栽培异源四倍体棉花的进化、表达及功能分析gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

Dirigent (DIR)蛋白介导木酚素生物合成过程中的区域选择性和立体选择性，也参与木质素、棉酚和紫檀的生物合成。该基因家族在棉花抗逆性和次生细胞壁发育中发挥着重要作用，但目前对该基因家族还缺乏系统的认识。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，107gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba和107gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba被确定在gydF4y2BaGossypium Barbadense.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba陆地棉gydF4y2Ba,分别。这些基因大多具有经典的无内含子的基因结构，并编码含有信号肽的蛋白质。系统发育分析表明，棉花gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因被划分为4个不同的亚家族(a、b/d、e和f)，其中，DIR-a和DIR-e具有进化上的保守性，片段重复和串联重复同样有助于它们的形成。相反，DIR-b/d主要通过近期的串联复制，伴随着一些基因簇而扩大。随着迅速发展，DIR-b/d-III成为一种gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba特异性进化枝参与棉酚的atropselective synthesis。RNA-seq数据突出显示gydF4y2BaGhDIRgydF4y2BaS响应gydF4y2Baverticillium dahliae.gydF4y2Ba感染，并暗示gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族可以赋予患者的抗原性。我们还确定了候选人gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba与纤维发育相关的基因gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba并揭示了他们的差异表达。进一步确定参与gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba在纤维发育中，我们过度表达了一个纤维长度相关基因gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba并验证了其在毛状体和下胚轴中的功能。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些发现为人类进化提供了新的见解gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba为进一步了解其作用提供了有价值的信息gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba棉纤维发展中的基因以及应力反应。gydF4y2Ba

属gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba含有至少46个二倍体和五种良好的同种异体一体化。两个同种异体一种单一物种，gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba，它起源于a -基因组(类似于gydF4y2Bag . arboreumgydF4y2Ba或gydF4y2Bag . herbaceumgydF4y2Ba)和d -基因组(类似gydF4y2Bag . raimondii就gydF4y2Ba)大约1-2百万年前的祖先（MYA）[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba占全球棉花产量的90%以上，因为它的高产，然而gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba其特征在于其优异的纤维性能。棉花在其生长过程中面临生物和非生物胁迫;此外，改善的纤维质量是迫切需要解决合成纤维行业的挑战。最经济和有效的策略是发展转基因的品种，不仅提高了对环境压力的抵抗，而且改善了纤维质量。因此，对候选基因进行候选基因并解释其机制是重要的。gydF4y2Ba

Dirigent(来自拉丁语gydF4y2Ba迪里格尔gydF4y2Ba(引导或对齐)蛋白质首次从gydF4y2Ba连翘媒介gydF4y2Ba和介导的两种Coniferyl醇衍生的自由基的介导的区域和立体选择性偶联（+） - Pinoreinol生物合成[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]. 在此之后，人们从一些种子植物中克隆出了形成松脂醇的DIR蛋白，例如gydF4y2Bathuja plicata.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba五味子属对gydF4y2Ba［gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba亚麻gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba] 和gydF4y2Ba甘氨酸最大gydF4y2Ba［gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．此外，(−)-松脂醇形成的DIR蛋白gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba5gydF4y2Ba] 和gydF4y2Ba亚麻gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]也被隔离并表征。木质素还衍生来自单甘醇聚合，但光学不活性。虽然分子机制仍然模糊不清，但是毒素蛋白已参与木质素生物合成[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]. 除了单信号素代谢外，还发现了一些棉花DIR蛋白通过半棉酚自由基的阿托普选择性偶联介导（+）-棉酚的形成[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．DIR蛋白通常缺乏催化活性中心，但豆科植物中具有异黄烷醇脱水酶活性的一些成员可以产生紫丁香[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

DIR蛋白具有多种生化功能，在植物逆境响应中发挥着重要作用，特别是在植物对病原菌的防御中。的表达gydF4y2BaPsDRR206gydF4y2Ba在豌豆荚组织中诱导gydF4y2Ba腐皮镰孢霉菌gydF4y2Ba其代谢产物具有植保素的功能[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．过度的gydF4y2BaGMDIR22gydF4y2Ba在大豆中可增加总木脂素积累，增强植物对木脂素的抗性gydF4y2BaPhytophthora sojae.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．辣椒植物与沉默gydF4y2BaCaDIR7gydF4y2Ba更容易受到gydF4y2BaPhytophthora CapsicigydF4y2BaNaCl和甘露醇胁迫[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．棉花植株具有过表达性gydF4y2BaGhDIR1gydF4y2Ba木质素含量增加，抗性增强gydF4y2Baverticillium dahliae.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．除防御反应外，DIR蛋白还具有其他生理功能，如Casparian条带形成[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和豆荚开裂[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

RALPH和同事对种子植物划分进行了150个DIR蛋白的系统发育分析，并表明存在六个不同的DIR亚壳，DIR-A和五种DIR样亚属（B / D，C，E，F和G）[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在那之后,gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族在几种维管植物中得到了系统的研究，一些胁迫诱导基因[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20gydF4y2Ba或scw相关基因[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba被确定。了解gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因将是一种可行的方法来提高棉花的应力性和改善纤维性能，但直到现在棉花上没有全面的理解。只有几个gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba响应gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba文献中的基因和纤维发展有关gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因仍有待鉴定。最近，一系列gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba全基因组序列的公布，使棉花基因家族的全基因组分析成为可能。在本研究中，我们首先确定了gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族成员在培养的同种异体棉花，gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba分析了它们的演化过程。他们的表达模式gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba系统地研究了棉纤维发育过程中的侵染情况。此外，对gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba揭示了它在细胞伸长中的作用。我们的调查结果将进一步了解这一难以捉摸的基因家族并提供候选人gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba防御反应和纤维发展的基因。gydF4y2Ba

