieri.由根源制备M. Savatieri.揭示寄生虫发育中的miRNA差异。在本研究中，每个库生成了21,527,722 ~ 30,095,656个raw标签，剔除低质量标签后，每个库获得20,667,261 ~ 28,872,904个干净标签(表)3.)．Q20的最低值为98.6%，所有sRNA库中标记的比例均超过41.1%。这些小rna的序列长度从15 nt到30 nt不等，其中长度为24 nt的小rna数量最多(图S4.)．根据Rfam和GenBank数据库，我们注释了所有的序列M. Savatieri.库和描述了不同类别的计数(表4.)．在这些文库中，与成熟SRNA匹配的序列是最丰富的课程，除非露出序列之后，占近2-11％。

已知的和新的miRNA的发现

从小RNA序列中鉴定出110个已知的mirnaM. Savatieri.将序列与miRBase中已知的成熟mirna进行比较。利用miRA, 128个序列被鉴定为新型mirna的候选序列。如图S所示5.，已知和新的miRNA的第一个基地分布M. Savatieri.进行了分析。在鉴定的mirna中，第一个碱基的百分比分布不均匀。大多数已知和新miRNAs的第一碱基U %超过25%。构建维恩图来表示每组重叠的和特定的miRNAs的数量(图。6.a和b)。在4个文库中，每个文库中鉴定的已知和新miRNAs分别为69个和119个。家谱分析显示，在已知的miRNAsM. Savatieri.， 110个mirna来自30个家族(图。6.c).其中，miR166家族有13个miRNA成员，是最大的miRNA家族，其次是miR396家族，有11个miRNA成员。此外，14个家族中只有一个miRNA成员，如miR157和miR398(图1)。6.c)。

筛查Demirs.

目的:探讨miRNA的表达差异M. Savatieri.在与寄主建立寄生关系前后，分别对AC与AZ、BC与AC、BC与BZ、BZ与AZ进行比较分析。与AC相比，AZ中检测到下调和上调的mirna分别为29和49个。BZ与AZ比较发现，在AZ中有55个下调的mirna和107个上调的mirna(图2)。7.a和附加文件4.)．另外，在热图中可视化四个比较组之间筛选的失踪的一般概述（图。7.b).表达分析发现，大部分在BC与AC比较下的DEmiRs在BZ与AZ比较下具有相似的表达模式。此外，大多数DEmiRs在AC与AZ比较中表现出比BC与BZ比较更大的表达差异。

DEmiR靶基因功能注释

为了进一步了解DEMIR，我们使用GO和KEGG PATWAY分析来评估DEMIR靶基因（图。8.)．通过分析这三种比较，可以观察到注释的DEmiR靶基因在几个特定的GO项上富集。BZ与AZ比较中注释的DEmiR目标数量大于BC与AC和AC与AZ比较中注释的DEmiR目标数量。在每次比较中，大多数DEmiR靶标富集在细胞成分类别中，具有高度代表性的GO项分为“细胞”、“膜”、“细胞部分”、“细胞器”和“膜部分”。氧化石墨烯术语在生物过程分类中明显分为“单生物过程”、“代谢过程”和“细胞过程”，在分子功能分类中明显分为“催化活性”和“结合”(图)。8.A-C）。

在Kegg路线中，BC VS AC，BZ VS AZ和AC VS AZ比较中识别的DEMIR目标的数量分别为115,197和85（附加文件5.)．给出了三种比较中由最显著的DEmiR靶标富集的前20种途径(图)。8.d-f)。其中，DEmiR靶点主要富集于“RNA聚合酶”、“代谢途径”、“次生代谢产物的生物合成”、“内吞作用”、“氧化磷酸化”、“光合作用”和“戊糖与葡萄糖醛酸的相互转化”。值得注意的是，“嘌呤代谢”、“丙酸代谢”、“MAPK信号通路-植物”、“吲哚生物碱生物合成”、“糖酵解/糖异生”和“氨基酸生物合成”都在BZ与AZ和AC与AZ的比较中富集。此外，“核糖体”、“光合生物中的碳固定”、“单萜类生物合成”和“类黄酮生物合成”仅在BC和AC比较中显著富集。

QRT-PCR验证与寄生虫发育有关的失踪和靶

通过qRT-PCR，选取已知的6个(miR172a_3、miR156_2、miR396g-3p、miR171b-3p_3、miR397-5p_1、miR396h)和9个novel (novel_mir80、novel_mir50、novel_mir46、novel_mir113、novel_mir99、novel_mir49、novel_mir87、novel_mir40、novel_mir65) DEmiRs进行表达分析。这些选定的miRNA靶点被预测与生物调控、膜和细胞器以及代谢相关。在生物学调控相关的miRNAs中(图S6.a和b），和novel_mir50 miR396g-3P的表达水平在显着增加M. Savatieri.苗后寄生于g . jasminoides，虽然Novel _MIR80的表达水平显示出大的减少。关于膜和细胞器相关的miRNA（图S6.c和d)，与BZ和AC相比，AZ作用下miR171b-3p_3的表达降低，而novel_mir99的表达在建立寄生-寄主关联后显著增加。五种代谢相关mirna (novel_mir49, novel_mir87, novel_mir40, novel_mir65, miR396h)在AZ中的表达水平高于其他三组(图S)6.e和f）。

为了进一步了解与建立寄生关系相关的miRNA和靶的调节，分析了所选miRNA靶的表达水平。预计这些所选择的靶基因与生物调节有关（Cl9918.contig2，Cl14121.contig1，Unigene14700，Cl7316.Contig4，Cl219.contig5），膜和细胞器（Unigene4922，Cl1529.Contig2，Cl14340.contig10，Unigene652，Unigene34515）和新陈代谢（Unigene7334，Cl9246.contig2，Unigene21854，Unigene8689，Cl527.Contig67）。15个靶基因显示出不同的相对表达水平M. Savatieri.寄主寄生前和寄生后的幼苗(图S7.)．五个靶基因（Cl9918.contig2，Cl14340.contig10，Unigene7334，Cl9246.contig2，Cl527.contig67）与相应的miRNA强烈地呈负相关。表达水平cl9918.contig2.在建立寄生虫 - 宿主关联后上调，而其相应的miRNA（miR156_2）被下调。另外，六个靶基因（Unigene14700，Cl14121.contig1，Cl219.Contig5，Unigene34515，Unigene21854，Unigene8689）与相应的miRNA强烈地呈正相关。表达水平Unigene14700.被寄主寄生后下调，其相应的miRNA (novel_mir80)也下调。

共差异表达mirna与靶点的相关性分析

在本研究中，BZ与AZ比较中共差异表达的mirna和靶点数量最多，其中负相关58个，正相关260个。在BC和AC的比较中，30个mirna和77个靶点共差异表达(表)5.)．探讨MiRNA和目标之间这些相关基因的生物学功能和分布M. Savatieri.，执行GO功能注释和KEGG路径分析。Bz VS Az比较中相同GO术语的注释基因的数量大于BC VS AC比较中的注释基因（图。9.A和B）。值得注意的是，仅在BC VS AC比较中检测到“生物过程的阴性调节”，而仅在BZ VS AZ比较中检测“生物过程的正调节”。此外，参与“信号传导”，“细胞结”，“蛋白质结合转录因子活性”，“膜封闭的腔”，“分子传感器活性”，“细胞外区域”和“Supplast”的相关靶案特别代表BZ VS AZ比较（图。9.关于KEGG通路，在BZ vs AZ和BC vs AC比较中，“细胞生长和死亡”、“运输和分解代谢”、“信号转导”、“物质依赖”、“碳水化合物代谢”、“发育”和“环境适应”中，相关靶标均显著富集。但在BZ和AZ的比较中，大多数相同KEGG项的相关基因的数量多于BC和AC的比较中大多数相同KEGG项的相关基因的数量(图。9.C和D）。有趣的是，仅在BC VS AC比较中显着富集“感官系统”。

本文基于mRNA-miRNA相互作用网络中BZ/AZ的比较M. Savatieri.其中，novel_mir65共差异表达的靶基因数量最多，其中21个和147个被novel_mir65靶向的相关基因分别为负表达和正表达(fig。10那11和附加文件6.)．此外，novel_mir40得到11共差异表达的靶基因，具有相关的miRNA的负调节相互作用网络中的第二数量最多。关于正调控相互作用网络，novel_mir87和novel_mir40得到26和24共差异表达的靶基因，作为相关miRNA的第二和第三大数目，分别。

转录和miRNA数据的相关性分析揭示了几个功能分类特定于BZ / AZ。因此，与这些功能的miRNA靶基因对来自所描述的相互作用网络筛选。最后，从7种miRNA得到10的miRNA靶基因对。该novel_mir65有4个靶基因：CL4768。Contig1参与生长素激活信号传导途径;的Unigene 36442参与了phosphorelay信号转导系统;的Unigene 25492与ATP结合相关联;和CL5625。Contig5是有关的DNA结合。所述novel_mir80有靶基因，Unigene14700，参与细胞表面受体的信号传导途径; novel_mir40 had a target gene (Unigene 21,854) related to the phosphorelay signal transduction system; miR397-5p_1 had a target gene (Unigene 652) related to hydroquinone: oxygen oxidoreductase activity; novel_mir17 had a target gene (CL2077. Contig6) related to RNA polymerase II transcription cofactor activity; the target genes of novel_mir36 (CL5994. Contig7) and novel_mir25 (Unigene 13,724) were associated with MAP kinase activity (Fig.12)．这七个miRNA可能会影响寄生发育M. Savatieri.通过调节信号传导，细胞连接和分子调控的相关基因。

M. Savatieri.是一种医学上重要的寄生虫，由于其狂热的野性资源急剧下降，已经对人工培养进行了很多关注。寄生虫生命习惯的本质是与主持人建立寄生关系[23］．近几十年来，对寄生关系建立的研究揭示了其对半寄生植物生长发育的促进作用Pedicularis雷克斯和Thesium研究方面[24那25］．在我们最近的研究中，增长和发展M. Savatieri.寄主寄生后显著促进(图。1一种）。然而，迄今为止，对潜在的分子机制并无研究，并且关于相关内源激素的特征，知之甚少。本研究是第一个探讨与宿主建立寄生关系之前和之后的转录组和小RNA的变化。

植物激素是调节植物生长发育的重要因子。通过分析KEGG通路，我们发现许多DEGs在“植物激素信号转导”中富集(图)。3.本研究表明，生长素(IAA)、ME-IAA和ICA的水平均显著降低M. Savatieri.开发，独立于建立寄生虫 - 宿主关联（图。1b和c)。同样，IAA含量在Cuscuta japonica在其寄生期间[11］．虽然JA和SA水平M. Savatieri.无寄主生长的幼苗随着发育而显著增加，在有寄主生长的幼苗中观察到相反的变化(图。1据报道JA可调节植物生长和胁迫反应[26]，而SA被发现介导了抗压力[27］．然而，JAS和SA的寄生植物的功能还是一个未知数。我们推测，源JAs和SA可能在应激适应信号至关重要的作用，并在附下降JA和SA水平M. Savatieri.幼苗可能与保护需求的减少有关。附著的半寄生虫中ABA水平的升高已在Rhinanthus小[28］．ABA级别M. Savatieri.与寄主生长的幼苗相比，寄主寄生后寄主数量显著增加(图8)。1f)。在附hemiparasites高水平ABA的，可能是由于从主机得到的自合成ABA和ABA的增加[29］．出奇，M. Savatieri.培养16 WAS有大约3.7倍超过ABAM. Savatieri.在没有主机的情况下，即使在没有主持人的情况下也是长大的。长期未附加的寄生虫可能易受非生物应激的影响，从而刺激ABA的增加，这是一种与植物干旱相关的激素。这些结果提供了通过外源应用植物生长调节剂来改善有益寄生虫的生长的线索，尽管需要获得进一步的证据来验证效果。

