一种改进而有效的GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba瞬态转化的注射器浸润及其在杨树基因功能释放中的应用GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

林木具有重要的经济和生态价值。杨树作为一种模式树，在阐明树木生物学的分子机制方面发挥了重要作用。然而，突变体库的缺乏和稳定的遗传转化过程的耗时严重限制了杨树基因功能特性研究的进展。因此，需要一种方便、快速的瞬时转化方法来促进杨树功能基因组学的研究进展。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

对11个杨树无性系进行了注射器渗透驯化筛选。对土壤生长的幼苗叶片下侧进行注射器渗透。通过观察β-葡萄糖醛酸酶(GUS)和绿色荧光蛋白(GFP)的瞬时表达情况。以报告基因荧光素酶(LUC)的表达水平为基础，优化注射器农业渗透的实验参数。以叶片为外植体，通过诱导愈伤组织再生获得稳定转化植株。的功能GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba用碱性葡萄蛋白染色后，通过在其中可视化木质素沉积来表征二次细胞壁增厚的基因。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

我们大大提高了注射器的瞬态变换效率GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba通过从不同的杨树无性系中筛选合适的杨树无性系，并优化注射器渗透程序，在杨树中进行渗透。选择杨树无性系，GydF4y2Ba杨树davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2Bap . bolleanaGydF4y2Ba服从GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器渗透，这表明细菌悬液在叶片组织内很容易扩散。利用该技术，我们在特定的胞内细胞器中定位了多种杨树蛋白质，并说明了蛋白质-蛋白质和蛋白质- dna的相互作用。瞬时转化叶片可通过愈伤组织诱导和分化获得稳定高效的转化植株。此外，通过与次生壁形成相关的基因的瞬时过表达，在农业渗透的叶片中诱导了原木质部导管元件的转分化和异位次生壁增厚。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

应用GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2Bap . bolleanaGydF4y2Ba在GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器渗透为快速和高通量功能表征提供了基础GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba在完整的杨树植物中，包括那些与木材形成有关的基因，并提供了一种有效的替代GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba稳定的遗传转化。GydF4y2Ba

森林树木具有重要的经济和生态价值，因此一直是树生物学基本问题研究的重点。由于几种生物优势，包括快速生长速率，小基因组大小，易于克隆繁殖和遗传转化[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]，杨树已被用作模型来评估树木独特生物学的细胞和分子机制，如广泛的二次生长和多年生习性。就像几个GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba物种已被排序[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba[杨树基因功能的阐明可以为森林树木的遗传修饰提供基础。然而，缺乏突变文库和耗时的稳定遗传转化过程严重限制了杨树功能基因组学的进展。因此，需要在杨树中方便快速的瞬态转换方法，并将增强高吞吐量功能分析GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba基因。GydF4y2Ba

瞬时基因表达因其简单、快速、高效而成为研究基因功能的有力工具[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．目前，三种瞬态转化技术 - 生物轰炸，原生质体转化，和GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba渗透-已被广泛应用于基因功能分析，如感兴趣蛋白的亚细胞定位，蛋白之间的相互作用，转录因子的交易，和基因过表达或抑制[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．然而，生物轰击法和原生质体转化法的一些缺点限制了它们在基因功能高通量分析中的应用。例如，由于需要金微粒和昂贵的基因枪系统，生物轰击相对昂贵[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba并可能导致水稻和玉米基因组受损[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]．原生质体转化不适合于细胞间大分子运输的分析。此外，原生质体制备过程中细胞壁的去除导致了细胞骨架和内质网(endoplasmic reticulum, ER)亚细胞组织的改变，这将影响定位在这些区段的蛋白质的实验结果[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．这些限制在生物轰击和原生质体转化GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba渗透是暂态转化的首选方法。作为一个结果,GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba渗透已成为植物瞬时表达的有利基因传递方式[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

农杆菌属GydF4y2Ba渗透，通过该渗透到完整植物的器官中的悬浮液体细胞的悬浮培养物，为瞬时表达外国基因提供了一种快速有效的方法GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]．由于T-DNA转移的高效率，这项技术的力量已被描述在许多植物物种，如GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba公司一GydF4y2Ba[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]．它已被广泛应用于转基因互补[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]，在完整植物中进行交易化验[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba，植物与病原体相互作用[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba),启动子分析GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]，鉴定基因的生物学功能[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba，蛋白质生产[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba，研究蛋白质定位的各种瞬时表达试验[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba，以及蛋白质-蛋白质相互作用[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．多年来，已经发展了几种农业渗透方法，包括注射器渗透(农业注射)[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba，真空渗透[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]和农醉酒（植物根邻近的土壤浸透GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba悬架)[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．其中，真空浸润法操作复杂，结果多变，通常表达较弱，这可能是由于血管对组织的渗透不均匀造成的GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba悬架(GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．Agrodrench通常与根中表达的基因一起工作[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．注射器渗透是进行基因功能分析的最简单、最有效的农业渗透方法。它允许在单个叶子上执行多个瞬时表达分析[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba，有利于优化可能影响蛋白表达效率的实验参数。虽然只有少数植物可以自然地接受注射器渗透[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]，经过努力，注射器渗透已成功应用于GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba),烟草(GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]， 洋葱 [GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba),土豆GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba),柑橘类(GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba,番茄GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]，葡萄[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]和生菜[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．然而，这种简单且高效的技术尚未在杨树应用，可能是由于无法的GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba悬浮扩散在叶内。事实上，在农业渗透中高水平的瞬时表达高度依赖于细菌悬浮液穿过表皮屏障后在叶组织内广泛分布的能力[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．传播的容易GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba叶片内的悬浮液使GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba最受欢迎的主机工厂GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器的渗透。反之，传播有限GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba从叶静脉网络中悬架使该方法在混合Aspen中失效GydF4y2BaPopulus mrelulaGydF4y2Ba×GydF4y2Bap .美洲山杨GydF4y2Ba[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．值得一提的是，能力GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba悬浮液在叶片内弥散在物种内的品种的不同之处，如葡萄藤所示[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]土豆植物[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．因此，通过对杨树无性系的广泛筛选，有可能在某些无性系中加强注射器渗透法。GydF4y2Ba

在这项研究中，我们在不同的发展阶段评估了11种不同杨树克隆的回应GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器渗透，发现白杨杂种GydF4y2Ba杨树davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba是最顺从的吗GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器浸润，细菌悬浮液在渗透后容易蔓延。我们优化了几种影响注射器农药的实验参数，并实现了高水平的瞬态基因表达GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba．我们将这种瞬态转换方法应用于表征GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba在杨树次生细胞壁(SCW)生物合成相关基因的基础上，研究了调控杨树次生细胞壁(SCW)生物合成的分子机制。此外，我们还开发了一种利用农业渗透叶片作为外植体生成稳定转化杨树品系的方法，该方法可方便地用于叶表皮以外细胞类型中需要进一步研究的基因的功能表征。此外，在本研究中，我们首次揭示了植物对注射式农业渗透的适应性与细胞间空气空间的体积和叶内叶肉细胞的排列有关。GydF4y2Ba