鉴定、鉴定和系统发育分析gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

我们确定了107.gydF4y2BaGbDIRgydF4y2Ba基因(gydF4y2BaGbDIR1gydF4y2Ba-gydF4y2BaGBDIR107gydF4y2Ba)gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和107gydF4y2BaGhDIRgydF4y2Ba基因(gydF4y2BaGhDIR1gydF4y2Ba-gydF4y2BaGHDIR107.gydF4y2Ba)gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S1及S2)。为了解其进化关系，利用107条编码序列构建了相邻连接(NJ)系统发育树gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba, 107年gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba, 25gydF4y2BaAtDIRsgydF4y2Ba（gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba），44gydF4y2BaLudirs.gydF4y2Ba（gydF4y2Ba亚麻gydF4y2Ba), 49gydF4y2BaOsDIRsgydF4y2Ba（gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba）和35.gydF4y2BaPDIRsgydF4y2Ba（gydF4y2Ba云杉gydF4y2BaSPP。）（附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S3)。如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因明显分为6个亚家族，分别为DIR-a、DIR-b/d、DIR-c、DIR-e、DIR-f和DIR-g。其拓扑结构与以前的报告基本一致[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．在这些亚属中，Dir-A由8组成gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba7gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba， 5gydF4y2BaAtDIRsgydF4y2Ba6gydF4y2BaLudirs.gydF4y2Ba7gydF4y2BaOsDIRsgydF4y2Ba12.gydF4y2BaPDIRsgydF4y2Ba，表明这是一个高度保守的古老支系。日总生产量最大的组有81个gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba, 82年gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba, 14gydF4y2BaAtDIRsgydF4y2Ba,28岁gydF4y2BaLudirs.gydF4y2Ba, 10gydF4y2BaOsDIRsgydF4y2Ba12.gydF4y2BaPDIRsgydF4y2Ba，表明DIR-b/d在异源四倍体棉花中显著扩增。相比之下，DIR-f只包括5个gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba4gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba3gydF4y2BaLudirs.gydF4y2Ba11.gydF4y2BaPDIRsgydF4y2Ba，可能是由于基因缺失gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba．DIR-e包含13gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba, 14gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba6gydF4y2BaAtDIRsgydF4y2Ba6gydF4y2BaLudirs.gydF4y2Ba3gydF4y2BaOsDIRsgydF4y2Ba但是没有gydF4y2BaPDIRsgydF4y2Ba，表明可能存在被子植物特有的支系。DIR-c和DIR-g可能是单子叶植物所特有的，因为它们只含有gydF4y2BaOsDIRsgydF4y2Ba．为了验证系统发育关系，我们使用DIR蛋白序列重建了两个系统发育树gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1）。其进化关系与Fig。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．此外，这些DIR蛋白序列被提交给MEME，以发现保守的基序。如附加文件所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1，相邻的分支有相似的图案。gydF4y2Ba

大多数棉花gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因(特别是DIR-a, DIR-e和DIR-f中的成员)拥有一个没有内含子的经典基因结构(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1）。值得注意的是，Dir-B / D湿度显示可变基因结构，表明较低的选择约束。大约77％的gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba和82%的gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba编码蛋白质包含一个信号肽(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S1及S2)。正如预期的那样，亚细胞定位预测显示它们主要位于细胞外空间。尽管有一个信号肽，一些DIR蛋白属于DIR-b/d被定向到液泡。此外，还观察到DIR蛋白位于细胞核或过氧化物酶体中;意外的定位可能意味着新的功能。我们还扫描了棉花DIR蛋白序列的n -糖基化位点，以探索其溶解性和稳定性。有趣的是，DIR-e基因的n -糖基化位点要少得多gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），显示棉花的进化和分歧gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族。gydF4y2Ba

染色体分布、复制和进化gydF4y2Ba

确定棉花的染色体分布gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba根据它们的注释信息，我们标记了它们在染色体上的物理位置(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。所有107gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba定位于26条染色体中的24条(除At06和Dt06外)。这些染色体上的基因数量从1到15不等。具体地说,gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba属于Dir-B / D富含染色体AT01，AT04，AT11，DT01，DT04和DT11，而DIR-E基因主要位于AT10和DT10上。经常观察基因簇，表明许多串联复制事件。因为差异短的发散时间，gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba在染色体分布非常相似。gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba除Dt02、At06和Dt06染色体外，基因数在1 ~ 13之间。六个基因(gydF4y2BaGbDIR29标准gydF4y2Ba和gydF4y2BaGBDIR103.gydF4y2Ba-gydF4y2BaGBDIR107gydF4y2Ba)没有映射，因为位置信息不完整。gydF4y2Ba

分析棉花的膨胀gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族，我们确定了分段和串联重复gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba．分段重复的人数gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因和连续复制gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因分别为13和31个gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba18和41 ingydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa和b;附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S4及S5)。显然，串联重复作为主要动力推动棉花的膨胀gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba与上述基因簇相对应的基因家族。Ks(同义位点置换)值可用于估计基因重复发生的时间，进而识别全基因组重复事件。Ks范围为0.4-0.6(对应于gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba在16.6米mya约为16.6 mya）和1.5-1.9（对应于由eudicots共享的Paleo-hexaproidization事件约为130.8 mya）gydF4y2Bag . raimondii就gydF4y2Ba［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．此外，Ks峰值0.03解释了a -基因组与d -基因组祖细胞之间的差异[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．在这里，我们还计算了基因重复的KS值来分析其发生时间;选择LPB方法，因为其结果恰好符合预期（附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S4及S5)。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，ks值gydF4y2Ba国标14gydF4y2Ba/gydF4y2BaGbDIR41gydF4y2Ba，gydF4y2BaGBDIR79.gydF4y2Ba/gydF4y2BaGBDIR99gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR13gydF4y2Ba/gydF4y2BaGhDIR41gydF4y2Ba分别为0.60、0.41和0.58，说明这三个片段重复可能来自gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba-特异性多倍体化。其他的节段重复被推断来自古六倍化事件，因为它们的Ks值在或接近1.5–1.9。有趣的是，分段复制gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因主要从祖先WGD事件而不是近期保留，这表明一些进化的保守基因。串联重复的KS值范围为0.02至2.92gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba从0。03到2。68英寸gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba．串联重复的Ks值大多小于0.5，表明棉花近期扩张gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族。缺乏的KS值为0.5-1.0可能意味着由于多倍体化后染色体重新包装方法引起的基因损失和/或易位。此外，观察到具有KS> 1.0的一些串联重复，表明这些基因非常稳定。gydF4y2Ba

进一步揭示棉花的进化史gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族，我们将复制事件与包含107的系统发育树融为一体gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba, 107年gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba和23次报道gydF4y2BaDIRsgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC;附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S6)。轨道i标记片段重复，轨道ii、iii、iv和v(人工创建的Ks范围分别为0.0-0.2、0.2-0.6、0.6-1.9和1.9-3.0)标记串联重复。0.6和1.9分别是上述0.4-0.6和1.5-1.9的值，Ks值在0.1左右的一个簇设置了Ks范围为0.0-0.2(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S4及S5)。主要参与木脂素生物合成的DIR-a支链在木质素合成之前已经基本建立gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba-specific WGD事件(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).同样，由于缺乏最近的重复，DIR-e也是一个相对古老的分支。显然，由于最近的串联重复，DIR-b/d经历了快速扩张;我们相信DIR-b/d-I，−II和-III在进化中依次产生。其中，DIR-b/d-I包括串联复制和片段复制，形成一个过渡分支。DIR-b/d-II和右半部分的DIR-b/d-III缺乏复制事件的痕迹，可能经历了大规模的基因丢失和/或易位。DIR-b/d-III的左半部分参与棉酚的atrop选择性合成，是最近由于串联复制而出现的。此外，DIR-f在棉花进化中明显不活跃(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Ka / Ks比是蛋白质选择性压力的量度，Ka / ks> 1，= 1和<1表示阳性选择（或分子适应），中性演化和纯化选择（或选择性约束）。在这里，我们计算了所有重复的KA / KS比率gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因对(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S4及S5)。有趣的是，这三个基因对产生gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba-特定WGD（即。gydF4y2Ba国标14gydF4y2Ba/gydF4y2BaGbDIR41gydF4y2Ba，gydF4y2BaGBDIR79.gydF4y2Ba/gydF4y2BaGBDIR99gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR13gydF4y2Ba/gydF4y2BaGhDIR41gydF4y2Ba）显示Ka / Ks比率> 1，暗示阳性选择可能导致它们从基因损失和/或易位的存活。其他分段重复的Ka / Ks比率gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因对数相当低(0.14 ~ 0.35 ingydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和0.14-0.34 in.gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba)，建议由于净化选择而保留函数(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：图S3a和S3b）。此外，属于DIR-a和DIR-e的重复基因对也显示出非常小的Ka/Ks值（0.11-0.38）gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba-0.39和0.13gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba)，进一步证明了这两个支的保存。相反，DIR-b/d-III分支中的基因对具有较大的Ka/Ks值(0.51-1.74gydF4y2Ba在g .取得gydF4y2Ba和0.53–1.04gydF4y2Ba在g分子gydF4y2Ba)，表示较弱的选择约束(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3c和S3d)。适中的选择压力可能导致DIR-b/d-III的快速扩增。gydF4y2Ba

棉花的进化史gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族gydF4y2Ba

进一步验证棉花的演变gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族，我们构建了一个由488组成的系统发育树gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba八种双子叶植物的基因共享一个共同的古六倍体祖先（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个;附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：表S7）。在古六倍化事件之后，gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和gydF4y2Ba甘氨酸最大gydF4y2Ba在两轮WGD事件中分别经历了两轮WGD事件，而没有签署WGDgydF4y2Ba葡萄gydF4y2Ba和gydF4y2BaTheobroma可可gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．此外,gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba属经历了谱系特异性的WGD、分化和杂交。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba首先，我们确定了33,54,25,32,63,67,107和107gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因在gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Ba，gydF4y2Ba甘氨酸最大gydF4y2Ba，gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，gydF4y2BaTheobroma可可gydF4y2Ba，gydF4y2Bag . arboreumgydF4y2Ba，gydF4y2Bag . raimondii就gydF4y2Ba，gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba,分别。我们分配了这些gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba不同的枝条基因（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).虽然经历了不同轮的WGDs，但这些物种的DIR-a基因数量相当一致;gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba作为四倍体物种，它们的DIR-a基因是其他物种的两倍。类似地，除大豆外，DIR-e在不同物种间都是稳定的。因此，DIR-a和DIR-e可能是在Rosids发散之前建立的，与重复事件推断的结果相对应。在上述分析中，我们发现DIR-f在gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba．正如所料,gydF4y2Bag . arboreumgydF4y2Ba，gydF4y2Bag . raimondii就gydF4y2Ba，gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和gydF4y2BaTheobroma可可gydF4y2Ba它拥有较少的DIR-f基因。特别是,gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在进化过程中失去了dirf分支。DIR-b/d-I在葡萄和大豆中均存在，DIR-b/d-II在棉花中缺失，而DIR-b/d-III在棉花中具有亲缘特异性。显然，DIR-b/d-I，−II和-III确实在演变中依次出现。研究表明，DIR-b/d-III具有两个明显的演化支，且左演化支比右演化支出现得晚。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac、 DIR-b/d-III左分支的大部分基因位于共线区，说明DIR-b/d-III是在棉花品种分化之前建立的。在At04和At05之间还观察到了染色体互换现象，这一现象最近得到了证实[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

表达模式和转录调控gydF4y2Ba

研究表明，Dir蛋白涉及Lignan，木质素和Gossypol生物合成，这些都是针对病原体的植物防御反应的一部分。调查棉花的作用gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba抗病基因的表达模式gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba被分析了回应gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba和水(对照组)使用抗黄萎病品种。结果，约有四分之一gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba在检查组高表达(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．而“棉酚支系”(DIR-b/d-III的左半部分)则有近一半的成员表现出相当高的表达水平，表明其在植物预形成防御中的重要性。一旦秧苗被接种gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba，大多数高度表达gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba大幅下调。看来,gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba能弱化功能吗gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因扰乱他们的表达，以殖民化棉花宿主。这些下调基因应该是了解植物病原体相互作用的重要资源。为了验证有趣的表达模式，我们还分析了gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba- 水响应的表达gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba其他6个品种12 hpi，原木gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba（折叠更改）值在Heatmap中呈现（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S4)。接种后gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba其中，S1和S2的下调量最大gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因，对应于其最低的叶酸抗性。与S1和S2相比，品种T3和T4在DIR-A和DIR-E的曲线中显示出更高调节的基因，因此显示出更高的蠕虫枯萎耐受性。与T3，T4，S1和S2不同，品种T1和T2显示相当多的上调gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba接种后的基因gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba．尽管在不同品种中有不同的模式，gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因可能对棉花黄萎病抗性有贡献。gydF4y2Ba

考虑到木质素/木质素类酚醛物质会影响棉纤维品质，我们分析了木质素/木质素类酚醛物质的表达模式gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba棉纤维发育过程中的基因（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．如图所示，表达配置文件gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba(Pima90-53和Hai7124)gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba(HY405和ND13)，在DIR-e、DIR-f和DIR-b/d-III分支中表现出低表达水平。一些属于DIR-b/d-II的基因(gydF4y2BaGbDIR25gydF4y2Ba，gydF4y2BaGbDIR71gydF4y2Ba和gydF4y2BaGBDIR107gydF4y2Ba在gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba；gydF4y2BaGhDIR27型gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR28型gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR75gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR76gydF4y2Ba在gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba)在20dpa、25dpa和30dpa的棉纤维中优先表达，表明其在二次壁发育中具有潜在的功能。gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR35型gydF4y2Ba它们是DIR-b/d-I的一部分，在5、10和15 DPA的纤维中有较高的转录水平，表明它们在棉纤维伸长过程中的重要性。此外,gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR35型gydF4y2Ba高度同源但差异化表达。两个目录基因gydF4y2BaGhDIR12gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR36型gydF4y2Ba在次生壁增厚过程中表达量高，而其同源基因gydF4y2Ba国标13gydF4y2Ba和gydF4y2BaGbDIR35gydF4y2Ba表现出相当低的表达水平。差异表达可能导致这两个物种之间的不同纤维质量。gydF4y2Ba

转录因子结合位点(Transcription factor binding sites, TFBS)为转录调控提供线索。共选择了266个JASPAR基质，并对其启动子区域进行了潜在的TFBS鉴定gydF4y2BaGbDIRsgydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIRsgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：表S8）。尽管有偏见的Jaspar数据库和严格的阈值，但TFB被广泛检测到，包括激素激活的信号通路（ABA，IAA，Eth，Ga，Ja和Sa），反应非生物胁迫（干旱，盐和温度），对生物的反应胁迫和植物细胞壁发育（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba；附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：图S5;附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S9和S10)。在DIR-a, DIR-e和DIR-f演化支中，gydF4y2BaGhDIR33型gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR36型gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR78gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR80gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR86gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR92gydF4y2Ba无与ABA信号转导相关的TFBS，且在棉花幼苗根系中很少或没有表达(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）;其他人倾向于高度表达，表明ABA信号传导在根特异性基因表达中可能的调节作用。四个dir-b / d-II基因gydF4y2BaGhDIR27型gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR28型gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR75gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR76gydF4y2Ba在棉纤维中高度表达。尽管与这四种基因具有极其密切的系统发育关系，但gydF4y2BaGhDIR6gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR64gydF4y2Ba表达量非常低(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab）。一个原因可能是其启动子区域缺乏TFB（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．同样的,gydF4y2BaGbDIR6标准gydF4y2Ba和gydF4y2BaGbDIR60gydF4y2Ba不同于gydF4y2BaGbDIR25gydF4y2Ba，gydF4y2BaGbDIR71gydF4y2Ba和gydF4y2BaGBDIR107gydF4y2Ba在TFBS出现和转录水平中（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个;附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5)。另外一个例子,gydF4y2BaGhDIR36型gydF4y2Ba携带更多的iaa响应TFBSgydF4y2BaGbDIR35gydF4y2Ba，对应于它们在棉纤维中的差异表达(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba；附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S6a)。考虑到gydF4y2Ba国标13gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR12gydF4y2Ba棉纤维的转录水平不同但拥有类似的TFBs（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba；附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S6b)，他们的gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba对-作用TFs进行了分析。结果表明，一些与IAA信号、ETH信号或植物细胞壁发育相关的转录因子在中表达量较高gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba比在gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

