筛选优秀化学型格洛丽萨L.在印度生产抗癌血清序列：同时微波辅助提取和HPTLC研究

背景

格洛丽萨秋水仙科秋水仙属植物是原产于非洲和东南亚的高价值药用植物。它的治疗效果在包括阿育吠陀在内的传统药物中已经确立。其天然生物活性化合物秋水仙碱具有广泛的药理作用，如风湿病、痛风等，也被引入临床实践。不断增长的需求和非法采伐使这种珍贵的植物受到威胁。

方法

本研究采用微波辅助提取(MAE)与密度-高效薄层色谱(HPTLC)相结合的方法，对32个不同种群的秋水仙碱进行了分析g . superba. 采用Box-Behnken统计设计（3水平因子），以微波功率、照射时间、乙醇水溶液和pH值为自变量，秋水仙碱为因变量，对MAE进行优化。在硅胶60上进行色谱分析 F₂₅₄具有甲苯的TLC板：甲醇，85:15（v / v）用作溶剂系统。在后衍生化后λ= 254nm（10％甲醇硫酸）之后进行密度测量。

结果

最佳提取条件为7.51 mg g^− 1.这非常接近预测反应7.48 mg g^− 1.维持微波功率(460 W)，辐照时间(6.4 min)，乙醇水溶液-30,pH值-3。秋水仙碱含量在2.12 ~ 7.58 mg g之间^− 1.32人中 g . superba只有三种化学物质viz的种群。GS-1，GS-3和来自West Bengal和Sikkim收集的GS-2分别表现出秋水仙碱的最大收益率。

结论

因此，这种新开发的优化MAE结合HPTLC光密度测定方法不仅可以定量秋水仙碱，而且可以鉴别出秋水仙碱的优良化学类型g . superba，但它也鼓励选择高产的植物种群用于工业用途和促进农民的经济增长。这验证，简单和可重复的HPTLC方案是首次用于估计自然种群的秋水仙碱g . superba从印度的32个不同地理区域获得。

图形抽象

格洛丽萨(科:秋水仙科)1.a） 多年生草本半木质攀援植物[1.]产于亚洲和非洲热带地区。从喜马拉雅山西北部到阿萨姆邦和德干半岛，海拔2120米的热带印度随处可见。在卡纳塔克邦，它通常沿着西高止山脉生长;它也生长在马达加斯加、斯里兰卡、印度支那和邻近的岛屿[2.,3.,4.］．这个属的名字来源于拉丁词gloriosus，指的是花。g . superba是津巴布韦的全国花朵，也是泰米尔纳德邦的国家花。g . superba由于其高回报，被认为是像甘蔗和棉花一样的经济作物。2019年，该地区每亩土地的平均净收益g . superba据报道培养约卢比。每亩1,499,002亩[5.］．

它也被称为其商品名'光荣百合'；在英语中它被称为“马拉巴荣耀百合”，在印地语和梵语中分别被称为“卡利哈里”和“阿格尼西卡”[6.,7.,8.］．g . superba是一种重要的药用植物，具有广泛的生物活性。它是Yunani医学系统中久负盛名的草药之一。在热带非洲和亚洲，民间对这种植物的使用包括它的所有部分，土著居民利用它的价值与商人进行物物交换[9,10,11]. 它在传统医学中最受欢迎和广泛的应用表现为抗风湿和痛风[12]. 这种植物的块茎传统上用于治疗慢性溃疡、绞痛、瘀伤和扭伤、痔疮、麻风病、癌症，也可作为分娩疼痛的诱因[13,14,15,16]. 块茎的药理学特性表明它是一种堕胎药，以及小剂量的驱虫药、补药和健胃药。叶子被用来治疗痔疮、溃疡和排出胎盘，而种子被用来治疗与癌症有关的疾病[17］．

金盏花的药用价值主要归功于生物碱，特别是秋水仙碱、硫代秋水仙碱和金盏花苷，以及10种非生物碱化合物的存在维兹．β-谷甾醇、豆甾醇、白屈菜酸、木犀草素等[12,18,19］．秋水仙碱被用作有丝分裂抑制剂，用于癌症治疗和糖尿病，除了促进农业作物的多倍体。