在这项研究中，大多数与“淀粉和蔗糖新陈代谢”相关的Degs富集在比较中M. Savatieri.具有寄生关系的植株(图。3.此外，mirna与靶基因之间的相关基因也参与了植物的“碳水化合物代谢”M. Savatieri.(无花果。9.C和D）。类似地，已在寄生虫的发育中鉴定出与碳水化合物，淀粉和蔗糖代谢相关的未成熟剂Arceuthobium sichuanense在转录水平上[30.］．结合我们的研究结果，这些数据综合表明，碳水化合物、淀粉和蔗糖的代谢可能在发育中起重要作用M. Savatieri.与寄主建立寄生关系后。在我们最近的研究中，观察到M. Savatieri.在没有寄主的情况下植物增加了充足的氮的条件首次被报道[31］．有趣的是，本研究表明，在“氮代谢”和“光合作用”中显著富集的DEGs仅在发育过程中观察到M. Savatieri.没有主机种植（图。3.a).考虑到氮供应的增加刺激了光合速率Striga hermonthica[32]和保留的光合容量M. Savatieri.本研究推测，在自养生长过程中，氮代谢可能与光合作用密切相关，这可能是根半寄生物在无寄主情况下的生存策略。此外，参与“光合生物固碳”的DEGs和DEmiR靶标仅在发育过程中富集M. Savatieri.，这没有增长g . jasminoides（图。3.一个,8.a).寄生虫使用的大部分碳来自宿主这一发现可能部分解释了这些结果[33),这表明M. Savatieri.在附着在宿主之前，大部分依赖碳的光合作用。

基于转录组和小RNA测序M. Savatieri.，相关性分析表明，在具有成熟的寄生关系的植物的比较中，最合同表达的miRNA和靶标在植物的比较中表示（表5.)．在之前的研究中，发现信使rna在寄生虫和宿主之间双向移动[16[寄生虫MiRNA靶向宿主MRNA在寄生期间充当Trans-Speies调节剂[22]，这意味着遗传分子交换也发生在M. Savatieri.-host植物相互作用，大部分的miRNA和目标后寄生舞台上扮演的角色显著。值得注意的是，既没有正的也没有负相关中在AC VS AZ比较共差异表达的miRNA和目标被发现（表5.)．结果与我们的期望不一致。进一步对宿主植物的转录组和小RNA测序将有助于理解和验证结果背后的机制M. Savatieri.- 植物互动。此外，参与“细胞交界处”，“细胞外区域”，“膜封闭的腔”和“Supplast”的相关靶差异表达M. Savatieri.与植物建立寄生关系前后的植物g . jasminoides(无花果。9.a和b).寄生物从寄主植物获得营养物质的共质体或质外体运输近年来已被讨论[34］．通过对RNA-seq和sRNA-seq的分析，证实了其转运机制M. Savatieri.除了apoplast之外，来自宿主工厂的营养素包括Syplast。结果类似于报告的发现c . pentagona[14］．