功能描述gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

RNA-seq数据显示gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba在棉纤维伸长过程中优先表达gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR35型gydF4y2Ba不同的转录水平，意味着参与gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba在细胞伸长。为进一步识别其功能，将ORF的gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba由35S启动子驱动转化成gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba植物。两个转基因T.gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba细胞株OE2和OE3均得到稳定表达gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2BaReal-time PCR和Western blot结果证实(图8)。gydF4y2Ba7gydF4y2BaA和B）。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba叶子毛状体可以作为解剖棉花纤维发展的有用实验系统，因为它们部分分享了监管机制[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．在这里，测量来自OE2，OE3和WT植物的第五莲甜叶的毛状体，然后我们发现转基因植物拥有明显更长的毛状体（图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaC和D）。此外，利用深色生长的缺口来确定角色gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba因为它们的生长是由细胞的伸长而不是分裂产生的[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．结果表明，与WT相比，OE2和OE3幼苗的下胚轴明显更长(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bae和f）。如所预期的，在显微镜检查中的转基因植物的幼杆中观察到较长的表皮细胞（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bag).这些结果表明gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba可以促进细胞伸长率，可能导致棉纤维发育。gydF4y2Ba

b/d型组在棉花中有较大的扩张和迅速演化gydF4y2Ba

基因重复事件(串联、片段/全基因组或转座)为进化提供了原始材料，同时建立了各种类型的基因家族。其中，串联重复和片段重复(分别来自不均等交叉和罕见多倍体)在植物基因家族的进化中得到了充分的考虑[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．在本研究中，Dir-B / D的扩展主要是由于串联重复（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．结果，产生了许多基因簇，并且染色体AT01，AT04，AT11，DT01，DT04和DT11仅包含DIR-B / D基因（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。有趣的是，在染色体At01和Dt01上发现了包括DIR-b/d-II和DIR-b/d-III在内的异质基因簇，这为DIR-b/d-III的初始生成提供了线索。DIR-b/d基因占75.7%gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba76.6％gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba，云杉、大米、辣椒和亚麻的产量分别为34.3、20.4、50.0和56.8% [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在棉花中，DIR-b/d基因所占比例远远大于在棉花中gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Ba，gydF4y2Ba甘氨酸最大gydF4y2Ba，gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和gydF4y2BaTheobroma可可gydF4y2Ba．所有这些结果表明gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba-特定的DIR-b/d扩展。鉴于植物基因组中罕见的片段复制事件，串联复制被认为是应对快速变化环境的适当机制[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．因此，DIR-b/d的快速扩增可能是植物对生物和非生物胁迫的适应性进化。例如，位于染色体At04上的一簇高密度基因参与了棉酚的生物合成(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S2）可能有助于植物防御病原体和害虫的防御反应。此外，串联复制作用于各种贡献;tandemly重复gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因丰富了gydF4y2BaMedicago truncatulagydF4y2Ba和gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba但稀缺gydF4y2BaCapsicum Annuum.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20gydF4y2Ba］．为了探讨为什么串联重复促进Dir-B / D的快速扩张，我们比较了在串联重复基因上的选择强度（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3c和S3d)。与DIR-a和DIR-e基因相比，在DIR-b/d特别是DIR-b/d- iii中串联重复的基因表现出更大的Ka/Ks值，意味着更弱的纯化选择和进化速率。换句话说，宽松的选择限制可能加速了与“棉酚支系”发生相对应的新功能化。这可能是棉花DIR-b/d亚家族快速扩增的原因之一。考虑到计算出的Ka/Ks值在位点和时间上的平均值，阳性选择可能在单个位点或短期内起作用，有利于基因重复的保留。简而言之，可能是为了应对环境挑战，DIR-b/d分支在异源四倍体棉花中迅速扩展和进化。衔接着排列gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因也应该是育种计划中的候选抗性资源。gydF4y2Ba

DIRs对棉纤维的发育有很大的影响gydF4y2Ba

沉积在血管植物的二次细胞壁中的木质素，有助于水运输，机械支撑和植物应激反应。此外，由于可伸缩性降低，细胞壁中木质素的沉积可以抑制细胞生长。在棉纤维中，木质素被忽略了低浓度。但是，近年来，研究表明木质素样酚类可能会影响棉纤维质量[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]. 考虑到gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba分析了木质素生物合成相关基因在棉纤维发育过程中的表达模式。观察到一个DIR-b/d-II“SCW分支”gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba组成的gydF4y2BaGhDIR27型gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR28型gydF4y2Ba，gydF4y2BaGhDIR75gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR76gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab）。在二级壁增厚期间高度表达，它们可能会影响棉纤维中的木质素沉积。分析QTL报告的纤维质量特征后，gydF4y2BaGhDIR27型gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR28型gydF4y2Ba在QFS-C4-1中落在QFS-C4-1中，横跨多种环境控制光纤强度的QTL [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]. 此外，在几乎相同的区域检测到另外两个纤维强度QTL（qFS-C4-3和qFS04.1）和一个控制纤维马克隆值的QTL（qFM-Chr4-3）[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．有趣的是,gydF4y2BaGhDIR27型gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR28型gydF4y2Ba在QFL04.1中也落下，QTL赋予纤维长度[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]. 因此，我们有理由推测这一分支可能调控木质素的生物合成，影响纤维的发育。同样地，在实验中也观察到了“SCW分支”gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一种）。然而，gydF4y2BaGbDIR27gydF4y2Ba和gydF4y2BaGbDIR70gydF4y2Ba（直观到gydF4y2BaGhDIR28型gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR75gydF4y2Ba分别显示出相当低的表达水平，这可能在两种棉质物种之间部分不同的纤维性能解释。Dir-A基因被广泛地考虑介导木质生物合成（附加档案gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S6)。特别是，一种大豆DIR-a蛋白GmPdh1通过考虑其表达模式和促进豆荚开裂而被推断影响木质素沉积模式[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．它提醒我们功能缺失突变gydF4y2BaAtPrR1gydF4y2Ba（Pinoresinol还原酶）导致木质素水平的改变，木质素结构和组织特异性木质素分布[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba];木素生物合成和木素沉积之间可能存在联系。在目前的研究中，有两个dira基因gydF4y2BaGhDIR12gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR36型gydF4y2Ba类似的,gydF4y2BaGMPDH1gydF4y2Ba在二次电池壁增厚期间高度表达（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).然而，它们的同源基因(gydF4y2Ba国标13gydF4y2Ba和gydF4y2BaGbDIR35gydF4y2Ba)在棉纤维中表达量很少(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).调查是否gydF4y2BaGhDIR12gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR36型gydF4y2Ba可以通过提高木质素的生物合成负调控纤维质量。与上述基因不同，gydF4y2BaGhDIR35型gydF4y2Ba在纤维伸长时优先表达。属于DIR-b/d-I分支，属于纤维长度稳定qFL08.1 QTL [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba，高度同源gydF4y2BaGhDIR35型gydF4y2Ba，显示出更高的转录水平。而且，过表达gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物可促进细胞伸长(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．因此,gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba和gydF4y2BaGhDIR35型gydF4y2Ba它们在棉纤维伸长中起着重要的作用，其表达差异可能是纤维性能不同的原因之一。gydF4y2Ba

GBDIR78gydF4y2Ba可能通过调节苯丙烷丙醇代谢来促进细胞伸长率gydF4y2Ba

GBDIR78gydF4y2Ba能促进细胞伸长吗gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物，但机理还需要讨论。在棉纤维伸长时优先表达，gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba不太可能参与木质素的生物合成。一个大豆基因gydF4y2BaGMDIR22gydF4y2Ba能有效指导木脂素在体内和体外的生物合成[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba非常接近gydF4y2BaGMDIR22gydF4y2Ba在系统发育树中（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac),这意味着gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba也可能参与木脂素的生物合成。GbDIR78在洋葱表皮细胞中瞬时表达后，进入分泌通路，主要保留在质膜中(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S7)，这部分类似于GmDIR22的亚细胞定位。然而，DIR蛋白在参与木质素生物合成时以细胞壁为目标[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．因此，我们合理推测gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba参与木脂素的生物合成。令人有点困惑的是，报道的棉花gydF4y2BaGhDIR1gydF4y2Ba基因股票与之相关的进化关系gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba，而是过度表达gydF4y2BaGhDIR1gydF4y2Ba在棉花中可以提高木质素[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．这可以用木脂素和木素生物合成之间的联系来解释[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

胞外ROS(活性氧)信号对细胞伸长至关重要[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，但高浓度的ROS会产生毒性，导致细胞壁变硬[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]. 细胞壁gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物过表达gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba可能处于中度的ROS浓度，因为一些（Neo）木质素可以反对氧化损伤[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．鉴于木酚素与黄酮类化合物争夺苯丙氨酸前体[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba[朝向木质体的代谢助焊剂可导致黄酮类化合物的减少。表明黄酮类药物（特别是黄酮醇）抑制极性养蛋白转运[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．因此，在gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba过表达gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在植物中，生长素的运输(在顶端-基轴)可能比野生型植物高。综上所述，转基因植株的毛状体和下胚轴较长gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物可能是由于中等ROS水平和较高的生长素积累。在棉纤维中，适当的ROS水平对细胞伸长很重要[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．此外，一些黄酮类化合物对棉纤维发展发挥了负面影响[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．因此，黄酮类化合物转化木酚素的代谢通量应该是改善棉纤维品质的新途径。gydF4y2Ba

总之，我们进行了全基因组分析gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族在gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba．我们的研究清楚地证明了节段和串联重复如何促进棉花的扩展gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族和重点gydF4y2BaGossypium.gydF4y2Ba特异性进化枝参与棉酚的atropselective synthesis。我们也建议gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因不仅可以赋予葡萄黄枯萎病，而且影响棉纤维发育。此外，事实gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba能促进细胞伸长吗gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物为改善棉纤维性能提供了另一种途径。我们的结果提供了有用的见解的进化历史，表达模式，转录调控和功能分析gydF4y2Ba棉花gydF4y2Ba基因。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

g .取得gydF4y2Ba简历。Pima90-53 [gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]及Hai7124 [gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，纤维质量上乘，而且gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba简历。在生长季节(4月下旬至10月下旬)，在保定市(北纬38°45′，东经115°29′)试验田种植了纤维品质中等的HY405和ND13。田间管理遵循常规耕作方法。gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba不同抗逆性品种gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba本研究采用的感染情况如下:抗性品种ND601 [gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]4个耐盐品种（AusSiV2、新棉33b、农大棉7号和农大棉8号），2个感病品种（邯郸333和香棉18号）。在病圃多年观察的基础上，对黄萎病抗性进行了评价。在gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba- 响应表达实验，这些品种的幼苗在28℃/ 25℃（日/夜），16-H光周期和80％相对湿度下的环境条件下在50％的Hoagland的溶液中生长。每四天改变溶液，以确保幼苗的健康生长。四周古老的棉幼苗被感染了gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba应变LINXI2-1如Wang等人所述。［gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．上述品种大部分由国家棉花中期基因库收集保存，并获得相应的许可，包括Pima90-53 (M210080，引自美国)、Hai7124 (M210054;中国江苏)、AusSiV2 (M131662，引进自澳大利亚)、xin绵33b (M112566，引进自美国)、农大面7 (M110598;河北农大面8 (M110599;2 .河北邯郸333 (M112751;M114752;湖南、中国)。另外3个品种HY405、ND13和ND601是由河北农业大学从中国河北省采集的，其登录号分别为G100937、G100728和G100729。这些品种的种植和调查所需的所有许可均获得了河北农业大学和中国棉花中期基因库的批准，这些品种的收集和研究均符合《濒危野生动植物种贸易公约》的规定。gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba哥伦比亚野生型植物(Col-0)和转基因植物在温室(22°C, 16小时光周期，70%相对湿度)的无菌蛭石盆栽中培养。霍格兰的营养液每周添加一次。gydF4y2Ba