秋水仙碱(无花果。1.B)是主要的生物碱g . superba块茎表现出多方面的药理学特性，由于它在亚细胞水平上起作用而重新出现。秋水仙碱在200多年前被引入临床，至今仍被用作治疗痛风的有效药物，痛风是世界温带地区的一种常见病[20］．美国食品和药物管理局(FDA)(2009)已经批准使用秋水仙碱治疗痛风。该化合物还广泛应用于实验动物模型的微管聚合抑制和纤维化抑制[21,22]. 它也被用来治疗癌症[23,24]、风湿病及心血管疾病[25,26,27]. 秋水仙碱只在两种植物中大量存在维兹．秋水仙碱和格罗索斯sp。[28］．在g . superba秋水仙碱在根状茎中的产量为0.15% - 0.3%，在种子中为0.7% - 0.9% [5.］．在该植物中发现了高含量的秋水仙碱，增加了其在国内和世界市场的需求。

由于过度开发、滥采滥采以及大田栽培面临的制约，光荣百合已濒临绝种。因此，它被国际自然及自然资源保护联盟（IUCN）列为《红皮书》（2001年）中的濒危物种[1.,29]. 因此，为了确保秋水仙碱的持续供应和满足日益增长的中草药行业的需求，筛选秋水仙碱含量高的优良种质资源和从这种珍贵的药用植物中提高秋水仙碱产量的替代方法是研究人员的主要优先事项。对优良种质的鉴定将有助于使用适合商业化栽培的优质植物g . superba．关于印度不同地理区域的精英化学型勘探的报道很少维兹．印度锡金和恒河平原[30,31,32］．然而，有关秋水仙碱测定的资料很少g . superba采用hptlc -密度分析法[31,32,33]它是一种简便、快速、经济的有价值的植物化学物质定量测定方法[34,35,36,37］．

此外，原料药的质量控制是处理草药制剂或天然产品的行业和相关组织的基本要求。此外，优化和发展基于标记化合物的色谱图谱，以协助适当的药物生产是至关重要的。考虑到传统提取工艺（时间、能源和溶剂消耗）的限制，需要特别注意优化绿色和可持续的提取方法[38］．优化的绿色提取方法可在几分钟内产生安全、高质量的生物活性化合物，重现性高，溶剂消耗低。在过去的20年里，微波辅助提取(MAE)已经成功地作为“绿色提取方法”从植物基质中回收工业上重要的化合物[39,40,41］．为了优化不同响应变量的线性和交互效应，响应面法(RSM)是一种有效的统计和数学设计，以获得增值生物活性化合物的最大产量[42,43,44］．

因此，本研究的目的是:1)利用响应面法优化微波辅助提取(MAE)的显著性变量;2)分析32株秋水仙碱含量的内在种内差异g . superba采用快速、经济、有效的HPTLC方法，从印度11个州的32个不同地区采集人群；筛选优良（高产）种质资源g . superba为了验证和验证从不同地理位置收集的血清细胞含量的植物材料的质量和真实性，以满足药用植物市场和制药行业的不断扩大的需求。

Plackett-Burman设计

采用Plackett-Burman设计筛选重要提取变量，以分析七个自变量对秋水仙碱产量的影响（表1）1.). 在这里，选择设计的基质和由此产生的秋水仙碱产量从g . superba块茎呈现在表格中1.．采用回归分析的方法评价提取参数对秋水仙碱提取的影响2.). 结果表明，只有微波功率、辐照时间、溶剂组成和pH值四个因素对秋水仙碱的收率有显著影响P级别为5％（P<表中所示的0.05值3.). 在本研究中，使用Plackett-Burman设计获得的秋水仙碱产量报告差异高达2.82-6.66 mg/g干重（图。2.)．

Box-Behnken设计（BBD）模型配件

RSM是一种系统的现代统计设备，用于生物过程优化和建模策略，其中不同的设计集用于问题分析。RSM由不同的数学设计组成，BBD已成功地应用于多种药用和芳香植物的提取。响应变量具有线性、二次和交互作用关系，从而在提取过程中获得令人垂涎的生物活性药物。

因此，为了确认受影响的提取变量以及计算响应的内部变异性。BBD用于计算分析，这些关系存在于基于EQ的线性，二次以及双向交互模型组成的不同响应变量之间的关系。1.如下所述。进行多元回归分析以产生秋水仙碱产量（Y）的预测响应值（mg/g干重）。

[A，B，C，D：微波功率（A：300至600W），照射时间（B：3-9分钟），溶剂组合物（C：20％-40％乙醇水溶液）和pH（2-6）分别用作四个MAE独立变量，以达到增强的血清曲线水平G.Superba.. 采用HPTLC法测定秋水仙碱含量（%）。表3.除了秋水仙碱产量的预期值外，还展示了BBD以及三个不同水平的三个不同自变量和实验。秋水仙碱的预测值与实际实验值相关联。秋水仙碱的含量范围为3.445mg/g^-1到7。445毫克g^-1．不同自变量之间相互作用的响应面图如图所示。2.和3.．

模型拟合

方差分析（ANOVA）是基于二阶二次方程（Eqs）计算适应度概率的方法。1.和2.). 表中显示了线性、二次以及自变量交互作用的方差分析分数2.．

概率（P)假设值非常显著，小于0.01。小于0.05的值具有显著性，并用二次方程计算。P二次方程不考虑大于0.05的值，因为它们不显著。

决定系数(R .)表明了该模型在解释所有变化方面的有效性^2.)分别为99.9。假设R质量的接近性^2.对于1表示对实际数据的实验模型的卓越装配。相反，较小的r^2.值，为解释自变量的行为，模型中因变量之间的关系越小。

对于秋水仙碱的产率，微波功率(A)的线性效应有统计学意义(P≤0.00)值得注意(表3.). 微波功率的负二次影响（A）^2.）遵守提取产量的减速。考虑到萃取时间（B），存在阳性线性效果，证实化合物产率与随时间的增加成正比。萃取时间的负二次影响（b^2.)证明了萃取率的降低遵循Fick第二扩散定律。与固溶比（C）相关，所有响应均表现出正线性和负二次效应。微波功率×辐照时间、辐照时间×pH、辐照时间×乙醇水溶液、辐照时间×pH和乙醇水溶液×pH对秋水仙碱产率的交互作用显著。图中显示了自变量对秋水仙碱产量的主要影响。2.和3.．

如图所示。2.和3.,the optimized conditions for extraction using microwave i.e., microwave power-irradiation time-aqueous ethanol, pH for the better yield of colchicine were found to be irradiation time (6.4 min), microwave power (460 W), aqueous ethanol (30%), pH (3). At these optimized parameters for microwave extraction, maximum predicted yield achieved for colchicine was found to be 7.51 mg g^-1这非常接近预测反应7.48 mg g^-1分别。

HPTLC分析

准备TLC调查证实使用甲苯-甲醇溶剂体系[85:15 (v/v)]作为理想的流动相，导致秋水仙碱在0.27 R的清晰带_F除了生成对分析样品很好分辨的斑点外（图。4.)．在甲醇H后的254 nm处记录斑点_2.所以呢_4.[10% (v / v)喷涂]。对标准化合物进行HPTLC初步指纹分析，并对其参数进行优化。在相似的参数下，记录了样品的指纹图谱。在R_F0.27，秋水仙碱被记录存在。标准品和样品的三维密度图显示出与R_F价值0.27。还注意到了与该峰相关的特征光谱的精确匹配，指定与R的对应的化合物_F对于测试样品和标准相同的值为0.27。秋水仙碱光谱被发现与植物样品的相应峰重叠，如图所示。5.a.通过检测样品与标准品的吸收光谱匹配，验证峰纯度;可理解的重叠性反映了纯度的峰值(图。5.b).校准曲线线性度在1000-5000 ng之间，报道相关系数为0.97。校正图的回归方程为Y = 9178 + 4.527*X。线性回归结果见表4.．

方法验证

对目前的HPTLC方法进行了准确度、重复性和精密度验证（表1）4.). 本方法对秋水仙碱具有特异性，因为它能分解化合物（R_F= 0.27)中存在其他植物化学物质g . superba（图。4.). 反应之间的关系即。，峰面积与秋水仙碱含量在1.0 ~ 5.0 μg范围内呈线性关系，相关系数为0.974.). 同一点秋水仙碱扫描10次（%CV=0.44），以研究仪器精度。

使用11次相同的标准溶液（%CV=0.58）来确定方法的重复性。通过在块茎提取物中添加已知量的秋水仙碱，在三个不同水平上评估了方法的准确性即。50, 100, 150%。3个水平的回收率分别为100.17%、99.87%和100.2%5.)．精密度和重复性是通过评估一天和一天之间的变化，观察到的变化是不显著的。RSD分别为0.37%和0.51%5.)．通过提供标准秋水仙碱光谱和样品对应的峰，在400 ~ 800 nm范围内评价方法的专属性。光谱(无花果。5.)与块茎粉中所含的标记物精确匹配，不受其他植物化学物质的影响。利用该方程确定LOD和LOQ;LOD = 3 xn / B;LOQ = 10XN/B (N=标准峰面积的标准偏差;N=3，作为噪声的测量值；B=相应校准曲线的斜率）。检出限和定量限分别为70ng/带和210ng/带。

秋水仙碱的定量分析g . superba是否会

采用本方法研究了秋水仙碱的含量g . superba化学型。用峰面积参数测定含量（mg/g）^-1）生物活性标记和数据在表中呈现6.. 秋水仙碱含量在2.12-7.58毫克/克之间^-132人中g . superba收集了来自印度11个邦32个不同地区的人口．总共三个g . superba是否会维兹．GS- 3(采自孟加拉的Kalimpong) (7.58 mg g^-1)、GS- 1(采自孟加拉大吉岭)(7.57 mg g^-1)和GS-2（锡金甘托克）（7.37毫克）^-1）被筛选为Elite Germplasms。化学版：GS-27（2.12mg g^-1)，GS-28（2.67毫克）^-1)，GS-26（2.68毫克）^-1）和GS- 11（2.37 mg g^-1在旁遮普和恰尔肯德邦不同产地的秋水仙碱含量分别最低。结果表明，来自印度32个不同地理位置的32个不同群体的秋水仙碱含量存在明显差异(表格6.). 喜马拉雅东部高海拔地区秋水仙碱含量显著高于喜马拉雅西部和印度恒河平原地区。数字6.描述了32种植物中秋水仙碱含量的比较g . superbaHPTLC量化后的群体。基于血清细胞含量进行UPGMA分层树形树木，其中十四个样品维兹．GS- 1、GS- 2、GS- 3、GS- 6、GS- 7、GS- 8、GS- 14、GS- 15、GS- 17、GS- 18、GS- 24、GS- 30、GS- 31和GS- 32被归为一个聚类，其余的18个样品组成第二个聚类。数字7.给出了中药材中秋水仙碱含量的树状图g . superba收集自印度各地不同的自然栖息地，其中集群1代表精英化学型，集群2代表其他植物样本。秋水仙碱含量的变化与温度、紫外线辐射、土壤等因素有关。山地居群的多倍体性g . superba也可能在确定所述化学型中的植物化学成分含量中起关键作用。本研究为秋水仙碱的开采提供了重要的化学足迹g . superba．

采用响应面法筛选和优化重要提取参数

本研究采用Plackett-Burman和Box-Behnken设计(BBD)对非常规提取方法(MAE)进行优化。．采用Plackett-Burman设计筛选7个自变量，仅筛选4个参数维兹．微波功率、辐照时间、溶剂组成和pH值对秋水仙碱产率有显著影响。通过BBD评价这四个MAE自变量的线性、平方和交互效应，以获得最大的秋水仙碱产量g . superba. 在这些优化的微波参数下，秋水仙碱的最大预测产率为7.51mg/g^-1. 另一项研究报道了三个提取参数（时间、功率和甲醇浓度的相互作用）对BBD提取秋水仙碱的影响[45]. 然而，与绿色方法相比，传统方法消耗溶剂量大、提取时间长且不环保，因此成本较高。在本研究中，MAE以较短的时间（6.4min）和30%的乙醇水溶液获得较好的秋水仙碱产率。采用MAE和无毒溶剂对多种生物活性化合物进行绿色提取，得到了相似的结果即。五环三萜、仲环烯醚萜、口山酮苷类等[35,41,43］．

秋水仙碱的定量分析g . superba是否会

化学分类学的研究是鉴定优良种质的必要条件g . superba用于靶向代谢物的商业探索。在目前的研究中，开发了验证的HPTLC方法，用于筛选高代谢物产生趋化型g . superba．由于过度开发和不加选择的采集，印度的百合花种群已经濒临灭绝。因此，本研究确定的优良化学型(s)将为商业种植提供优质种植材料(QPM)，并将满足不断扩大的中草药行业的需求。

早期比较了秋水仙科两个属的秋水仙碱含量。格罗索斯和秋水仙．结果表明秋水仙碱积累量较高格罗索斯(0.9%)相比秋水仙(0.62%) (46］．g . superba原产于次大陆，生长在不同的海拔区域(高达2500米)。因此，生长在不同气候条件下的不同植物种群的代谢谱是不同的。因此，这种群体可以称为化学型。32种药材中秋水仙碱的定量分析g . superba在0-2045米的高度范围内生长的人口透露，海拔高度在趋化物之间的血肠含量起着至关重要的作用。沿着高度梯度的各种代谢物的数量中的类似帧内调制在不同的植物物种中提前注意到[47,48］．次级代谢物分析的这种海拔受影响的变异归因于若干生理，生态和环境因素。UV-B辐射升高，降低温度和酚类的根本清除性质[47,49,50,51,52,53,54,55,56］．Misra等人[31]还建立了一种高效薄层色谱法测定中药材中秋水仙碱和葛罗庚碱的定量方法g . superba从喜马拉雅山脉锡金。然而，他们的研究仅限于5种g . superba．此外，另一项研究评估了Karyomorphologyg . superba从西里古里、大吉岭和锡金采集的植株显示，锡金植株表现为四倍体，而其他植株为二倍体[57]. 因此，秋水仙碱含量较高的上坡种群g . superba也可能与所采集样本的倍性水平有关。然而，需要进一步的结论性研究来证明这一假设。在一些早期的研究中，自然或诱导的多倍体化与不同药用植物次生代谢产物的质量和数量有关[58,59]. 不同海拔高度的物种表现出不同的生物学特性，这主要是由于它们对不同环境条件的适应。在目前的调查中，秋水仙碱在高海拔地区的数量显著增加可能是由于适应不同的温度、紫外线辐射、湿度、土壤类型和干旱的结果。

在这项研究中，一个优化和验证的方法，同时MAE和HPTLC定量的抗癌秋水仙碱在印度自然人群中g . superba用于鉴定精英化学型。本研究中的所有统计指标都支持RSM作为一个成功的工具，从不同的角度优化MAEg . superba其中只有四个参数，例如微波，辐照时间，溶剂组合物和pH的时间表现出对血小藻产率的影响，如上所述P级别为5％（P< 0.05)。HPTLC研究结果表明，该方法在建立的范围内具有良好的线性、重复性、选择性和准确性。该方法是一种快速有效的分析技术，可在短时间内筛选大量样品。秋水仙碱含量在2.12 ~ 7.58 mg g之间^− 1.32人中 g . superba收集了来自印度11个邦32个不同地区的人口．据报道，从印度东部地区（大吉岭-西孟加拉邦）采集的样品中秋水仙碱含量最高（7.58%） 毫克 G^− 1.）和Gangtok-Sikkim（7.37 mg g^− 1.)，在不同群体中筛选为优良种质。这些精英g . superba在植物化学含量方面，种群可以被当地人民保存和大量繁殖。秋水仙碱含量的变化与海拔高度有关，可能与温度、紫外线辐射、土壤等因素有关。山地居群的多倍体性g . superba也可能在确定化学型中的植物化学含量中起关键作用。本研究提供了一种有价值的植物化学图谱g . superba植物材料将有利于制药工业。

植物材料、试剂和标准溶液

来自32个种群的块茎的小部分g . superba2018-2019年在海拔2045 m至2045 m的印度不同农业气候带采集了相同生长期(花期)的植物(表1)7.)．这些植物是在获得所有土地所有者的许可后从不同的地方采集的，允许我们在他们的私人土地上取样。这种植物被鉴定为g . superbar.cr.博士。Gupta，旁遮普大学植物学系教授，旁遮普邦帕塔尔省。植物材料（凭证标本No 11122018）已储存在生物技术，可爱的专业大学，Phagwara，Punjab。

将块茎在25-32℃下在25-32℃下风干，然后将它们的分段成小片段以加速干燥。为了制备用于分析的均匀粉末，将干燥的块茎研磨成粉末，粉末通过筛子。将所得粉末在室温下储存在黑暗中，以进一步分析。

HPLC级溶剂采购自E.默克(孟买，印度)。采用MilliQ PLUS净化系统(美国Millipore公司)获得超纯水。标准秋水仙碱购自美国Sigma-Aldrich公司。所有的分析级化学试剂都在分析中使用。将秋水仙碱(10mg)溶于10ml甲醇中，配制为1mg / ml的储备溶液。为了制备校准曲线，将原液连续稀释，制成不同浓度的标准溶液。

样品制备

在初步实验中，从每个种群中提取一克阴影干燥的粉状物质g . superba分别用甲醇（3x25ml）萃取。将单个烧瓶放置在转速为100 rpm的旋转振动筛上6小时。将悬浮液置于室温（22±2℃）下过夜后，进行所有提取物的汇集。

此外，还对不同的提取工艺参数进行了优化，以评价微波辅助萃取的效果。在这种情况下，粉末块茎（每个0.5克）的g . superba采用不同的提取参数，在100ml密闭容器单元中采用微波辅助萃取(MAE)(模型:LG MC7849HS)提取。滤纸(Whatman No1)用于过滤抽提物在真空中蒸发后，使用旋转蒸发器(型号:Eyela N-1100，中国)产生固体质量的抽提物，然后倒入甲醇(1毫升)，然后超声(10分钟)。用色谱法和秋水仙碱定量。

响应面法优化MAE的试验设计

采用Minitab统计软件进行实验设计。采用两阶段试验程序:i)检验显著性独立参数，采用Plackett-Burman设计，ii)验证最优水平和重要参数之间可能的相互作用，采用组合设计。

Plackett-Burman模型

为了优化提取工艺g . superba块茎秋水仙碱,采用Plackett Burman模型来分析重要参数。

Plackett–Burman设计基于以下一阶模型：

（其中Y是预期的目标函数，β₀缩放是常数和β吗_一世表示回归系数）

不同变量的影响即。考察了微波功率（300和600w）、辐照时间（3min和9min）、粒径（0.5和1.0mm）、溶剂组成（20%-40%乙醇水溶液）、固溶比（15和30g/ml）、pH值（2和6）和提取步骤（1和2）对秋水仙碱提取的影响。进行两水平实验，其中（+）表示最大值和最大值(−) 分别表示最小值（表1.)．

对上述变量进行了12次重复试验(表1)1.)．在5%水平(P<0.05）如表中展出2.．

Box-Behnken设计(bdd)

实验过程中，采用4因素BBD 3水平(-1、0、+1)模型对MAE的重要参数进行评价。以微波功率(A: 300-600 W)、辐照时间(B: 3- 9min)、溶剂组成(C: 20%-40%乙醇水溶液)和pH值(2-6)为自变量，微波提取中值得注意的三个因素为微波功率(A: 300-600 W)、辐照时间(B: 3- 9min)、溶剂组成(C: 20%-40%乙醇水溶液)和pH值(2-6)3.). 为了评估微波策略的稳定性和获得最佳秋水仙碱收率（%），采用了较高和较低的响应值。应用BBD优化秋水仙碱的产量g . superba．来自Colchicine的RSM模型响应值优化g . superba根据二次方程:

[其中是否需要Y生物活性化学的预测响应值，n是n = 3的独立变量的总数，β₀,β_一世,β₂,和β_ij分别是截距，线性，二次和相互作用效应的回归系数;X_一世 andX_j.是各种提取参数（i和j为1到n个变量）]。分析了MAE对秋水仙碱产量的影响(P.< 0.01)(表3.)．

秋水仙碱的HPTLC定量分析

HPTLC机制由三部分组成即。CAMAG Linomat 5自动取样器(Muttenz, Switzerland)， CAMAG TLC扫描仪3和一个附加软件(CATS;版本:1.4.4.6337)。薄层色谱板预涂硅胶60 F₂₅₄1.05554(默克公司。0007;固定相的尺寸为20cm × 10cm，层厚为0.25 mm。样品以6mm宽波段、10mm轨道距离的方式放置于平板中，采用带100 μl汉密尔顿注射器的氮气流送样器，送样速率为150 nl/s。流动相由甲苯-甲醇85:15 (v/v)组成，在双槽流动相汽相饱和玻璃室(CAMAG)内线性上升至80 mm;显影后，在100℃下干燥10分钟，用甲醇硫酸溶液[100毫升10% (v/v)]衍生。密度扫描在254 nm处进行。分别测量了5 mm × 0.45 mm和100 nm/s时的狭缝尺寸和扫描速度。

为了分析线性和校准，将标记储备溶液（1.0、2.0、3.0、4.0和5μl）施加到板上，以提供从100 ng到500 ng/带的量。采用相应浓度绘制峰面积，并进行回归分析，得出校正方程。为了分析地下块茎粉末提取物，将第2.2节所述的10μl获得的样品注入培养板。以标记纯度为100%为标准，经展开、衍生化、扫描、峰面积测定，计算秋水仙碱的含量。

将植物样品的提取物和标准溶液(1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 μl)分别置于薄层色谱板上，按上述方法进行分析。在峰面积解析后，以秋水仙碱的标准用量为依据，通过峰面积图生成定标图。此校正图用于计算秋水仙碱的数量存在于化学型。

方法验证

通过分析峰纯度、线性、检出限(LOD)、重复性(见表1)来确定方法的有效性4.)、回收率、日内及中间精密度(表5.)从块茎中提取的秋水仙碱。每种秋水仙碱标准溶液（相当于100、200、300、400和500 ng/band）分三次给药。以秋水仙碱的含量为对照，进行峰面积作图，得到校正曲线，并确定线性范围。对同一波段秋水仙碱（500ng）进行6次扫描，以检验仪器的精密度。峰面积和R_F测定了变异系数百分比的均值和标准差。从测量仪器精度或重复性的调查中获得的结果如表所示4.. 将标准溶液注入平板（一式三份），并测定%CV以测试评估秋水仙碱条带的重复性。样品中分别加入50%、100%和150%秋水仙碱，通过测定三个水平的回收率来检验方法的准确性。向1.0 g含有约0.76 mg秋水仙碱的粉末状植物材料中添加已知量的标准秋水仙碱，提取样品，并按照上述方法测定秋水仙碱的量。测定了所有三个水平的回收率（表1）5.). 精密度通过分析三个平板上提供的每个平板上三个带的样品溶液来计算，以确定日内精密度。为了确定中间精密度，在第二天对每个平板上三个带的样品溶液进行分析，并列举%CV（表1）4.)．在确定方法特异性时，采用根据标准血清曲霉的吸光光谱的测试样品的相应峰（在200-800nm范围内）。使用甲醇（空白）采用不同稀释液中的标准溶液，分别分辨分别检测和定量限制（LOD和LOQ）的限制。

当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。

作者感谢生物工程和生物科学系，可爱的专业大学，为实验室设施提供实验。

可爱的专业大学提供资金支持，但在研究设计、性能、数据收集和分析、决定出版、或编写稿件方面没有作用。

作者笔记

1. 德文德拉·库马尔·潘迪和普拉布乔特·考尔对这项工作作出了同样的贡献。

从属关系

1. 生物技术系，生物技术与生物学院，可爱的专业大学，Phagwara，Punjab，144411，印度

   Devendra Kumar Pandey, Prabhjot Kaur和Vijay Kumar

2. 印度理工学院生物化学工程学院，印度瓦拉纳西

   r . m . Banik

3. 埃塞俄比亚贡达尔大学医学和卫生科学学院生物化学系

   塔巴拉克·马利克

4. 校长大学生命科，86/1学院街，加尔各答，700073，印度

   Abhijit戴伊

贡献

DKP负责构思和监督工作，PK负责实验并撰写稿件，AD负责稿件，VK负责统计部分，RMB负责表格和图表的编制，TM负责稿件的编辑。所有作者均已阅读并批准稿件

相应的作者

对应于Devendra Kumar Pandey或塔巴拉克·马利克或Abhijit戴伊．

道德认可和参与同意

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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