克隆和过度表达PeWRKY31从杨树×euramericana提高盐和生物耐受的转基因烟草

背景

作为重要的森林树种，生物压力和土壤盐渍化是限制生长的重要因素杨树×euramericana．wrkey是植物中重要的转录因子，可调控植物对生物和非生物胁迫的响应。在这项研究中,PeWRKY31是独立于杨树×euramericana，并对其生物信息、耐盐性和抗虫性进行了分析。本研究旨在为抗盐抗虫杨树的生产提供指导。

结果

PeWRKY31其预测的开放阅读框(ORF)为1842 bp，编码613个氨基酸。预测的蛋白是不稳定的酸性亲水性蛋白，分子量为66.34 kDa，有许多潜在的磷酸化位点，主要是在丝氨酸和苏氨酸上。PeWRKY31是锌指C₂H₂Type-II WRKY TF与WRKY TFS密切相关Populus tomentosa，并定位于原子核。一个PeWRKY31构建并转化为过表达载体烟草l .超表达的PeWRKY31提高了转基因烟草的耐盐性和抗虫性。转录组测序和KEGG富集分析表明，过表达烟草中谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导和MAPK信号通路相关基因表达量升高，这些基因在植物耐盐和抗虫中起重要作用。

结论

PeWRKY31是独立于杨树×euramericana．过度的PeWRKY31提高转基因植物对盐胁迫和害虫胁迫的抗性。该研究为生产具有潜在经济效益的抗逆性系提供了参考。

许多植物转录因子与防御相关的基因启动子相互作用，最终增强植物的抗逆性[1］．应激反应基因的转录调控不仅帮助植物对各种应激源做出反应[2]但对于植物生长，发展和代谢途径也很重要[3.］．转录因子在植物的发育、代谢以及对生物和非生物胁迫的响应中起着重要的作用。NAC、AP2/ERF、WRKY等转录因子在胁迫下植物生长调控中发挥重要作用[4］．

wrky是最大的转录因子家族之一，在植物高等转录因子家族中数量排名第七，仅次于bHLH、MYB、ERF、NAC、C₂H₂，和bZIP [5］．WRKYS已在165株植物中鉴定，共有14,549人预计将参与对生物和非生物胁迫的反应，激素信号的传播以及生长和发展的调节[6，7］．在非生物胁迫中，wrkey主要在冷热胁迫中发挥作用[8]、干旱和洪水[9，10，11]，高盐[12，13，14，15，16]和过量辐射[17］．wrkey还在植物对生物胁迫的免疫反应、对病原体和细菌的防御反应中发挥重要作用[18，19，20.，并建立相关信号转导途径[21，22］．的WRKYs拟南芥米饭已被证明在昆虫抵抗中发挥作用[23，24]但是，很少有研究在抗虫的背景下调查了杨树的杨树。

杨树生长繁殖快、分布广、适应性强，是常用的木本模式植物。此外，杨树在中国具有重要的商业价值。其中,杨树×euramericana品种易得，生长快，适应性强。近年来随着测序工作的完成Populus Trichocarpa.基因组和生物技术工具的不断发展，对杨树的研究已更多地集中在分子水平。PlantTFDB的最新版本(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)转录因子数据库共包含185个Populus tomentosaWrkys。已经孤立过十几种相关的转录因子，他们的功能已经过验证[25]而许多白杨树的腕子基因已被证明响应非生物应激，并在盐抵抗中发挥重要作用[26，27，28］．初步实验室研究显示PeWRKY31杨树×euramericana反应生物压力，但潜在的机制尚不清楚。为了澄清功能，PeWRKY31是独立于杨树×euramericana采用生物信息学方法对其序列进行分析。我们构建了用于亚细胞定位分析和烟草过表达的载体。然后，我们确定了PeWRKY31在盐和害虫胁迫信号转导途径中的作用。该研究为抗应力材料的生成奠定了基础杨树×euramericana行。