序列来源gydF4y2Ba

基因组数据gydF4y2Bag . raimondii就gydF4y2Ba(JGI_221_v2.1) [gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]，gydF4y2BaG.植物园gydF4y2Ba（CRI\ U第2版）[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba(ZJU_TM-1_V2.1)和gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba（ZJU\ U Hai7124\ U V1.1版）[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]从CottonFGD下载[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．的gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba（12x）[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaT. Cacao.gydF4y2Ba(Criollo_cocoa_genome_V2) [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]基因组从Ensembl Plants [gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]，和gydF4y2Bag·马克斯gydF4y2Ba（wm82.a2.v1）[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]从Phytozome下载基因组[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．的gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba本研究对上述物种的基因进行了鉴定。的DIR序列gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，gydF4y2Bal . usitatissimumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]，gydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba] 和gydF4y2Ba云杉gydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，从TAIR (gydF4y2Bahttp://www.arabidopsis.org/gydF4y2Ba), Phytozome (gydF4y2Bahttps:///phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html.gydF4y2Ba），水稻基因组注释项目（gydF4y2Bahttp://www.rice.plantbiology.msu.edu/gydF4y2Ba）和ncbi（gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba),分别。gydF4y2Ba

DIR蛋白的鉴定和鉴定gydF4y2Ba

序列比对gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba基因家族(PF03018)从Pfam [gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．使用Hmmer 3.0鉴定候选毒剂蛋白[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]，并已通过批查光碟服务确认[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．使用NetnglyC 1.0鉴定N-糖基化位点（gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/netnglyc/gydF4y2Ba)．用信号5.0进行信号肽预测[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．YLoc用于预测亚细胞定位[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．蛋白质长度，分子量和等电点是通过一个本机Perl脚本进行研究。gydF4y2Ba

基因结构，染色体分布，保守的主题和系统发育分析gydF4y2Ba

从基因注释文件中提取外显子-内含子信息和基因定位信息，然后使用TBtools进行可视化[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．采用MEME搜索保守的motifs，限制15个motifs及其他默认参数[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．系统发育树采用MEGA 7.0软件，采用邻域连接(NJ)方法构建，bootstrap复制1000次[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]然后用在线ITOL工具显示[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

基因复制和Ka，Ks和Ka / Ks值的计算gydF4y2Ba

使用默认参数的MCScanX检测分段和串联重复[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］．获取重复事件，然后用tbtools显示[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．采用双向最佳命中法测定了At-亚基因组和dt -亚基因组之间的同源基因。我们用了ParaAT [gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]构建蛋白质编码的DNA序列。然后用KaKs\u计算器和LPB法计算Ka、Ks和Ka/Ks值[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

RNA-seq数据gydF4y2Ba

一个黄萎病作物gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba品种ND601和一个高度激进的脱落gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba菌株Linxi2-1用于gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba-反应性表达分析。4周龄苗木的根系gydF4y2BaV. Dahliae.gydF4y2Ba分别在接种后2、6、12、24和48 h (hpi)分别采集，同时在相应时间点采集接种蒸馏水的幼苗根系作为对照。每个时间点产生两个生物复制。冻僵的根在液氮中机械地磨成细粉。然后按照制造商的说明，使用RNAprep纯植物试剂盒(天根，中国北京)分离总RNA。对于RNA-seq，链特异性cDNA文库是在中国北京Novogene生物信息研究所制备的。然后使用Illumina Hiseq 4000平台进行测序，生成150 bp的对端reads。然后用FPKM (gydF4y2BaFgydF4y2BaragmentsgydF4y2BaPgydF4y2Ba呃gydF4y2BaKgydF4y2Ba外显子模型每gydF4y2Ba米gydF4y2Baillion映射读取)。最后,日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba（1 + FPKM）显示平均后的两个复制后的值。同样，四个verticillium耐受性gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba品种Aussiv2，Xinmian33b，Nongdamian7和Nongdamian8（分别在当前研究期间称为T1，T2，T3和T4）和两个易感品种Handan333和Xiangmian18（分别称为S1和S2）用于表达实验。以与上述相同的方式在12hPI以12HPI产生RNA-SEQ样品。要突出显示表达式更改，我们将使用日志显示折叠更改值gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba转换。倍数变化是1 + FPKM(处理)与1 + FPKM(控制)的比值。此外,gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba品种Pima90-53和Hai7124gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba在纤维显影相关表达分析中使用栽培品种Hy405和ND13。对于每种品种，棉铃被独立于5，10,15,20,25和30天收获（DPA）。对于每个时间点，收集来自多个棉铃的样品并合并以最小化变化。最后，使用28个文库（由0DPA的胚珠，5,10,15,25和30dPa的纤维）用于在Hiseq 2500平台上产生125bp配对盖。rpkm（gydF4y2BaRgydF4y2Baeads.gydF4y2BaPgydF4y2Ba呃gydF4y2BaKgydF4y2Ba外显子模型每gydF4y2Ba米gydF4y2BaIllion映射读取）被应用于估计表达水平，并且我们最终显示了日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(1 + RPKM)值。gydF4y2Ba

