高世代近等基因系与多组学结合研究波里马细胞质雄性不育的机制

背景

天然存在于高等植物中的细胞质雄性不育（CMS）是分析核和线粒体基因组功能的有用机制，并鉴定线粒体基因在植物生长和发育中的作用。polima（波尔CMS是油菜中最普遍重视的雄性不育类型。先前的研究描述了波尔CMS恢复基因招标公告和不育诱导基因orf224在石油种子强奸中，位于线粒体。然而，生育恢复和不孕症的机制仍然是未知的。此外，仍然未知繁殖力恢复剂基因如何干扰无菌基因，引起无菌基因失去其功能，并导致生育恢复。

结果

在这项研究中，我们使用多OMICS联合分析来发现与无菌基因相互作用的候选基因orf224和恢复剂基因招标公告的波尔CMS提供不育的发生和恢复机制的理论支持。通过多组学分析，我们筛选编码与RNA编辑，呼吸电子传递链，花药发育，能源运输，绒毡层发育，氧化磷酸化蛋白24个差异基因。使用酵母双杂交测定，我们总共七个获得招标公告相互作用蛋白，与orf224蛋白质包括五个相互作用的蛋白质。

结论

我们建议招标公告它的相互作用蛋白会裂解atp6 / orf224，导致不孕症基因失去其功能和恢复生育能力。什么时候招标公告不是裂解,orf224毒害绒毡层细胞和花药发育相关蛋白，导致波尔CMS线粒体功能障碍与男性不育。多组学联合分析的数据为pol CMS的潜在分子机制提供了信息，将有助于育种B. Napus.杂交种。

细胞质雄性不育(CMS)是指植物不能产生功能性花粉，这种自然现象在维管植物中普遍存在，特别是在开花植物中[1]。研究人员利用CMS充分培育作物以生产杂交种子，这是利用杂种优势的一种非常有效的方法[2]。CMS似乎主要是由位于线粒体中的基因重排、缺失或突变引起的，而这些基因可被存在于核基因组中的生育恢复因子基因消除[3.，4]。CMS不仅可以用于研究细胞质基因和核基因之间的关系，而且还可以是用于检查杂种优势的合适供体，为三线育种提供理论依据[5，6]。随着研究人员不断地阐明导致异常花粉发育的因素，有几个因素可能会导致被发现了这一现象。科学家们已经做出关于CMS机制，如细胞毒性，高级程序性细胞死亡（PCD），能量不足，及反向逆调节假说[对应的假设7]。虽然没有直接证据证明毒性蛋白假说，但不育基因对原核细胞的生育抑制作用已被充分证明[8，9，10]。线粒体基因重排导致能量损失，这可能是CMS中花药流产的重要原因[11]。以往的研究表明，在玉米CMS-T过程中，花药发育过程中线粒体分裂迅速。因此，CMS基因表达升高可能导致线粒体功能缺陷，导致男性器官发育能量供应不足，从而引发流产[12]。ATP合成需要通过在线粒体中的复合I，II，III和IV产生的氢离子的浓度梯度产生的氢离子流动，线粒体膜结构的完整性对ATP的产生至关重要[[11，13]]。许多由CMS基因编码的蛋白质，包括URF13、ORF138 ORF79,ORPH79,是跨膜蛋白。这些蛋白质可以与线粒体内膜结合，影响氢离子浓度梯度，从而影响ATP合成[14，15，16]。

油菜(芸苔属植物。)是世界上第四大产油作物。雄性的细胞质不育芸苔栗鸟也被广泛地研究了促进杂种种子生产的富含细胞质雄性不育的富源，以获得所需的性状。以前的研究发现，油菜籽中至少有九种CMS：OGU CMS [17]，小睡CMS [18]、旅游事务管理中心[19]，波尔CMS [20.]，shan2ACMS [21]，oxa.CMS [22]，NCACMS [23]，Moricandia薄荷CMS [20.]，NSA.CMS [24]，hauCMS [25]，inCMS [25]。根据花药堕胎的时期，CMS分为孢子素和杂种性无菌。在油菜籽中，目前报告的无菌细胞质类型是孢味性无菌性的。根据细胞质源，CMS分为两种类型：均质细胞质和异质细胞质无菌[26]。

在油菜籽中，最常见的CMS类型是波尔CMS，用于全球范围内的研究目的。自1987年发现以来，已发现线粒体基因转录异常ORF224 / ATP6.导致发生的发生波尔CMS [27，但不育基因如何orf224有助于开发异常的制度运作仍有待探索的遗体[28]。此外，修复基因波尔通过基于地图的克隆已经验证了CMS [29，30.，31］．招标公告是一种核基因，编码位于线粒体中的PPR蛋白，它最终导致不育基因的功能失常orf224，从而允许恢复POL CMS引起的繁殖力[29]。然而，不审查生育恢复剂的机制。互联网检查B. Napus.表明一些蛋白质的累积水平波动很大，包括与能量和碳水化合物代谢、光合作用和类黄酮生产、醛脱氢酶性能和细胞壁重塑相关的蛋白质[32]。CMS的发生特点是在蛋白质水平、转录水平和代谢水平上存在相当大的差异。我们将通过蛋白质组、转录组和代谢组的联合分析，进一步分析CMS的原因和结果，为阐明核质粒界面提供新的研究基础。新类型CMS的发现不仅可能改善十字花科植物的细胞质资源，而且也为检测核质粒相互作用提供了有价值的资源[11，33]。在多组学的发展中，核组学(包括基因组学和转录组学)揭示生命现象的潜在因素，蛋白质组学揭示生命现象的外部因素，代谢组学揭示最终结果现象。因此,通过整合不同层的组织学结果意识到生命的本质现象的深入挖掘造成影响,从表面到内部,我们将有一个更全面和准确的对法律的理解,揭示生命的特征[[34，35]]。

RNA是一种遗传大分子，在真核生物和原核生物中发挥着多种作用。RNA有三种类型，在生物的生命周期中，它们在细胞内具有不同的位置和功能:信使RNA (mRNA)、核糖体RNA (rRNA)和转移RNA (tRNA)。RNA是核糖酶和核糖蛋白的重要组成部分。分离特异材料的显微解剖技术已成为基因表达谱研究的热点。与单细胞生物不同，高等植物已经进化成非常复杂的生物;它们是根据维护良好的器官和组织的基本功能进行分类的。目前的研究人员忽略了这一点，即植物有不同的细胞类型;因此，他们的实验结果不够深入和翔实。高空间分辨率的整体转录水平分析对于完全描述特定组织的状态是必需的。因此，特化植物细胞中单细胞水平上的基因转录差异对于分析植物性状发生的机制至关重要，这些差异也引起了科学家们的广泛兴趣[36]。激光捕获显微解剖、激光显微解剖和压力喷射是收集均匀细胞分析植物代谢物的合适的取样技术。微解剖切除绒毡层细胞，提取RNA并扩增进行单细胞转录组测序。在本研究中，我们应用多组学联合分析来发现与不育基因互作的候选基因orf224和恢复剂基因招标公告的波尔CMS提供不育的发生和恢复机制的理论支持。

紫花苜蓿花粉CMS微形态缺陷的观察芸苔栗鸟

我们使用的不育系1141A波尔CMS和恢复系材料bing409。后13代回交，我们构建的恢复基因的NIL材料波尔CMS。不育系与恢复系在无性发育过程中无表型差异。然而，在恢复系生长的后期波尔CMS的花蕾和花的形态差异显著。通过立体显微镜和扫描电镜观察不育系和恢复系的花药和花粉的差异，我们发现不育系和恢复系的花粉有相当大的差异。在不育系中，花蕾和雄蕊干涸，花瓣变小收缩，无花粉，蜜腺明显减少。1A和C)。

相比之下，恢复植株是健康的，显示出野生型的花瓣和雄蕊生长，蜜腺的数量最大(图。1通过扫描电子显微镜比较不育系花粉和恢复系花粉，发现许多异常的发育突起(图2)。1e和f），花药表皮生长延迟（图。1g和h）与表面上存在的花粉颗粒和异常收缩破裂（图。1不育植株的花粉粒明显收缩，向内弯曲，萎陷;此外，外墙的开发被放弃，中心板是不规则的。

在无菌花药代谢物和恢复系的分析波尔CMS近代源性线

无菌恢复系的花蕾的代谢分析波尔CMS近等基因系共鉴定出699种代谢物，包括88个氨基酸衍生物、71个苯丙类、17个醇类、10个多酚类、26个酚酰胺类、57个核苷酸衍生物、8个花青素类、41个黄酮类、25个黄酮醇类、17个黄酮类、3个醌类、32个生物碱类、21个碳水化合物、17个萜烯类、3个维生素及其衍生物、4种异黄酮，8种吲哚衍生物，110种有机酸及其衍生物，1种原花青素，6种类固醇，65种脂类，35种其他(图)。2a).主成分分析(Principal component analysis, PCA)显示，黄花不育系和恢复系花蕾中代谢物的丰度波尔CMS巨大的变化，无菌和肥沃分开，最大达到23.39％，群体达到36.36％（图。2b)。