杨树无性系筛选GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器渗透GydF4y2Ba

为了增强杨树瞬时测定的注射器渗透方法，共有11个白杨克隆，包括四个白杨克隆（GydF4y2Ba白杨变种锥体GydF4y2Ba， IE。，GydF4y2Bap . bolleanaGydF4y2Ba那GydF4y2Bap . tomentosaGydF4y2Ba'bjhr01'，GydF4y2Bap . tomentosaGydF4y2Ba‘741’,GydF4y2Bap . tomentosaGydF4y2Ba' B331 ')、三棵白杨或混合白杨(GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba那GydF4y2Bap·阿尔巴GydF4y2Ba×GydF4y2Ba格兰葫芦GydF4y2Ba84 KGydF4y2Bap . tremulaGydF4y2Ba×GydF4y2Ba阿尔巴GydF4y2Ba'Inra 717-1b4'），一个白杨杂交（GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba)、两棵白杨(GydF4y2Bap . euramericanaGydF4y2Ba“74/76”和GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba),和一个GydF4y2Bap . popularisGydF4y2Ba' 35-44 '，筛选对注射器渗透的适应性。我们选择GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba菌株EHA105，广泛用于稳定的遗传转化GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba物种 [GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]，初步评估。这种应变包含报告者二进制载体GydF4y2Ba超级GydF4y2Ba：GydF4y2Ba绿色荧光蛋白GydF4y2Ba-GydF4y2Ba国旗GydF4y2Ba或CaMVGydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba-GydF4y2Ba介绍GydF4y2Ba便于瞬态表达式的可视化。超级启动子由octopine synthase和mannopine synthase2 '的转录激活元件以及最小启动子组成[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]．通过使用没有针的注射器，GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba渗透介质中的光密度（OD）的悬浮液（OD）为1 [10 mm mgclGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在生长1个月后，将5 mM ms - koh (pH 5.6)和0.2 mM Acetosyringone (AS))注入土壤生长植株完全展开叶片的下表皮。不同无性系间植物对注射式农业渗透的响应差异较大。渗透的细菌悬液在无性系叶片内很好地扩散GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba白杨变种锥体GydF4y2Ba,GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa).然而，在其他克隆中，悬浮局限于一个非常小的区域，有时只有注射器头的大小。我们注意到，叶脉网络对农杆菌悬液在这些无性系中的传播起到了限制作用，这一点在无性系叶片LPI 3中得到了证实GydF4y2Bap . tomentosaGydF4y2Ba'b331'和GydF4y2Bap . popularisGydF4y2Ba'35 -44'。虽然细菌悬浮液可以在叶片内弥漫GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba，来自注射器渗透的压力经常引起渗透区上的凸点，这进一步导致下表皮从叶片组织的其余部分分离，并对渗透叶引起一定程度的损伤。对于克隆GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba白杨变种锥体GydF4y2Ba时，菌悬液易于渗透叶片组织，且随着液体在叶片组织内扩散，渗透面积增大。值得注意的是,克隆GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba是最容易处理的，细菌悬浮液在所有完全展开的叶片中传播轻微，特别是在叶片塑化指数(LPI) 4的叶片及其以下的叶片中，在大多数情况下，只需少量操作即可到达叶片周围(图)。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa). LPI作为叶龄的指标[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba在本研究中，LPI 4表示长度从植物顶部长于20毫米的第四叶。GydF4y2Ba

接下来，通过监测报告蛋白表达来检测转化事件。易于检测到绿色荧光蛋白（GFP）的信号GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba在渗透后3天（DPI）GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba荧光激发手电筒(夜间海，美国)(数据未显示)。由于在荧光激发手电筒的作用下，由于注射器头的机械压力对叶片组织的损伤会发出错误的荧光信号，这使得在菌悬液不能很好地在叶片内扩散的无性系中评估GFP报告基因的表达变得非常困难，我们检测了5dpi下GUS报告基因的表达，以监测不同克隆之间的差异转化(图)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba在克隆b)。GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba时，所有浸水叶片均发生大面积的转化。对于克隆GydF4y2Ba白杨变种锥体GydF4y2Ba（IE。，GydF4y2Bap . bolleanaGydF4y2Ba)，农菌悬液到达的区域GUS染色呈阳性，特别是叶片LPI 4。相反，在叶中没有观察到转换事件GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba，可能是由于叶片生理状态不佳，尚未完全从渗透损害中恢复过来。在其他8个无性系中，GUS仅在叶片注射器接触区附近检测到，这与农杆菌悬浮液在叶片内的微弱传播一致。GydF4y2Ba

我们注意到克隆中易于扩散细菌悬浮液GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba白杨变种锥体GydF4y2Ba,GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba．其中,克隆GydF4y2Ba白杨变种锥体GydF4y2Ba是白杨杂交的雄性父母GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba．这表明遗传背景可能对农杆菌悬液在叶组织内的可展布性起重要作用。为了评估叶片内部结构在农菌悬浮液扩散中的作用，我们观察了被测无性系叶片的横切面(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bac).令人惊讶的是，我们发现这三个杨树无性系叶片下侧的细胞间隙更大，更连续，表明农杆菌悬液在叶片组织内的传播更好。特别是克隆人GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba在所有测试克隆中具有最大的细胞间空间，这延伸了广泛和连续，并占据了一半的叶片横向区域。相反，在其他克隆中，农杆菌悬浮液限于较小的区域，因为空气空间较小，并且通过静脉组织细胞和压实的叶肉细胞更加小时。另外，克隆的叶子中还有其他不同的特征GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba这可能是其在农业渗透中的良好表现。特别是叶肉细胞排列松散，几乎每个细胞都被空气包围，甚至在叶脉组织簇与下表皮之间也存在空气(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bac).这些数据表明，不同的叶片内部结构有助于农菌悬浮液进一步扩散，并与叶细胞有更多的接触GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba而不是在其他克隆中，这极大地促进了农药的高瞬态表达效率。GydF4y2Ba

由于白杨杂交GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba最容易渗透(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa）并且显示出相对高的瞬态表达效率（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab)，通过定量分析三个悬浮传播克隆中报告荧光素酶(LUC)的酶活性进一步验证了这一点GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba白杨变种锥体GydF4y2Ba,GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)，选择在杨树上进行注射式农业渗透，并用于后续试验。GydF4y2Ba

生物体的生理状态的影响，GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba突变表达效率的菌株和化学成分GydF4y2Ba

