对MADS-box转录因子基因作用的新见解GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba菊花的根源和拍摄开发（GydF4y2Ba菊花GydF4y2Ba）GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

疯狂箱转录因子（TFS）是植物中多种发育过程的关键调节因子;其中，一个菊花疯子盒tfGydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba已经被隔离并描述为响应于高硝酸盐浓度信号的根部开发中的功能。但是，CMANR1如何影响根，拍摄发展仍然不清楚。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

我们报道了CmANR1在菊花离体组织培养的整个发育阶段对根系发育都有积极的作用。代谢组学结合转录组学分析表明GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba通过促进硝酸盐同化，影响氨基酸、糖酵解和三羧酸循环(TCA)循环的代谢途径，促进根系的健壮发育。此外，我们发现TFs的表达水平与硝酸盐信号通路相关，如GydF4y2BaAGL8.GydF4y2Ba那GydF4y2BaAGL21GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaLBD29GydF4y2Ba，显着上调GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-相对于野生型(WT)控制的转基因植物;相比之下，表达水平GydF4y2BaRHD3样GydF4y2Ba那GydF4y2BaLBD37GydF4y2Ba， 和GydF4y2Bagata23.GydF4y2Ba显着下调。这些结果表明，这些硝酸盐信令相关的TFS涉及GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-调控根的发育。此外,GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba也作为一个积极的调节剂，以控制茎的生长和发育。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

这些发现揭示了MADS-box TF CmANR1通过调控一系列与TFs相关的硝酸盐信号通路，影响氨基酸和糖酵解代谢途径，以及TCA循环和硝酸盐同化，从而调控根茎发育的潜在机制。GydF4y2Ba

CmANR1对菊花根茎发育具有多效性。GydF4y2Ba

根系不仅是植物吸收水分和养分所必需的，而且是植物体内各种激素、有机酸和氨基酸的合成所必需的[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］.通常，根生长和发展以及对改变环境提示和压力条件的反应通常由一些复杂的调节网络运营，包括分子组分，例如调节肽，小RNA和转录因子（TFS）[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.TFs通过调控多个靶基因对根的可塑性和发育尤为重要，它们的突变或功能的获得可能导致对特定条件的显著表型改变[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.MADS-box转录因子是植物多种发育过程的关键调控因子[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]但他们对根源发展的贡献很少被发现。GydF4y2BaANR1.GydF4y2Ba是一种MADS-box转录因子基因，已被报道在一些植物的富硝酸盐环境下的侧根发育中发挥作用，但到目前为止，其根发育的潜在调控机制仍局限于硝酸盐信号通路中生长素相关的生物学过程[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］.此外，除了在根本发展中的作用之外，还有一些证据支持其在拍摄发展中的作用[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba］.因此，目前，连接GydF4y2BaANR1.GydF4y2Ba对根本和拍摄发展成为一个新的挑战。GydF4y2Ba

组学分析已经成为一种广泛的工具，通过在DNA/RNA、代谢物和蛋白质水平上测量与作用模式相关的生物化学物质的含量来识别相关的生物标志物[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］.高通量转录组测序通过发现不同器官、组织和品种在某些特定条件下的不同表达基因(DEGs)，已被广泛应用于高效、全面的分子机制分析[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］.代谢组学现在越来越多地用于识别潜在的生物标志物，并在环境或遗传扰动下探索生物体的网络[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］.有时，代谢组合与转录组织或蛋白质组学相结合，称为综合代谢组学，适用于了解通过“基因 - 代谢 - 表型”研究模型的基因组功能表型的代谢[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］.超高效液相色谱 - 四重飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）和HPLC-ESI已广泛用于植物代谢组研究。这些数据提供了大量代谢物的准确测量，可以促进复杂性状的研究[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

由于植物形态特征与代谢物之间的显着相关性，在本研究中，六个样本GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba- 分别用于分别用于根和芽的代谢物分析，分别用于分别的转基因和野生型（WT）（六个样品）。基于非靶向UPLC-QTOFMS和基于GC-MS的代谢物分析应用于相对于其野生型转基因菊花中的不同积累的代谢物的筛选。与先前的转录组分析的代谢物分析揭示了规则的新可能机制GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba菊花根系发育的研究。同时，代谢物分析结果的根源和枝条GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-转基因植株和WT植株均表明GydF4y2BaCmanr.GydF4y2Ba1-过度抑制背景和GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba在-硝酸盐信号依赖条件下，根系中参与各种氨基酸代谢和碳水化合物消化吸收的代谢产物显著增加。同时，与氨基酸代谢相关的代谢产物如天门冬酰胺和组氨酸下降，而与不饱和/脂肪酸生物合成相关的主要代谢产物增加。在转基因植株中，CmANR1的茎长和光合性能均优于野生型植株，表明CmANR1对菊花的根和茎的发育具有多效性。GydF4y2Ba

CmANR1在菊花离体组织培养的整个发育阶段对根系发育都有积极作用GydF4y2Ba

三个独立GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba转基因线(GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-GydF4y2BaOVX56，GydF4y2Ba−GydF4y2BaOVX67GydF4y2Ba， 和 -GydF4y2BaOVX81GydF4y2Ba）通过引入a而产生的菊花GydF4y2Ba35 s:: CmANR1-GFPGydF4y2Ba载体经菊花叶盘进入GydF4y2Ba农杆菌GV3101GydF4y2Ba，表现出表达水平的差异GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一)GydF4y2Ba。GydF4y2Ba这GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba- 与体外组织培养生长早期（10天）的早期WT植物相比，转基因植物对根部发育的更有力的生长效力（图10日龄）（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab).中不定根(AR)的个数GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-OVXs株系较WT株系显著提高23.8-69.3%(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC）。同时，与WT植物相比，在转基因植物中检测到根系长度的显着增加，如AR的长度所示（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bad）。有趣的是，光学显微镜观察表明，根毛的密度和长度GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-OVXS线条相对于WT植物也明显增加（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba例如）。这些结果表明，Cmanr1在体外组织培养的整个发育阶段积极控制根系结构。GydF4y2Ba

UHPLC-Q-TOF/MS分析过表达cmanr1和野生型菊花根系代谢产物GydF4y2Ba

组织水平的中间体及其最终生化产物与基因型密切相关，可能直接影响植物复杂的数量性状[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］.因此，鉴定转基因和WT植物之间的根系中的不同累积的代谢物可能更好地破译潜在的监管机制GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba论根系发展。因此，两者都有根系的代谢物分析GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-overexpressing（GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-OVXs)和WT菊采用超高效液相色谱-串联四极杆/飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF/MS)。将质控(QC)样品作为具有代表性的“平均”样品，包括分析过程中的所有分析物，在ESI阳性或阴性分析批次中作为真实样品处理，以监测仪器的稳定性[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］.主要组分分析（PCA），潜在结构的正交突起判别分析（OPLS-DA）和部分最小二乘辨别分析（PLS-DA）在研究中的所有样本上进行了所有样本，包括调节运行和QC样品。所有QC样本（蓝色）都在PCA分数图中紧密聚集（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.所有实验样本重复QCs的一致性和可靠的数据质量支持了本研究中代谢物谱分析方法的可靠性。GydF4y2Ba