基因的筛选与克隆PeWRKY31

提取叶总RNA杨树×euramericana用4%盐处理或咀嚼的无性系和系Clostera anachoreta．的OD₂₆₀/ OD_280.在1。8到2。0之间，服药过量呢₂₆₀/ OD₂₃₀大于2.0，说明总RNA纯度足够。以cDNA为模板PeWRKY31表达和PCR引物设置31#所有F/R(表S1）.目标基因PeWRKY31以31# All F/R为引物进行PCR扩增(表S1）.得到的PCR产物为约1800bp，与预期尺寸一致，并用于载体结构。

分析表达PeWRKY31在杨树×euramericana在不同的压力,杨树×euramericana用4‰盐处理，幼虫取食。RT-PCR结果显示PeWRKY31在用4℃NaCl处理后改变7天和幼虫喂养1小时。相对表达PeWRKY31在4‰NaCl处理和生物胁迫下，分别增加了约10倍和8倍。1)，表明生物和非生物胁迫调控PeWRKY31表达。

生物信息学分析PeWRKY31

全长预测的ORFPeWRKY31包含1842 bp，编码613个氨基酸。预测蛋白分子量为66.34 kDa，等电点为6.12(酸性)，不稳定系数为48.59，疏水性为−0.712。这些结果表明，PeWRKY31是一种酸性的、不稳定的亲水蛋白。在PeWRKY31的二级结构中，α-螺旋占24.96%，β-旋转占2.94%，延伸链占12.56%，随机结构占59.54%(图S1一)。三级结构模型主要由五个β折叠结构和随机结构组成（图S1- b)。cNLS分析显示，PeWRKY31含有核定位信号序列PSDNRRR，表明该蛋白位于核上或核内。由于没有发现预测的跨膜区域，也没有预测的信号肽，因此该蛋白可能是细胞内的(图S2一)。该蛋白有75个潜在的磷酸化位点，以丝氨酸为主，苏氨酸紧随其后。

氨基酸序列的亲缘关系最为密切PeWRKY31在烟草attenuata则，拟南芥，Populus Trichocarpa.，水稻，玉米,菊花persica采用BlastX (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi.)、Phytozome v12.1 (https:///phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html.)和DNAMAN (https://www.lynnon.com/dnaman.html软件(图)。2a). 7个蛋白均包含一个WRKYGQK序列和一个C₂H₂锌 - 手指结构，是II族腕蛋白的典型特征，表明它们属于II类腕骨亚家族。PeWRKY31WRKY结构域与其他物种的WRKY蛋白具有较高的相似性。

在NCBI和Phytozome数据库(v12.1)中进行了检索PeWRKY31来自7个物种的基因和15个同源物(栽培稻，玉米，烟草attenuata则，菊花persica，拟南芥，Populus Trichocarpa.,大麦芽）.利用MEGA ver中的邻域连接方法分析了不同物种基因的进化过程。7.0 (https://www.megasoftware.net) [25]，并根据结果构建系统发育树(图5)。2b)。PtrWRKY10有最亲密的遗传关系吗PeWRKY31,紧随其后的是AtWRKY72．的功能PtrWRKY10是未知的，但它密切相关吗AtWRKY72对盐害等非生物胁迫做出反应[29］．因此,PeWRKY31也可能对盐胁迫有反应。

亚细胞定位GFP-PeWRKY31在瞬时转化烟草中

融合表达载体35S:GFP-PeWRKY31(p31#subl+ 1302)和控制载体35S:GFP瞬时转化烟草叶片农杆菌肿瘤术细菌感染的菌株。然后用荧光显微镜观察叶片。3.）.DAPI荧光染料用作对照揭示了核的位置。在用35s：GFP载体转化的叶片中，绿色荧光GFP信号分布在细胞核和细胞质中，表明预期的非特异性本地化。用35秒改变叶子：GFP-PeWRKY31，细胞内出现GFP荧光信号。只有核显示绿色荧光;核外细胞质中未检测到荧光信号，说明GFP-PeWRKY31特异性定位于烟叶核中。这些结果表明，PeWRKY31是一个核定位蛋白。

转基因烟草株系的一代

过表达载体p31#op+ 121(图。年代3.B)被转化成烟草使用农杆菌肿瘤术-介导叶盘法。共培养36 h后，筛选抗病营养繁殖体，将绿色抗病营养繁殖体转入生根培养基中。有根的烟草植株转移到花盆中，在正常的温室条件下生长(图。4广告）。

利用103#F/R引物对10个烟草品系的DNA进行PCR扩增nptII约500bp的片段(图。4e）和35＃发送F和31＃-JC R，其放大了〜400bp部分PeWRKY31(无花果。4f)(表1对于所有引物信息)。以含目的基因的质粒为阳性对照(CK+)， WT烟草为阴性对照(CK-)。从10个烟草品系中有9个(除1号巷外)和阳性对照中扩增出目的片段，但没有从阴性对照中扩增出目的片段。因此，十个测试烟草品系中有九个被确认含有目标结构。

qRT-RCR结果显示PeWRKY31在转基因系B5，B12和A12中，分别显着高于WT，分别在10,31和17次（图。5a).内源同源基因的相对表达NtWRKY31(LOC107770788)在转基因株系B5和A12中显著低于WT(图。5b)。

过表达转基因烟草耐盐性分析PeWRKY31

植物体内抗氧化酶SOD和POD的活性反映了胁迫对植物的伤害程度。0‰盐胁迫72 h后，WT和转基因烟草的SOD和POD活性均降低(图1)。6）.在4‰盐溶液条件下，转基因株系的SOD和POD活性均显著高于野生型株系。

MDA含量和电导率反映细胞膜的完整性。盐胁迫72 h后，WT烟草与转基因烟草在0‰盐浓度下的MDA含量和相对电导率均无差异。与无盐处理相比，4‰盐处理下各品系MDA含量显著增加，相对电导率由40%提高到60-80%。转基因株系的MDA含量和相对电导率均显著低于野生型，但转基因株系之间的结果无差异。结果表明，盐胁迫对烟草细胞壁均造成氧化损伤，其中WT细胞壁损伤较其他转基因株系严重。因此，目的基因对烟草细胞质膜具有保护作用，提高了烟草的耐盐性。

对转基因株系和WT烟草的株高和地径进行了5 d的监测。6）.盐胁迫下，所有烟草线的植物高度生长速率显着下降;转基因系，尤其是线B12的高度和地直径生长的生长显着高于WT的生长，表明转基因系比盐胁迫下的WT更鲁棒。这表明过度表达PeWRKY31提高烟草耐盐性。

抗虫性分析PeWRKY31- 转基因烟草

WT烟草的叶子和类似区域的转基因系列和等于等质量的叶片置于同一培养皿中以观察棉铃虫的饲养偏好（图。7一种）。喂食4小时后，显然昆虫主要集中在WT烟草叶上，因为昆虫咀嚼损伤的较高水平是可见的。在喂养8小时后，WT烟草的叶片损失面积近于50％，而所有转基因系的叶片的面积低于10％。这些结果表明PeWRKY31改善了烟草的抗虫性。

将WT烟草和面积相近、质量相同的转基因株系的叶片分别置于棉铃虫培养皿中，24 h后观察叶片的脱落情况(图1)。7b). WT烟草的叶面积损失大于转基因株系，而B12和A12转基因株系的叶面积损失小于B5株系，说明B12和A12转基因株系具有更强的抗虫性。

转录组分析PeWRKY31- 转基因烟草

WT烟草和过表达B12转基因烟草系PeWRKY31受转录组测序。从转基因和WT烟草中检测到37,628和38,271种表达的基因，并在转基因烟草中检测到1696个独特的基因，而在WT烟草中检测到2339个独特的基因。转基因和WT烟草中的差异表达基因的数量为14,892，在转基因系中具有6978个上调基因和7914个下调基因（图。4- b)。

采用基因本体功能分类方法对差异表达基因进行功能分类。差异表达基因中，4753个注释到677个生物学过程，1635个注释到177个细胞组分，6704个注释到457个分子功能，其中差异表达基因富集了44个生物学过程，7个细胞组分，27个分子功能。生物过程主要包括代谢过程，细胞成分主要是类囊体和光系统，分子功能主要是催化活性和结合(图S)4- c)。

此外，Kegg数据库用于分析不同途径中差异表达基因的富集。1233差异表达的基因PeWRKY31- 将转基因的转基因烟草注释为113个特异性代谢途径。该途径包括参与植物激素信号转导的人，植物病原体相互作用，植物MAPK信号通路，类胡萝卜素生物合成，萜类化合物和酮生物合成，抗坏血酸代谢，谷胱甘肽代谢，泛醌和其他三萜类化合物和醌的生物合成。上面列出的苯丙基丙醇生物合成和其他途径与植物疾病，抗虫性和耐盐性相关。

在PeWRKY31-过表达转基因株系中，胁迫相关基因的表达显著上调。在谷胱甘肽代谢途径中，表达氧化酶明显上调。抗坏血酸过氧化物酶（APX），其基因也上调，清除H.₂O₂在植物中，尤指在叶绿体中在植物激素信号转导中，表达JAR1是调节。表达的上调NPR1以及TGA转录因子的结合NPR1启动子可启动烟草的广谱抗性。在植物MAPK信号通路中，有2条与抗病相关的关键通路，2条与伤人相关的关键通路，2条与抗寒、抗旱、耐盐碱相关的关键通路。在创伤途径中，表达的是RbohD和Oxi1.被调节。在植物MAPK信号通路中，与非生物胁迫相关的MAPK5、MAPK8、MAPK1、MPK2和MPK6表达上调。

为了验证差异表达基因(DEGs)结果的可靠性，选取8个与生物胁迫和非生物胁迫相关的上调的DEGs进行qRT-PCR (quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证NtActin用作内参基因。数字8显示八个基因的测序结果和QRT-PCR结果。尽管Line B12的QRT-PCR基因表达结果与测序结果没有完全一致，但用于验证的所有八个基因的表达模式基本上与DEGS一致，表明测序数据的准确性和可信度。不同转基因系中的Degs的相对表达的差异可能是由不同的插入位置引起的，并且它们的表达模式也将通过插入位置不同（见表S.1引物序列)。

亚细胞定位分析PeWRKY31

不断发展的生物信息学技术和高通量测序项目带来的不断增长的转录组数据库越来越多地被用于基因挖掘和功能研究[30.]并且PCR方法用于获得靶基因[31］．在本研究中，qRT-PCR显示PeWRKY31反应生物和非生物胁迫。

大多数Wrky蛋白的活动发生在核中。WRKY蛋白拟南芥［32]和大米[33]定位于细胞核，荧光信号来自于融合蛋白PtrWRKY40在Populus Trichocarpa.和PtoWRKY60在Populus tomentosa只在细胞核中观察到[34］．此外,OfWRKY3，Cawrky6.和Cawrky30蛋白质也位于细胞核中[35］．荧光显微镜显示瞬态转化的DAPI染色结果与绿色荧光信号一致，表明PeWRKY31定位于原子核。

阻力的分析Pewrky31-overexpressing烟草

近年来，随着对转录因子的研究越来越多，人们发现WRKY转录因子参与了植物多种多样的生物学过程。虽然WRKY基因已经被研究拟南芥、水稻和其他示范植物品种[8，9]的研究很少WRKY杨树的基因。

盐胁迫应答基因的过表达可以提高植物的耐盐性[36，37，38］．盐胁迫下，过表达菊花抗氧化酶含量增加DgWRKY5，而丙二醛含量降低[39］．转基因小麦过表达的抗氧化酶活性Tawrky44远高于WT [22］．大豆基因GmWRKY12在盐胁迫下，MDA含量降低GmWRKY12-overexpressing大豆(40］．TaWRKY10，Tawrky44,TaWRKY19在小麦对盐胁迫的反应中，提高转基因植物对盐胁迫的耐受性[21，22，41］．在这项研究中，aPeWRKY31构建过表达载体并转化烟草。盐处理下，番茄幼苗的SOD和POD活性PeWRKY31-过表达烟草显著高于野生型，MDA含量和电导率显著低于野生型。这些结果与前人的研究结果一致，表明PeWRKY31可提高烟草的耐盐性。

AtWRKY18，AtWRKY40,AtWRKY60在拟南芥属于WRKY IIa + IIb亚家族，协同调控aba介导的盐胁迫反应[42，43］．在烟草减弱，WRKY3.和WRKY6对食草性昆虫造成的咀嚼损伤作出反应。WRKYs可通过激活水杨酸(SA)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)等信号通路调节某些基因的转录水平[44，45，46］．过度的ATWRKY18-ATWRKY40或AtWRKY18-AtWRKY60通过调节JA和SA通路调节机体对昆虫的免疫拟南芥［23］．AtWRKY28和AtWRKY75可增强抗氧化性拟南芥通过JA和ET途径感染真菌[47］．过度的OsWRKY53通过激活H₂O₂抑制乙烯的合成[24］．这些结果表明，wrkey通过参与信号转导调控对害虫的敏感性和抗性。在这项研究中,美洲杨树PeWRKY31受到生物应激后表达上调，过表达PeWRKY31在烟草中增加了对昆虫的抵抗力。然而，还需要更多的实验来确定是否PeWRKY31函数杨树和烟草一样。

转录组分析

在本研究中，转基因烟草过表达PeWRKY31对生物和非生物胁迫的反应增强。转录组KEGG富集分析显示差异表达基因与植物激素信号转导、植物MAPK信号通路、类胡萝卜素生物合成、萜类和酮类生物合成等重要的耐盐和抗虫途径相关[44，45］．差异表达基因在谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导和植物MAPK信号通路中均有表达，均对生物和非生物胁迫有响应。氧化酶催化还原性谷胱甘肽(GSH)转化为氧化性谷胱甘肽(GSSG)，从而清除有害自由基，从而保护细胞膜结构和功能不受过氧化物的损害[48］．调节APX型表达可以增强植物的抗氧化能力，从而增强植物抵抗逆境的能力[49］．调节的表达LAR1可提高植物的耐盐性和抗虫性[48］．调节的表达JAR1会增加JA-Ile，促进COI1-JAZ共受体复合物的形成[50］．这最终导致了JAZ蛋白的降解。JAZ降解可增强MYC2与其他蛋白的相互作用，激活MYC2启动子靶蛋白的表达，增强烟草的耐盐性和抗虫性[50］．表达的上调LAR1，APX型，我的C和MAPK家族基因在这些通路中可能在调节反应中发挥重要作用PeWRKY31- 转基因烟草对疾病，虫害和盐胁迫。

转基因烟草株系对生物逆境和非生物逆境的抗性存在差异，这可能与转基因烟草株系所处的位置不同有关PeWRKY31插入;这种差异也可能调控其他deg的表达。同源性表达下调NtWRKY31烟草中的基因可能是由于过表达的抑制作用Pewrky31。在未来的研究中，我们将探索PeWRKY31，为抗性杨树的选育提供理论依据。

在这项研究中,PeWRKY31是独立于杨树×euramericana，对其功能进行了研究。过度的PeWRKY31提高转基因烟草对盐胁迫和害虫胁迫的抗性。这些结果不仅揭示了作用WRKY31在杨树×euramericana，还要告知使用WRKYs在未来的木质植物研究中。未来的项目将包括过度表达PeWRKY31以杨树为研究对象，阐明其在生物和非生物胁迫响应中的特殊作用。这些研究的目标是获得具有潜在经济效益的抗逆性系。

材料

所用的植物材料为无性繁殖体杨树×euramericana和野生型（wt）烟草（烟草l .)。所用菌株为大肠杆菌DH10B和农杆菌肿瘤术GV3101。质粒pcm - t、pCAMBIA1302和pBI121用于载体构建。资料保存在河北农业大学林学院河北省森林种质资源与森林保护重点实验室。

定量逆转录-聚合酶链反应

分析PeWRKY31表达式杨树×euramericana在不同胁迫和不同过表达烟草系中，从烟叶中提取RNA并反转录成cDNA。根据OD值确定RNA的纯度₂₆₀/ OD_280.和OD₂₆₀/ OD₂₃₀比率。一对特异性引物(表S1)和SYBR Green Master Mix (Roche)进行qRT-PCR扩增PeWRKY31．根据转录组数据(引物序列见表S1）.我们进行了三个独立的生物学实验，以actin和18S作为内参。通过ΔΔCT法计算表达水平的Fold change (Fold change = 2−[ΔΔCT])。Real-time RT-PCR反应在95°C孵育3min，然后在95°C孵育30 s，在55°C退火30 s进行40个循环。

隔离PeWRKY31

采用RNA提取试剂盒(赛诺生物科技，张家口，中国)提取叶片总RNA，采用凝胶电泳法分析RNA质量。反转录合成第一链cDNA。

利用转录组数据设计引物进行筛选WRKY基因，导致隔离PeWRKY31cDNA。程序底漆版本。5.0用于根据cDNA序列设计特定引物组31＃所有F / R;这些引物用于从基因组DNA的靶基因的PCR扩增，分离全长PeWRKY31基因。所用的PCR循环为:起始95°C 5 min，然后依次进行30个循环，95°C 30 s, 59°C 40 s, 72°C 2 min。目的片段连接pUCm-T，转化成大肠杆菌DH10B感受态细胞热休克。对氨苄西林抗性阳性克隆的插入质粒进行了测序。选择用于进一步研究的克隆命名为31#all+T(表S1引物信息)。

分析PeWRKY31序列

的编码序列PeWRKY31使用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在NCBI网站上。用ExPASy()分析了PeWRKY31的分子量和等电点。http://web.expasy.org.）使用SOPMA预测其二级和三级结构（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)及SWISSMODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/interactive/dtducp/models/),分别。利用cNLS Mapper (cNLS Mapper)分析序列的潜在核定位信号(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/nls_mapper_form.cgi.)，利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)，信号肽使用seqNLS (http://mleg.cse.sc.edu/seqNLS/)和磷酸化位点使用NetPhos ver。3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) [26］．寻找与。同源的基因PeWRKY31在NCBI和Phytozome数据库中进行。利用DNAMAN对PeWRKY31的预测氨基酸序列与同源基因进行比较，并在MEGA ver中采用邻接法构建分子系统发育树。7.0。

GFP融合亚细胞定位载体和过表达载体的构建

使用31＃全+ T克隆作为基板，设计底漆组31＃Subl-ORF F / R和31＃OP-ORF F / R被设计成放大预测PeWRKY31编码序列。采用双酶切法构建表达载体p31#op+ 121和p31#subl+ 1302。将GFP融合表达载体p31#subl+ 1302和过表达载体p31#op+ 121转化为感受态GFP农杆菌肿瘤术GV3101细胞通过热冲击。使用P31＃ORF F / R和HPT2JC F / R引物组放大P31＃SUBL + 1302插入区域以验证正确的构象PeWRKY31和绿色荧光蛋白在向量中农杆菌肿瘤术并且同样地，P31＃OP + 121插入区域被P31＃ORF F / R和103＃F / R引物组放大，以验证正确插入PeWRKY31和nptII．

亚细胞定位分析PeWRKY31

GFP融合表达载体与相应载体仅包含绿色荧光蛋白通过农杆菌侵染将基因插入物瞬时转化到野生型烟叶中。利用荧光显微镜观察叶片的荧光信号，确定GFP的亚细胞定位:PeWRKY31融合蛋白。

烟草的遗传转化及转基因素鉴定

农杆菌属含有过表达载体p31#op+ 121的细胞在含有卡那霉素的LB液体培养基中振荡直到OD值₆₀₀0.4 - -0.6。以烈性烟草营养繁殖体为转化材料。营养繁殖体的叶子被切成约1厘米的薄片²，然后在感染液中浸泡约10分钟。在无菌纸上吸干叶盘，置于MS培养基上，黑暗培养36 h。然后转移到筛选培养基(MS培养基2.0 mg L⁻¹6-BA, 0.1 mg L⁻¹IBA, 800毫克L⁻¹头孢塔，50毫克l⁻¹卡那霉素）进一步的文化。选择30-50天后，将耐药营养促进培养培养基转移到生根培养基（800mg L的MS培养基⁻¹头孢噻肟和50 mg L⁻¹卡那霉素)进一步生根筛选。根长达到2厘米的营养繁殖体被转移到含有泥炭:珍珠岩:蛭石3:1:1混合物的塑料盆中，然后在温室中生长。30 d后，从生长良好的植株上取第4片叶子，用ctab法提取DNA。利用103#F/R和35#35sendF两对带有31#-JCR的特异性引物进行PCR鉴定。PCR对照以含目的基因的质粒为阳性对照(CK+)， WT烟草DNA为阴性对照(CK-)。

转基因植物盐胁迫处理及生理指标测定

在盐胁迫处理中，WT烟草与3个转基因株系(B5、B12、A12)分别种植在同一个塑料盆中。土壤分别以0‰和4‰NaCl水处理，在温室中种植。以下指标的处理和测量均涉及三个生物重复。

72 h后，采集各处理组叶片标本，测定过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和电导率。采用氧化愈创木酚定量法测定过氧化物酶活性。以抑制硝基蓝四氮唑的光化学还原为基础，用分光光度法测定了SOD活性。用硫代巴比妥酸法测定游离丙二醛含量。用浸泡法测定了相对电导率。

在盐应激的日子0,5和10上，测量三种转基因系（B5，B12，A12）和WT的植物高度和接地直径，并计算增加。

棉铃虫取食实验

从土壤中生长的WT和转基因烟草线（B5，B12，A12）切除叶片30天。相同称重的叶子分别置于带15和8的培养皿中Helicoverpa armigera(棉铃虫)，每组重复3次。记录每个品系的叶片摄食和侵染损失率。

转录组测序

将叶为30天历史的WT和转基因（B12线）烟草被送到天津Nuohe Zhiyuan生物公司进行转录组测序，并将每个样品的三种生物重复用于RNA-SEQ。通过GO评估和分析差异基因表达（http://geneontology.org/）.kegg（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC102409/)数据库分析差异表达基因的途径富集[45］．记录与差异表达基因相关的生化、代谢和信号转导通路。

所有数据和材料都在主论文和附加的支持文件中。所有原始序列数据均可在国家生物技术信息中心(NCBI)网站获得，SRA注册号为PRJNA694343 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/prjna694343）.

子:

开放阅读框

TF:

转录因子

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

去：

基因本体论

MAPK:

增殖蛋白激酶

绿色荧光蛋白:

GreenFluorescent蛋白质

SOD:

超氧化物歧化酶

圆荚体:

过氧化物酶

MDA:

丙二醛

WT:

野生型

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

不申请。

基金资助:国家自然科学基金项目(No. 32071790);河北省基础研究计划项目(No. 18966801D)。这些资助机构没有参与研究的设计、样本收集、数据分析或解释以及手稿的撰写。

从属关系

1. 河北农业大学林学院林系，中国保定

   小岳宇，玉潘，闫冬，赵章，民生杨丽辉佐

2. 2 .河北省林木遗传资源与森林保护重点实验室，保定071000

   余晓月，董燕，张超，杨民生

3. 天津市诺和医学检验有限公司

   于锅

4. 河北农业大学园林与旅游学院，河北保定

   本卢

5. 河北工程大学景观与生态工程学院，邯郸056000

   励辉左

贡献

XY和LZ对数据进行分析，编辑稿件。XY和YP对数据进行分析，并撰写稿件。YD和CZ进行了实验。BL进行实验并编辑稿件。MY和LZ设计实验，编辑稿件。所有作者都阅读并批准了原稿。

相应的作者

对应到民生银行杨或励辉左．

伦理批准和同意参与

不涉及伦理问题。

同意出版物

不适用。

利益争夺

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

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