在本研究的数百次渗透中，我们发现不同生理状态和不同发育阶段的植物以及不同年龄叶片的瞬时基因表达水平存在很大差异。此外,GydF4y2Ba农GydF4y2Ba用于渗透的菌株对瞬时基因表达水平有显著影响。从最初的实验中，我们发现，在生长室内的Murashige & Skoog (MS)培养基中培养的杨树植株，叶片比在土壤中生长的植株更薄，由于细菌悬液未能在叶片组织内扩散，所以对农用细菌的注射渗透具有抗性。在土壤中生长的植物，较低和较老的叶片更容易渗透，细菌悬液在这些组织中广泛传播。我们还发现GydF4y2Ba农GydF4y2Ba通过免疫印迹法在5dpi检测GFP-Flag报告基因的表达，菌株GV3101表现出比EHA105更高的瞬时表达效率(图SGydF4y2Ba2GydF4y2Ba无花果。SGydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.此外，当渗透介质含有1.6mm的时，获得最高的LUC活性（图SGydF4y2Ba2GydF4y2Bab).在前期试验结果的基础上，报道了影响农业渗透瞬时转化效率的试验条件[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba进一步优化，包括植株发育阶段、叶龄、品系GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba通过定量报告LUC酶活性，了解细菌生长阶段和细菌密度、AS浓度、浸润介质和表达时间。GydF4y2Ba

使用GydF4y2Ba农GydF4y2Ba本研究以品系GV3101为材料，对10、11、12、13和14个不同PI发育阶段植株的叶片LPI 4进行了渗透，以定量分析株龄对瞬时基因表达的影响。PI被用作植物年龄的指标[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]，利用植株叶片长度超过20 mm的叶片总数来表征植株年龄。我们发现，PI值为10 ~ 12的杨树幼苗的LUC活性比PI值为13 ~ 14的杨树幼苗的LUC活性高2倍左右(图13 ~ 14)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种）。由于PI 12时代的植物在不同年龄的植物中表现出最高的瞬态表达，因此选择对叶片发育阶段对瞬时表达效率的影响。这些测试也使用GydF4y2Ba农GydF4y2Ba应变GV3101。在LPI范围为3 ~ 6的叶片中，LPI 4的表达效率最高(图4)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab).因此，在接下来的实验中，对在气候室土壤中生长约2周的植物PI 12的叶片LPI 4进行了瞬时测定。GydF4y2Ba

接下来，我们评估了GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba菌株GV3101、EHA105、AGL1、LBA4404和C58C1通过定量报告LUC酶活性对瞬时检测效率的影响。瞬时表达效率在各菌株间存在显著差异。值得注意的是，GV3101菌株的LUC活性最高，而EHA105和LBA4404菌株的LUC活性最低(图4)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac).然后我们研究了GV3101培养的细胞浓度和生长阶段是否影响基因表达效率。不同细菌密度和生长阶段的培养物间无显著差异(图SGydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).然而，更新培养的LUC活性略高于未更新培养(过夜培养)(图SGydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).此外，使用渗透介质[10 mM MgCl]评估AS剂量对瞬时基因表达水平的影响GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，含有0.2,0.8,1.6或3.2mm的5mm Mes-Koh（pH 5.6），如植物PI 12.再次，我们发现获得最高的LUC活性，含有1.6毫米，约为比大约三倍高从0.2mm的培养基获得（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad).此外，我们发现浸润后LUC活性逐渐增加，在5 dpi时达到最大值，随后缓慢下降(图5)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bae）。为了进一步改善瞬态测定，两种类型的渗透介质[10 mm mgclGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，5 mm Mes-Koh（pH 5.6）和1.6 mm AS]和[0.5×MS培养基，5mm MES-KOH（pH 5.6）和1.6mm，为1.6 mm]，根据报道进行修饰[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba，结果与我们的实验结果非常相似(图SGydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

总结优化实验的结果，在5 dpi时，得到了本研究中最高的瞬态表达式GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba从植物pi 11-12中留下LPI 4被渗透GydF4y2Ba农GydF4y2Ba菌株GV3101悬浮在浸润介质中[0.5 × MS培养基，5 mM MS - koh (pH 5.6)和1.6 mM AS]。用于实现高瞬时表达的理想植物和叶片如图所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一个。另外，在最佳瞬态变换条件下获得的报告GFP的表达如图2所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba湾在两表皮细胞和培养基细胞中检测到荧光信号。随后的实验在这些最佳的瞬时转化条件下进行。GydF4y2Ba

杨树各种蛋白质的亚细胞定位GydF4y2Ba

瞬态转化的主要应用之一是监测靶蛋白在活细胞亚细胞室中的定位。为了验证杨树蛋白质亚细胞定位的瞬时转化试验，几种类型的蛋白质针对不同的亚细胞室，如质膜(PM)、内膜室(如液泡膜、内质网和高尔基体)、细胞核和质体细胞器，与绿色荧光蛋白融合，在杨树叶片上进行注射器式农业渗透表达GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba．我们首先确定PDBCBL1的亚细胞定位（钙碱B样钙传感器蛋白1）[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]，其定位于PM和监管NAGydF4y2Ba^+GydF4y2Ba/ KGydF4y2Ba^+GydF4y2Ba内稳态的GydF4y2Ba胡杨GydF4y2Ba．PdbCBL1-GFP融合蛋白定位于细胞中的PM，与PM染料FM4-64 (Invitrogen)的荧光完全重叠(图)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。接下来，几种表征杨树蛋白的端膜隔室中的定位，金属耐受蛋白1（MTP1）[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba，肉桂酸-4-羟化酶(C4H) [GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]、糖基转移酶家族47 (GT47C) [GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]在我们的瞬时表达实验中得到证实。PdbMTP1-GFP在液泡内可见绿色荧光，与FM4-64标记的PM相区别(图2)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)，与PtoMTP1蛋白在液泡膜上作为液泡锌转运体的功能相一致[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．PdbC4H-GFP的荧光信号分布在网状网中，并与ER标记蛋白HDEL-mCherry的红色荧光重叠[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bac). PdbGT47C呈点状，与共表达的高尔基囊泡标记NAG-mCherry重叠，与其在次生壁形成过程中葡糖醛酸聚糖生物合成的功能一致[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad）。此外，PtomyB221，MYB转录因子的调控的成员[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]，显示定位于细胞核，通过与DAPI (Sigma)染色细胞核共定位证实(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae）。PDBPRXQ，这是涉及解毒过氧化物的过氧杂志家族的成员[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba]，在叶绿体中定义并与叶绿素自动荧光共同定位（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baf).相比之下，Super启动子驱动的调控GFP信号在表皮细胞的细胞质和细胞核中普遍表达(图)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bag).因此，转化细胞中多个靶蛋白的表达验证了瞬时转化试验及其亚细胞定位的实用性GydF4y2BaPopuluGydF4y2BaS基因的同源植物系统。GydF4y2Ba

蛋白质-蛋白质和蛋白质- dna相互作用的共转化GydF4y2Ba

瞬时转化试验的另一个标准应用是检测活细胞中的蛋白质-蛋白质和蛋白质- dna相互作用。这些研究常用的方法，如BiFC(双分子荧光互补)、split-luciferase、CoIP(共免疫沉淀)、FRET-FLIM (Förster共振能量转移)[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba，和交易试验，在这里进行注射器农业渗透杨树。首先，由于同型二聚体的形成，AtWRKY40与自身的相互作用验证了BiFC分析[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba]．在ATWRKY40-yfp的共同表达后，在核中检测到YFP信号GydF4y2Ba^NGydF4y2Ba与AtWRKY40-YFPGydF4y2Ba^CGydF4y2Ba，通过DAPI染色证实，而阴性对照组合中未观察到荧光，说明AtWRKY40与自身存在相互作用(图)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).然后与PM中形成复合物的硝酸盐转运体AtNRT2.1和AtNRT3.1进行荧光素酶裂解分析[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]．与阴性对照相比，ATNRT3.1-Nluc和ATNRT2.1-CLUC的CO-DEAD LED在杨树叶中的较强的LUC活性，仅显示了背景水平LUC活动（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab).接下来，我们选择PtoUBC34(泛素结合酶34)与PtoMYB221蛋白组合，在ER中形成复合物[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]，通过生化共免疫沉淀(CoIP)和Förster共振能量转移(FRET-FLIM)实验验证更真实的蛋白相互作用。CoIP显示，flag标记的PtoUBC34s(截断的UBC34)与myc标记的PtoMYB221共沉淀(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bac），建议形成复杂的。FRET-FLIM实验表明，当用PtomyB221-RFP共表达时，PTOUBC34S-YFP荧光信号的寿命显着降低（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba这意味着它们在纳米尺度上足够接近，并形成了一个复合物。最后，我们证明了SUPRD的转录抑制活性[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba在与记者共同表达效应Gal4bd-suprd时，相对LUC活动的显着降低GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaGAL4GydF4y2Ba-GydF4y2Ba卢克GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bae).此瞬态分析能够证明GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba蛋白质相互作用GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba通过BIFC，分裂荧光素酶，COIP和FRET-FLIM，以及进行交易测定。GydF4y2Ba

由瞬时转化的叶片产生稳定转化的植株GydF4y2Ba

为了确定瞬时转化基因整合到植物基因组的可能性，我们研究了是否能从瞬时转化的叶片中再生出稳定的转化植株。使用两种表达抗潮霉素GFP和表达抗卡那霉素GUS的转化载体。这些报告基因允许我们使用GFP荧光或GUS染色作为标记来跟踪植物再生的各个步骤。通过直接器官发生，再生植株均为非转基因植株。相反，通过愈伤组织诱导的间接器官发生过程产生的再生芽大部分被证实转化了GydF4y2Ba1GydF4y2Ba,无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.值得注意的是，大约67-75％的阳性愈伤组织能够生产至少一个转基因植物。多达约54-97％的外植体与枝条和叶原序形成阳性疾病，41-67％的外植体至少再生一个转基因植物（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.简而言之，GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器渗透杨树叶可用于以高效率产生稳定转化的植物。GydF4y2Ba

杨树叶片木质部导管分子分化和次生壁沉积的诱导GydF4y2Ba

为了进一步探索这种瞬时表达系统在表征SCW形成相关基因方面的潜力，我们暂时过表达了三个SCW生物合成的关键激活因子，即PdbVNS07/WND6A (VND-， NST/SND-和smb相关蛋白，也称为WND)， PdbVNS09/WND2A和PdbMYB020。在杨树叶片中，以特定的方式激活了表皮细胞的次生壁生物合成(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.PDBNVS07 / WND6A的过表达，VND组的成员[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba，导致表皮细胞转分化为原木质部样的导管分子，细胞壁呈环状和螺旋状增厚。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa-b），与其类似的运作GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Baortholog VND7作为植物原生木质部导管分子形成的主调控因子[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]．叶表皮过表达PdbVNS09/WND2A表现出明显且大量的异位次生壁增厚(fig .;GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac-d)，这与其作为纤维细胞中SCW生物合成主开关之一的关键作用是一致的[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba]．PdbMYB020, VNSs主开关下游二级壁生物合成和功能的另一层关键开关[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba]GydF4y2Ba那GydF4y2Ba结果导致表皮细胞带状状次生壁增厚。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bae-f)。因此，通过我们的瞬时转化方法，可以在体内诱导杨树叶片表皮细胞的木质部导管分子分化和次生壁沉积。GydF4y2Ba

农业渗透由于其简单、快速、高效的特点，已被广泛用于许多物种的高通量基因功能研究[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba]．虽然GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba在杂交杨树中建立了真空渗透GydF4y2Bap . tremulaGydF4y2Ba×GydF4y2Ba美洲山杨GydF4y2Ba[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]，复杂的操作和典型的弱表达限制了其在杨树功能基因组学研究中的应用。在这项研究中，我们增强了GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器渗透法使用白杨杂交克隆，GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba．在整个关键实验条件的优化过程中，该克隆表现出高水平的瞬态表达，并易于与更广泛使用的克隆一起工作GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba．高转化效率使得亚细胞定位GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba蛋白质，允许蛋白质相互作用和转录调控分析在同源植物系统中完成。该方法不仅为杨树稳定遗传转化提供了一种有效的选择，而且为杨树次生壁形成相关基因的鉴定提供了新的途径。GydF4y2Ba

白杨杂种无性系GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba，又名山西羊，在中国北方广泛种植。并被选为最佳克隆GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器渗透，因为最容易渗透，瞬时表达效率较高。在该克隆中，细菌悬液很容易通过叶片传播，此前有报道称，这是农业渗透中高水平瞬时表达的关键因素，因为它最大限度地提高了农杆菌对叶细胞的物理接触[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba]．这一推测得到了数据的支持GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba],葡萄藤[GydF4y2Ba35.GydF4y2Baparato [GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba[其中最高的转化效率与农杆菌悬浮液的可扫描性均匀，如叶片组织内的弥漫性，如葡萄栽培品种“炼金油”和马铃薯品种“Katahdin”所示。通过研究所有测试杨树克隆的叶片的内部结构，我们发现农杆菌悬浮液的可铺展性与叶片内的细胞间空间的体积有关，这促进了叶片内的土壤杆菌蔓延，有时涉及静脉网络，由于空气，随着农杆菌悬浮液容易替换，在叶子下侧的温和压力。良好的铺展性通常导致瞬态表达水平，如克隆所示GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba白杨变种锥体GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.然而，有一个例外，那就是克隆GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba显示最大的细胞间隙和良好的扩散性，但瞬时表达水平很低(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.我们提出，与其他克隆相比，辽阔和连续的空间使叶子变成了GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba在农业渗透过程中更容易受到严重破坏。由于细胞间隙很大，叶片内大量细菌悬浮液的重量导致下表皮与叶片组织的其余部分分离，如结果部分所述。由于叶片生理状态不佳，尽管农菌悬浮液在叶片内广泛传播，但叶片细胞的转化往往失败(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.除了叶片细胞间空气空间的体积外，我们发现，农业渗透的瞬时转化效率还受到叶肉细胞和叶脉网络的排列的影响(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.在克隆GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba，松散地布置的叶肉细胞得到了与农杆菌细胞接触的更好机会，然后转化。相反，相对较小和隔间间的细胞间空间和压实的叶片细胞，限制了渗透悬浮液的扩散和克隆中叶片细胞的转化GydF4y2Bap·阿尔巴GydF4y2Ba×GydF4y2Ba格兰葫芦GydF4y2Ba“84 K”,GydF4y2Bap . tomentosaGydF4y2Ba‘741’,GydF4y2Bap . euramericanaGydF4y2Ba“74/76”。此外，叶脉网络对农杆菌悬浮液的限制也已在莴苣和番茄中得到证实[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．这些数据表明，植物对注射器农药的易于性与叶子的内部结构相关。GydF4y2Ba

有趣的是，许多因素被报道对杂交杨树的真空农业渗透很重要GydF4y2Bap . tremulaGydF4y2Ba×GydF4y2Ba美洲山杨GydF4y2Ba，例如细菌密度、生长阶段及渗透介质[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba，对白杨杂种无明显影响GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba(图SGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.在这项研究中，我们发现植物的生理状况在高效注射器中发挥了基本作用GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba．具体来说，我们了解到杨杨杂交幼嫩植株在MS培养基上生长3周，然后在气候室土壤中生长2周，达到近似株龄PI 12，表现出最高水平的表达效率(图12)。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa).在植物PI 12的不同龄期叶片中，LPI 4最容易渗透，表达量最高(图12)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab）。此结果有两种可能的解释。首先，来自植物Pi 12的叶片LPI 4的良好性能（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA-B）归因于其专业的生理状态。通常在生长室条件下在MS培养基下培养至小于1cm的叶片，并在气候室条件下的土壤中越快地发展，并且在渗透时完全扩增。此外，它最近经历了快速细胞扩张的剧烈细胞促进了高水平的瞬态转化，如前所述[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．其次，发现该叶子与在气候室中稍后开发的叶子相比具有较少的葡萄牙，这进一步促进了注射器浸润。青春期的变化可能是生长室和气候室之间的水可用性差异的结果，分别具有叶片LPI 4和较年轻的叶片在前者和后者中进行有机组织。还报道了沙漠灌木的水可用性对青春期发展的影响GydF4y2BaEncelia粉末状的GydF4y2Ba[GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在这项研究中，我们开发了一种有效的替代方法GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba利用农业渗透叶片作为外植体的遗传转化。通过农业渗透将转移基因整合到烟草中也有报道[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]和葡萄藤[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．该方法提高了白杨杂化的频率GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba高达41-67%(附表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)，远高于常规遗传转化过程中叶盘外植体与普通外植体共培养的遗传转化结果GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba液体培养和芽通过直接器官发生再生(16.4%的转化频率)[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba]．本研究中转化频率较高，主要是由于在愈伤组织诱导阶段对转化体进行早期选择的有效性，已有报道有利于转化的成功[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba]．间接器官发生过程中,外植体的愈伤组织形成切割面,增长缓慢沿介质表面,并使密切接触中选择性培养基诱导阶段,允许选择压力下的转化细胞繁殖,然后最小化非转基因逃逸的数量(图GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.相反，在直接的器官发生过程中，通常在叶子中的切割和叶子中的中静脉的切口中引发愈伤组织，可能是从这些主要静脉内的挂钩细胞，土壤杆菌细胞无法通过注射器农药由于静脉周围的紧密对齐的血管束鞘细胞。在培养10天后，在外植体的切割表面的上侧可见这些愈伤组织，并且从叶片薄片的表面快速增长，从而防止它们直接接触选择性培养基（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.由于无效选择，本研究通过直接器官发生的再生植株均为非转基因植株。在培养过程的早期阶段有效选择转化子的重要性可能进一步说明，阳性愈伤组织产生至少一个转基因植株的频率较高(67-75%)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.另外，稳定转化植株的产生进一步证实了这一点GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba注射器渗透可以靶向表皮细胞以外的叶肉细胞中的异种基因，如图所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaB，因为表皮细胞抗脱分化，没有形成愈伤组织和进一步发展成植物的潜力[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．虽然稳定转化系的产生通常需要2-4个月，比瞬时表达的时间要长得多，但本方案中确定的稳定转化系的产生方法为研究叶表皮以外的细胞类型的基因提供了方便的途径。在这种情况下，在叶片表皮进行荧光融合蛋白的瞬时表达分析后，可以直接利用无菌的渗透叶片进行愈伤组织的诱导和再生，从而避免了外植体接种的常规步骤GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba和co-cultivationGydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba介导的杨树转换。GydF4y2Ba

此外，通过过表达次生壁形成主激活因子PdbVNS07/WND6A、PdbVNS09/WND2A和PdbMYB020，农杆菌注射器渗透法可以在体内激活杨树叶片表皮细胞中SCW生物合成的特殊过程(图)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)，这些关键调控因子的激活活性通过与疱疹病毒VP16蛋白的激活域融合而增强GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba]．PDBNVS07 / WND6A的过表达诱导表皮细胞转化为原生毒细胞状容器元件的转化细胞（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa-b)、PdbVNS09/WND2A和PdbMYB020导致表皮细胞发生异位次生壁沉积(图1)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba氟)。由于维管组织深埋在植物体内，对其发育过程的详细分析较为困难。因此，木质部导管分子的离体诱导系统GydF4y2BaZinniaGydF4y2Ba悬浮细胞(GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba悬浮细胞(GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba切除子叶(GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba建立了努力，并提供了关于木质船元素发展的基本信息。因此，在杨树叶中诱导二次壁形成的成功为解剖调节杨树血管发育的分子机制提供了强大的工具。例如，在不久的将来，产生那些SCW产生表皮细胞中的综合基因表达谱分析将有助于阐明木质植物的SCW形成和血管元素分化的专业调节机制。GydF4y2Ba

广泛探索合适GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba本研究建立了杨树注射器渗透试验方法，并对试验参数进行了优化。在本研究中，5 dpi时瞬时表达最高GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba对植物PI 11-12的叶片LPI 4进行了浸提GydF4y2Ba农GydF4y2BaGV3101细胞株悬浮在含有1.6 mM AS的浸润介质中。单株叶片的渗透量足以进行RNA和蛋白质分析。这种方法将有助于快速和高通量的表征GydF4y2Ba杨树GydF4y2BaGE.NE.s, such as analyses of the subcellular localization of gene products and the interaction between proteins and proteins or DNA, the production of stable transformants, and the elucidation of gene biological function and molecular mechanisms, e.g., in the developmental process of protoxylem tracheary elements and the biosynthesis of SCW. Since the transient transformation is conducted in intact plants, this system allows gene function to be elucidated in diverse genetically modified backgrounds, especially in overexpression transgenic lines, RNAi-based gene silencing lines, artificial microRNA-based gene silencing lines, and genome editing lines, either via transient overexpression or silencing of the target genes through syringe agroinfiltration. This makes it possible to manipulate multiple genes in perennial trees, in which crossing between mutant (or transgenic) lines normally takes years.

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

杨树GydF4y2Ba克隆GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba杨珊，张教授的礼物[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba，起源于黑龙江省森林与环境研究院，中国黑龙江省)，GydF4y2Bap . tremulaGydF4y2Ba×GydF4y2Ba阿尔巴GydF4y2Ba“INRA 717-1B4”(美国佐治亚大学叶z教授赠送，源于法国国家农业、食品与环境研究所)，GydF4y2Bap·阿尔巴GydF4y2Ba×GydF4y2Ba格兰葫芦GydF4y2Ba' 84 K '(由中国林业科学研究院从韩国引进，中国北京)，GydF4y2Bap . euramericanaGydF4y2Ba“74/76”(由中国林业科学研究院从意大利引进，中国北京)，GydF4y2Bap . tomentosaGydF4y2Ba' 741 '(河北农业大学，河北，中国)GydF4y2Bap . tomentosaGydF4y2Ba“B331”(北京林业大学，中国北京)，GydF4y2Bap . tomentosaGydF4y2Ba'BJHR01'（北京，中国和北京林业大学北京农业和林业科学院合作育，中国），GydF4y2Bap . popularisGydF4y2Ba'35 -44'（中国林业学院，北京，中国），GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba(中国黑龙江东北林业大学姜涛教授赠送，原籍中国黑龙江)GydF4y2Ba白杨变种锥体GydF4y2Ba(由中国重庆西南大学徐超教授赠送，原籍中国新疆)GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba(Nisqually-1，北美)最初在添加3%蔗糖和0.6%琼脂的Murashige & Skoog (MS)培养基(Phytotech, M519)上培养。杨树植株的无性系繁殖是按照Wang等人的描述进行的[GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba]，培养于MS无菌培养基上，25℃，昼夜光周期16 h/8 h，在生长室中培养。生长3周后，移栽到土壤中，在25°C、昼夜光周期16 h/8 h的气候室中生长。一旦移栽到土壤中，植物就会被透明的盖子覆盖一个星期，以防止水分从叶子中流失。在初步试验中，筛选杨树无性系，在渗透前在气候室中培养杨树植株1个月。用于评价植物年龄和叶龄的影响GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba在瞬时表达效率方面，将5批3周龄试管苗每隔3天移栽到土壤中。当土壤中第一批植株生长3-4周后达到PI 14龄时，对LPI 4叶片进行农业渗透[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]的不同发育阶段植株，以及叶片LPI 12的LPI 3-6。为进一步研究AS浓度、细菌生长期、细菌细胞密度、渗透培养基和瞬时表达时间对瞬时表达效率的影响，将植株置于气候箱中培养2周，即PI ~ 12。GydF4y2Ba

叶注射器渗透GydF4y2Ba

根癌土壤杆菌GydF4y2Ba菌株GV3101，GydF4y2Ba农GydF4y2BaEHA105，和GydF4y2Ba答:rhizogenesGydF4y2BaC58C1是从实验室获得的GydF4y2Ba农GydF4y2Ba菌株AGL1和LBA4404购自上海Weidi Biotechnology Co.，Ltd。（中国上海）。渗透前一天，具有特定二元载体的土壤杆菌（图SGydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）从琼脂平板上的单个克隆开始，在振荡器上在28℃下在LB液体培养基中培养过夜。通过将新鲜培养基（1/50比率，v / v）接种新鲜培养基（1/50比，v / v），再次启动新的细菌培养物，直到ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba ~ 1. Then, the cultures were transferred to Eppendorf tubes and centrifuged at 8000 GGydF4y2Ba在室温下持续2分钟并悬浮在报告的渗透介质中[10 mm mgclGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba， 5 mM meses - koh (pH 5.6)和0.2 mM AS] [GydF4y2Ba29GydF4y2Ba到最后的服药过量GydF4y2Ba_600GydF4y2Ba~ 1在初始实验中。在后续实验中，将农杆菌培养物悬浮在改良的渗透培养基[10 mM MgCl]中GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba， 5 mM MES-KOH (pH 5.6)和1.6 mM AS]代替。为了评价细菌培养的生长阶段和细胞浓度对瞬时表达效率的影响，无论是隔夜OD培养GydF4y2Ba_600GydF4y2Ba在最终OD值为2.0的改良渗透培养基中悬浮后直接进行渗透GydF4y2Ba_600GydF4y2Ba分别为0.2、0.5、1.0、1.5或2.0，或更新培养至最终ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba0.2,0.5,1.0,1.5或2.0，并重新悬浮在具有与原始培养相同的渗透介质中。在农毒素滤冻前，将细菌悬浮液置于室温下1-2小时。GydF4y2Ba

上面描述了用于注射器渗透的植物。通过将1-mL注射器的尖端压在叶片的下侧，将细菌悬浮液通过气孔渗透到杨树叶中通过气孔，并在柱塞上施加温和的压力。通常，将多个注射施加到单叶中以扩大渗透零件。叶片的渗透面积被标记笔圈盘旋，后面将杨树植物在气候室中生长5天，并用于评估基因表达。对于两种或更多种靶基因的共表达，相同的体积GydF4y2Ba农GydF4y2Ba悬浮液GydF4y2Ba_600GydF4y2Ba~ 1.0在渗透前混合。GydF4y2Ba

吕克·活动分析GydF4y2Ba

CAMV.GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2Ba卢克GydF4y2Ba向量(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa)是王教授的礼物(中国农业大学，北京，中国)[GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba]．从叶片浸润区提取总蛋白，用荧光素酶检测试剂(Promega)和荧光读卡器(gloo - max®20/20;根据制造商的协议)。用Bradford蛋白测定法测定蛋白的浓度。以每微克蛋白质的光强度计算LUC活性。每个数据点代表至少8个重复。进行了三个独立的实验。GydF4y2Ba

GUS染色GydF4y2Ba

叶片、愈伤组织和植株经pCAMBIA2301-CaMV转化GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba- intro（图.. sGydF4y2Ba6.GydF4y2Bab)按所述对β-葡醛酸酶(GUS)活性进行染色[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba]．一个来自植物的内含子插入其中GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba以避免报告基因在GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

亚细胞定位和BiFC检测GydF4y2Ba

一些蛋白质的GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba对其亚细胞定位进行了研究。制备gfp标记的载体，编码区域GydF4y2BaCBL1GydF4y2Ba那GydF4y2BaMTP1GydF4y2Ba那GydF4y2BaC4HGydF4y2Ba那GydF4y2BaGT47CGydF4y2Ba那GydF4y2Bamyb221GydF4y2Ba,GydF4y2BaPRXQ.GydF4y2Ba采用特异性引物，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增，其中包括相应的限制性内切酶(表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba)，然后克隆到二进制矢量pSuper1300-GydF4y2Ba超级GydF4y2Ba：GydF4y2Ba绿色荧光蛋白GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac)。GydF4y2Ba农GydF4y2Ba其中载体GV3101悬浮体渗透到lpi4叶片中GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba在上述结果部分所述的最佳实验参数下，使用注射器种植PI 11-12。5 dpi分离渗透叶片，在尼康倒置荧光显微镜TE2000-E下观察GFP荧光信号，激发波长为488 nm，发射波长为510 nm。用mf4 - 64 (20 mg/L, Invitrogen)对质膜染色1 min, DAPI (1 mg/mL, Sigma)对细胞核染色10-20 min，用ER标记融合蛋白HDEL-mCherry [GydF4y2Ba71GydF4y2Ba]使用Golgi标志物融合蛋白Nag-MCHerry表示Golgi [GydF4y2Ba71GydF4y2Ba]．在543nm和610nm的543nm和543nm的发射中检测FM4-64的荧光，并且在358nm和461nm处发射的DAPI。在激发波长为543nm和610nm的发射波长的激发波长下监测红色荧光信号和Nag-mcherry的红色荧光信号。通过其自荧光在488nm的激发和681nm的发射中检测到叶绿素。GydF4y2Ba

对于BIFC测定，编码区GydF4y2BaAtWRKY40GydF4y2Ba采用特异性引物扩增(表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba克隆至pSPYNE173 (NE)和pSPYCEM (CE)载体(图SGydF4y2Ba6.GydF4y2Bae) (GydF4y2Ba72GydF4y2Ba]．在488nm的激发和510nm的激发中观察到YFP的荧光信号。如上所述进行与DAPI染料的核的可视化。GydF4y2Ba

将荧光素酶检测GydF4y2Ba

GV3101GydF4y2Ba杆菌GydF4y2Ba承载建筑物GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaATNRT3.1.GydF4y2Ba-GydF4y2BaNlucGydF4y2Ba那GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaAtNRT2.1GydF4y2Ba-GydF4y2BaClucGydF4y2Ba那GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaNlucGydF4y2Ba,GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaClucGydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baf)王教授赠予(中国农业大学，中国北京)。如所述进行了分裂荧光素酶分析[GydF4y2Ba73GydF4y2Ba经过一些修改。具体地说，转化后的叶片用5 dpi的无针注射器向2 mM荧光素浸润，然后在黑暗中放置6分钟以熄灭荧光。发光强度由微光冷却CCD成像设备(Lumazone PyLoN2048B, Roper Scientific)捕捉，当相机冷却到−110°C时，曝光时间为5-10分钟。图像采集采用Light Field软件进行操作和处理。GydF4y2Ba

Western印迹和共免疫沉淀测定GydF4y2Ba

在western blot中，被渗透的叶子与GydF4y2Ba农GydF4y2Ba携带GV3101或EHA105GydF4y2Ba超级GydF4y2Ba：GydF4y2Ba绿色荧光蛋白GydF4y2Ba-GydF4y2Ba国旗GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad）在5 dpi收获。根据Ticconi等人进行来自叶片和蛋白质印迹测定的渗透末端的总蛋白质的提取。[GydF4y2Ba71GydF4y2Ba]．简而言之，在10％SDS-PAGE上分离15-30μg蛋白质。使用抗标志（MBL）和抗肌动蛋白（ABMART）作为一抗。通过CCD遥控科学成像系统（LAS-4000，FUJIFILM）捕获图像采集。对于共免疫沉淀测定，GydF4y2Ba农GydF4y2BaGV3101窝藏GydF4y2Ba超级GydF4y2Ba：GydF4y2BaPtoUBC34sGydF4y2Ba-GydF4y2Ba国旗GydF4y2Ba或GydF4y2Ba超级GydF4y2Ba：GydF4y2BaPtoMYB221GydF4y2Ba-GydF4y2Ba我的CGydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bag）用于渗透。如前所述进行共同免疫沉淀测定[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

FRET-FLIM化验GydF4y2Ba

PtoMYB221和PtoUBC34s之间的相互作用在以前的研究中有描述[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]．供体载体pGreen0029-GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaYFPGydF4y2Ba-GydF4y2BaPtoUBC34sGydF4y2Ba受体载体pGreen0029-GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaPtoMYB221-RFPGydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaH）通过将杨树转移到杨树叶中GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba- 如上所述介导的注射器渗透。根据报告的方法，在奥林巴斯倒置FV1200显微镜上进行FRET-FLIM，另外配备了Picoquant Picoharp300（德国）控制器[GydF4y2Ba74GydF4y2Ba]．YFP-PdbUBC34s在488 nm处被激发，使用皮秒脉冲二极管激光器通过物镜(40×水浸，NA 1.2)以40 MHz的重复频率工作。发射的光在同一个物镜中收集，并用520/35 nm带通滤波器过滤。然后用MPD SPAD检测器检测荧光。图像中感兴趣的区域被选择并通过采集多达20,000或更多的光子获得。使用SymphoTime 64软件(PicoQuant, Germany)计算每像素的衰减曲线，并采用衰减模型进行拟合。结合供体YFP-PdbUBC34s和受体PdbMYB221-RFP，选择双指数组合，仅以供体YFP-PdbUBC34s为对照，采用单指数模型。GydF4y2Ba

事务分析GydF4y2Ba

向量CaMVGydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba-GydF4y2BaGAL4DBGydF4y2Ba-GydF4y2BaSUPRDGydF4y2Ba和Camv.GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba-GydF4y2BaGAL4GydF4y2Ba-GydF4y2Ba塔塔GydF4y2Ba-GydF4y2BaΩGydF4y2Ba-GydF4y2Ba卢克GydF4y2Ba-GydF4y2Ba号GydF4y2Ba为Masaru Ohme-Takagi教授(日本东京国立先进产业技术与科学研究所)赠予[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba，其中的地区GydF4y2BaGAL4DBGydF4y2Ba-GydF4y2BaSUPRDGydF4y2Ba和GydF4y2BaGAL4GydF4y2Ba-GydF4y2Ba塔塔GydF4y2Ba-GydF4y2BaΩGydF4y2Ba引物扩增(表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba）并克隆到PGreenii 62-SK和PGREENII 0800-LUC的二进制载体中（图SGydF4y2Ba6.GydF4y2Bai）分别产生效应载体和报告载体。表达盒GydF4y2BaRenilla.GydF4y2Ba荧光素酶(RLuc)也包含在pGreenII 0800-LUC载体中，作为内部对照。交易分析使用双荧光素酶报告基因分析系统(#E1980, Promega)根据制造商的协议进行。将每个转换的LUC表达值归一化为RLuc值。每个数据点代表至少8个重复。进行了三个独立的实验。GydF4y2Ba

二次壁感应GydF4y2Ba

SCW生物合成的三个关键激活子的编码区，即GydF4y2BaVNS07 / WND6AGydF4y2Ba那GydF4y2BaVNS09 / WND2AGydF4y2Ba,GydF4y2BaMYB020GydF4y2Ba，被扩增了GydF4y2Bap . davidianaGydF4y2Ba×GydF4y2BaBolleana.GydF4y2Ba引物cDNA序列(表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba)，克隆到二元载体pGreenII 62-SK中(图SGydF4y2Ba6.GydF4y2Bai）用于杨树叶子的瞬态过度表达。载体pgreenii 62-sk用作阴性对照。瞬时转化的叶子在10dpi下用碱性葡萄蛋白染色，并且用相隔的显微镜观察二次壁沉积，如前所述[GydF4y2Ba75GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