启动子分析gydF4y2Ba

的启动子序列(ATG上游2000 bp)gydF4y2BaDIRgydF4y2Ba从基因组中提取基因gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba．根据基因本体论注释,总共有266 JASPAR矩阵(转录因子绑定配置文件)被选中,然后获取,包括hormone-activated信号通路(ABA、IAA、GA,乙、JA和SA),响应非生物胁迫(干旱、盐和温度),生物反应压力,和植物细胞壁发展(gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．对于每个jaspar矩阵，FIMO用于扫描具有严格阈值的匹配的启动子序列gydF4y2BapgydF4y2Ba-Value <1E-5 [gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．根据分类信息统计潜在转录因子结合位点(TFBS)。最后，我们展示了使用iTOL [gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的功能分析gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba

的编码序列gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2Ba(来自Pima90-53)被扩增并插入Gateway pDONR207载体中形成进入克隆。将编码序列重组到Gateway pGWB414载体中，在CaMV 35S启动子的控制下生成过表达(OE)结构。OE结构被转化为gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba（col-0）通过gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba介导的植物转化。使用50μg/ ml卡那霉素筛选（1/2 ms培养基）和PCR检测鉴定转基因植物。两个转基因T.gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba细胞株OE2和OE3均得到稳定表达gydF4y2BaGBDIR78gydF4y2BaReal-time PCR和Western blot (HA-Tag)检测。用奥林巴斯BX51显微镜(东京，日本)对4周龄野生型(WT)和OE植物的第5莲座叶进行了乙醇脱色，并用ImageJ软件对每行约150个清晰的毛状体的最长枝条进行了测量[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．观察黑暗生长的下胚轴，种子gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba在22℃、持续黑暗条件下，在垂直培养皿(1/ 2ms培养基、0.9%琼脂、pH 5.8)中培养。收获五天大的WT和OE幼苗，然后用专业的爱普生V800扫描仪(长野，日本)拍照。随后使用ImageJ软件测量他们的下胚轴[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．用碘化丙啶(PI)染色，用Olympus FV10i激光扫描显微镜(东京，日本)拍照，观察下胚轴表皮细胞。双尾gydF4y2BatgydF4y2Ba测试(gydF4y2BapgydF4y2Ba-value)使用GraphPad Prism软件(San Diego, CA, USA)进行。为了检测GbDIR78的亚细胞定位，将其编码序列重组到Gateway pEarleyGate103载体中，该载体可以表达c端GFP融合的靶蛋白。单独表达GFP的质粒作为对照。采用Bio-Rad PDS-1000/He系统(Hercules, CA, USA)在洋葱表皮细胞中瞬时表达GbDIR78-GFP融合蛋白和GFP。转化后的细胞在MS琼脂培养基上培养24小时(22℃，连续黑暗)，用Olympus BX51显微镜(日本东京)监测。gydF4y2Ba

支持本研究发现的数据包括在这篇发表的文章及其附加文件中。RNA-seq数据可在基因组序列档案(gydF4y2Bahttps://bigd.big.ac.cn/gsa;gydF4y2Ba登录号码：CRA003811，CRA003789和CRA002927）或合理提交的相应作者。gydF4y2Ba

米娅:gydF4y2Ba

几百万年前gydF4y2Ba

Ks:gydF4y2Ba

每个同义站点的同义替换gydF4y2Ba

卡:gydF4y2Ba

每个非同义位置的非同义替换gydF4y2Ba

WGD:gydF4y2Ba

全基因组复制gydF4y2Ba

TFBS:gydF4y2Ba

转录因子结合位点gydF4y2Ba

阿巴：gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

国际宇航科学院:gydF4y2Ba

吲哚-3-乙酸gydF4y2Ba

eth：gydF4y2Ba

乙烯gydF4y2Ba

GA：gydF4y2Ba

赤霉酸gydF4y2Ba

青年成就组织：gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

山:gydF4y2Ba

水杨酸gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

OE:gydF4y2Ba

超表达gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

现病史:gydF4y2Ba

接种后的小时gydF4y2Ba

分区:gydF4y2Ba

天post-anthesisgydF4y2Ba

QTL:gydF4y2Ba

数量性状位点gydF4y2Ba

作者感谢世界各地的同事公布棉花基因组数据。gydF4y2Ba

本研究由国家重大科技计划（2016ZX08005003-005），河北省优秀青年基金（Grant C2019204365）和中国农业研究体系（Cars15-03）提供资金。融资机构在研究设计，数据分析和手稿准备中没有作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 刘正文和王兴芬对这项工作的贡献不相上下。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 河北农业大学华北作物改良与调控国家重点实验室，华北作物种质资源教育部重点实验室，河北保定071001gydF4y2Ba

   刘正文，王兴芬，孙正文，张燕，程胜孟，陈斌，王国宁，柯慧峰，吴金华，颜媛媛，吴立强，李志坤，杨军，张桂银，马志英gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

ZM和GZ构思了这个项目。ZL和XW进行了研究并对数据进行了分析。ZS、YZ、CM和YY对生物信息学分析有贡献。BC、GW和JW采集RNA-seq样本。HK, LW, ZKL和JY帮助种植实验材料。ZL和XW写了手稿。ZM和GZ对手稿进行了修改。所有作者均已阅读并批准稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2BaGuiyin张gydF4y2Ba或gydF4y2Ba马志英gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放存取gydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba. 知识共享公共领域放弃(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba