比较蛋白质组学分析gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba植物下面gydF4y2Ba中国小麦马赛克病毒gydF4y2Ba感染gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

中国小麦马赛克病毒gydF4y2Ba(CWMV)是一种严重威胁冬小麦生长的病毒gydF4y2BaPolymyxa Graminis.gydF4y2Ba．CWMV和植物之间的相互作用机制很差理解。在该研究中，进行了基于纳米喹氢喹吖状体质谱（MS）/ MS的比较蛋白质组学分析，以表征植物响应CWMV感染的蛋白质组学变化。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

总共鉴定了2751个宿主蛋白，其中1496种被定量，并鉴定为差异表达蛋白质（Deps）的146个上调和244个下调蛋白质。基因和基因组（KEGG）富集分析的京都百科全书表明，DEPs与光合天线蛋白，MAPK信号植物和乙醛酸和二羧酸盐代谢途径最强烈。亚细胞定位分析预测，超过一半的DEP在叶绿体中定位，细胞器对于脱离酸（ABA）合成不可或缺。我们的研究结果表明，CWMV感染中断正常叶绿体功能并降低ABA浓度gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba．进一步的分析表明，在CWMV感染期间抑制了ABA途径，并且ABA治疗诱导的植物宿主对CWMV的防御。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们鉴定了在CWMV感染期间表达的几种候选蛋白质，并且ABA途径与对CWMV感染的反应强烈相关gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在过去几十年里，病毒感染严重降低了不同作物的产量和质量[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]. 植物宿主资源和因子对于病毒感染是必不可少的，因为植物病毒的基因组较小，编码的蛋白质相对较少[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．越来越多的证据表明，在病毒感染的各个步骤中需要各种宿主因子。例如，gydF4y2Ba米矮人病毒gydF4y2Ba由于RDV P2和OsIAA10蛋白的相互作用破坏了OsIAA10和OsTIR1之间的相互作用，(RDV)感染破坏了水稻中的生长素信号传导[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．P5-1蛋白编码gydF4y2Ba米黑条纹矮病毒gydF4y2BaRBSDV (RBSDV)与OsCSN5A物理相互作用，OsCSN5A干扰SCF E3连接酶的泛素化活性，并抑制茉莉酸信号转导，以促进水稻病毒感染[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

小麦(gydF4y2BaTriticum aestivum.gydF4y2BaL.）是全球人类最重要的粮食作物之一[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．然而，小麦的品质和产量受到许多不利因素的限制，包括生物和非生物胁迫[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．许多土壤传播病毒可以在自然条件下感染小麦，从而影响小麦生长和发展[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba中国小麦马赛克病毒gydF4y2Ba（CWMV）是我国首次发现的土传病毒[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．CWMV被识别为属的成员gydF4y2BaFurovirusgydF4y2Ba在家里gydF4y2BaVirgaviridaegydF4y2Ba，其基因组包括两个正义单链rna, RNA1和RNA2 [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]. cwmvrna1由7147个核苷酸（nt）组成，有三个主要的开放阅读框，编码病毒复制和传播所必需的三种蛋白质。CWMV RNA2为3564 nt长，编码四种蛋白质：主要外壳蛋白（CP；19 两种CP相关蛋白（N-CP；23 kDa和CP-RT，84 kDa）和富含半胱氨酸的蛋白质（CRP；19 作为RNA沉默抑制物[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20gydF4y2Ba］．到目前为止，只有少数研究专注于CWMV及其主持人之间的关系。沉默gydF4y2BaNBRDR6.gydF4y2Ba在较高温度下减少CWMV积累和sirna [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]. NbHSP70与CWMV RNA1编码的病毒复制酶相互作用，其亚细胞定位因CWMV复制酶的作用而改变[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．cwmv衍生的vsiRNA-20干扰HgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在病毒感染的细胞中，导致CWMV积累[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．在感染期间识别参与植物相互作用的潜在宿主因子是一种紧迫的事情。gydF4y2Ba

已经开发和常用于植物微生物相互作用研究中的定量蛋白质组学。例如，通过定量的全蛋白酶分析，Fu等人。发现雷莫林蛋白（Nbrem1）的表达被抑制在下面gydF4y2Ba水稻条纹病毒gydF4y2Ba进一步研究发现RSV编码的nssvc4蛋白与NbREM1相互作用，抑制NbREM1 s -酰化促进RSV感染[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．进行蛋白质组学分析以解决RBSDV对玉米蛋白丰度的影响，揭示玉米的RBSDV感染受到许多代谢途径的调节[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．玉米cv。B73植物感染了gydF4y2Ba玉米褪绿斑驳病毒gydF4y2Ba（MCMV）已经在一项比较蛋白质组学研究中被研究，以产生详细的整体蛋白质组信息，表明在MCMV感染期间，核糖体蛋白质、与应激反应、氧化还原过程和氧化还原稳态相关的蛋白质的表达水平显著改变[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba是分子植物 - 微生物相互作用研究中最常见的实验模型，因为它高易受多种病原体的影响，并且适用于瞬时蛋白表达和病毒诱导的基因沉默[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．据报道，热休克蛋白70（HSP70）据报道，米饭中的RSV感染是必需的，这是天然宿主和gydF4y2BaN. Benthamiana，gydF4y2Ba实验宿主[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．蛋白质γbgydF4y2Ba几乎没有条纹马赛克病毒gydF4y2Ba是一种多功能蛋白质，可以通过干扰自噬蛋白（ATG）7和ATG8之间的相互作用而抑制自噬gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba作为实验宿主[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．此外，人工合成的全长CWMV cDNA克隆也能成功感染gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba已开发出来，这对以后的研究有相当大的意义[gydF4y2Ba30gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．关于我们对CWMV及其植物主体之间的精心相互作用的理解，已经取得了一些进展;然而，到目前为止，还没有关于植物宿主对CWMV感染的反应的研究。gydF4y2Ba

在本研究中，我们进行了蛋白质组学比较分析gydF4y2Ban benthamianagydF4y2BaCWMV感染过程中的植物。确定了一定数量的差异表达蛋白质（DEP）。我们还发现CWMV感染抑制了脱离酸（ABA）信号通路，而ABA应用诱导gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba对CWMV的抵抗力。结合病毒诱导的基因沉默（Vigs）技术，我们发现编码ZeAxanthin环氧酶（NBABA1）或Xantoxin脱氢酶（NBABA2）的基因的沉默可能通过干扰ABA途径来增加CWMV积累。我们的结果表明，培养抗性小麦品种的候选因素，并为CWMV致病性的分子基础提供新的见解。gydF4y2Ba

定量蛋白质组学分析概述gydF4y2Ba

在接种植物的上部叶片上接种四叶阶段植物的四叶阶段植物后的十四天（额外文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图。S1A）。此外，通过逆转录 - 聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹确认CWMV感染（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图。S1B和C）。收集症状叶片进行定量蛋白质组学分析。与对照植物相比，进行该分析以研究CWMV感染植物中的蛋白质组学变化;工作流程如图4所示。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA.皮尔逊相关系数表明生物重复相关是足够的（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab） 是的。共检测到12845个多肽，平均质量误差为< 0.02 Da，表示质谱（MS）数据的高质量精度（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac） 是的。大多数已鉴定肽的长度分布在7到20个氨基酸残基之间，这与胰蛋白酶酶解和HCD裂解的规律一致（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad） 符合质量控制标准。关于已鉴定肽的详细信息见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2BaS1:表。共鉴定出2751个蛋白，其中1496个被定量。为了进一步研究所鉴定的蛋白的功能，分别对这些蛋白进行GO术语、亚细胞定位、KEGG通路注释，并预测其功能域。蛋白质鉴定的详细信息列于附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：表S2。gydF4y2Ba

CWMV感染对gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba蛋白质组gydF4y2Ba

平均折叠变化> 1.5或<0.67的蛋白质gydF4y2BaPgydF4y2Ba差异表达蛋白(DEPs) <0.05。1496个定量蛋白中，390个蛋白被鉴定为DEPs。dep的详细信息列在附加文件中gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：表S3。根据基因本体（GO）分析结果，2751个已鉴定的蛋白质和390个DEP被分为三大类：生物过程、细胞成分和分子功能（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。在生物学过程中，参与代谢过程的1290个鉴定的蛋白质和221·DEP，并且972鉴定的蛋白质和168型DEP参与细胞过程;在细胞组分中，493鉴定的蛋白质和82···与细胞有关，并且281个鉴定的蛋白质和50 dep与大分子复合物有关;在分子官能团中，参与催化活性的1253个鉴定的蛋白质和200型蛋白，并且1072个鉴定的蛋白质和147型DEP参与结合活性。gydF4y2Ba

所有已鉴定的蛋白质和dep均按亚细胞定位进行分类。总之，共鉴定出15种不同的亚细胞成分，包括1142种叶绿体定位蛋白、698种细胞质定位蛋白和366种细胞核定位蛋白（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。关于Deps，仅发现10种不同的亚细胞组分，其中包含218个叶绿体局部化的DEP，其中包含52个上调和166个下调的DEP，82个细胞质 - 局部化的DEP，包含36个上调和46个下调的DEP，和24个核 -包含13个上调和11个下调的DEP的局部DEP（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。gydF4y2Ba

富含CWMV感染的DEPS的富集分析gydF4y2Ba

为了进一步探索DEPS作为对CWMV感染的反应，基于GO注释，KEGG分析和蛋白质结构域进行390 DEP的富集分析。在这390℃下，146个蛋白质显着上调，244个蛋白质显着下调（附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S2)。大量上调的DEPs主要与代谢过程(74个蛋白)、催化活性(70个蛋白)和结合(54个蛋白)相关(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一种）。关于下调的DEPS，代谢过程（147蛋白），催化活性（130蛋白）和细胞过程（117蛋白）是主要的（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab） 是的。在GO富集的聚类分析中，绘制了涉及三个功能群的DEPs。生物过程组的dep主要集中在甘油醚代谢过程、细胞氧化还原稳态、四吡咯生物合成过程、有机酸分解代谢过程和光合电子传递链中。分子功能组中的DEP富含蛋白质二硫键氧化还原酶活性、半胱氨酸型内肽酶活性、作为核糖体结构成分的二硫键氧化还原酶活性、组氨酸脱氢酶活性、甘氨酸脱氢酶（脱羧）活性、过氧还氧酶活性，以及原叶绿素还原酶活性。细胞成分组的DEPs在内质网中富集（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）。Kegg浓缩分析表明，DEPS与光合作用天线蛋白（NTA00196），植物MAPK信号通路（NTA04016），乙醛酸和二羧酸盐代谢（NTA00630），甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢（NTA00260），卟啉和叶绿素代谢（NTA00860）（NTA00860）和光合生物（NTA00710）中的碳固定（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一种）。蛋白质富集分析表明，在叶绿素A / B结合蛋白结构域，肽酶C1A，肽，细胞分裂蛋白FTSZ，C末端，PSBQ样域，醛糖酶型TIM桶，硫酮域，30S核糖体蛋白S13，C-末端，谷氨酸合酶，α亚基，C末端，核糖体蛋白S13样蛋白，H2TH，疏水种子蛋白质，核糖体蛋白L5，C末端，过氧化嗪，C末端，核糖体蛋白S5结构域2-type fold, subgroup, calreticulin/calnexin, P domain, aquaporin-like, thioredoxin-like fold, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, NAD(P) binding domain, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, catalytic domain, alpha-D-phosphohexomutase alpha/beta/alpha domain III, and alpha-D-phosphohexomutase alpha/beta/alpha domain I (Fig.5gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