稳定转化杨树的世代GydF4y2Ba

被渗透的叶子GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2BaGV3101中含有二进制质粒pSuper1300-GydF4y2Ba超级GydF4y2Ba：GydF4y2Ba绿色荧光蛋白GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac)具有耐潮霉素或CaMVGydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba- intro（图.. sGydF4y2Ba6.GydF4y2Bab）从9 dpi的植物中收获了卡那霉素抗性。这些叶片在运行自来水下彻底洗涤，在2％次氯酸钠溶液中灭菌10分钟，补充有0.01％吐温20，用无菌水冲洗三次。在渗透时标记的叶片的渗透部分被切成碎片，以避免米子。通过愈伤组织诱导的间接器件再生转化的植物。首先，在补充有1mg / L 2,4-D的MS培养基上进行愈伤组织诱导，0.1mg / L Naa，0.2mg / L 6-Ba，0.01mg / L TDZ，0.1g / L int，0.1g/ L CEFO，4.5mg / L潮霉素（用于GFP转化体）或50mg / L Kanamycin（用于GUS转化体）在25°C的黑暗中，在黑暗中为3-4周。然后，将愈伤组织转移到拍摄介质[补充有0.1mg / L NAA的MS培养基，0.2mg / L 6-Ba，0.01mg / L TDZ，0.1g / L Tim，0.1g / L cefo和4.5mg /L潮霉素（用于GFP转化体）或50mg / L Kanamycin（用于GUS转化体），并在25℃下培养16小时光/ 8小时光/暗循环。将这些愈伤组织每2周培养到新鲜拍摄培养基上，直至形成芽。从顶端尖端下降约1.0厘米，从顶端尖端切除芽，并在生根培养基上培养（补充有0.1mg / L Naa的MS培养基，0.1g / L Tim，0.1g / l Cefo和4.5mg / L潮霉素（用于GFP转化体在25°C和16小时光/ 8小时光/黑暗循环时，50mg / l Kanamycin（用于GUS转化体））。在转移拍摄再生之前，在DFP-1双荧光蛋白手电筒（夜海）下，验证了GFP阳性Calli。calli介绍了GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba取再生枝后GUS染色。在移栽至生根培养基后5-10天内生根的再生植株上检测GFP或GUS的表达情况。如前所述，通过直接器官发生进行的转化[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

使用DFP-1双荧光蛋白手电筒(Night Sea, USA)观察转化的愈伤组织和表达GFP报告基因的完整植株中的GFP荧光信号。植物材料用RB-Royal Blue (400-460 nm)照射，通过黄色滤光片进行观察和拍照。GydF4y2Ba

显微镜GydF4y2Ba

杨树离开LPI 4，除了叶子LPI 3的例外GydF4y2Bap . trichocarpaGydF4y2Ba，用来研究叶的内部结构。叶片的横切面已按前面所述准备好[GydF4y2Ba76GydF4y2Ba]．用切片机(德国徕卡RM2265)切割5微米厚的切片，如前所述用甲苯胺蓝O (TBO)染色[GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba]，并使用Leica DM 5500 B光学显微镜（Leica，德国）观察。GydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。本研究中使用的所有材料可从相应的作者获得。GydF4y2Ba

本研究使用的基因登录号为:PdbCBL1 (MN400431)、PdbMTP1 (MN400432)、PdbC4H (MN400430)、PdbGT47C (MN400434)、PdbPrxQ (MN400433)、PdbVNS07 (MN887349)、PdbVNS09 (MN887350)、PdbMYB020 (MN887351)、AtWRKY40 (AT1G80840)、AtNRT2.1 (AT1G08090)、AtNRT3.1 (AT5G50200)、PtoUBC34 (MH708242)。GydF4y2Ba

2,4 - d:GydF4y2Ba

2,现在也是酸GydF4y2Ba

6-BA:GydF4y2Ba

6-苄基氨基嘌呤GydF4y2Ba

BiFC:GydF4y2Ba

双分子荧光互补GydF4y2Ba

CAMV 35S启动子：GydF4y2Ba

花椰菜马赛克病毒35s启动子GydF4y2Ba

Cefo:GydF4y2Ba

头孢噻肟GydF4y2Ba

CoIP:GydF4y2Ba

CoinmunoprecipitationGydF4y2Ba

呃：GydF4y2Ba

内质网GydF4y2Ba

FRET-FLIM:GydF4y2Ba

Förster共振能量通过荧光寿命显微镜测量GydF4y2Ba

LPI:GydF4y2Ba

叶塑料译者指数GydF4y2Ba

卢克:GydF4y2Ba

荧光素酶GydF4y2Ba

乙酰天冬氨酸:GydF4y2Ba

Naphthalene-acetic酸GydF4y2Ba

OD:GydF4y2Ba

光密度GydF4y2Ba

聚合酶链反应:GydF4y2Ba

聚合酶链反应GydF4y2Ba

下午:GydF4y2Ba

血浆膜GydF4y2Ba

PI：GydF4y2Ba

Plastochron指数GydF4y2Ba

RFP：GydF4y2Ba

红色荧光蛋白GydF4y2Ba

RLuc:GydF4y2Ba

Renilla荧光素酶GydF4y2Ba

标准铜线:GydF4y2Ba

次生细胞壁GydF4y2Ba

SUPRD:GydF4y2Ba

超人的类耳母题压抑域GydF4y2Ba

蒂姆:GydF4y2Ba

TimentinGydF4y2Ba

TDZ:GydF4y2Ba

的物质GydF4y2Ba

感谢汪洋教授提供的CaMV载体GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaATNRT3.1.GydF4y2Ba-GydF4y2BaNlucGydF4y2Ba和Camv.GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaAtNRT2.1GydF4y2Ba-GydF4y2BaClucGydF4y2Ba和Camv的空向量GydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaNlucGydF4y2Ba, CaMVGydF4y2Ba35个年代GydF4y2Ba：GydF4y2BaClucGydF4y2Ba冯浩博士提供GFP-Flag载体，张丽丽博士提供pGreenII 62-SK和pGreenII 0800-LUC载体。我们感谢清华大学蛋白质科学技术中心成像核心设施协助使用配备Picoquant FLIM/FCS系统的fv1200lscm。GydF4y2Ba

中国国家重点研发计划（授予2016YFD0600104）的国家重点研究，中国经济转基因研究的国家重点计划（批准2018ZX0802000），以及北京农业和林业科学学院科学基金（Grant号kjcx20200205）。资金机构为研究项目提供了财务支持，包括出版成本，但在研究设计，数据收集，分析和解释和稿件准备方面没有角色。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 中华人民共和国北京市海淀区曙光花园中路9号北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，100097GydF4y2Ba

   林正，吉西杨，姚娟陈，萍玺，剑华伟与洪智王GydF4y2Ba

2. 中华人民共和国北京市昌平区回龙观北农路7号北京农业大学生物科学与资源环境学院，邮编102206GydF4y2Ba

   Jixiu杨GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

LZ，HW和JW设计了这项研究。LZ，JY和YC进行了研究。LZ，LD和JY准备了植物材料并分析了数据。HW，JW和LZ写了这篇论文。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba剑华威GydF4y2Ba或GydF4y2Ba弘治王GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

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