SiFBA5是一种冷响应因子gydF4y2Ba索尿涉及gydF4y2Ba在冷应力下促进转基因番茄植物的冷弹性和生物量增加gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

索尿涉及gydF4y2Ba在极端的北极状况中存活，非常耐冷。该物种在岩石，山区的巨大山区增长，海拔2400-4100米，周围地覆盖着冰雪覆盖，受到冻结温度。gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba光合效率特别高，为分析植物的冷胁迫反应提供了一个极好的模型和丰富的基因库。果糖- 1,6 -二磷酸醛缩酶(FBA)是光合作用过程中的关键酶，在糖酵解和糖异生过程中介导果糖- 1,6 -二磷酸(FBP)转化为二羟基丙酮磷酸(DHAP)和三磷酸甘油(GAP)。潜在的分子机制gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba中国的抗冷能力尚不清楚;因此，本研究旨在探讨FBA在植物冷胁迫反应中的作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，我们鉴定了一种冷敏感基因，gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba，基于初步低温，基因组范围的转录分析gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba．表达分析表明寒冷的温度迅速诱导转录表达gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba，建议gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba参与初始压力响应。亚细胞定位分析显示gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba局限于叶绿体。过度表达的转基因番茄植株gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba是使用gydF4y2BaCAMV.gydF4y2Ba35s启动子。表型观察表明，与野生型植物相比，转基因植物的耐寒性和光合效率增加。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

冷胁迫对作物产量有不利影响。我们的结果表明gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba积极调节对冷应激的植物反应，这对于在冷应力条件下增加作物产量具有重要意义。gydF4y2Ba

Calvin循环是光合碳固定的关键部分，为植物存活提供必要的化合物[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba那gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．这个过程与各种催化反应有关，并分为三个不同的阶段:固定碳、还原和起始分子的再生[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．据报道，在温和的光照和温度条件下生长的植物可以承受50%以上的核酮糖- 1,5 -二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的降低，而对光合作用的影响很小。相反，在强光条件下，Rubisco活性降低与光合作用降低有关[gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba]．Rubisco并不总是在Calvin循环期间最活跃的酶，其他酶可能在光合作用期间施加更大的控制，特别是Sedoheptulose-1,7-双磷酸酶（SBPase），转铁糖糖苷酶（TK）和果糖-1,6-二磷酸醛糖酶（FBA）。因此，这些酶是用于增加光合碳固定的努力的候选者[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

FBA是一种关键代谢酶，其在糖酵解和糖苷期间介导果糖-1,6-二磷酸酯（FBP）的可逆转化为果糖-1,6-二磷酸酯（FBP）和甘油醛-3-磷酸（间隙）[gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba]．在卡尔文循环中，FBA还可以催化红-4-磷酸和GAP的sedoheptulos -1,7-二磷酸的缩合[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba]．反义抑制和光合作用模拟研究表明，FBA可在Calvin循环中控制碳代谢率和核糖糖-1,5-二磷酸（RUBP）再生中发挥重要作用[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba那gydF4y2Ba11gydF4y2Ba那gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．烟草实验(gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba）表示过表达gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba可以促进RUBP再生，同时略微增加增长和生物量生产率[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba]．此外，番茄（gydF4y2BaSolanum lycopersicumgydF4y2Ba)表明,gydF4y2BaSlFBA7gydF4y2Ba过度表达在钙氏循环中增加了几种主要酶的活性，以及​​净光合速率（PN），种子尺寸和茎直径[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

FBA也参与了植物冷应力反应。例如，冷应力上调gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba家庭成员gydF4y2Baclaldc.gydF4y2Ba表达gydF4y2Ba党参生长状况gydF4y2Ba[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．有趣的是，这gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba家人对冷治疗不同的反应gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和米饭（gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba那gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．尽管对几种模型植物和商业作物进行了广泛的研究，但很少有研究则探索了作用gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba在更极端的栖息地。gydF4y2Ba

S. vollucrata.gydF4y2Ba常年高山植物耐受极冷应激[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．尽管生命周期很短，gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba可以积累实质性生物质，并且已经进化了与耐寒耐耐力有关的许多基因[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．最近，完成了转录组测序和广泛的生物信息学分析gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba，为我们提供确定具体的机会gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba与之相关的基因gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba冷应力耐受性[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．在本研究中，我们使用农杆菌介导的转化来构建番茄植物的转基因系，以研究推定的功能gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba基因[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

孤立gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba从gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba

SIFBA5.gydF4y2Ba从转录组测序中鉴定cDNAgydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba．使用基因特异性引物获得全长cDNA [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．测序分析显示开放阅读框架（ORF）gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2BacDNA（1179bp）编码392-氨基酸蛋白，分子量为42.57kda和8.84的等电点（pi）（图gydF4y2BaS1gydF4y2Ba-gydF4y2BaS2gydF4y2Ba）.多个序列对齐显示gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba分享75.2％，74.9％和70.2％与辛辣同源物相似gydF4y2Baccfba3.gydF4y2Ba那gydF4y2BaLSFBA3.gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaHAFBA3.gydF4y2Ba， 分别;因此，基因高度保守（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).该基因还显示了参与醛醇缩合的I类醛醇酶的典型赖氨酸残基。系统发育分析表明gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba与同性恋密切相关gydF4y2BaAtFBA3gydF4y2Ba，叶片FBA（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab）。这一结果表明gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba定位于叶绿体。gydF4y2Ba

的表达模式gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba

调查如何gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba响应冷压力，gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba五叶阶段的玫瑰花在4℃下暴露于1,3,6,12和24小时。1小时后，相对表达gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba在逐渐下降之前增加10倍（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。这种快速和强烈的表达诱导表明gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba参与对冷压力的初始反应。gydF4y2Ba

亚细胞本地化gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba

狼Psort（gydF4y2Bahttps://wolfpeort.hgc.jp/gydF4y2Ba），yloc（gydF4y2Bawww.multiloc.org/yloc.gydF4y2Ba)和MultiLoc2 (gydF4y2Bahttp://www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/services/multileC2.gydF4y2Ba)预测,gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba亚细胞定位是在叶绿体中。为了测试这一预测的稳健性，我们构建了一个SiFBA5-GFP融合蛋白，并使用共聚焦显微镜检测它的存在gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba叶细胞。我们证实SiFBA5-GFP定位于叶绿体（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。所以，gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba可能参与Calvin循环，并且在光合碳通量期间可能与下游基因调节有关。gydF4y2Ba

转基因的冷应激反应gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba超表达行gydF4y2Ba

揭示…的功能作用gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba，构建了在35S启动子控制下的番茄过表达系。PCR分析验证了转基因整合。在常温条件下(25°C)，过表达系和野生型的生长没有差异，表明过度表达gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba不会引起异常表型（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.然而，在耐寒性测定（4°C）期间，野生型植物表现出稀疏和下垂的叶子，以及弯曲的侧枝，而过度抑制gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba植物没有。此外，在0℃下，野生型叶片卷曲并呈颜色加深，而转基因叶不再是可行的（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

转基因植物在冷胁迫下的生理变化gydF4y2Ba

冷应力导致植物细胞中反应性氧物质（ROS）和氧化损伤过量生产。在冷胁迫条件下（4°C），过度表达系呈显着较少较少的丙二醛（MDA）积累而不是野生型（gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05) (Fig.4.gydF4y2Baa).由于MDA是ros诱导的脂质过氧化的产物，这一结果表明植物在氧化应激时受到的影响较小gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba过度表达。然后，我们测定了三种主要抗氧化酶（超氧化物歧化酶，SOD;过氧化氢酶，猫，猫，POD）的活动，以研究这种变化的原因。在正常条件下转基因和野生型植物之间的SOD活性没有显着差异，但在冷应激下，SOD活性显着增强（gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05) (Fig.4.gydF4y2Bab）。此外，我们发现与冷应力下的野生型相比，转基因系中的豆荚活性显着增加（gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05) (Fig.4.gydF4y2Bac).随着温度的降低，CAT活性的下降幅度大于SOD和POD活性的下降幅度。转基因和野生型植物的CAT活性也有显著差异，前者的CAT活性低于后者(gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05) (Fig.4.gydF4y2Bad）。我们的结果表明gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba过表达通过减少MDA积累和增强抗氧化酶活性，抑制冷应力下的ROS损伤。gydF4y2Ba

的影响gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba关于光合和叶绿素荧光因子gydF4y2Ba

我们通过测定净光合速率(Pn)的变化来深入研究冷胁迫如何改变光合效率。结果表明，正常条件下，转基因植株和野生植株的Pn无显著差异。然而，在10℃和4℃下，过表达系的Pn显著高于野生型(gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.01) (Fig.4.gydF4y2BaG）。根据这种升高的光合作用观察gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba转基因植物中的过表达，芽和根干生物量分别在84.34和40.14％中大于野生型（gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.01) (Fig.4.gydF4y2BaH）。我们还观察到过表达系中的总叶绿素含量明显高于16°C和10°C（gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05) (Fig.4.gydF4y2Bae）。最后，我们测量了PSII光化学（FV / FM）的最大效率，反映了PSII PhotoInibituct。在里面gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba过表达系，Fv/Fm大于野生型(gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05) (Fig.4.gydF4y2Baf)，表明冷胁迫对转基因植物的PSII复合体没有损伤。gydF4y2Ba

SIFBA5.gydF4y2Ba对其他卡尔文循环酶的过表达效应gydF4y2Ba

我们分析了参与光合作用调节的几种酶的表达:gydF4y2BaRubisco，SBPase.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba果糖-1,6-双磷酸酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaFBPasegydF4y2Ba），gydF4y2Baglyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba）， 和gydF4y2Ba三糖-3-磷酸异构酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaTPI.gydF4y2Ba）.转基因株系均表现出显著的高表达gydF4y2Barbcl.gydF4y2Ba和gydF4y2BaRBCS.gydF4y2Ba（Rubisco大小和小亚基）比野生型在4°C（gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05) (Fig.5.gydF4y2Baa，b）。此外，gydF4y2Basbpase.gydF4y2Ba那gydF4y2BaFBPasegydF4y2Ba那gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba， 和gydF4y2BaTPI.gydF4y2Ba转基因系中表达显着高于野生型（gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05) (Fig.5.gydF4y2BaC-F）。gydF4y2Ba

植物是无梗，不能避免通过移动造成损坏的环境，因此他们已经进化了一系列基因来应对压力。以前的研究发现，使用农杆菌介导的转化gydF4y2Ba波斯核桃（Juglans Regia）gydF4y2Ba体细胞胚胎可以增强植物的抗性反应，并有助于更好地出现消费者的内核[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]．冻害是作物损失的主要原因和限制因素。对核桃抗寒机理和抗寒适应方法的研究较多[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

因此，本研究旨在开发gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba基因gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba并将其转移到番茄植物中。果糖-1,6-双磷酸醛糖酶对植物中的碳代谢至关重要，在糖酵解，葡糖生成，戊糖磷酸盐途径等过程中发挥作用，以及Calvin循环[gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba]．多种植物物种的研究充分展现了关键作用gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba在调节植物胁迫耐受性，生长和发展方面[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba14gydF4y2Ba那gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba]．据我们所知，本研究是第一项研究的研究之一gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba在极端栖息地特有的植物中发挥作用gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba，即使在低于低于-21°C的温度下也可以存活[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．转录组分析gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba确定了15gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba基因转录物，其中三个响应于冷应激（数据未显示）上调。我们选择了gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba在这里进行进一步分析。生物信息学分析显示gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba蛋白质与其他物种的FBA同源物高度相似。与低温转录组图谱一致，低温胁迫显著增加gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba转录性丰富。系统发育分析gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba表明与植物叶绿体FBAs具有高度同源性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba、大米、烟草和番茄[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba13gydF4y2Ba那gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．在高等植物中，FBAs有两种同工酶:胞质和叶绿体[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba[后者是否参与了Calvin循环。在土豆中，抑制叶绿体FBA抑制光合作用[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．此外，SiFBA5-GFP融合蛋白定位于叶绿体(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。我们的gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba- 与低温暴露的野生型植物相比，无表达转基因系揭示了改善的光合效率和耐寒性。gydF4y2Ba

我们还成功地确定了涉及冷应激反应的一些生理过程，例如MDA生产增加。因此，我们在野生类型中测试了MDA内容gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba- 冷应激下的过表达转基因系，显示MDA含量的降低gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba- 相对于野生型转基因线（gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05). These results indicated thatSIFBA5.gydF4y2Ba-过表达的植物具有较低的氧化应激(图。gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba) (gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．此外，在冷应激下，转基因植物的SOD，豆荚和猫活性明显高于野生型。这三种酶是抗氧化防御系统的一部分，其在植物中演变以抵消ROS诱导的氧化损伤（例如，脂质过氧化）[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．假定非生物胁迫增加了这些酶的活性;我们推测过度表达gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba可以消除细胞中的过量RO，提供防止氧化损伤。gydF4y2Ba

低温降低植物利用光能的能力，并增加冷敏感植物的光抑制[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．一些数据表明，光合作用通过醛缩酶表达减少而受到抑制[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．另一个研究发现gydF4y2BaAtFBAgydF4y2Ba过表达特异性促进RuBP再生，COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba固定效率，转基因烟草中的光合速率[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba]．我们的结果表明gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba冷应力下的过度表达线构成升高gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba在叶绿体中的表达和促进的Rubisco表达，增强了RUBP再生，导致加速RUBP代谢。这些变化然后促进整个光合途径。转基因植物的个体FBA的变异表明，C3周期的再生能力将局限性对光合速率进行局限性[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

冷应力降低FV / FM，使后者是筛选冷耐耐耐力的重要变量[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]．我们的研究证实，冷胁迫降低了Fv/Fm，导致植物不能有效利用激发能，从而降低了PSII光化学效率。在低温胁迫下，转基因植株的Fv/Fm高于野生型。在低温胁迫诱导的光合速率减缓后，维持较高的Fv/Fm的能力能够增强光合作用。我们还发现了叶绿体的过度表达gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba在冷应力下略微增加Pn，但不在正常温度下。因此，延长暴露于冷应激似乎减少gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba转录，但过度表达gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba部分补偿FBA损失，这与来自马铃薯的数据一致[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]和西红柿[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

我们成功克隆了gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba从gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba并将基因产物鉴定为醛糖酶。过度表达gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba在低温胁迫条件下，减轻了番茄的细胞损伤，提高了抗寒性，提高了光合能力。我们的数据为应用提供了理论基础和实验依据gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba在发展中gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba种质资源。此外，该基因是一个强有力的候选基因工程，以提高作物产量和抗逆性在寒冷气候。gydF4y2Ba

植物材料和治疗gydF4y2Ba

S.包括劳动力gydF4y2Ba种子是新疆益鲁县浙江省珠民县林业局的礼物。幼苗的gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba使用植物组织培养技术培养并置于19°C的玻璃盆中，具有16小时光/ 8小时深色光周期。gydF4y2Ba

尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba在26℃/ 12h在22℃下在26℃/ 12h黑色的光周期下，在22℃下，在12小时的光周期下在3：1泥炭藓和蛭石和蛭石土（v / v）的罐中生长。gydF4y2Ba

用75%乙醇1 min、2% v/v次氯酸钠15 min对番茄(雅馨87-5)种子进行表面消毒，用无菌蒸馏水冲洗6次。种子播种在1/2 Murashige和Skoog (MS)培养基上。种子在25°C，日光灯下光照16 h /暗8 h循环培养一周。取7-d龄幼苗的子叶外植体gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba转型。对于冷处理，五叶阶段的玫瑰花叶片分别暴露于4℃，分别为4℃，3,6,12和24小时。将所有组织样品在液氮中冷冻并储存在-80℃。gydF4y2Ba

RNA分离和QRT-PCRgydF4y2Ba

用三唑分离的总RNAgydF4y2Ba美国involucratgydF4y2Bae和番茄，遵循制造商协议。PrimescriptTM RT试剂盒（Takara，中国）用于第一链cDNA合成。使用LightCycler®480SYBRGreen I Master Mix（Roche Diagnostics）在轻循环仪480系统（Roche Diagnostics，德国）中进行定量实时PCR（QRT-PCR）。热循环方案为40℃，10s，60℃，20s，72℃，30秒为40℃。用2计算相对表达gydF4y2Ba^{——ΔΔCtgydF4y2Ba}方法。每个表达谱系以三份独立验证。QRT-PCR引物显示在补充表中gydF4y2BaS1gydF4y2Ba．我们用了gydF4y2Ba美国involucratgydF4y2BacDNA放大gydF4y2BaFBA.gydF4y2Ba来自番茄的基因和cDNA检测相关基因的表达。实验表示为三种复制的平均值。gydF4y2Ba

孤立gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba基因gydF4y2BaS. vollucrata.gydF4y2Ba

这gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba基因序列是从gydF4y2Ba索尿gydF4y2BaKBase（gydF4y2Bahttp://www.shengtingbiology.com/saussureakbase/index.jsp.gydF4y2Ba。）。使用基因特异性引物SIFBA5-F和-R（补充表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba）.gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2BacDNA连接到pMD®19-T简单载体(TaKaRa，中国)和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α感受态细胞(中国TransGen);通过Sanger测序(华大基因，北京，中国)验证克隆成功。所有后续构造都使用这个克隆作为模板。gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba在NCBI中使用BLASTP鉴定基因同源物（gydF4y2Bahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi.gydF4y2Ba）.使用默认参数和DNAMAN在ClustalX2中进行多序列比对。然后在MEGA 5.0中对序列进行调整以构建系统发育树。gydF4y2Ba

DNA构建体gydF4y2Ba

的编码区gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba使用引物G-SiFBA5-F和-R进行扩增，具有适当的限制序列（表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba）.PCR产品被消化gydF4y2BaBamHgydF4y2Ba我和gydF4y2Ba萨尔gydF4y2Ba我，然后用多个克隆网站（MCS）连接gydF4y2BapCAMBIAgydF4y2Ba2300二进制矢量，含gydF4y2BaGFP.gydF4y2Ba作为记者，在gydF4y2Ba花椰菜马赛克病毒gydF4y2Ba35s（gydF4y2BaCAMV.gydF4y2Ba35s）启动子[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．构造gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba亚细胞定位是通过帧内融合完成的gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba终止密码子TAG被删除gydF4y2BaGFP.gydF4y2Ba．生成过表达构造，gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Baorf被克隆到了gydF4y2BapCAMBIAgydF4y2Ba2300矢量在控制之下gydF4y2BaCAMV.gydF4y2Ba35s启动子。插入件从PMD19-T-释放gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba通过gydF4y2BaSMA.gydF4y2Ba我和gydF4y2Ba萨尔gydF4y2Ba我消化，然后连接到gydF4y2BapCAMBIAgydF4y2Ba2300 MCS。结构被引入gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba拉紧gydF4y2Bagv3101gydF4y2Ba通过使用基因脉冲层II系统（Bio-rad，Hercules，Ca，USA）的电穿孔。gydF4y2Ba

植物转化gydF4y2Ba

这gydF4y2Ba35 s:: SiFBA5gydF4y2Ba载体分别被引入番茄中的过度表达线。选择无菌，坚固的番茄幼苗，具有完全扩张的子叶，切断子叶的两端，然后将它们从叶子的中间分成两个。使用叶片作为遗传转化的外植体，并在MS + 2 mg / L 6-BA + 0.15mg / L IAA培养基上用背面，深色培养物涂抹2天。转化为番茄，用子叶作为外植体，随后发表了公布的协议[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]．诱导愈伤组织和芽再生。然后在添加不同浓度植物生长调节剂和抗生素的MS培养基上筛选外植体。在含卡那霉素(50 mg L)的选择性培养基上再生芽gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}）.根系抗卡那霉素的初级转化植株(5-10 cm高)转移到盆栽土壤;年代gydF4y2BaIFBA5.gydF4y2Ba通过PCR得到证实。这gydF4y2Ba35s :: sifba5-gfpgydF4y2Ba将载体引入烟草中，用于亚细胞定位实验，第三到第五个最小的叶子三到四周gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba注入了（大约8-10叶阶段）gydF4y2Ba与农杆菌gydF4y2Ba- 使用1ml注射器压制GFP融合蛋白。在生长室中孵育后2-3d孵育，激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss，德国）用于在烟叶中的GFP荧光图像。gydF4y2Ba

压力治疗gydF4y2Ba

胁迫处理是在25°C、16 h/8 h(光/暗)光周期的土壤中生长9周后开始的。研究…的作用gydF4y2BaSIFBA5.gydF4y2Ba在耐冷条件下，野生型和转基因番茄植株(Percival Scientific, USA)在12/12 h光照(25°C)/黑暗(22°C)、中等光照强度和50-60%相对湿度的条件下培养一周。然后将野生型和转基因番茄植株分别在16℃、10℃和4℃进行3 d的冷胁迫，然后将植株置于0℃的冷室中过夜。gydF4y2Ba

生理测量gydF4y2Ba

测定了冷胁迫处理后不同阶段的生理特性。如前所述，应激诱导的氧化损伤分析使用丙二醛测定法[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]．硝基蓝四唑（NBT）光电凝固方法用于估计SOD活性[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．接下来，通过在Guaiacol氧化期间监测470nm的吸光度的增加来确定POD活性[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．最后，通过监测下降来测定猫活动gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1分钟内吸光度（240nm）[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．通过一些修改的先前方法按照先前的方法测量总叶绿素含量[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．我们将0.1g叶片组织称为碎片，用乙醇提取总叶绿素：丙酮：hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO（4.5：4.5：1）并通过紫外分光光度法分析。gydF4y2Ba

气体交换和叶绿素荧光gydF4y2Ba

使用便携式光合作用系统Li-6400（USA，USA）检测净光合作用和气孔电导。用迷你PAM叶绿素荧光计（Waltz，德国）测量叶绿素荧光[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有数据都表示为三种复制的平均值。SPSS.gydF4y2Ba_{13.0gydF4y2Ba}软件（SPSS，芝加哥，USA）用于比较对照和转基因系中的MDA含量，SOD活性，豆荚活性，猫活性或相对基因表达。单向差异分析，然后是Tukey的诚实性差异（gydF4y2BaP.gydF4y2Ba < 0.05 andP.gydF4y2Ba < 0.01) multiple comparison tests were used to determine the significant differences. Error bars in all figures represent standard deviations from the mean. SigmaPlot_{12.0gydF4y2Ba}用来生成数字。gydF4y2Ba

本研究过程中产生或分析的所有数据均包含在本发表的文章及其补充信息文件中。此外，在合理的要求下，通信作者可以提供原始图像(朱建波，gydF4y2Bazhujianboshzu@163.com.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量实时PCRgydF4y2Ba

SBPase：gydF4y2Ba

Sedohepleplulose-1,7-双磷酸酶gydF4y2Ba

TK:gydF4y2Ba

转酮醇酶gydF4y2Ba

功能性:gydF4y2Ba

的特性,6-Bisphosphate醛缩酶gydF4y2Ba

FBP：gydF4y2Ba

果糖-1,6-双磷酸盐gydF4y2Ba

DHAP：gydF4y2Ba

二羟丙酮磷酸gydF4y2Ba

差距:gydF4y2Ba

甘油醛-3-磷酸盐gydF4y2Ba

RuBP:gydF4y2Ba

丝纤维-1,5-二磷酸gydF4y2Ba

Pn:gydF4y2Ba

光合速率gydF4y2Ba

多发性硬化症：gydF4y2Ba

Murashige和斯库gydF4y2Ba

ROS：gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

MDA：gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

猫：gydF4y2Ba

催化剂gydF4y2Ba

荚：gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

MCS：gydF4y2Ba

多个克隆网站gydF4y2Ba

NBT：gydF4y2Ba

硝基蓝色四唑唑唑gydF4y2Ba

感谢新疆乌兰乌苏农业气象实验站站长王金为我们提供了叶绿素荧光和光合作用检测仪器。gydF4y2Ba

该工作得到了国家科学基金会项目（31360053）和中国国家主要转基因项目（2019ZX08005-004-009）的支持。资金机构在研究和收集，分析和解释方面没有作用，数据和撰写手稿。gydF4y2Ba

作者笔记gydF4y2Ba

1. 穆建强、傅亚娟对这项工作贡献相当。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，新疆石河子832003gydF4y2Ba

   穆建强，刘不仓，张瑶，王爱英，李玉霞，朱建波gydF4y2Ba

2. 南方科技大学生物系，广东深圳518055gydF4y2Ba

   建强穆和雅娟福gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

JZ、JM和YF策划了实验，并对手稿的撰写做出了重要贡献。JM、YF、BL、YZ进行了实验。AW和YL进行了一些实验。所有作者都已阅读并批准了最终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba简帛朱gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

植物材料（gydF4y2Ba索尿制剂gydF4y2Ba）在本研究中使用的是来自我们的实验室（农业生物技术重点实验室，生命科学学院，石河子大学生命科学学院，新疆石河832003;电子邮件gydF4y2Bazhujianboshzu@163.com.gydF4y2Ba）.所有植物材料都是免费提供的。gydF4y2BaS.包括劳动力gydF4y2Ba在本实验中使用的是我们实验室中的组织培养植物，它不是濒危物种。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba