中几丁质酶基因的全基因组鉴定gydF4y2Bathalassiosira pseudonanagydF4y2Ba并分析其在非生物胁迫下的表达gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

含氮多糖甲壳素是地球上的第二个最丰富的生物聚合物，并且在硅藻的细胞壁中发现，用作Biosilica沉积的支架。硅藻土是海洋环境中的碳和氮的重要来源，但令人惊讶的是抗硅藻中的基本几丁质酶代谢而令人惊讶的少。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这里，我们鉴定了24个几丁质酶基因的模型中心硅藻gydF4y2Bathalassiosira pseudonanagydF4y2Ba．我们证明了在非生物胁迫下它们的表达广泛上调，尽管几丁质酶本身的活性保持不变，我们讨论了对这一结果的几种解释。我们还研究了内含子丰富的潜在转录复杂性gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因并为其演进过程中的两个单独串联复制事件提供证据。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

鉴于乌龟和甲壳素衍生物在缝合线生产，伤口愈合，药物递送等过程中的许多应用，新的脑电图新陈代谢的新洞察力都具有理论和实用的价值。gydF4y2Ba

几丁质，β-1,4-连接gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Cetyl-D-葡糖胺，是纤维素后地球上最丰富的天然聚合物。甲壳素在昆虫和甲壳类动物外骨骼，软体动物内骨架和真菌和硅藻的细胞壁中发现[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]. 几丁质及其衍生物，壳聚糖，用于缝合线生产，伤口愈合，药物输送，载体，支架和其他应用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．甲壳素有三种主要的晶体结构:α-、β-和γ-甲壳素[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．其中，β-甲壳素显示了一种平行的多糖结构，与其他两种甲壳素相比，具有更大的反应性、溶胀性和溶解度[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．β-几丁质只存在于某些海洋生物中，包括软体动物[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba[窃贼] [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba、硅藻[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

硅藻是占主导地位的初级生产者，占海洋初级产品的40%，占全球每年固碳量的20% [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．甲壳素是硅藻细胞壁内的基本结构，用作Biosilica沉积的支撑支架[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．已经提出了灵活的几丁质刺来控制细胞浮力或下沉[gydF4y2Ba12gydF4y2BaChitin可以在促进细菌的粘附等硅藻细胞周围形成网络，例如gydF4y2Ba副溶血弧菌gydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．甲壳素是一种含氮多糖，是海洋环境中重要的碳、氮来源。有人认为，如果几丁质停止循环，这两种元素将很快从海洋中消失[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．到目前为止，在两个硅藻属中已经对甲壳素代谢进行了研究，gydF4y2BaThalassiosira.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCyclotellagydF4y2Ba，由于它们的基因组测序完成[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

作为已知的β-几丁质生产商，中心硅藻被认为含有催化几丁质生物合成和降解的特殊酶。几丁质酶（ec3.2.1.14）是一类最大的水解酶，能将几丁质分解成蛋白质gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰氨基葡萄糖。几丁质酶及其衍生物在农业、致病性、致敏性和健康等方面有着广泛的应用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．从不同王国的不同王国的不同生物中发现了几丁酶，从细菌和高等植物到动物[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．它们基于其催化结构域的序列同源性分为糖基水解酶18和19（GH18和GH19）[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．GH18几丁质酶广泛分布于病毒、细菌、真菌、酵母、植物和动物等生物体中，而GH19几丁质酶几乎只存在于植物中[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．两章替纳酶家族具有明显的序列特征和不同的三维（3D结构，表明它们已从不同的祖先中降临[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．刘等。（2018）描述了东方果蝇中几丁酶酶的序列同源性，域架构和基因表达模式，并提出了他们推定的生理功能[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．Chen et al.(2018)研究了几丁质酶基因家族gydF4y2Ba芸苔属植物拉伯gydF4y2Ba并研究了它在根根病抗性中的作用[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．Bartholomew等人(2019)鉴定了黄瓜几丁质酶基因，并描述了它们的进化和对其的反应gydF4y2Ba尖孢镰刀菌gydF4y2Ba［gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．gydF4y2BaCAO＆TAN（2019）研究了番茄三胰酶基因家族及其反应gydF4y2Ba菌核病gydF4y2Ba和非生物胁迫，包括低温，高温，干旱和盐[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．此前的研究工作主要集中在细菌、真菌、昆虫、植物、动物和其他生物体的营养、形态发生和抵御病原体和非生物胁迫方面的几丁质酶功能[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]但很少有研究已经检查了硅藻中的几丁酶。gydF4y2Ba