在本研究中，通过使用热图聚类，我们分类了无菌和恢复系的代谢物（图。1A). KEGG富集分析表明，代谢物参与次级代谢、类黄酮代谢和糖酵解/糖异生途径，这些途径的代谢物水平变化显著(图S)1B;表S.1)．差异代谢物火山图显示，不育系与恢复系与11种花芽的代谢物差异(|Fold change|≥1，|Fold change|≤0.5)共37个。此外，有11个代谢产物向上积累，26个代谢产物向下积累(图。3.一)。3.b列出了多个代谢物差异最大的前20种物质，其中pterostilbene向上积累最多，d - red -sphinganine向下积累最多(表S)4)．

不育系与恢复系之间的差异丰富蛋白(DAPs)波尔CMS

进一步探索的机制波尔在不育系和恢复系的不育系中，我们对其花芽进行了取样B. Napus.采用无标记法检测近等基因系不育系和恢复系之间的基因表达差异和蛋白质丰度差异。对于蛋白质组，共检测到711479个总光谱、27274个匹配光谱、46998个多肽、30391个独特多肽、7598个蛋白和4967个可定量蛋白(图S)2a，c）。PCA分析结果表明，在无菌和恢复系中，该组之间的差异在44.6％下显着，本组内的差异为14.9％，可以更好地区分两种材料之间的差异，并表明该方法具有良好的方法定量重复性（图S2B)。

可标记的方法用于检测四个水平的蛋白质。基于-Log10P-value > 1.5，共鉴定出140个DAPs。其中65个蛋白积累量上升，75个蛋白积累量下降(图S2d）。COG / KOG分类分析表明，跳带分为18个功能（图。4)．差异表达蛋白的COG/KOG功能分析显示，存在相当大差异的代谢过程涉及翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣、翻译、核糖体结构和生物发生以及能量生产和转化(表S3.，S.5)．通过以前的研究，发现了波尔CMS的发生主要发生在花药第四阶段的开头。Tapetum层是由预先编程的死亡引起的，并且Tapetum层主要为花药的发展提供能量。

同时，细胞质雄性不育也主要发生在线粒体中，线粒体也被用作植物发育中的能量转化的地方。因此，我们推测，发生波尔CMS可能与能量的产生和转化有关，从而调节绒毡层的降解，引发花药异常发育。”我们进行GO分析以确定DAPs的官能团。CMS与维持系之间的140个DAPs被划分为17个功能组，其中生物过程、细胞组分和分子功能分别占7、4和6个GO项。在生物过程中，有30种蛋白存在于蛋白丰富的细胞过程中，56种蛋白存在于代谢过程中，26种蛋白与单一的生物过程相关，4种对刺激的反应，8种蛋白用于定位，3种蛋白用于调节生物过程。此外，基因修复在细胞质雄性不育的转运激活等方面还存在进一步的变化。参与细胞周期和恢复过程的相关蛋白表现出不同波尔CMS线条（表S5)．细胞组分被干扰;细胞组成蛋白18种，细胞器11种，生物大分子复合物13种，膜相关蛋白10种。在分子官能团中，具有催化活性和结合活性的蛋白分别占54和49个蛋白，其中有4个蛋白具有转运蛋白活性，8个结构分子活性蛋白，3个抗氧化蛋白和3个其他特征蛋白(图)。5)．

不育系和可育系绒毡层的单细胞转录组测序波尔CMS近代源性线

我们利用激光微生物切除和Illumina技术进行单细胞RNA-SEQ分析，以阐明差异表达基因（DEGS）和NIL中POL CM之间的关系。修剪原料数据后，分别为肥沃和无菌样品获得了总共52,936,673和52,606,810个清洁读数。此外，Q20和Q30分别> 96.61和> 92.53％。无菌和肥沃样品的GC含量定期显示约45％，表示测序精确。所有清洁读数（105,543,483）使用三位一体方案对齐，导致117,332个折叠，平均长度为901 nt（图S3.)．我们执行集群并确定了80,851个unigenes（> 200 bp）;平均长度为1054nt，N50为1586nt。记录的所有ungenes的长度超过199年的BP，其中86.95％从200到1999年的BP范围。我们将所有组装的未成年人进行以搜索NR，Swiss-Prot和Cog数据库，66,143（81.81％），54,85​​7％（67.85％）和28,129（34.79％）分别与这三种蛋白质数据库对齐（图。S.3.)．其中，在无菌和恢复系材料中检测到114,517和104,780个基因，并且在两种材料中检测到98,735个基因。