用XCMS软件从所有样品中分别提取了阳性和阴性的保留峰3194和2927个。ESI阳性模式下的PCA评分图无显著性差异，阴性模式下的转基因和WT样本有分离的趋势(图5)。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa，b）。在OPLS-DA建模分析中，评估参数R2Y和Q2≥0.5，这表明分析方法在本研究中具有良好的稳定性和可靠性（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.随后，利用基于OPLS-DA模型的变量重要性投影(variable importance for the projection, VIP)评价各代谢物对各组样本分类判别和解释能力的表达模式，探索具有生物学意义的差异代谢物。以VIP > 1为筛选标准，初步筛选出不同积累的根样代谢物GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-OVXs和WT菊花(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.这些代谢物大致分为三类：氨基酸，碳水化合物和生物碱。关于各种氨基酸生物合成和代谢，TCA循环和戊糖代谢以及嘧啶，维生素B6代谢的代谢物被改变GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba比较-ovxs和wt植物（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.此外，基于根系中显著代谢物丰度谱的相似性程度，进行了层次聚类分析。将表达模式相似的代谢物聚在一起，表明它们参与了代谢过程中相对密切的反应步骤。例如，l -组氨酸和4-胍丁酸聚在一起，表明它们在氨基酸代谢中的作用;同样，柠檬酸、麦芽糖糖和d -甘露糖紧密聚集在一起，表明它们可能在ESI阳性模式下的糖代谢中发挥作用(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac).同时，有机酸如l -苹果酸、柠檬酸等聚类紧密，提示在ESI阴性模式下它们在有机酸代谢中的作用(图5)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad）。GydF4y2Ba

Cmanr1通过促进硝酸盐同化促进根系发展GydF4y2Ba

众所周知，硝酸盐不仅是大多数高等植物的主要氮源，而且是调节植物整体基因表达和许多生理过程的信号[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］.此外，我们已经表明，Cmanr1通过改变菊花在菊花中的毒素转运基因的杂散活化活性来促进横向和不定根浓度发育[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］.因此，根部的硝酸盐含量GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-Overexpressing菊花在WT对照中较高，增加25.5,27.6和13.6％（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。定量实时PCR（QRT-PCR）测定表明，几种硝酸盐转运蛋白基因的表达，例如GydF4y2Banrt1.2GydF4y2Ba那GydF4y2BaNPF5.2GydF4y2Ba那GydF4y2BaNPF8.3.GydF4y2Ba在转基因植物中显着增加（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）可以解释根系中硝酸盐含量的增加GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-OVXs菊花。此外，一些基因编码硝酸盐还原酶(TR16877|c0_g8，−0.772337;参与硝酸盐同化过程的TR16877|c0_g9，−3.56766)、亚硝酸盐还原酶(TR7757|c0_g2，−1.05013)和GOGAT (TR9225|c1_g1, 1.373529)的表达差异显著GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-Transcenic和WT植物（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC）。值得注意的是，根代谢物分析数据显示，相比之下，几种氨基酸不同累积GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-转基因和WT植物。氨基酸代谢中的4个重要生物标志物(l -组氨酸、l -焦谷氨酸、l -瓜氨酸和苯乙酰甘氨酸)的比值分别提高了4.10-、2.49-、2.05-和1.80倍GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-OVXs / WT。相比之下，l -谷氨酰胺和l -苯丙氨酸的变化是0.75倍和0.54倍GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-ovxs到wt（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.一旦硝酸盐被运输到细胞中，它就会经历同化，并转化为氨基酸，该氨基酸在根系中服用许多生理过程。因此，我们提出Cmanr1通过基于硝酸盐含量的增加，促进硝酸盐同化，以及转基因植物根中的氨基酸含量的变化来促进根系发展。GydF4y2Ba

Cmanr1在菊花的根部发育过程中影响糖酵解和TCA循环的代谢途径GydF4y2Ba

我们之前的转录组测序是用根进行的GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-ovxs和wt chrysanthemum，为我们提供了有关分子机制的许多信息GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba在根系发育中[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］.进一步探索更多可能的调控机制GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba在根中，我们对根进行了转录组分析GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-OVXs和WT菊花。Venn图显示了36种显着的差异转录物和代谢物参与相同的代谢途径（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。令人惊讶的是，在两个OMIC共享的Top10 Kegg途径期间，最佳代表涉及“氨基糖和核苷酸糖代谢”的转录物（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab;额外的文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.然后，我们在该术语中列出了几种代表性的糖代谢途径，发现编码在这些糖代谢途径中的关键酶的基因的表达显着改变GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba- 植物。例如，编码几丁质酶的基因（TR4985 | CO-G1），六酮酶（TR12735 | CO-G1），Frutokin酶（TR12776 | C5-G3）和UDP-葡萄糖4,6-脱水酶（TR21678 | CO-G1，TR21678| C0-G4）显示出明显的表达差异GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-Transcenic和WT植物（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC）。此外，两种主要代谢物，柠檬酸盐和苹果酸盐显着积累，并且在糖酵解和TCA循环中显着上调和下调相对基因和下调GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-OVXS与WT植物相比（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad)，表明CmANR1可能以某种方式影响转基因植物根中的糖酵解和TCA循环。随后，这些活性生化过程的变化可能为其他代谢产物的生物合成提供更多的碳骨架，为某些生理过程提供更多的能量当量，从而促进菊花根系的发育。GydF4y2Ba

硝酸盐信号转导相关的转录因子参与了cmanr1调控的根发育GydF4y2Ba

目前，我们已经阐明了两种机制，硝酸盐同化的动机和可能的糖酵解和TCA周期相关的促进效果，在规定下GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba菊花根系发育的研究。然而，调控的确切机制GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba要复杂得多。转录因子是重要的上游调控因子，在植物的多种生理过程中发挥着重要的作用。在我们之前的转录组测序数据中，共鉴定出1752个编码转录因子(TFs)的DEGs，可分为约34个主要不同的科(图1)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。Apart from a set of very small share families that we named as ‘The other kind’, the largest group of differently expressed transcription factor genes was the bHLH family (176, 10.48%), followed by the NAC (141, 8.40%), ERF (116, 6.91%), WRKY (110, 6.55%), MYB-related (99, 5.90%), MYB (83, 4.94%), and C2H2 (68, 4.05%) families. Notably, the LBD (49, 2.31%), M-type_MADS (38, 2.26%), and TCP (18, 1.07%) families have also a significant proportion (Fig.5.GydF4y2Bab）。这三个TF家族的成员被认为是与横向根部发育以及硝酸盐信号通路最相关的GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]，这与我们的研究背景非常吻合。然后，我们从上述已报道调控其他植物根或根毛发育的TF家族中选择并绘制了几个TF基因的热图[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］.例如，热图显示表达水平GydF4y2BaAGL8.GydF4y2Ba那GydF4y2BaERF3.GydF4y2Ba那GydF4y2BaAGL21GydF4y2Ba那GydF4y2BaLBD29GydF4y2Ba， 和GydF4y2Banlp6.GydF4y2Ba是否显著上调GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba- 与WT植物相比的转发植物，而表达式GydF4y2BaRHD3样GydF4y2Ba那GydF4y2BaLBD37GydF4y2Ba和GydF4y2Bagata23.GydF4y2Ba显著下调(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC）。此外，与RNA-SEQ分析有关的若干与LR或毛发根部发育有关的几种选定基因的实时PCR测定结果，确认RNA-SEQ数据的有效性（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad）。一方面，这些基因的表达变化表明它们在分子调节下可以与LR或根发发育的相关性GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba在菊花。另一方面，转基因植株和野生型植株之间大量不同表达的TF基因暗示了硝酸盐处理条件下根系发育的复杂性。GydF4y2Ba

CmANR1是调控菊花茎部生长发育的正向调控因子GydF4y2Ba

一次，更多的担忧都致力于定义义务GydF4y2BaANR1.GydF4y2Ba在根本开发中，如它对LR启动和LR长度的正规调节GydF4y2Ba拟南芥和GydF4y2Ba菊花(GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]，以及以依赖硝酸盐的方式促进水稻的LR和PR发展[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］.事实上，我们发现拍摄了GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-转基因植株在组织培养初期比野生型植株表现出更旺盛的生长(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种）。这种现象在整个文化期间都持续存在。我们测量了体外组织培养植物的芽生长。转基因植物的芽比WT植物的枝条高得多，从55.3增加到97.3％（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一种）。在转基因植物的芽上观察到更多节点（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab），这是拍摄更长的原因。此外，拍摄高度GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba- 转变植物显示比WT对照的高得多（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC）。此外，我们对这些植物的叶片的总叶绿素含量和光合特性进行了详细的研究。转基因植物中的叶绿素含量水平远高于WT植物的含量水平（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad)。通过对叶片实际光化学效率(ΦPSII)、净光合速率(Pn)和电子转移速率(ETR)的测量，发现转基因植株的参数显著高于野生型植株，表现出更好的光合性能(图5)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba例如）。更好的光合性能GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba- 转发植物对其更高且较强的射击增长提供了良好的解释。GydF4y2Ba

为了更好地解释转基因植物和野生型植物的地上部发育差异，我们接下来对两种植物的地上部进行了代谢组学分析，评估了主要代谢产物的相对含量。与根代谢组学结果相似，本研究中阳性模式和阴性模式数据的OPLS-DA评分图和排列检验均显示出良好的稳定性和可靠性(补充文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.基于HILIC UHPLC-Q-TOF质谱数据的ESI阳性和阴性模式的PCA评分图显示样品之间有分离的趋势(图1)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa, b).通过层次聚类分析，概述了所检测到的转基因与野生型芽的代谢产物的含量差异及可能的联系。热图和树状图显示，胆碱和贺福林以正模式聚集在一起，且两者含量均增加，表明可能提高了抗逆性和次生代谢产物的活性GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba转基因植物。l -谷氨酸、l -天冬酰胺和二氢尿嘧啶在负向模式中紧密聚集，这是遵循它们在氨基酸代谢中的可能作用(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bac, d)。从枝条的折尺变化判断不同积累代谢物的相对含量，情况与根系不同。与各种氨基酸代谢相关的代谢产物如l -谷氨酸、l -天冬酰胺和l -组氨酸在转基因植物的芽中减少。与野生型植株相比，转基因植株嫩枝中参与脂肪酸或不饱和脂肪酸生物合成的代谢产物含量显著增加。而核苷酸糖代谢和糖酵解的主要中间体d -甘露糖和甘油3-磷酸，在转基因植株的嫩枝中分别比野生型植株增加了2.13倍和1.51倍(表1)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.我们一起记录在此，在此记录过表达的GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba可以在菊花中挑起根本和拍摄开发的相当大的变化。GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba对菊花的生长发育具有多效性的积极作用。GydF4y2Ba

基于我们之前的报告，目前的结果提供了进一步的证据GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba对菊花根系发育有积极影响。这GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba- 与WT植物相比，转发植物具有更高的根系，例如更长的LR，AR和根毛，以及更大的根系表面和体积（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.我们对转基因和野生型菊花(10日龄离体组织培养、20日龄离体组织培养、40日龄离体组织培养)几个时期的根生长和发育参数进行了观察和测量，结果表明GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba对较高浓度(10 mM，培养条件下)的硝酸盐反应较快，其对根系发育的积极作用在生长初期表现明显，并可能持续到转基因植物后期的生长发育中。另一方面，在这项研究中，我们证实了GydF4y2Bacmanr1-GydF4y2Ba转基因植物在组织培养条件下具有更高的光合性能更加绿色，具有比WT植物更好的光合性能（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.作为GydF4y2Bacmanr1-GydF4y2Ba转基因植物中的过度表达被A触发GydF4y2Ba35年代GydF4y2Ba因此，我们研究的启动子，我们无法确定转基因植物的增长优势是由于直接调节GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba对茎中其他分子分子的影响或由于转基因植物根系对更多养分和水分吸收的间接促进作用。要确定菊花根茎相互作用的可能机制还需要更多的工作。GydF4y2Ba

之前的研究已经报道过了GydF4y2BaANR1.GydF4y2Ba是一种快速的硝酸盐响应和硝酸盐依赖性转录因子基因[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］.Cmanr1可以作为植物素转运基因的转录激活剂，从而导致菊花中硝酸盐信号通路期间根部的养蛋白积累[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］.与此同时，这是GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-过表达增加了转基因植物根系对硝酸盐的吸收和含硝酸盐量(图1)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。除了作为信号分子，硝酸盐与大多数土地植物的主要氮源具有其基本营养作用，并且将被吸收，易于旋转，同化和过渡到细胞水平的其他生理化合物（如氨基酸）中在植物中[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］.在我们的根代谢组测定中，显然，参与转基因植物中的各种氨基酸代谢的代谢产物的显着增加，例如L-组氨酸，L-焦蛋白酸，4-胍丁酸和L-苯丙氨酸（桌子GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.这些调查结果表明GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba在富硝酸盐条件下对菊花根系发育过程中硝酸盐同化有一定影响。GydF4y2Ba

众所周知，三羧酸是连接植物中几乎所有代谢途径的重要中枢通路，它负责氧化呼吸底物以驱动ATP合成[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba］.糖酵解是一种氧化过程，负责将葡萄糖转化为丙酮酸，是另一种普遍存在的细胞代谢。对己糖激酶、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸变化酶等重要激酶和变化酶的表达进行修饰，可对光合代谢产生显著影响[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］.值得注意的是，根系的转录组织分析显示与氨基糖和核苷酸糖代谢相关的次数和代谢物大多富集。清楚地说明了替代糖酵解和TCA循环的折叠变化的详细表达水平和参与TCA循环。结果表明，编码六酮酶的基因表达（TR12735 | C1-G1,1119），丙酮酸激酶（TR99 | CO-G3，-1.075）和磷酸性蛋白样（TR15403 | CO-G1,1.585）显着改变在转基因植物中（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba此外，某些呼吸底物如柠檬酸、l -苹果酸、麦芽糖和d -甘露糖含量的显著变化表明转基因植物根系的能量可能增强，这可能是转基因植物根系发育良好的另一种解释。总之，这一证据暗示了糖代谢和根系发育之间的联系是由GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

此外，在转基因植物中存在一些其他有趣的代谢物。首先，胆碱是转基因植物的根源和芽中最丰富的代谢物之一。作为乙酰胆碱（ACH）的主要来源的胆碱也与甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢有关，并在叶绿体中合成甘氨酸甜菜碱（Glybet）[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba］.ACH和Glybet对植物中的各种重要的生理过程和对非生物胁迫的耐受性是必不可少的[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]。胆碱含量的增加给出了关于转基因植物可能的氨基酸转变增强和应力抗性改善的信息，这为未来的探索提供了新的想法。其次，作为重要的黄酮类化合物之一，rhoifolin具有各种显着的生物活性，包括抗过敏，抗炎，抗氧化剂，抗微生物和抗癌效果[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba］.在我们的芽代谢组测定中，rhoifolin的含量显示出转基因植物的显着增加，表明可能的抗胁迫和次级代谢物活性的改善GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba转基因植物。此外，一些与不饱和脂肪酸和脂肪酸的生物合成密切相关的代谢物，例如α-亚麻酸，（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）-4,7,10,13,16，在转基因植物的芽中发现了19-二十二碳甲酸和CIS-9-棕榈酸酸，表明转基因植物中的寒冷和抗病性抗性的提高。GydF4y2Ba

最后，我们提出了一个工作模型GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba在植物开发上（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.根:GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba感测传感器NRT1.1通过的较高的硝酸盐信号，该信号位于根部的血浆膜上。然后，CMANR1与另一CMANR1形成同型二聚体，与AGL21的异二聚体，反式激活下游靶基因，例如相关基因[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]、糖代谢基因和硝酸盐响应基因，导致植物相关生理过程的改变。生长素的最终增加[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]，与糖酵解有关的AAS，代谢物和根中的TCA循环（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)促进菊花根系发育。此外，TF表达分析表明，在此背景下，一些TF，如NLPs、lbd和其他MADS-box TF更可能与CmANR1共同作用于根系发育(图1)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.因此，可以得出结论GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba通过将硝酸盐信号通路与生长素传输，硝酸盐同化以及糖溶解和TCA循环组合，通过组合硝酸法信号通路促进菊花中的根系开发。GydF4y2Ba

在芽中，转基因植物中芽高，叶绿素含量和三个光合作用参数（PN，ETR和φPSII）的显着增加表明转基因植物枝条中的更强壮的生长和更好的光合作用性能（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.但是，无论GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba直接发挥了一些关于拍摄发展的影响尚不确定。最低，过度表达GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba可以触发拍摄发展。连胜，过度表达GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba可以促进菊花的根源和拍摄开发。GydF4y2Ba

在本研究中，我们报道了CmANR1在菊花离体组织培养的整个发育阶段对根系发育的积极作用。代谢组学结合转录组学分析表明，CmANR1通过促进硝酸盐同化，影响氨基酸、糖酵解和三羧酸循环(TCA)循环的代谢途径，从而促进根系发育。此外，我们发现TFs的表达水平与硝酸盐信号通路相关，如GydF4y2BaAGL8.GydF4y2Ba那GydF4y2BaAGL21GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaLBD29GydF4y2Ba，显着上调GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-相对于野生型(WT)控制的转基因植物;相比之下，表达水平GydF4y2BaRHD3样GydF4y2Ba那GydF4y2BaLBD37GydF4y2Ba， 和GydF4y2Bagata23.GydF4y2Ba显着下调。这些结果表明，这些硝酸盐信号相关的TFS参与了Cmanr1调制的根部开发控制。此外，Cmanr1还可作为控制射击生长和发育的正调节因子。这些发现揭示了MADS-box TF CmANR1通过调控一系列与TFs相关的硝酸盐信号通路，影响氨基酸和糖酵解代谢途径，以及TCA循环和硝酸盐同化，从而调控根茎发育的潜在机制。GydF4y2Ba

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

野生型（WT）组织培养的菊花由Junping Gao教授（中国农业大学）友好提供。崔辉博士承担了正式的识别GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-转基因菊花。三个独立GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba转基因线(GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-GydF4y2BaOVX56，GydF4y2Ba−GydF4y2BaOVX67GydF4y2Ba， 和 -GydF4y2BaOVX81GydF4y2Ba）通过引入a而产生的菊花GydF4y2Ba35 s:: CmANR1-GFPGydF4y2Ba载体经菊花叶盘进入GydF4y2Ba农杆菌GV3101GydF4y2Ba[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］.GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba- 在山东农业大学标准化文化室的Murashige和Skoog（MS）中，在体外培养 - 转体生物和Wt菊花。这些材料已在山东省农业大学植物征中存放和公开。存款号是SDAU510008。GydF4y2Ba

菊花根系的形态学特征GydF4y2Ba

施用大约10天的体外组织培养的菊花植物，用于根形态特征。根毛的表型图片GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba在光学显微镜（奥林巴斯CX31，日本）下拍摄-ovxs和wt菊花。使用图像J软件（NIH，Bethesda，MD，USA）测量植物材料的不定根（AR）数量和根毛密度。AR和Root头发的长度由R项目计划（GNU，新西兰）计算。GydF4y2Ba

RNA-SEQ分析GydF4y2Ba

由Illumina HiSeq2000进行的10日龄转基因和野生菊花根的高质量RNA提取(每个样本3个生物学重复)、文库导入和RNA测序由orii -gene生物技术公司(orii -gene Inc.，北京，中国)专业进行。RNA-Seq数据处理、从头组装和注释如前所述[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］.本研究中引用的这些RNA-SEQ测序数据沉积在NCBI SRA数据库中（对这些SRA数据的加入Cite：Prjna692061;网站链接：GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA692061GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

UHPLC / Q-TOF设置GydF4y2Ba

cmanr1.GydF4y2Ba-转基因和野生型菊花(每个样本有6个生物学重复)用于根和芽的代谢产物分析。对于代谢组学和质谱(MS)，以及代谢组学数据的处理和分析如前所述[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

实时定量PCR (RT-qPCR)GydF4y2Ba

从根系中提取总RNAGydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba- 使用Trizol试剂（Vazyme，南京，中国）的转发和Wt菊花，然后使用Primescript First-strand cDNA合成试剂盒（Takara，Dian，China）。QPCR测定反应程序和计算方法称为HU等[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba］.用于QPCR测定的引物在附加文件中列出GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

总叶绿素分析GydF4y2Ba

将菊花鲜叶(~ 0.2 g)切成小片，用少量石英砂和2 ~ 3ml 96%乙醇(v/v)磨成白色。用25 mL 96%乙醇对含叶绿素的液体进行过滤提取。用紫外分光光度计(U-5100，日立，日本)在AGydF4y2Ba_649GydF4y2Ba,一个GydF4y2Ba_{665.GydF4y2Ba}和一个GydF4y2Ba_470GydF4y2Ba。根据下式计算叶绿素含量：CHLA = 13.95AGydF4y2Ba_{665.GydF4y2Ba}-6.88GydF4y2Ba_645GydF4y2Ba;chlb = 24.96a.GydF4y2Ba_649GydF4y2Ba-7.32GydF4y2Ba_{665.GydF4y2Ba}。详细的操作程序称为Hu等[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

叶绿素荧光参数GydF4y2Ba

使用FMS-II加调制荧光计(Hansatech，英国)在上午10点至下午1点的同一叶片上测量叶绿素荧光。最小的荧光(FGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba)，最大荧光(FGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba），psii（被确定为fGydF4y2Ba_V.GydF4y2Ba/ FGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba），光适应的最大荧光（fGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba'）和稳态荧光收率（fGydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba)的测量和计算参照“以前的研究[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba那GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］.PSII (ΦPSII)的量子效率被确定为(Fm ' - Fs)/Fm ' [GydF4y2Ba52GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

除非特别标记，否则所有样品均至少一式三份分析并表示为平均值±标准偏差。使用学生进行重要性分析GydF4y2BaT.GydF4y2Ba测试。GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-值≤0.01认为显著，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 值≤0.001代表非常重要的差异和N.S.表明没有显着差异。GydF4y2Ba

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。这GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba序列已上载于菊花基因组数据库(GydF4y2Bahttp://www.amwayabrc.com/GydF4y2Ba）.GydF4y2Bacmanr1.GydF4y2Ba-转基因和野生型菊花(编号:SDAU510008)在山东农业大学植物标本室保存并公开获取。本研究中引用的RNA-Seq测序数据保存在NCBI SRA数据库中(这些SRA数据引用Accession: PRJNA692061;网站链接:GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA692061GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

WT:GydF4y2Ba

野生型GydF4y2Ba

ar：GydF4y2Ba

不定根GydF4y2Ba

FGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

荧光最小GydF4y2Ba

FGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

最大荧光GydF4y2Ba

FGydF4y2Ba_V.GydF4y2Ba/ FGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

Psii.GydF4y2Ba

FGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba'：GydF4y2Ba

Light-adapted最大荧光GydF4y2Ba

FGydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

稳态荧光收率GydF4y2Ba

感谢山东农业大学包志龙教授对论文写作提出的建设性建议，并感谢TopEdit (GydF4y2Bawww.topeditsci.com.GydF4y2Ba）在编写本手稿期间的语言援助。GydF4y2Ba

这项工作得到了“国家重点研究和发展计划”（2018YFD1000405），“山东省自然科学基金会”（ZR2019QC006），“中国国家自然科学基金”（31902049,31972375）。在2018YFD1000405上资助了这项工作实验平台和购买实验仪器的建设。材料结构，代谢组种数据和数据分析是ZR2019QC006,31902049和31972375的财务支持。GydF4y2Ba

作者指出GydF4y2Ba

1. 程 - 郑铮，大刚胡和方芳马同等地贡献了这项工作。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 山东农业大学园艺科学与工程学院园艺作物生物学和种质创新作物生物学国家重点实验室，山东271018，山东271018GydF4y2Ba

   崔辉孙，嘉辉王，k迪顾，彭张，欣义张，程舒郑，大刚胡＆方芳马GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

DGH和CHS构思和设计了实验。CHS，JHW，KDG，PZ，XYZ和CSZ进行了实验。CHS，DGH和FM写了这篇文章。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaCheng-Shu郑GydF4y2Ba或GydF4y2Ba大刚胡GydF4y2Ba或GydF4y2Ba方芳马GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

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