鉴定来自三个最丰富的Kegg途径的代表性DEPgydF4y2Ba

根据我们的蛋白质组学数据分析，共有15个DEPs参与光合作用天线蛋白途径，9个DEPs参与植物MAPK信号途径，18个DEPs参与乙醛酸和二羧酸代谢途径。来自光合作用天线蛋白途径（P27491、Q0PWS6、A0A1S3YAU9、Q0PWS5和A0A1S4CBW5）、来自植物MAPK信号途径（P17514、A0A1S3XTH4、P24091、A0A1S3ZVW5和A0A1S4DGP1）和来自乙醛酸和二羧酸代谢途径（A0A1S3YRT4、A0A1S3ZFE6、a1s3y2x0、a1s3yyyg2、，A0A1S4BAT9）和A0A1S4BAT9）进行了关于三种最显著富集的途径的检查（表3）gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）。gydF4y2Ba

部分DEPs的转录水平分析gydF4y2Ba

为了验证蛋白质组学分析在蛋白水平上的变化，随机选择编码DEPs上调的5个基因和编码DEPs下调的5个基因进行定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)。基因库登录号为XM_016620556、XM_016614219和XM_016584441的三个编码下调DEPs的基因表达水平均有所下降。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).基因表达水平无显著变化gydF4y2BaNbDECR公司gydF4y2Ba观察到基因（GeneBank登录号XM_016603860）和表达水平gydF4y2BaNbftsZgydF4y2Ba基因(Genebank登录号XM_016656262)显著增加。在所选的编码DEPs上调的基因中，DEPs的表达无显著变化gydF4y2BaNbGCSH公司gydF4y2Ba而其他基因(Genebank登录号XM_016640264、XM_016599276、XM_016631233、XM_016645028)的表达量在感染CWMV期间均有所增加。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab） 是的。大量研究表明，基因转录与蛋白质丰度不相关；然而，我们的结果表明编码大多数DEPs的基因的mRNA数量与其蛋白表达水平一致。所选部门的所有基本信息都列在附加文件中gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：表S4。gydF4y2Ba

在CWMV感染植物中的ABA途径抑制gydF4y2Ba

亚细胞定位分析表明，35.62%的上调DEPs和66.94%的下调DEPs定位在叶绿体中（另附文件）gydF4y2Ba7gydF4y2Ba：图。S3）。这些结果表明CWMV侵袭可能会改变叶绿体的功能。包括ABA在内的各种植物激素的合成受叶绿体机械系统密切调节[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]. 此外，无标记分析显示，与对照相比，在CWMV感染的植物中，参与ABA途径的ABA1和ABA2的表达水平显著下调。此外，mRNA的表达gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba与对照相比，感染cwmv的植株也明显受到抑制(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一种）。gydF4y2Ba

为了研究CWMV感染的影响，我们测定了ABA浓度gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba结果表明，与对照相比，感染cwmv的植株ABA含量显著降低(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一种）。此外，RT-QPCR分析表明ABA-Biosynthetic基因的mRNA表达水平（gydF4y2Banbnced3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba铌酸钾gydF4y2Ba；基因库登录号分别为GQ477382和EH364870)， ABA信号转导基因包括(gydF4y2BaNbPYL6gydF4y2Ba和gydF4y2BaNbPYL9gydF4y2Ba；基因库登录号分别为TC19819和EH365959)、aba响应基因(gydF4y2BaNbRAB18gydF4y2Ba和gydF4y2BaNbABI5公司gydF4y2Ba；与对照植物中的表达水平相比，分别在CWMV感染植物中显着下调GeneBank登录号Q6DHC1和Q9SJN0（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab）。连同，这些结果暗示了ABA途径响应CWMV感染而基本上改变。gydF4y2Ba

敲除ABA1和ABA2增强了CWMV的积累gydF4y2Ba

在某种程度上已经研究了ABA途径和病毒感染之间的关系;然而，ABA途径相关基因关于ABA-CWMV相互作用的作用仍不清楚。因此，为了研究CWMV感染期间NBABA1和NBABA2的功能，我们沉默gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba并用CWMV接种这些改性植物。氨基酸序列分析表明gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba共享96％的序列同一性gydF4y2Ban .烟草gydF4y2BaABA1（NTABA1）和69％的序列同一性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaABA1（ATABA1）（附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S4)。gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba有92%的序列标识gydF4y2Ban .烟草gydF4y2BaABA2 (NtABA2)和66%序列相同gydF4y2BaA.拟南芥gydF4y2BaABA2（AtABA2）（附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:图S5)。的保守域内约有250-nt的序列gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba被选来消声gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba．使用相同的方法gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba沉默。RT-QPCR数据确认gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba细微调节mRNA表达水平（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab和c）。未观察到明显的表型变化gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba- 义或gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba- 植物（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba一种）。此外，RT-QPCR结果表明，ABA响应基因的表达水平包括gydF4y2BaNbRAB18gydF4y2Ba和gydF4y2BaNbABI5公司gydF4y2Ba被抑制的gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba-沉默和gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba-沉默的植物，与那些gydF4y2Ba烟草响尾病毒gydF4y2Ba（TRV）：00-处理植物（图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaD-e）。这些结果与氨基酸序列分析相结合，确认NBABA1和NBABA2确实涉及ABA信号通路。gydF4y2Ba

然后我们接种gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba-沉默和gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba- 具有CWMV的植物。TRV：00治疗植物接种CWMV作为对照。接种（DPI）与CWMV，RT-QPCR和Western印迹后24天显示CWMV CP RNA和CP的累积水平较高gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba沉默(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2BaF和g)和gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba沉默(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2BaH和i)植株，与对照组相比。RT-qPCR检测结果显示，接种CWMV 30 d后，水稻中CWMV CP RNA的积累量明显增加gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba沉默(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Baf）和gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba沉默(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Bah）植物，与对照中的植物相比。我们的结果表明，我们的结果表明gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba或gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba降低植物抗病毒感染。gydF4y2Ba

外源施用ABA诱导植物对CWMV的抗性gydF4y2Ba

ABA在植物防御反应中起着重要作用;因此，我们处理四叶gydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba含ABA (100 μM)，含ABA抑制剂(NDGA;10mm)，或0.2%乙醇(对照)。处理12 h后，将预处理植株接种CWMV。接种后的植物在温室中生长了大约四周。结果表明，对照植株产生了典型的CWMV感染症状，包括发育迟缓和局部褪绿病变，而aba处理的烟草只表现出轻微的CWMV症状(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Baa） 是的。与预期一样，NDGA处理的植株表现出更多的CWMV症状，并且CWMV CP RNA和CP的积累水平在NDGA预处理植株中最高，在ABA预处理植株中最低（图。gydF4y2Ba9gydF4y2BaB-D）。此外，我们研究了ABA对小麦CWMV感染的影响，天然CWMV宿主。用50μmABA溶液或0.2％乙醇溶液（对照）施用小麦播种。治疗后12小时，用CWMV机械接种预处理的小麦播种叶。RT-QPCR的结果表明，ABA处理的小麦中CWMV CP RNA的累积水平低于0.2％乙醇处理的小麦（附加档案gydF4y2Ba12gydF4y2Ba：图S6）。另外，考虑到ABA对病毒RNA表达量的影响，我们进行了以下研究；四叶期gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba用0.2％乙醇处理的ABA和植物治疗，被认为是对照。12小时以后，我们将这些预处理的植物接种了仅携带CWMV RNA2的农杆菌培养物。接种后三天，我们收集了接种的叶子进行RT-QPCR。RT-QPCR分析表明，表达水平没有显着变化gydF4y2BaCPgydF4y2Ba和gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba，证实了ABA减少有利于CWMV感染(附加文件gydF4y2Ba13gydF4y2Ba：图S7）。总之，我们的结果表明ABA处理可以诱导gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba针对CWMV的防御。gydF4y2Ba

CWMV由gydF4y2BaP. Graminis.gydF4y2Ba休眠孢子能在土壤中存活10年以上 对冬小麦生产构成持续威胁。此外，gydF4y2BaP. Graminis.gydF4y2Ba也是一种携带矢量传输gydF4y2Ba小麦黄花叶病毒gydF4y2Ba，与CWMV一起，可以共同感染小麦，导致数量和质量较高。因此，进一步了解我对CWMV感染和宿主反应的分子机制的理解是一种迫切的物质。在目前的研究中，使用基于标记的比较蛋白质组学方法来获得综合的全蛋白质组洞察CWMV感染gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物。我们工作的结果为植物防御反应对CWMV的分子基础提供了新的见解。gydF4y2Ba

皮尔逊相关系数很强（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab）。蛋白质质量和覆盖的关系，以及所鉴定的肽的分布如预期（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac - d)。这些结果表明，数据分析的重复性和质量是足够的。共有390名副署长从gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba接种CWMV。在这些DEP中，146个上调，244个下调（补充文件）gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：图S2）。据报道，乙醛酸和二羧酸代谢途径主要通过平衡代谢紊乱和传递能量来增强植物对环境胁迫的抗性[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．在本研究中，我们还发现CWMV感染后乙醛酸和二羧酸代谢途径显著富集。在这些DEPs中，有18个蛋白被鉴定，其表达水平明显改变，提示CWMV感染可能通过干扰乙醛酸和二羧酸代谢途径而破坏宿主免疫系统。MAPK信号通路与植物生长发育、植物对环境胁迫的反应和病原体入侵密切相关[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．Payne等克隆了两个编码致病相关蛋白PR-P和PR-Q的酸性内几丁质酶基因，发现随后诱导了这两个蛋白的表达gydF4y2Ba烟草花叶病毒gydF4y2Ba（TMV）感染[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．在目前的研究中，在CWMV感染后显着富集的MAPK信号通路的酸性内切酶Q的表达水平上调超过48倍（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明乙醛酸和二羧酸代谢途径在反应中起重要作用gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物对CWMV的感染。植物RNA病毒感染通常会引起叶片褪绿、坏死、植物发育迟缓和其他症状，而叶片褪绿经常导致叶绿体的光合活性降低[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．光合作用天线蛋白途径中的叶绿素a/b蛋白(CAB)是一种膜蛋白，它通过与色素分子结合以进行光合作用而捕获光能是至关重要的[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．符合此结果，我们观察到植物叶片的杂种病变，接种CWMV（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图。S1A）。此外，我们的结果还表明光合作用天线蛋白途径显着富集。几个驾驶室蛋白质被下调（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），预计在CWMV感染期间预测超过一半的DEP位于叶绿体中（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC），这表明CWMV侵袭后可能会损害叶绿体功能。gydF4y2Ba

许多植物RNA病毒通过招募叶绿体膜来促进侵染，并影响包括光合作用相关基因在内的许多叶绿体相关基因的表达[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．叶绿体是众多前卫信号的来源，它们与效应引发的抗扰度的开始密切相关[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．更重要的是，在叶绿体中发生ABA生物合成途径的一系列关键步骤。对ABA的真菌和细菌的相互作用得到了广泛研究;然而，ABA和植物病毒之间的相互作用是高度多样化的，目前尚未得到很好的理解[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．众所周知，ABA合成途径在植物病毒感染期间发挥着重要作用。例如，包括的关键ABA生物合成基因的表达水平包括gydF4y2Ba玉米黄质环氧化酶gydF4y2Ba（oszep1 / osaba1），gydF4y2BaXanthoxin脱氢酶gydF4y2Ba（OSABA2），9-gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-gydF4y2Ba环氧基甲丙酮类二氧化酶gydF4y2Ba(OsNCED3)和gydF4y2Ba脱落醛氧化酶gydF4y2Ba(OsAAO3)对RBSDV感染反应降低[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba竹花叶病毒gydF4y2Ba（BaMV）和gydF4y2Ba黄瓜马赛克病毒gydF4y2Ba(CWV)感染显著提高了ABA生物合成基因的表达gydF4y2BaABA1型gydF4y2Ba，gydF4y2BaABA2型gydF4y2Ba和gydF4y2BaAAO3gydF4y2Ba在gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物 [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．在本研究中，与RT-QPCR分析相结合的无标签分析表明，与对照组的CWMV感染植物中ABA1和ABA2的mRNA和蛋白表达水平显着降低（附加档案gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：表S4和图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一种）。为了详细研究ABA途径和CWMV之间的关系，进行RT-QPCR，结果表明，ABA-生物合成基因的mRNA水平包括gydF4y2Banbnced3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba铌酸钾gydF4y2Ba响应于CWMV感染响应于下调（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab).此外，我们发现CWMV感染显著降低了ABA浓度(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).这些结果表明ABA生物合成途径在CWMV感染中起重要作用。据报道，在ABA信号网络的各个层面上都存在着巨大的反馈[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．然而，我们观察到ABA信号转导基因的表达水平（gydF4y2BaNbPYL6gydF4y2Ba和gydF4y2BaNbPYL9gydF4y2Ba)和ABA反应基因(gydF4y2BaNbRAB18gydF4y2Ba和gydF4y2BaNbABI5公司gydF4y2Ba)在CWMV感染时也表达下调（图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaB)，这可能归因于原因gydF4y2Ba所有供试gydF4y2Ba基因以多种方式函数，例如MAPK信令和ABA信号转导途径[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．我们表明MAPK信号通路也会受到CWMV感染的影响（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）。gydF4y2Ba

病毒感染通常诱导宿主转录性丰度的显着变化，其中大量转录因子构成重要部分[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．因此，我们推测CWMV感染会改变多种转录因子的表达，导致ABA1和ABA2在转录和蛋白质组水平上的表达减少。综上所述，我们的结果表明CWMV感染确实通过干扰ABA1和ABA2的表达来抑制ABA通路。ABA1和ABA2在ABA生物合成途径中都起着重要作用，因为ABA1负责催化玉米黄质转化为紫黄质，ABA2负责产生ABA醛[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．据报道，ABA1和ABA2与BAMV积累强烈相关gydF4y2BaA.拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．在本研究中，我们发现了gydF4y2BaABA1型gydF4y2Ba沉默显着增加了CWMV累积（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Baf和g），并观察到类似的模式gydF4y2BaABA2型gydF4y2Ba沉默(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Bah和i）。这些结果还表明Nbaba1和Nbaba2是响应CWMV感染的阳性调节因子。ABA在植物抗病毒免疫反应中发挥了多种。例如，ABA治疗可以增强针对TMV的抗性，而在水稻的研究表明ABA应用通过抑制茉莉酸盐途径并增加反应性氧物质的产生增加对RBSDV感染的敏感性[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．为了更全面地分析ABA途径和CWMV感染之间的关系，ABA预处理的植物被CWMV接种，结果表明，ABA治疗减轻了两者的CWMV感染gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物和小麦（图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba13gydF4y2Ba：图。S7）。这些结果在一起暗示了ABA生物合成途径在植物防御中发挥了阳性调节因子。gydF4y2Ba

CWMV对小麦生产造成破坏性损害，控制这种冬小麦的这种疾病是差异[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．选育抗病小麦品种是目前防治cwmv病最有效、最经济的对策;然而，只有少数品种对CWMV有抗性[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．在目前的研究中，蛋白质组学方法被用来探索蛋白质组学变化gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba在CWMV感染期间。根据注释，鉴定了390个DEP的特征。光合作用天线蛋白，植物MAPK信号传导和乙醛酸和二羧酸二羧酸二羧酸酯代谢途径最显着富集。CWMV感染抑制了ABA途径gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．总之，我们的研究结果也为鉴定抗病候选因子培育抗病品种提供了基础。gydF4y2Ba

质粒建设gydF4y2Ba

如前所述制备含有35S促进剂后面的全长CWMV RNA1或RNA2序列的质粒PCB-35S-R1和PCB-35S-R2的[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]. 基因的部分序列gydF4y2BaNBABA1.gydF4y2Ba（注册号XM\ U 016620556）和gydF4y2BaNBABA2.gydF4y2Ba(登录号XM_016584441)采用引物对NbABA1-F进行pcr扩增gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}与nbaba1-rgydF4y2Ba^bgydF4y2Ba和NbABA2-FgydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}与NbABA2-RgydF4y2Ba^bgydF4y2Ba,分别。PCR产物用限制性内切酶消化gydF4y2BaBamh.gydF4y2Ba我gydF4y2Ba和SmagydF4y2Ba我（新英格兰Biolabs，Ipswich，Ma，USA），并将产品单独克隆到基于TRV的PTRV2中以产生PTRV2：NBABA1和PTRV2：NBABA2载体。使用用于质粒结构的PCR产物使用Kod DNA聚合酶（Toyobo，Kita-Ku，Osaka，Japan）产生。本研究中使用的PCR引物列于附加文件中gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:表S5。gydF4y2Ba

伟强gydF4y2Ba

基于TRV的VIGS系统gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba被描述为先前的小改动[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．PTRV2：NBABA1和PTRV2：NBABA2载体单独转化为gydF4y2BaA. Tumefaciens.gydF4y2Ba对菌株GV3101进行电穿孔。农杆菌培养和gydF4y2BaA. Tumefaciens.gydF4y2Ba将含有TRV RNA1的菌株GV3101生长过夜，沉淀，再悬浮在感应缓冲液中（1M MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，10 mm MES，pH = 5.6和100mM乙酰苯乙烯酮）并在叶片渗透之前在室温下温育3小时（H）。在农业浸润后7天收集渗透叶（DPAI），并使用RT-QPCR检查以确认靶基因的沉默。gydF4y2Ba

植物材料和CWMV接种gydF4y2Ba

原本的gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba种子是亲捐赠的。于乐柳（清华大学，中国）。gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植株在22°C的温室中生长，光周期16/8 h(光/暗)，直到四叶期接种CWMV。如前所述，对CWMV接种进行了轻微的修改[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．农杆菌培养物携带重组二元结构pCB-35S-R1和pCB-35S-R2分别生长至约ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba = 0.8. After centrifugation at 6000×g for 5 min, the supernatant was collected and re-suspended using an induction buffer (1 M MgCl_2gydF4y2Ba， 10 mM MES, pH 5.6, 100 mM乙酰丁香酮)，室温下放置3小时。然后，在叶片渗透前等体积混合含有pCB-35S-R1或pCB-35S-R2的诱导缓冲液。所有接种植株在17℃恒温培养箱中生长，光周期14/10 h(光/暗)。RT-qPCR和western blot检测14 dpi时全身感染成功。采集样品作进一步分析。用CWMV rna接种小麦幼苗的试验如前所述[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．简而言之，具有CWMV RNA1和携带CWMV RNA2的PCB-35S-R1的质粒进行线性化以进行体外转录。将CWMV RNA1和RNA2的体外转录物以摩尔比为1：1的多余的接种缓冲液（0.1M甘氨酸，0.06M磷酸钾，1％膨润土，1％焦磷酸钠，1％硅藻土，pH 8.5）然后接种到小麦播种的叶子中。gydF4y2Ba

RNA提取与RT-qPCRgydF4y2Ba

使用Trizol Reagent（Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA），在14 dpi下分离出总RNA。使用第一链cDNA合成试剂盒（Toyobo，Kita-Ku，Osaka，Japan）合成第一链cDNA。使用ABI7900HT序列检测系统（Applied Biosystems，CA，USA）进行RT-QPCR反应，其中ACEQ QPCR Sybr Green Master Mix（中国vazyme）。使用至少三种生物重复进行每种治疗，每个生物重复至少具有至少三种技术复制。使用2分析了与ABA相关基因和CWMV CP的相对表达水平gydF4y2Ba^{-ΔΔc（t）gydF4y2Ba}如前所述的方法[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．使用肌动蛋白基因作为每次反应的内部参考。在RT-QPCR中使用的这些引物在附加文件中列出gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:表S5。gydF4y2Ba

北印迹分析gydF4y2Ba

Northern blotting如前所述进行[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．简而言之，将来自每个样品的3μg总RNA装载到包含琼脂糖凝胶的1.5％甲醛的孔中并通过电泳分离。然后，将分离的RNA转移到杂合 - N +膜（Amersham Bioscience，Buckinghamshire，United Kinggom）上，并在80℃下交联2小时。用针对CWMV RNA的3'-末端的挖掘标记的DNA探针分析CWMV基因组RNA。探针是使用制造商（Roche，Basel，瑞士）所指示的挖掘高素DNA标记试剂盒II制造的。最后，使用Amersham Imager 600（GE Healthcare Bio-Sciences，Pittsburgh，Pa，USA）检测到印迹信号。gydF4y2Ba

Western Blotting.gydF4y2Ba

如前所述进行蛋白质印迹测定以微小的修改进行进行[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．样品分别在液氮中研磨，然后在蛋白质提取缓冲液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)中均质，补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(Roche, Basel, Switzerland;1片/ 50ml缓冲液)。16,000×g 4℃离心20 min后，收集上清，煮沸10 min，然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至硝化棉膜。一种CWMV cp特异性抗体是内部生产的。gydF4y2Ba

蛋白质提取gydF4y2Ba

纳米液相色谱（LC）-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质提取如前所述进行，并进行了微小的修改[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．将样品粉末分别收集并在液氮中单独研磨。将0.1g样品粉末转移到萃取缓冲液中（40mM Tris-Cl，pH 8.5,7M尿素，2M硫脲，4％SDS，1mM PMSF，10mM DTT和2mM EDTA）。然后彻底涡旋。将反应物在冰上温育10分钟。在16,000×g和4℃离心20分钟后，将上清液与冷丙酮的四片体积混合。将混合物在-20℃下孵育过夜。在16,000×g和4℃离心10分钟后，弃去上清液，使用速度真空浓缩器干燥沉淀物。使用含有8m尿素的溶液缓冲液和100mM三乙基碳酸氢铵（Temb; pH 8.0）储存在-80℃的溶液缓冲液中溶解干燥的颗粒。使用RC DC TM蛋白质测定（Bio-rad，Hercules，Ca，USA）评估蛋白质浓度和定量。gydF4y2Ba

蛋白质消化gydF4y2Ba

将蛋白质溶液与10mM DTT混合30分钟，然后在56℃下孵育，然后加入20mM碘乙酰胺，并将溶液在室温下温育30分钟。对于胰蛋白酶消化，使用100mM茶叶稀释蛋白质样品五倍。以1:50（质量比，胰蛋白酶：蛋白质）的比例加入胰蛋白酶用于过夜消化，并且以1：100（质量比，胰蛋白酶：蛋白质）的比例为4小时的比例。消化了大约150μg样品。gydF4y2Ba

LC-MS / MS分析gydF4y2Ba

LC-MS/MS分析如前所述进行，稍作修改[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．总之,反应混合物溶解使用0.1%甲酸,然后加载在一个反相分析柱15厘米长度和75μm身份证。一个梯度98%乙腈溶剂含有0.1%的甲酸的生产6 - 23%的25分钟,8分钟内从23到35%,然后上升到80%在3分钟,最后3分钟，在易nlc 1000超高液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC)系统中，以400 nL/min的恒定流速保持80%。这些肽在NSI源和Q Exactive™Plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)以及UPLC中使用MS/MS。电喷雾电压设置为2.0 kV。全扫描，m/z扫描范围为350 ~ 1800。然后选择肽段进行MS/MS, NCE设置为28，在Orbitrap中检测到片段，分辨率为17,500。一个依赖于数据的过程在一次MS扫描和20次MS/MS扫描之间交替进行，并有15秒的动态排除。自动增益控制设置为5E4。固定的第一质量设置为100 m/z。gydF4y2Ba

数据库搜索gydF4y2Ba

如前所述，进行了数据库搜索[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．使用Maxquant搜索引擎(v.1.5.2.8)处理得到的MS/MS数据。然后对UniProt进行串联质谱搜索gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba数据库（73605序列；2019年5月更新）。在第一次和主要搜索中，前驱体质量和碎片质量的初始质量公差为20 ppm和5 ppm。研究包括蛋氨酸氧化的可变修饰和氨基甲基半胱氨酸的固定修饰。胰蛋白酶/P被指定为切割酶，最多允许两次错误切割。肽和蛋白质鉴定的错误发现率（FDR）设定为0.01。如前所述，用MaxQuant对蛋白质进行定量，并进行了一些小的修改[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．gydF4y2BaPgydF4y2Ba-根据FDR校正数值，并应用于统计分析，以估计感染样本和对照样本之间的差异。基于强度的绝对定量在MaxQuant上对所鉴定的肽进行定量蛋白质丰度。差异表达的蛋白质以>1.5倍的倍数变化和FDR进行过滤gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05。gydF4y2Ba

蛋白质注释gydF4y2Ba

对UniProt-GOA数据库(www. goa)中获得的蛋白质序列产生GO注释。gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/goa/gydF4y2Ba）。首先，将鉴定的蛋白质的ID转化为Uniprot ID，然后通过蛋白质ID映射以进行ID。对于未在UNIPROT-GOA数据库中未注释的蛋白质，Interprocan软件（V.5.14-53.0）（WWW。gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/interprogydF4y2Ba)用来注释每个蛋白质的GO功能。然后，通过GO注释将蛋白质分为三类：生物过程、细胞成分和分子功能。gydF4y2Ba

真核细胞中的蛋白质定位于各种细胞器中，这取决于它们结合的是什么膜结构。真核细胞亚细胞定位主要包括细胞外空间、细胞质、细胞核、线粒体、过氧化物酶体、空泡、高尔基体、内质网、细胞骨架、核质、核基质和核糖体。我们使用Wolfpsort (v.0.2) (www。gydF4y2Bahttp://www.genscript.com/psort/wolf_psort.htmlgydF4y2Ba)，亚细胞定位预测软件。Wolfpsort是PSORT/PSORT II的更新版本，用于预测真核生物序列。gydF4y2Ba

Kegg数据库用于路径注释。首先，kegg在线工具kaas用于注释蛋白质的kegg数据库描述，之后使用kegg路径数据库和kegg在线工具kegg映射器映射注释结果。gydF4y2Ba

鉴定的蛋白质的域功能描述使用基于蛋白质序列对准方法使用Interprocan（序列分析申请）来注释，并且使用域名数据库。Interpro（gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/interpro/gydF4y2Ba)是一个数据库，它集成了蛋白质家族、域和功能位点的各种信息，并通过基于web的接口和服务向公众免费提供。数据库的中心是被称为特征码的诊断模型，根据这些模型可以搜索蛋白质序列以确定它们的潜在功能。InterPro可用于全基因组和亚基因组的大规模分析以及单个蛋白质序列的表征。gydF4y2Ba

功能丰富分析gydF4y2Ba

蛋白质通过GO注释分为三类：生物过程，细胞室和分子函数。对于每个类别，采用双尾渔民的确切试验来测试富含所有已识别的蛋白质的富集。去吧gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05，错误发现率<1%被认为是显著的。gydF4y2Ba

KEGG数据库使用双尾Fisher精确测试来检测DEPs对所有已鉴定蛋白的富集。经过修正的路径gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05和假发现率<1%为显著性。根据KEGG网站，这些途径被划分为等级类别。gydF4y2Ba

For each category of proteins, InterPro (a resource that provides functional analysis of protein sequences by classifying them into families and predicting the presence of domains and important sites) database was searched, and a two-tailed Fisher’s exact test was employed to test enrichment of DEPs against all identified proteins. Protein domains with aPgydF4y2Ba值<0.05被认为是显着的。gydF4y2Ba

ABA和ABA抑制剂治疗（NDGA）gydF4y2Ba

ABA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶解于0.2%乙醇中，最终浓度为100 μM。NDGA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)，目标为9-gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-ePoxycarotenoid DiOxygenase，用0.2％乙醇溶解至10mm。gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba用100 μM ABA溶液、10 mM NDGA溶液或0.2%乙醇溶液(对照)处理植株。将处理液涂抹在叶片的正、背面，直至溶液从叶片上滴下。12 h后，进行预处理gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶片接种CWMV。gydF4y2Ba

ABA内容分析gydF4y2Ba

如前面所述，从实验植物中收集样品，如前所述[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．然后样品在液氮中研磨，并分别与(每个样品200 mg叶粉)混合gydF4y2Ba^2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba阿坝(45 pmol)。每个样品加入2毫升甲醇，然后混合，混合物在−20℃孵育过夜。160,000×g 4℃离心20 min，收集上清液，氮气干燥。颗粒溶解在1ml 5%氨溶液中，按照制造商的说明使用Oasis MAX SPE柱(Waters, Milford, MA, USA)纯化。将洗脱后的ABA在氮气下干燥，用200 μL水/甲醇混合溶液(20:80,v/v)溶解，采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)分析。使用3个独立的生物重复。gydF4y2Ba

本研究中产生或分析的所有数据都包含在本文及其补充材料中。所有原始质谱（MS）数据文件已被沉积，并且可以使用DataSet标识符PXD017593访问Proteomexchange（gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/pride/profile/hnndhelong2gydF4y2Ba）。gydF4y2Ba

CWMV：gydF4y2Ba

中国小麦马赛克病毒gydF4y2Ba

P. Graminis.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

Polymyxa Graminis.gydF4y2Ba

女士：gydF4y2Ba

质谱分析gydF4y2Ba

DEPs:gydF4y2Ba

差异表达蛋白质gydF4y2Ba

n benthamianagydF4y2Ba：gydF4y2Ba

尼古利亚娜·宾夕法尼亚州gydF4y2Ba

美国律师协会：gydF4y2Ba

脱盐酸gydF4y2Ba

ABA1：gydF4y2Ba

玉米黄质环氧化酶gydF4y2Ba

ABA2：gydF4y2Ba

Xanthoxin脱氢酶gydF4y2Ba

感谢刘玉乐教授提供gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba种子。gydF4y2Ba

这项工作得到了国家重点研发计划（2018YFD0200507）的支持，gydF4y2Ba

Natural Science Foundation of Ningbo City (2019A610415), National Key R&D Plan in China (2017YFD-0201701, 2018YFD0200408), and China Agriculture Research System from the Ministry of Agriculture of the P.R. China (CARS-03), and National Key Project for Research on Transgenic Biology (2016ZX08002–001), and K.C. Wong Magna Funding Ningbo University. These funders had no role in the design of the study and collection, analysis, and interpretation of data and in writing this manuscript.

隶属关系gydF4y2Ba

1. 南京农业大学植物保护学院，南京，210095，中国gydF4y2Ba

   何龙，陈建平gydF4y2Ba

2. 宁波大学植物病毒研究所，农产品质量与安全国家重点实验室，宁波315211gydF4y2Ba

   久，彭金，玄辰，天叶张，杏仁，彭柳，建萍陈＆煎gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

HL和YJ构建了该项目并设计了实验;HL，JP，CX，ZTY，ZKL和LP进行了实验;HL和YJ分析了结果并写了稿件;YJ和CJP修订了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

通信gydF4y2Ba陈健平gydF4y2Ba或gydF4y2Ba剑阳gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放存取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用线中另有说明。如果材料没有包含在文章的创作共用许可证中，而您的预期使用不被法律法规允许或超过允许的使用，您将需要直接获得版权持有人的许可。如欲浏览本许可证的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba. 知识共享公共领域放弃(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非信用额度中另有规定。gydF4y2Ba

转载和许可gydF4y2Ba