我们分析了无菌系和恢复系之间的度的视角为先进的识别的基因表达模式的差异。我们确定了在生育和不育的比较831个基因，其中包括501个上调基因和330个下调基因（图6一种）。选择具有显着FDR≤0.05的基因≤0.05用于Kegg浓缩途径分析。结果显示光合作用，光合作用 - 天线蛋白质中的富集基因，光合生物，糖酵解/葡糖生成，淀粉和蔗糖代谢，卟啉和叶绿素代谢，果糖和甘露糖代谢，甘油磷脂代谢等代谢途径（图。6B;表S.2，S.6)．花药细胞在生长过程中也表现出快速增殖和旺盛的代谢过程[37]。因此，参与能量代谢的光合作用和糖代谢过程可能在发育中发挥重要作用B. Napus.囊里。

联合转录组，蛋白质组和代谢分析

通过蛋白质素，代谢物和转录om的组合分析，我们发现在无菌线和恢复系列中波尔CMS接近同学线，由于恢复基因的差异招标公告，一系列的基因和途径发生在芸苔属植物拉伯．我们对检测到的DEGs及代谢物进行KEGG富集分析。通过对蛋白质组和代谢组的联合分析，发现糖酵解/糖异生等代谢途径存在显著差异。转录组和代谢组的联合分析揭示了三个途径的显著差异:苯丙烷生物合成途径、糖酵解/糖异生代谢途径和丙酮酸生物合成途径。然而，转录组和代谢组富集分析显示，钙转运atp酶活性、上皮指示蛋白、糖酵解/糖异生、磷酸酶活性和淀粉蔗糖代谢存在显著差异(图S4)．

在蛋白质组，代谢物和转录组织分析中，我们获得了141个差分蛋白，37个差分代谢物和831个差异基因。通过在分析中组合蛋白质组，转录组和代谢物的三个常规，转录组和代谢物中的差异基因，筛选总共24个基因用于蛋白质组，转录组和代谢物的相关差异。这些基因的功能主要包括与RNA编辑，呼吸电子传输链，花药发育蛋白，能量传输相关蛋白，绦虫发育蛋白和氧化磷酸化蛋白质相关的基因（表1)．在高代近等基因系材料中，修复基因的显著差异导致了蛋白质、代谢和转录水平的差异。因此，我们筛选蛋白质之间的相互作用波尔CMS不育基因orf224和修复基因招标公告通过酵母双杂交，以进一步了解无菌和恢复基因的机制（图。7一种）。RT-PCR验证了酵母双杂交验证的基因，发现只有三种基因不合理不同，而所有其他基因都显着差异（图。5)．

研究表明，RNA编辑、呼吸电子传递链、花药发育、能量传递、绒毡层发育、氧化磷酸化等相关通路涉及不育基因与恢复基因之间的相互作用。我们利用酵母双杂交找到与恢复基因相互作用的蛋白，分析恢复基因恢复育性的机制。结果表明，修复基因与参与RNA编辑的蛋白质可能共同作用波尔CMSatp6 / orf224成绩单。恢复基因和参与RNA编辑的蛋白质相互作用，导致不育基因无功能。此外，恢复系基因还与能量、呼吸电子传递链和丙酮酸脱氢酶相关蛋白相互作用，提示CMS的发生和育性恢复可能与能量代谢密切相关。

类似地，我们用orf224蛋白的不育基因，以验证选定的候选基因。前期研究发现不育基因主要与花粉发育和绒毡层相关蛋白互作;因此，我们推断不育基因主要与花粉发育有关。绒毡层发育相关的蛋白质通路导致了绒毡层发育的发生波尔CMS。因此，考虑到我们的结果，我们提出了一个假设来解释的机制波尔CMS的发生与基因恢复的作用。当恢复基因是隐身基因时，它不会干扰不育基因的功能。因此,orf224蛋白会影响与绒细胞发育或花药发育相关的蛋白B. Napus，从而导致花药流产波尔CMS。当恢复系基因占显性时，称为恢复系基因招标公告不能直接剪切mRNA转录本招标公告基因将结合到相应的蛋白，它们一起使atp6 / orf226记录改变;这将导致orf224失去其毒性功能，从而恢复生育能力