共鉴定出162个差异表达的已知和新的miRNAsM. Savatieri.在与主机建立寄生关系之前和之后（图。7.一个);然而，只有53个DEmiRs使它们的靶基因表现出显著不同的表达(图3)。10和11)．考虑到相平化的小干扰RNA（siRNA）在生长调节中的作用[35]，我们推测的siRNA也可作为在基因表达的调节器M. Savatieri.发展。MiRNA在调节植物开发方面的作用已经广泛研究。在拟南芥， miR167调控的表达模式ARF6和ARF8胚珠和花药的育性是必需的[36］．miR396过表达导致生长调节因子表达减少，细胞数量减少答:芥[37］．在这个mRNA-miRNA相互作用网络中，已知mirna属于miR167、miR396、miR845家族及其靶标在根中共差异表达M. Savatieri.在建立寄生关系之前和之后（图。10和11)．在这些mirna中，大多数已知的mirna在植物物种中是保守的。然而，miR845在植物中并不常见，这表明一些mirna可能对某些物种具有特异性。此外，miR396也是其中数量最多的家族之一M. Savatieri.(无花果。6.c），这表明MiR396可能在寄生虫发育过程中具有重要作用。然而，基于mRNA-miRNA相互作用网络，大多数共差异表达基因由一些新的miRNA靶向，包括Novelmir65，Novel_mir40和Novel_mir87（图。10和11)．因此，需要进一步的分子实验来研究它们在寄生蜂寄生过程中的作用和机制M. Savatieri.．

与寄主建立寄生关系降低了寄主体内IAA和JA水平，增加了寄主体内ABA含量M. Savatieri.．我们的研究为进一步研究生长增强的分子机制提供了第一个转录组和小RNA资源M. Savatieri.建立寄生关系后。通过高通量测序，获得了包含167,941个unigenes的转录组数据M. Savatieri.根中检测到46,424个DEGsM. Savatieri.有寄生关系和没有寄生关系。分析小RNA数据，获得128个新mirna和110个已知mirna，其中198个mirna在中有显著差异表达M. Savatieri.．deg和demir与生长发育有关M. Savatieri.通过GO和KEGG途径富集分析发现。此外，通过mRNA和miRNA的相关性分析发现，来自novel_mir65、novel_mir40、novel_mir80、miR397-5p_1、novel_mir36、novel_mir25和novel_mir17的10对miRNA靶对可能在调控猪的寄生发育中起重要作用M. Savatieri.．本研究产生的数据提供了丰富的信息和基因及miRNA序列，为加速分子和遗传研究提供了依据M. Savatieri.．在未来，需要研究来了解寄生虫 - 宿主协会的建立调节生长和生理过程的确切机制。

植物材料和生长条件

M. Savatieri.种子胶囊完全成熟，从位于惠州市江西省江西省永丰县的实验基地收集，于2017年5月（惠州市九辉药业有限公司允许该收集），然后在4℃下储存在纸袋中直至需要。M. Savatieri.经鉴定，并通过乔盛郭教授，南京农业大学认证。该凭证标本保藏在中国中西医结合南京农业大学（南京，中国）研究所。由于栀子茜草科(Rubiaceae)是茜草科植物群落中广泛分布的植物M. Savatieri.[3.]并可以通过盆栽寄存M. Savatieri.[7.]，它被用作本实验中的宿主。M. Savatieri.幼苗在存在或不存在下生长g . jasminoides工厂。2018年3月19日，用自来水冲洗后，我们将市面上可用的水进行了移植g . jasminoides大约15厘米的植物高度（从灵山Yufeng Guomiao Co.，Ltd）进入装满770克的细砂和营养土壤（2：1，v / v）的锅中，一个g . jasminoides每壶厂。为了促进种子萌发，800 mg·l⁻¹用赤霉素溶液浸泡M. Savatieri.种子室温保存24小时[38］．这些种子是在2018年4月17日播种的，每个罐子里有50颗种子。在播种后4周间苗，每盆保存10株高约5 mm的幼苗[7.］．

南京农业大学中国药材研究所的自然夜间/天温室培养所有植物。该实验是从春季（2018年3月）到夏季（2018年8月）的20周（2018年8月）进行的。在稀疏（起可能5月至8月）后，温室被50％的阳光块遮盖网覆盖，以使光线状况类似于M. Savatieri.栖息地。在整个实验中，每天用自来水浇水，以达到现场容量并随机完全放置，每2周重新安置，以最小化位置的效果。

收获和取样

进行了两次收获以检查之间的差异M. Savatieri.在存在或不存在时生长的g . jasminoides在寄生植物的两个主要发育阶段[23］．一个在8 WAS时(与寄主建立寄生关系前)，另一个在16 WAS时(与寄主建立寄生关系后)。半寄生体生长明显增强，证实了建立的成功M. Savatieri.-g . jasminoides协会(39］．实验包括四个不同的群体。公元前，M. Savatieri.生长在没有g . jasminoides8;热,M. Savatieri.已经长大了g . jasminoides8;交流,M. Savatieri.生长在没有g . jasminoides16;阿兹,M. Savatieri.已经长大了g . jasminoides16是。为了分析植物内源激素，将来自每组的幼苗样品用三个重复收集并称重以进一步测量。用于分析转录组和小RNA，M. Savatieri.每组采集的根迅速在液氮中冷冻，然后在−80°C下保存到需要的时候。有3个重复用于转录组和小RNA分析。

内源激素测量

如前所述，进行IAA，ME-IAA，IC），TZ，CZ，JA，H2JA，Jasmonoyl-（L），SA和ABA的提取，净化和测量。40］．简单地说，1克新鲜的M. Savatieri.样品用10 mL甲醇/水/甲酸(15:4:1,v/v/v)在4℃提取。LC-ESI-MS/MS (MS, Applied Biosystems 6500 Triple Quadrupole;采用高效液相色谱(HPLC)、SHIMADZU UFLC CBM30A系统(SHIMADZU - UFLC - SHIMADZU CBM30A系统)对生成的萃取物进行分析，esi -三重四极线性离子阱(Q trap)-MS交替连接出水。此外，由Analyst 1.6软件(AB Sciex)控制的API 6500 Q TRAP LC/MS/MS系统配备ESI Turbo ion - spray界面，在正离子模式下操作。

总RNA提取、文库构建及测序

根组织总RNA的提取M. Savatieri.根据制造商的指导，使用Trizol Reagent Kit（Invitrogen，USA）进行。在使用Nanodrop分光光度计8000（赛默飞世尔科技，USA）和安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技，USA）被用来分别评价这些总RNA的数量和质量。使用BGISEQ-500平台，合格的总RNA已准备好用于转录组和小RNA测序。共有12 mRNA和SRNA文库，每个治疗都有三种生物重复。BGI（中国深圳）进行测序，数据处理，基因功能注释和miRNA鉴定。两个RNA-SEQ和小RNA-SEQ数据已存放在NCBI数据库SRA时，分别用BioProject ID的PRJNA600790和PRJNA601043。Trinity software (parameter: --min_contig_length 150 --CPU 8 --min_kmer_cov 3 --min_glue 3 --bfly_opts ‘-V 5 --edge-thr = 0.1 --stderr’) was adopted to de novo assembly of the filtered clean reads [41］．此外，我们使用默认参数执行BUSCO，以检查组装的转录本的质量[42］．

转录组和小RNA分析

通过比对miRBase中已知成熟mirna的序列，识别出已知的mirna。基于miRNA前体的发夹二级结构特征，miRA [43采用默认参数(cluster_min_reads = 10;min_precursor_length = 50;max_mfe_per_nt =−0.2;min_duplex_length = 18;max_duplex_length = 30;allow_three_mismatches = 1)。用DESeq R包(1.18.0)分析对的差异表达。为了控制错误发现率，采用Benjamini和Hochberg方法对错误发现率进行调整P.价值。用于筛选DEGs和DEmiRs的条件是fold change≥2.00和一个调整的条件P.-value < 0.05 [44］．对DEVIR的DEG和目标基因进行GO和KEGG浓缩分析是基于超距离模型的[45］．为了获得更精确的结果，既psRobot（参数：-gl 17 -p 8 -gn 1）[46和TargetFinder(参数:-c 4) [47采用]预测miRNA的靶基因，并选择相应的交叉点作为最终结果。

DEG网络分析

执行网络关系的分析，DEGS用由DIAMOND的STRING数据库进行比较，并通过同源性已知蛋白质获得的基因之间的相互作用。存在用于基因之间的相互作用，这表明相互作用的可靠性得分值。从150至1000，分数越高，越可靠的相互作用关系。在our analysis, the network relations with score ≥ 300 were selected for building the DEG network.

mRNA与miRNA的相关性分析

为了进一步了解mRNA和miRNA（mRNA-miRNA表达的阴性和正相关）之间的所有可能的相互作用，使用内部R脚本建造mRNA-miRNA监管网络。简而言之，为了将具有DEG的失败集成，对所有样品的匹配mRNA和miRNA测序数据被归一化，然后MRNA和miRNA的表达谱，MiRNA靶标的信息和样品类别进行了整合。

实时荧光定量PCR分析

本实验选取“细胞部分”、“植物激素信号转导”、“代谢”相关的14个基因、15个mirna和靶基因，采用qRT-PCR分析其表达水平。根据制造商的指示,豆类植物RNA提取MiniBEST工具包(豆类,中国)采用从公元前中提取总RNA, AC和AZ gDNA橡皮擦完美的实时和PrimeScript™RT试剂盒(豆类,中国)采用合成cDNA用于基因的存在分析和microrna的目标。通过rna尾链验证miRNA表达，并使用Mir-X™miRNA第一链合成和TB Green™qRT-PCR试剂盒(TaKaRa，中国)合成用于miRNA qRT-PCR分析的cDNA。根据之前的一份报告，使用Step One Real-Time系统(应用生物系统，美国)进行放大反应[48］．采用了三个生物重复。所有引物序列见表S2，S.3.和s4.．对于基因和miRNA靶点，相对表达水平与几何平均值进行归一化GAPDH.和肌动蛋白基因[49］．对于miRNA，U6 SNRNA作为内部控制，并根据2进行分析^−ΔΔCT方法(50］．

统计分析

采用IBM Statistical Product and Service Solutions (SPSS) 22.0软件(IBM Corporation, USA)进行统计分析，采用Duncan 's multiple range检验(P.< 0.05)。

在当前研究中分析的RNA-SEQ读取数据可在NCBI SRA数据库中提供，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA600790(登录生物工程编号:PRJNA600790)。本研究中分析的Small RNA-seq read数据可在NCBI SRA数据库中获得，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA601043（加入生物原理编号：Prjna601043）。

RNA-SEQ：

RNA序列

度的视角：

差异表达基因

DEmiRs:

差异表达microrna

NR:

非冗余蛋白质数据库

NT：

核苷酸序列数据库

走:

基因本体论

Kegg：

京都基因和基因组百科全书

srna:

小rna

是:

播种后几周

IAA：

Indole-3-acetic酸

ME-IAA:

甲基吲哚-3-乙酸盐

ICA:

吲哚-3-羧甲醛

tZ:

Trans-zeatin

cZ:

Cis-zeatin

是:

茉莉酸

H2JA:

Dihydrojasmonic酸

JA-ILE:

Jasmonoyl - (L)异亮氨酸

SA：

水杨酸

阿坝:

脱盐酸

存在:

定量实时PCR

我们感谢航空大学空军龙凯先生在手稿准备过程中对图像处理的帮助。

这项研究是由财政惠州久辉药业有限公司（批准号：HY0068）的支持。这些资金的身体已经在研究，收集，分析，和解释数据的设计没有任何作用，并以书面稿件。种子胶囊M. Savatieri.从惠州市九辉药业有限公司的实验基地收集

隶属关系

1. 南京农业大学中药材研究所，江苏南京210095

   Lanlan Chen，乔胜郭，Zaibiao Zhu，Hefang Wan，Yuhao Qin＆Hui Zhang

贡献

LC，ZZ和QG设计了实验;LC进行了实验并写了原始草案;ZZ和QG修改了稿件;HW和YQ贡献培养实验材料;LC和Hz分析了数据。所有作者均阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到Zaibiao朱．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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