在这里，我们研究了模型中的几丁质酶基因家族gydF4y2BaThalassiosira.gydF4y2Ba物种gydF4y2Bathalassiosira pseudonanagydF4y2Ba，利用其完全测序的基因组[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．我们鉴定了24个几丁质酶基因，并分析了它们的序列结构特征、支架位置、系统发育关系和胁迫相关gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba作用元件，亚细胞位置，以及在转录和酶水平上对非生物胁迫的反应。这是首次研究硅藻中几丁质酶家族成员的特性。我们的研究结果为硅藻中的β-几丁质降解提供了见解，并可以支持从硅藻中提取的几丁质酶的体外应用。gydF4y2Ba

几丁质酶基因的全基因组鉴定与分析gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba

共鉴定出24个非冗余几丁质酶基因gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba和指定的gydF4y2BaTpChi1-24gydF4y2Ba基于它们的染色体位置。表中提出了基因名称，基因ID，染色体位置，外显子数，氨基酸序列长度，分子量（MW）和理论等电点（PIS）gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．几丁质酶序列长度从417个(TpChi1)到3512个(TpChi6)氨基酸(aa)残基，平均1517个aa。相对分子质量为46.4 kDa (TpChi1) ~ 373.1 kDa (TpChi6)， pI值为4.09 (TpChi6) ~ 5.42 (TpChi16)。gydF4y2Ba

表的年代gydF4y2Ba1gydF4y2Ba列出了预测的信号肽、跨膜螺旋(TMHs)和几丁质酶的亚细胞定位。HECTAR预测显示，多达一半(24个中的12个)具有信号肽。其中9个(TpChi9、TpChi13、TpChi14、TpChi17、TpChi18、TpChi20、TpChi21、TpChi22和TpChi23)被SignalP-5.0、HECTAR和ASAFIND三个程序预测含有信号肽，表明这些几丁质酶参与了分泌途径。其中12个(TpChi1、TpChi2、TpChi3、TpChi4、TpChi5、TpChi7、TpChi8、TpChi10、TpChi11、TpChi15、TpChi16和TpChi19)经HECTAR预测具有П型信号锚，表明它们可能是П型跨膜蛋白，N-in取向，可能定位于叶绿体或线粒体膜上。其中6个(TpChi2, TpChi5, TpChi9, TpChi14, TpChi22, TpChi23)被预测含有TMHs，表明其亚细胞定位于质膜或内膜系统。gydF4y2Ba

基因结构，图案和保守域gydF4y2BaTpChigydF4y2BaS基因gydF4y2Ba

所有几丁质酶基因含有至少两个外显子和一个内含子，gydF4y2BaTpChi5gydF4y2Ba含有17个外显子，是几丁质酶基因中最多的。四分之一的gydF4y2BaTpChigydF4y2BaS有超过10个内含子(625%)，超过一半有7个或更多的内含子(1458%)，而且只有1个gydF4y2BaTpChi1gydF4y2Ba有一个内含子（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

利用Pfam数据库和MEME程序分别分析了几丁质酶家族的保守结构域和保守基序，进一步分析了几丁质酶家族的序列差异。20幅保存完好的作品被鉴定出来gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶蛋白质。它们的长度从15到65 aa不等，详细情况见表SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba．在19种几丁质酶中发现了gly_hydro_18结构域，在6种几丁质酶中发现了gly_hydro_19结构域。值得注意的是，几丁质酶TpChi12被发现同时具有gly_hydro_18和gly_hydro_19结构域。10个蛋白序列中检测到Chitin_bind_1 (PF00187)、CBM_14 (Peritrophin A, PF01607)和LPMO_10 (PF03067)三个辅助结构域(41.7%)。此外，还发现了与两个gly_hydro结构域对应的三个基序组合。在几丁质酶TpChi1、TpChi12、TpChi13、TpChi15、TpChi19和TpChi20的gly_hydro_19结构域中检测到19、11、17、13和10的组合。在gly_hydro_18结构域中还发现了另外两个高度保守的基序组合。TpChi18,几丁质酶TpChi3、TpChi6 TpChi14 TpChi21, TpChi22,和TpChi24包含的组合图案18日,16日1、7、3、12和5,而TpChi2 TpChi4, TpChi5, TpChi7, TpChi8, TpChi9, TpChi10, TpChi11, TpChi12, TpChi16,和TpChi23包含主题的结合2,8,1,7日,15日,3、4、6、3和9。TpChi17是一个例外，只包含主题1和14。总的来说，同组几丁质酶具有相似的基序组成(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

系统发育分析具有代表性gydF4y2BaThalassiosira.gydF4y2Ba几丁质酶gydF4y2Ba

构建了一棵无根系统发育树，揭示了几丁质酶之间的进化关系gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba，gydF4y2Ba科特奥斯科gydF4y2Ba(22、表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba） 和gydF4y2BaT. Weissflogii.gydF4y2Ba(76年,表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．总共有122个蛋白质序列gydF4y2BaThalassiosira.gydF4y2Ba物种用于构建系统发育树（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba根据系统发育树的拓扑结构和蛋白质序列的结构域结构，将几丁质酶分为8类(I-VII)。GroupV是最大的，包含6个成员gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba, 5gydF4y2Ba科特奥斯科gydF4y2Ba，和12gydF4y2BaT. Weissflogii.gydF4y2Ba．3种几丁质酶共检测到15个结构域gydF4y2BaThalassiosira.gydF4y2Ba物种(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．将II-VII组含有与Glyco_hydro_18催化结构域的几丁质酶，并且基因酶中的几丁酶（TWCHI50除外）仅含有Glyco_Hydro_19结构域。GroupII（TWCHI9，TWCHI24，TWCHI58和TWCHI65）中的一些花序酶包含两个Glyco_hydro_18域。有趣的是，GroupI中的七个几丁酶（TPCHI12，TWCHI11，TWCHI29，TWCHI31，TWCH1，TWCH1，TWCHI74）含有GloCo_Hydro_18和Glyco_hydro_19催化结构域。总体而言，同一组的几丁酶具有类似的域架构。gydF4y2Ba

支架位置和基因复制gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

24. TpChigydF4y2Bas被分配到12个支架（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和桌子gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，几丁质酶基因在各支架上的分布不均匀。几丁质酶基因最多的是Chr7和Chr19a_19(4)，而只有一个几丁质酶基因位于Chr8、Chr10、Chr11a、Chr12、Chr22和Chr23上。几丁质酶基因家族成员间未发现重复片段。然而，有两对连续重复的基因对:gydF4y2Ba第11页gydF4y2Ba和gydF4y2BaTpChi12型gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaTpChi21型gydF4y2Ba和gydF4y2BaTpChi22型gydF4y2Ba. 这些基因分别位于Chr7和Chr19au19上，占几丁质酶基因的16.7%。MCScanX检测结果表明，几丁质酶基因家族成员间不存在共线性。gydF4y2Ba

与压力有关gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba中的-acting元素gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因启动子gydF4y2Ba

目的:探讨其可能的调控机制gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba在非生物或生物应力下，使用PlantCare数据库分析1.5kb上游序列（启动子区）以识别gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba监管要素。二十六种类型的259种压力相关gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba其中包括光响应相关因子(G-box等21种)、低温响应相关因子(LTR)、干旱诱导相关因子(MBS)等gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba参与防御和应激反应的作用元件（即CCAAT盒和富含TC的重复）（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．几丁质酶基因均含有2-9个胁迫相关基因gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba启动子区域的作用元素。G-box被全部找到了gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba启动子和约占已鉴定元素的一半(122)。共22种199光响应型gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba表演元素占与压力相关的76.8％gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba表演元素。gydF4y2Ba

二级和三维结构的gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶gydF4y2Ba

发现了4种二级结构(α-螺旋结构、延伸链结构、β-转角结构和无规螺旋结构)gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几章酶（表SgydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．几丁质酶二级结构以α-螺旋和无规则螺旋为主，分别占24.79和47.46%。扩链结构占二级结构的19.63%，β-转角结构占8.12%。数字gydF4y2Ba5gydF4y2Ba显示每个组的代表性二次结构。3D分子建模提供了通常难以获取实验的动态信息，并且为3D蛋白质模型构造gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几章酶以更好地了解它们的结构性（表S.gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．最热门的模型(75%)是来自多种系统发育起源的几丁质降解酶，包括病毒(TpChi5)、细菌(TpChi2、TpChi7、TpChi8、TpChi10、TpChi11、TpChi16、TpChi17)、酵母(TpChi20)、真菌(TpChi12、TpChi23)、水稻(TpChi1、TpChi19)、昆虫(TpChi14、TpChi18)和人类(TpChi3、TpChi21、TpChi24)。gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba同一系统发育群中的几丁质酶（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)的三维结构相似(表SgydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

表达式的分析gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba非生物胁迫下的基因gydF4y2Ba

研究单个基因对低辐照度的反应（50μmolmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})、低温(12°C)和转录水平的硅缺乏胁迫，随机从24个涉及非生物胁迫响应的基因中选取14个基因进行实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba表演元素的预测。一般来说,gydF4y2BaTpChigydF4y2Bas在暴露于应力48 h后上调(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．二氧化硅耗尽产生了14个基因中的12个基因的转录性丰度的最大增加（85.7％）在二氧化硅限制下上调。在显着和温度限制的应力下，增强了9（64.3％）和11（78.6％）基因的表达水平。虽然大多数基因在压力下上调，但最显着上调的基因是gydF4y2BaTpChi4gydF4y2Ba，在光照、温度和二氧化硅限制条件下，其相对表达量比对照增加了14倍、5倍和5倍。相比之下，只有一种几丁质酶基因(gydF4y2Ba第17页gydF4y2Ba)在温度限制条件下，表达量下降到对照的十分之一。gydF4y2Ba

为了进一步研究几丁质酶基因家族在酶水平上参与非生物胁迫反应，我们测定了几丁质酶活性gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba在低辐照度、低温和二氧化硅耗尽的条件下。活动的活动gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba在低辐照度，低温和二氧化硅缺损下，几丁酶保持稳定（gydF4y2BapgydF4y2Ba > 0.05) (Fig.6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

甲壳素是硅藻细胞壁中主要的多糖，其多种功能使硅藻能够适应多变的海洋环境。几丁质酶是一种能够将几丁质分解成糖链更短、分子量更低的有价值衍生物的酶，因此在硅藻中值得更多的关注。尽管几丁质酶基因家族已经在昆虫、高等植物和真菌中得到了广泛的研究[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]但是有关斯特拉络合物中这个基因家族的信息，还尚未进行系统调查。的完整性gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba基因组序列可以鉴定推断的硅藻几丁质酶基因[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在目前的研究中，gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba从基因组序列中鉴定了几丁质酶基因及其系统发育关系gydF4y2BaThalassiosira.gydF4y2Ba、基因结构、保守基序和结构域、支架位置、重复事件、应激相关gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-对非生物胁迫下的作用元件、转录表达谱和酶活性进行了综合研究。gydF4y2Ba

结构的多样性和内含子的丰度可能产生具有多种功能的几丁质酶gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba

共获得24个几丁质酶基因gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba基因组和验证的基础上鉴定保守几丁质酶结构域。类似数量的几丁质酶基因已在以前的报道gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba（超过20个几丁醇酶编码基因）[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaCyclotella crypticagydF4y2Ba（22只花碱酶）[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]. 委员会成员gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶家庭显示不同的二级和3D结构（表SgydF4y2Ba5gydF4y2Ba,年代gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，表明它们可能在多个生物过程中发挥作用，如应激相关反应、生长和发育操作。内含子的获得和丢失放大了基因组织的复杂性[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)，我们发现了不同的外显子-内含子结构gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）可能导致其在进化期间的结构多样性。重要的是，这是gydF4y2BaTpChigydF4y2Bas通常拥有大量的内含子。25%的人有10个以上的内含子，超过一半的人有7个或更多的内含子（14，58%），第五组成员的内含子最丰富（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．当嵌入基因序列中的丰富内含子时，在基因转录期间可能发生替代剪接（AS）。在真核生物中，通过选择性地保留或去除一些外显子，在空间上并时间地调节基因表达，从而产生多个MRNA [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．AS的许多可能的变体gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba因此，美国可以扩大多样性gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶转录组和蛋白质组。gydF4y2Ba

串联重复和遗传多样性可能共同影响了该物种的进化gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba基因家族gydF4y2Ba

t . pseudonanagydF4y2Ba根据系统发育树，几丁质酶基因分为8组(I-VII)，还包括另外两个蛋白gydF4y2BaThalassiosira.gydF4y2Ba物种。每组的几丁酶显示相似的域架构，图案组合物（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和保守的次级(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)和三维结构(表SgydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，表明它们可能有更近的进化历史和相似的细胞功能。gydF4y2Ba

在进化过程中，片段复制和串联复制推动了基因家族的扩展[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]. 在这里，我们发现了两对成对的gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因（gydF4y2Ba第11页gydF4y2Ba和gydF4y2BaTpChi12型gydF4y2Ba，gydF4y2BaTpChi21型gydF4y2Ba和gydF4y2BaTpChi22型gydF4y2Ba）没有节段重复事​​件，显示串联复制在扩展方面发挥了更重要的作用gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因家族。gydF4y2BaTpChi21型gydF4y2Ba和gydF4y2BaTpChi22型gydF4y2Ba在Chr19a_19上靠近;分为GroupIII (Figs.)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）和表现出保守的结构域和基序组合物（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）以及类似的次级和3D结构（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和表年代gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．另一对,gydF4y2Ba第11页gydF4y2Ba和gydF4y2BaTpChi12型gydF4y2Ba，位于Chrèu 7（362 kb）划分为不同的系统发育类群。几丁质酶TpChi11和TpChi12含有一个共同的Glyco_hydro_18结构域。然而，TpChi12也有一个糖化氢结构域和较长的序列长度。已知在进化过程中，重复基因的遗传和功能会发生分化[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTpChi12型gydF4y2Ba被鉴定为串联复制体gydF4y2Ba第11页gydF4y2Ba，虽然它有一个额外的几丁质降域。这些观察结果表明，通过获取glyco_hydro_19域的获取gydF4y2BaTpChi12型gydF4y2Ba或者它的损失gydF4y2Ba第11页gydF4y2Ba．此外，外显子-内含子结构和硅限制下的基因表达谱是不同的gydF4y2Ba第11页gydF4y2Ba和gydF4y2BaTpChi12型gydF4y2Ba，表明这对基因发生了功能分化。基于这些结果，我们推测几丁质酶基因家族可能先经历了重复，然后经历了遗传多样化，进而推动了功能多样化。gydF4y2Ba

几个亚细胞位置被预测为gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba蛋白质gydF4y2Ba

几丁质原纤维位于二氧化硅壁和产生几丁质的硅藻细胞膜之间[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]，但甲壳素降解的位置尚不清楚。因此，我们研究了亚细胞位置gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶。我们主要解释了子单元的位置gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba蛋白质根据公顷的结果，专业设计用于象鼻星。公顷的预测表明，一半的几丁醇酶家族成员参与了分泌途径，与发现大多数几章胰蛋白酶基因一致gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba和gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba是分泌物[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．这表明几丁酶具有细胞外活动和重要的体外应用。gydF4y2Ba

分泌型几丁质酶能够降解硅藻细胞壁上的几丁质纤维，进而改变细胞生物硅的沉积和浮力[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．此外，在高等植物中，分泌几丁质酶是一组应对病原体和非生物胁迫的致病相关(PR)蛋白[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．在gydF4y2BaindicgydF4y2Ba稻，转基因水稻线及其过度表达苦瓜胰蛋白酶基因的后代表现出对大米主要真菌病原体的抗性增强抗性[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．在冬季黑麦，观察到双重功能抗冻蛋白与妊娠胰蛋白酶同源[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．因此，我们可以推测分泌物gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶参与了对构成几丁质的病原体和非生物因子的响应，这也得到了qRT-PCR结果的支持。其余几丁质酶，然而，预计驻留在叶绿体或线粒体膜。鉴于硅藻所表现出的次级内共生[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]，gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba锚定到叶绿体或线粒体膜的几丁酶可以通过原始从红藻类或非光合外出的基因编码。gydF4y2Ba

不同的几丁质酶基因表达模式可能支持几丁质代谢和其他生理需求gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba在多变的环境中gydF4y2Ba

26种与压力相关的类型gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-调控元件在24个基因的启动子区域被发现gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba基因(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba），表明它们可能会接受复杂的转录调节。共有199个轻响应gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba作用元素分布不均匀gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba基因启动子，表明大多数几丁质酶基因的表达是由光诱导的。与该观察结果一致，LTR，富含TC的重复和MBS元素对于诱导黄瓜胰蛋白酶基因的诱导也很重要，gydF4y2BaB. Rapa，B. JunceagydF4y2Ba， 和gydF4y2Ba亚麻荠漂白亚麻纤维卷gydF4y2Ba［gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

多项研究表明，在植物生物抗病过程中，几丁质酶家族基因的转录会发生变化[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．CAO＆TAN（2019）研究了番茄氯化酶基因的表达响应于病原体gydF4y2Ba菌核病gydF4y2Ba在低温下，高温，干旱和盐胁迫下[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．他们观察到，在这些应激条件下，几丁质酶基因的表达在大致升高。目前的研究表明了类似的整体上调模式gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba基因对低辐照度、低温和硅耗竭的响应。不同的转录谱gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因在不同的非生物胁迫条件下具有不同的响应和调控机制，可能参与多种生理过程。gydF4y2Ba

尽管几丁质酶基因转录增加，但在非生物胁迫下，几丁质酶活性没有明显变化。这可能归因于在不利环境中酶活性的限制或几丁质酶蛋白翻译的减少。基因转录和酶活性之间的不一致可能支持这样的提议gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因除了参与几丁质代谢外，还参与了其他细胞过程，或者可能代表了变化环境中几丁质代谢的代偿性调整。这一不一致的结果也提示了在几丁质降解过程中可能存在转录后调控gydF4y2Bat . pseudonana。gydF4y2Ba相比之下，在转录中升高了海岸曲丁醇酶基因的表达[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]和蛋白质活性水平[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]在冷压力下。此外，用生物或非生物应激诱导剂治疗后黄瓜和烟草的几丁酶活性也增加了[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．本研究结果表明，与高等植物相比，硅藻中几丁质酶的调控和活性可能存在功能上的差异。gydF4y2Ba

Durkin等人(2009)发现二氧化硅沉积和几丁质暴露在gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba细胞壁呈负相关[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．他们认为，在不能沉淀二氧化硅的应激细胞中，几丁质生物合成得到了增强。此外，据报道，硅酸和铁消耗对转录本数量的共同调控与细胞壁过程有关[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．在本研究中，几丁质酶转录本积累，而酶活性保持稳定的二氧化硅耗竭。因此，当二氧化硅无法沉积时，稳定的几丁质酶活性和较高的几丁质积累可能使几丁质作为细胞壁材料的替代品。此外，由于硅藻细胞生长需要二氧化硅，细胞的异常生长也可能影响甲壳素代谢，进而影响海洋中碳等营养物质的循环[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．然而，涉及甲壳素代谢的其他基因(如甲壳素合成酶和甲壳素去乙酰化酶)需要进一步的研究。gydF4y2Ba

辅助结构域可协助甲壳素结合gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶gydF4y2Ba

大多数几丁质酶包含一个催化结构域和额外的辅助结构域，如碳水化合物结合模块(CBMs) [gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]在CAZy数据库中被分为87个科(gydF4y2Bahttp://www.cazy.org/gydF4y2Ba)．CBMS将酶固定在基底上并破坏其结晶结构，产生自由链末端，从而提高酶朝向不溶性基材的催化活性[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．几丁质结合已被证明只包含两个CBM_14结构域的蛋白质[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．在本研究中，CBM_14，CHITIN_BIND_1和LMPO_10结构域通常在几丁质酶TPCHI3的蛋白质序列中鉴定在丁蛋白结合蛋白中gydF4y2Ba，gydF4y2BaTpChi5gydF4y2Ba，gydF4y2BaTpChi8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba第11页gydF4y2Ba，gydF4y2BaTpChi16型gydF4y2Ba，gydF4y2Ba第17页gydF4y2Ba，gydF4y2BaTpChi21型gydF4y2Ba，gydF4y2BaTpChi22型gydF4y2Ba，gydF4y2BaTpChi23和TpChi24(41.7%)，其中5个具有2个或2个以上的CBM_14结构域(TpChi3gydF4y2Ba，gydF4y2BaTpChi21型gydF4y2Ba，gydF4y2BaTpChi22型gydF4y2Ba，gydF4y2Ba第23页gydF4y2Ba，gydF4y2Ba和TPCHI24）（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），表明依甲酸丁蛋白结合能力gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶。此外，预测含有CBM_14结构域的七个几丁酶（TPCHI3，TPCHI11，TPCHI16，TPCHI21，TPCHI22，TPCHI23和TPCHI24）或位于叶绿体或线粒体膜中的细胞外（含有信号肽）（表S.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba). 这一发现表明，与Traller等人（2016年）讨论的硅藻质膜和硅藻截体之间的空间相比，含有CBMï14结构域的硅藻几丁质酶的亚细胞位置更多[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们确定了24. TpChigydF4y2Ba基因的gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba基因组并将它们分成八个亚组。从基因结构，系统发生，支架位置，基因重复，二次和3D结构的角度分析了基因家族，并在非生物应激下的转录和酶水平的表达。通常，上调逐胰酶转录物水平，但在非生物胁迫下酶活性保持不变。这些研究结果表明gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因家族是对多变环境的响应的关键，在细胞过程中起着不可缺少的作用，但尚未确定其特征。我们的报告有助于更好地理解硅藻中几丁质的代谢，并为今后的功能表征奠定基础gydF4y2BaTpChigydF4y2Ba基因及其体外应用gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶。gydF4y2Ba

t . pseudonanagydF4y2Ba栽培gydF4y2Ba

t . pseudonanagydF4y2Ba(CCMP 1335)来源于宁波大学微藻采集中心。细胞在由上海光宇生物科技有限公司提供的优化的f/2液体培养基中生长。培养温度为19°C，光照:黑暗日循环12h: 12h (100 μmol m)gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}）以100 rpm摇动。gydF4y2Ba

当在起子培养物中生长的细胞达到指数相时，在2850℃下在无菌条件下离心50ml细胞培养物 ggydF4y2Ba15分钟 min（Beckman Coulter，Allegra X-I5R离心机），用培养基洗涤一次，接种到50%的培养基中 mL新鲜培养基。对于限温处理，将细胞置于12℃的低温下 摄氏度，100 μmol MgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}而在光限制条件下，细胞暴露在50 μmol m的低辐照度下gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在19°C。在限硅处理中，细胞用培养基清洗一次，接种到50 mL新鲜的无硅培养基中，然后在100 μmol m的正常光照下培养gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和温度(19°C)条件下的对照组。试验在瓶中进行，48 h，每个处理设3个生物重复。gydF4y2Ba

中几丁质酶家族基因的鉴定gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba

核苷酸序列和相应的蛋白质序列gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因来源于联合基因组研究所的藻cocosm数据库(JGI藻cocosm，gydF4y2Bahttps://jgi.doe.gov/data-and-tools/phycocosm/gydF4y2Ba）使用表S中列出的“Chitinase”和其他相关关键字gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．共93个片段注释为几丁质酶相关基因。从这些基因中，我们剔除了41个基因，它们被冗余注释为全长序列，但实际上是其他52个基因的部分序列(表SgydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．将剩余的52个基因的蛋白质序列提交给智能和PFAM网站，以确认几丁酶结构域Glyco_hydro_18（PF00704）和Glyco_Hydro_19（PF00182）的存在gydF4y2BaEgydF4y2Ba-value of < 0.0001 [gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．用一种或两种Glyco_hydro_18和Glyco_hydro_19结构域被认为是推定的几丁质酶的蛋白质。gydF4y2Ba

序列分析和结构表征gydF4y2Ba

所有的核苷酸序列均使用ExPASy ProtParam工具进行分析，计算其氨基酸数、分子量和pi [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．从JGI phycocosm获得基因组位置，内含子数和基因结构信息。MEME V5.1.1在线软件用于识别几丁质酶蛋白中的保守基序，以下参数：任何数量的重复，最多20个图案，以及6-200个氨基酸的最佳主题宽度[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．信号肽和TMHs使用SignalP-5.0 (gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/gydF4y2Ba）和tmhmm server v.2.0（gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/gydF4y2Ba)分别是。结合WoLF-PSORT结果预测亚细胞位置(gydF4y2Bahttps://wolfpsort.hgc.jp/gydF4y2Ba)HECTAR和ASAFind是两个专门用于heterokonts的软件[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

二级结构gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶蛋白序列采用SOPMA (gydF4y2Bahttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.htmlgydF4y2Ba)使用默认参数。对于每个系统发育组gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba含有至少两个成员的几丁质酶，蛋白质序列与ClustalW (gydF4y2Bahttps://www.genome.jp/tools-bin/clustalwgydF4y2Ba），然后用ESPRIPT3.0将代表性二次结构进行可视化[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．3D模型的gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶使用SWISS-MODEL服务器构建[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

支架定位和基因复制鉴定gydF4y2Ba

使用TBtools软件根据检索到的基因组位置信息进行支架定位[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．用BLASTP和MCSCANX方法识别家庭内的基因复制事件[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．所有的gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba用BLASTP彼此对准几丁质酶蛋白序列。BLASTP结果用作MCSCANX的输入，并使用默认参数识别重复事件和基因共同性。gydF4y2Ba

系统发育分析和分类gydF4y2Ba

研究几章酶中的进化关系gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba，gydF4y2BaThalassiosira Oceanica，gydF4y2Ba和gydF4y2Ba这种weissflogiigydF4y2Ba，利用MEGA X软件(v10.1.8)构建了1000个引导复制的无根邻居连接系统发育树[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．这gydF4y2Ba科特奥斯科gydF4y2Ba利用关键词“几丁质酶”从JGI PhycoCosm数据库中下载蛋白质序列。收购gydF4y2BaT. Weissflogii.gydF4y2Ba蛋白质序列，24 t . pseudonanagydF4y2Ba用Chitinase蛋白序列用作BLASTP查询gydF4y2BaT. Weissflogii.gydF4y2Ba海洋微生物真核生物转录组测序项目(MMETSP)发布的转录组[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．这gydF4y2Ba科特奥斯科gydF4y2Ba和gydF4y2BaT. Weissflogii.gydF4y2Ba将候选序列提交到SMART和PFAM，以验证甘油_HYDRO_18和GLYCO_HYDRO_19结构域中的一个或两个[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．总共22个全长gydF4y2Ba科特奥斯科gydF4y2Ba几章酶（表SgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba), 76gydF4y2BaT. Weissflogii.gydF4y2Ba几章酶（表SgydF4y2Ba4gydF4y2Ba），24个新鉴定的几丁酶gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba用于系统发育分析。gydF4y2Ba

的预测gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- 征收元素gydF4y2Ba

预测gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba的启动子区中起作用的调节元件gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba从JGI PhycoCosm数据库中下载各初始密码子(ATG)上游1.5 kb的几丁质酶基因。压力与响应相关的gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba然后使用Plantcare网站研究了几丁质酶基因的启动子序列中的作用元件（gydF4y2Bahttp://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

酶测定和转录剖面分析gydF4y2Ba

在应激处理48小时后，使用制造商的说明书的Solarbio Chitinase测定试剂盒（Cat＃BC0820）从每次烧瓶中取出1ml样品，用于测量几丁质酶活性。剩下的49毫升gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba2850年离心收集每个瓶中的细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba，用新鲜培养基洗一次，并在液氮中闪蒸。这gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba细胞颗粒通过涡旋试剂（Invitrogen，Waltham，Ma，USA）涡旋均匀化，然后在9700处离心 ggydF4y2Ba．上清液用氯仿和异丙醇提取RNA。RNA小球在焦碳酸二乙酯处理的水中重悬，然后用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara，日本)消除基因组DNA和合成互补DNA (cDNA)。将合成的cDNA用于qRT-PCR实验。gydF4y2Ba

14个随机选择的转录谱gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba使用Tb Green TM Premix ExTaq™II（Takara，Japan）和热循环骰子实时系统（Takara，Japan）通过QRT-PCR获得几丁质酶基因。使用NCBI Primer-Blast网站设计基因特异性QRT-PCR引物[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．引物信息见表SgydF4y2Ba9gydF4y2Ba．以β -微管蛋白基因(TUB3)为内参基因，对其表达进行规范gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶基因[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

参考基因组gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba在JGI Phycocosm释放，加入号码gydF4y2Bathalassiosira pseudonanagydF4y2BaCCMP 1335（gydF4y2Bahttps://jgi.doe.gov/data-and-tools/phycocosm/gydF4y2Ba)．基因序列和蛋白质序列gydF4y2Bat . pseudonanagydF4y2Ba几丁质酶从JGI藻糖下载(gydF4y2Bahttps://jgi.doe.gov/data-and-tools/phycocosm/gydF4y2Ba)．几丁质酶蛋白序列gydF4y2Ba科特奥斯科gydF4y2Ba从JGI Phycocosm下载（gydF4y2Bahttps://jgi.doe.gov/data-and-tools/phycocosm/gydF4y2Ba)．几丁质酶蛋白序列gydF4y2BaT. Weissflogii.gydF4y2Ba从imiCrobe网站下载（gydF4y2Bahttps://www.imicrobe.us/gydF4y2Ba)．支持本文结果的所有数据集都包含在本文及其附加文件中。gydF4y2Ba

AA:gydF4y2Ba

氨基酸gydF4y2Ba

为:gydF4y2Ba

可变剪接gydF4y2Ba

CBMS：gydF4y2Ba

碳水化合物结合模块gydF4y2Ba

变得更PhycoCosm:gydF4y2Ba

联合基因组学院植物科学数据库gydF4y2Ba

兆瓦:gydF4y2Ba

分子量gydF4y2Ba

NCBI：gydF4y2Ba

国家生物技术信息中心gydF4y2Ba

NJ：gydF4y2Ba

邻接gydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开放阅读框gydF4y2Ba

PI：gydF4y2Ba

等电点gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

TMHS：gydF4y2Ba

跨膜螺旋gydF4y2Ba

UTR:gydF4y2Ba

翻译区gydF4y2Ba

3D：gydF4y2Ba

三维gydF4y2Ba

作者想要感谢TopEdit (gydF4y2Bawww.topeditsci.com.gydF4y2Ba)在准备这篇手稿的过程中提供语言上的帮助。我们还要感谢西安交通大学的关杰张和中国科学院海洋研究所的贝宁雪，对他们的统计分析提供帮助和鼓励。gydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(no . 41806175);国家重点研发计划项目(no . 2018YFD0900106);国家海洋科技先导实验室海洋生物与生物技术实验室青年项目(no . YQ2018NO06)。这些资助人资助了研究所需的仪器和试剂的采购。每个资助机构都参与了研究的设计、收集、分析和解释数据，以及撰写手稿。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 中国科学院海洋研究所海洋大科学中心海洋实验生物学重点实验室，青岛，266071gydF4y2Ba

   程浩淼，邵占儒，卢畅，段德林gydF4y2Ba

2. 青岛海洋科学技术国家重点实验室海洋生物与生物技术实验室。R中国gydF4y2Ba

   程浩淼，邵占儒，卢畅，段德林gydF4y2Ba

3. 中国科学院大学，北京，100049，P.R中国gydF4y2Ba

   Haomiao Cheng＆Chang LugydF4y2Ba

4. 青岛明月海藻集团有限公司海藻生物活性物质国家重点实验室，青岛，266400gydF4y2Ba

   段德林gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

HC, ZS和DD构思和设计研究。HC进行了实验，分析了数据并撰写了论文。ZS和DD对手稿进行了批判性的修改。CL分析了数据。所有作者均已阅读并批准稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaZhanru邵gydF4y2Ba或者gydF4y2Ba段德林gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

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作者们宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

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