随着科学技术的进步，多组学分析被广泛应用于解决生物学问题[38]。多OMICS联合分析可以理解并优先考虑从大数据和多维数据解决问题的问题[39]。本研究采用激光捕获显微解剖技术从绒毡层细胞中提取RNA进行转录组分析，< 1 mm花蕾用于蛋白质组学和代谢组学分析[29]。优异的结果我们后续分析实现和候选基因的筛选。我们获得了参与RNA编辑，电子传递呼吸链[24个候选基因16[表达，通过多OMICS途径的关节分析，表达，能量转化，绦虫发育和氧化磷酸化相关。我们的研究结果表明，糖酵解/葡糖生成途径与三羧酸周期中的能量产生和运输有关[40]。本研究的联合分析发现糖酵解/糖异生途径的相关性分析相当多样化。我们的发现表明，能量变化应该是波尔CMS。利用酵母双杂交系统，我们发现了恢复基因，并发现了参与RNA编辑的蛋白质可能在波尔CMSatp6 / orf224成绩单[29]。此外，共享导致不育基因失去功能。

的波尔CMS恢复基因招标公告编码通常识别和结合细胞器中的RNA序列的PPR蛋白[39]。在之前的研究中波尔CMS，与Northern印迹进行比较，无菌，维护器和恢复系的材料，结果表明原版atp6 / orf224分别与无菌和恢复系分别转录成1.1kb，2.2kb和1.9 kB转录物。但是，在重新引入线材中，两种转录物为2.2kb和1.9 kb显着降低，而同时出现了两个新的转录物1.4kb和1.3 kb41]。因此，我们假设波尔CMS的恢复基因参与的编辑atp6 / orf224mRNA。成绩单atp6 / orf224翻译的orf224蛋白质和orf224已证实对毒性作用大肠杆菌。

此外, orf288在hau CMS中具有毒性蛋白功能，可导致雄性不育[2]。在本研究中，我们定位了三个RNA编辑相关蛋白。通过酵母菌的验证，发现两种与恢复基因相互作用的蛋白质和一种与不育基因相互作用的蛋白质可能参与了切割波尔CMS不育基因atp6 / orf224成绩单（图7b)。

研究发现CMS基因主要由线粒体基因组成，线粒体是生物体内主要的能量供应者[[42，43]]。绝大多数CMS基因是由线粒体排列事件产生的嵌合基因，其中cox1, atp8,ATP6作为不孕症基因;然而，它们中的大多数编码电子传输呼吸链相关蛋白或ATP合酶相关综合体[14，44]。协同转录和电子传递链的正常代谢与能量代谢密切相关[45]。据认为，在玉米T-CMS中，T-URF13在MT膜附近造成不可恢复的损伤，导致膜电位丧失，最终导致线粒体破裂和不育[[10，46]]。在油菜籽oguCMS，不育基因ORF138被发现破坏线粒体膜内的电子传递链，导致花药流产[47]。

在高等植物细胞质雄性不育现象中，线粒体基因突变导致不育。一些作物研究发现绒毡层细胞的早期和延迟降解都可能导致不育。绒毡层是一个分阶段的组织，为小孢子细胞的成熟提供营养和能量。大白菜的组学研究[47]，萨尔维亚[48,强奸49,西瓜50]，和棉花[51]，发现糖酵解/糖异生途径在雄性不育过程中具有重要作用。糖酵解/糖异生途径产生多种碳水化合物和多种酶，与植物的平均生长发育密切相关。然而，由于雄性不育的调控因素复杂，这类基因对雄性不育的具体作用尚未得到分子生物学的证实。然而，通过额外的作物组学测试和分析，糖酵解/糖异生途径与雄性不育密切相关。

同样，在矮牵牛CMS Connett、野生G-CMS甜菜中发现了电子传递呼吸链紊乱和ATP合酶复合体功能中断[42]，和向日葵CMS [52]。这些先前的发现表明CMS蛋白和线粒体电子传输链复合物之间的关联。例如，在水稻CMS系中，无菌基因ORF79.和orfH79导致花药中ATP/ADP比值降低，活性氧增多[15]。我们发现，在花药开发期间的线粒体基因的快速分裂可能导致线粒体功能缺陷，导致男性器官发展的能量供应不足，触发堕胎[52]。所有上述信息都表明线粒体的极端能量不足是CMS的唯一可能原因，但触发了非官能花粉的机制仍未完全理解[53]。研究人员认为CMS蛋白以某种方式与特异性线粒体蛋白结合以实现这种效果，但没有发现相关的候选蛋白质。在我们的差异候选基因中，我们还发现电子转移链相关的蛋白质和能量转移相关蛋白质与恢复基因相互作用，这可能导致生育率的CMS和恢复剂[54];然而，需要进一步的研究和更多的科学证据来证实当前的假设。

采用立体显微镜和扫描电子显微镜观察了不育系和可育系花药和花粉发育的差异B. Napus.．结果表明，不育植株的花粉粒明显收缩、向内弯曲和塌陷，而可育植株的花粉粒表现为正常表型[55]。在我们的研究中，使用半薄部分的透射电子显微镜分析，我们观察到这一点波尔CMS的无菌线材材料表现出异常和崩解。这些异常主要发生在花药开发的第三阶段，并导致孢子源细胞的早期PCD，最终导致L2细胞，外部细胞，内细胞，绦虫细胞和微孔母细胞的异常分化[54，56，57]。本研究在不育植物中鉴定了许多花药发育相关蛋白和绒毡层发育相关蛋白，这些蛋白与不育基因相关。因此，我们得出结论波尔CMS的育种基因导致产生异常的花药和绦虫发育相关蛋白质，这导致了花药堕胎[31]。但是，该项目也有重大缺点。尽管通过组合的多OMICS分析和酵母双杂交实验筛选了几种候选基因，但是其他分子生物学实验和油籽油菜转基因未验证相应的结果。

在综合分析中波尔利用多组学方法筛选了24个差异基因，并将这些差异基因与恢复系进行酵母双杂交检测招标公告不育基因orf224在波尔CMS也在寻找同样的东西波尔CMS的育性改变相关蛋白。最后，我们筛选了7个招标公告相互作用蛋白，其主要功能是RNA编辑、花药发育和绒毡层发育相关的蛋白质相互作用。不育基因orf224蛋白质筛选出五种相互作用的蛋白质;它们的主要功能是电子呼吸传动链，花药开发和氧化磷酸化相关蛋白质。因此，我们推测恢复剂基因招标公告通过形成与上述类型的蛋白质的蛋白质复合物作用于无菌基因，导致无菌基因的功能丧失和生育的恢复。不孕症基因主要与电子呼吸转移链相关的蛋白质相互作用，直接作用于与花药开发有关的蛋白质，或与氧化磷酸化相关的蛋白质相互作用，这影响了花药的发育，并且未能开发最初正常的花粉颗粒。因此，我们通过多OMICS关节分析组合不孕症基因和恢复剂基因筛选了12个候选基因进行后续研究，为分析提供了特定的数据依据波尔同时也为揭示其潜在的分子机制提供了帮助波尔CMS。

样品收集

在实验室中，利用bing409 (pol恢复系)(来源:付廷东教授)和1141A(不育pol系)(来源:付廷东教授)通过13代回交建立了近等基因系(NIL)(来源:杨宗辉博士)。使用这种材料，我们精细地映射波尔CMS恢复基因。在BC8代中，32 kb渗透特异标记扫描定位基因片段，然后通过杂交13代不育系和生殖系进行实验。2018年5月在武汉播种油菜零粒，苗密度控制在20 cm × 40 cm。NIL材料通过多年回交试验，表型为不育系与恢复系的1:1。不育表型和可育表型可以很好地区分。通过石蜡切片观察，我们发现不孕期波尔CMS是花药开发3-4个阶段，提前发生绦虫的降解，导致堕胎[29]。花药发育2 ~ 3期，花蕾大小< 1 mm;因此，我们收集了< 1 mm的花芽，研究了蛋白质组和代谢组。所有采集的样品均用液氮冷冻，保存在−80℃。同时采集同期不育系和可育系的花芽并固定，用于激光显微解剖捕捉，研究单细胞转录组学。本程序旨在进行调查波尔CMS在代谢、蛋白质和转录水平更准确。转录组、蛋白质组和代谢组样品采集建立了三个生物重复，用于组学测序分析。

代谢物提取及加工

样品制备和代谢物提取程序如下：将100±1mg 3-4级的3-4-4℃放入2ml EP管中，0.6ml萃取缓冲液（V._甲醇V:_DH2O= 3:1)，然后加入20 μL阿多尼醇(dH中原液1 mg/mL)₂o）根据内标。使用的柱是水处理UPLC HSS T3 C18（1.8μm，2.1mm×100mm。使用的流动相如下：相A，纯水（含有0.04％乙酸）;相B，乙腈（含0.04％乙酸酸）。洗脱梯度计划如下：0.00-10.00分钟0％B; 10.00-11.00分钟95％B; 11.00-11.10分钟，5％B; 11.10-14分钟，维持在5％B.“10.00 min, B’s ratio increased linearly to 95% and remained at 95% for 1 min. From 11.00 to 11.10 min, B’s ratio decreased to 5% and maintained till 14 min. The elution conditions were as follows: The flow rate is 0.35 mL/min; the column temperature is 40 °C; the injection volume is 4 μL. The mass spectrometry conditions are as follows: the electrospray ionization temperature is 550 °C; the electrospray ionization temperature is 550 °C. Mass spectrometer voltage, 5500 V; curtain gas 30 psi; collision induced dissociation parameters [58]。基于Triple四极其中的最佳交叉电位和碰撞能量来扫描每个离子对进行检测。使用武汉Metuke Biotechnology的广泛的目标代谢型方法进行代谢分析[59]。中国(武汉)(http://www.metware.cn/)．

无实验室蛋白质组检测方法

花药是液氮中的第一个研磨。将粉末转移到5mL离心管中，并使用高强度超声处理器（Sanchez-Puerto等，2015）在裂解缓冲液中（含有1％TritonX-100,10mM二硫代噻γ醇，1％蛋白酶抑制剂鸡尾酒，50μmpr-619,3μmtsa，50 mm nam和2 mm EDTA）。加入等体积的苯酚（pH8.0），然后将混合物进一步旋转5分钟。离心（4℃，10分钟，5000×g）后，将上酚相转移到新的离心管中。通过加入至少四个体积的硫酸铵饱和甲醇沉淀蛋白质，然后在-20℃下孵育至少6小时。在4℃下离心10分钟后，弃去上清液。用冰冷的甲醇洗涤剩余的沉淀物，然后用冰冷的丙酮洗涤三次。在8米尿素中重新溶解蛋白质，并使用BCA试剂盒根据制造商的说明确定蛋白质浓度。

将胰蛋白酶肽溶于0.1%甲酸(溶剂a)中，直接上载于自制的反相分析柱上(柱长15 cm, 75 μ m)。梯度从6% B增加到23% B(0.1%甲酸在98%乙腈)在26分钟，从23到35%在8分钟，上升到80%在3分钟，然后保持80%在easy-nlc 1000 UPLC系统。最后3分钟的流速为400 nl / min。多肽从NSI来源加工，然后在在线连接到UPLC的Q ExactiveTM Plus (Thermo)中进行串联质谱(MS/MS)。电喷雾电压为2.0 kV。完整扫描的m/z扫描范围为350 ~ 1800，在Orbitrap中以70000的分辨率检测到完整肽。然后用NCE设置28筛选多肽进行MS/MS，在Orbitrap中以17500的分辨率检测这些片段。数据依赖进程在一次MS扫描后执行20 MS/MS扫描，动态消除时间为15.0 s。自动增益控制(AGC)设置为5E4。固定的第一质量设置为100米/z [60]。

用质谱技术检测每个样品中相应蛋白的信号丰度。通过非标准定量计算方法得到每个样品中蛋白质的LFQ强度，根据不同样品之间的蛋白质LFQ强度得到每个样品的相对定量值。第一步是计算比较组中两个样本的蛋白差异表达。首先计算每个样本在多次重复中定量值的平均值，然后计算两个样本的平均值之比，以此作为对照组的最终微分表达式。第二步是计算显著性P- 蛋白质在两个样品中的差异表达。首先，将每个样本的相对定量值取为log2（以使数据符合正态分布），然后使用双样本双尾T-test方法来计算ap价值。什么时候p-value< 0.05，以差异表达超过1.5的变化作为显著上调的变化阈值，显著下调的变化阈值小于1/1.5。

基因被基因本体学注释分为三类：生物过程，细胞室和分子功能。随着纠正的方式p< 0.05的值被认为是重要的[61]。基因和基因组（Kegg）数据库的百科全书用于鉴定通过双尾Fisher的精确测试来鉴定富集途径，以测试所有鉴定的蛋白质的富集的富集[62]。路径与纠正p-value < 0.05被认为重要。

单细胞转录组测序使用微量键测序

利用激光显微解剖技术从组织切片中分离单细胞或细胞器。操作者在显微镜下观察组织切片，定位目标细胞，在计算机显示屏幕上标记目标细胞区域，然后用激光切割区域提取[52]。

首先将花蕾切片分别用75、85和95%乙醇在58°C水浴中处理90 s，然后用正丁醇和无水乙醇以1:1和3:1的不同比例在58°C下处理2次，各90 s。最后，用正丁醇在58℃下处理90 s完成微切口材料的预包埋处理。将样品在65℃石蜡中浸泡3次，分别浸泡30 min、60 min、90 min，然后放入包埋盒中。玻片用RNase和75%乙醇处理。截面的厚度是根据处理材料的深度来选择的。花芽切片宽度为16 μm。

将单细胞样品收集在含有裂解成分和核糖核酸酶抑制剂的试管中。然后使用Smart-Seq2方法进行扩增[63]。将寡聚-DT引物引入逆转录反应的逆转录反应中，用于第一链CDNA合成，然后通过PCR扩增来富集CDNA和磁珠纯化步骤以清洁合成材料。接下来，通过Qubit®3.0荧光计和Agilent 2100 BioAnalyzer（Thermo Fisher Scientific）检查cDNA产物，以确保长度约为1-2 kBp的预期输出。随后，通过超声波随机剪切cDNA，用于Illumina文库制剂，包括DNA碎片，末端修复，3'末端A尾，衔接子连接，PCR扩增和文库验证。PerkinElmerlabchip®GX触摸和步骤OnePlus™实时PCR系统被引入了图书馆准备后的图书馆质量检验。然后将合格的库加载到Illumina Hiseq平台上进行PE150测序。

酵母2台混合动力分析

恢复基因的全长CDNA招标公告和无菌基因orf224扩增并克隆到诱饵载体pGBKT7中，候选基因分别克隆到猎物载体pGADT7中。将诱饵载体pGBKT7和猎物载体pGADT7构建的载体共转化到酵母株AH109受体细胞[64]。

RNA提取，逆转录PCR

参照试剂制造商的说明，我们使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA从羽衣甘蓝型油菜，再悬浮于无RNA酶的水的RNA，并用无RNA酶的DNA酶I（Fermentas公司热）处理它。用DNase I消化处理之后，PCR扩增被用来确认DNA污染的消除。然后，我们逆转录使用M-MLV逆转录酶（Invitrogen）和随机引物（Fermentas公司热），以获得的cDNA消化的RNA。的cDNA使用SYBR Green我用基因特异性引物上的光循环仪480（Roche）的扩增。实时定量PCR使用与基因特异性引物的SYBR Green I主PCR试剂盒检测的羽衣甘蓝型油菜基因的表达[上的光循环仪480（Roche）的执行65]。

与本文相关的原始转录组测序数据被存储在NCBI数据库SRA与提交ID SUB8446872（https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)及生物工程编号PRJNA673655(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA673655),审稿人链接:https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/prjna673655?reviewer=5lfjtb644f2dg76db7tat7pvvh.．本文及其附件中还包括本文结果的其他数据。

PPR：

Pentatricopeptide重复

CMS:

细胞质雄性不育

PCD：

编程细胞死亡

走:

基因本体论

Kegg：

基因和基因组的百科全书

PCA：

主成分分析

衣冠楚楚的:

差异丰富的蛋白质

可见：

差异表达基因

ESP：

内膜间接异常蛋白

感谢王学禄教授和石春梅教授在激光光纤切割方面的帮助;天车生物(https://www.ptmbiolabs.com/)寻求蛋白质组的帮助，武汉迈特生物科技有限公司(https://www.metware.cn/)以帮助代谢组，以及Anogene (http://www.genome.cn/)寻求单细胞转录组的帮助。感谢胡凯宁博士在生物信息学分析方面的帮助。感谢Editage (www.editage.cn）英语语言编辑。

该项目得到了中国国家重点研发计划（2016年FD0100804）和中国国家自然科学基金的支持，支持该项目（授予第31871701,31930032号）。资金代理商在研究设计，数据收集，分析或数据解释中没有作用。

隶属关系

1. 作物遗传改良油菜改良，华中农业大学国家中心，武汉，430070，中国国家重点实验室

   Benqi Wang，Zunaira Farooq，Lei Chu，Jie Liu，Huadong Wang，Jian Guo，Jinxing Tu，Chaozhi Ma，Cheng Dai，Jin Wen，Jinxiong Shen，Tingong Fu＆Bin yi

贡献

ZF负责文章修改和RNA提取，CL负责取样和酵母双杂交实验，LJ、WH和GJ负责工作的设计、数据的获取、分析和解释;TF教授，ZY博士。为实验材料JT提供种子。,厘米。，CD., JW., and JS. Provided a flexible research platform and environment, and BY., he conceived and designed the experiments. All authors have read and approved the manuscript.

相应的作者

对应于宾义．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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