淀粉合酶的三重零突变SSIIA.基因同源性导致六倍体小麦具有高直链淀粉和抗性淀粉

背景

缺乏营养适当的食物是美国和世界范围内肥胖的主要原因之一。小麦(小麦）提供每天在全球消耗的20％的卡路里。小麦籽粒中的营养素主要来自由直链淀粉和支链淀粉组成的淀粉。通过改性淀粉合成途径可以增加抗淀粉含量，该淀粉含量具有显着的人体健康益处。淀粉合成酶SSIIa,亦称淀粉粒蛋白亚型-1 (SGP-1支链淀粉(支链淀粉)是生物合成支链淀粉的重要组成部分。本工作的目标是开发一个三重零突变基因型SSIIA.Elite硬红色冬小麦品种'Jagger'的基因座，并评估敲除突变对野生型粒子抗性淀粉含量的影响。

结果

淘汰赛的突变SSIIA.利用TILLING技术鉴定了小麦品种Jagger的三个基因组。随后，这些A、B、D基因组上的功能缺失突变通过杂交组合而成一个三敲除突变基因型Jag-ssiia——∆ABD。jag-ssiia-∆ABD的直链淀粉含量为35.70%，而Jagger的直链淀粉含量为31.15%，导致Jagger -的抗性淀粉含量增加了~ 118%ssiia-∆ABD Jagger小麦基因型。单个基因组突变对淀粉组成也有不同的影响。

结论

我们的全零捷豹ssiia-Δabd突变体显示rs的显着增加，没有其他剧烈的谷物表型ssiia优质小麦品种的敲除。此外，这项研究显示了以非转基因方法开发营养改良食品的潜力。所有突变体均已在优质小麦品种上获得，在今后的生产和供应中应用是可行的。

世界上约13%的人肥胖，根据现有数据，肥胖是全球人类死亡的最大风险因素之一[1]．由不良饮食引起的疾病，如心血管疾病和2型糖尿病，与肥胖直接相关[1那2]．2017年，全球约8%的死亡是由肥胖相关疾病造成的[1]．肥胖是一种久坐生活方式的效果，以及廉价的高热量食物的过度公积[2]．为了更好地应对这种规模的流行病，开发负担得起的高营养食品来源势在必行。全球范围内，小麦平均每天消耗超过500卡路里，大约相当于每日推荐热量的20% [3.那4.]．提高这种重要食物来源的营养价值是对抗肥胖的有力工具。

与小麦产品相关的卡路里和营养主要来自淀粉，它是胚胎的能量和碳储存库。胚乳干质量的大约70-90%是由淀粉组成的[5.那6.]．淀粉主要由葡萄糖聚合物的交替部分组成;直链淀粉和高支链淀粉[6.那7.]．非支链由α-(1,4)连接的葡萄糖组成，而支链由α-(1,4)连接的葡萄糖以及支链的α-(1,6)连接的葡萄糖组成[8.那9.]．高分分支淀粉蛋白的区域与双螺旋的线性阵列交替，有助于淀粉颗粒的半结晶组成[10]．总的来说，淀粉是根据其消化率分类的:快消化淀粉(RDS)和慢消化淀粉(SDS)。RDS在淀粉降解酶的培养前20分钟内转化为它们的葡萄糖成分。SDS在小肠中被完全消化。抗性淀粉(RS)是一小部分对α-淀粉酶活性有抗性的淀粉，由结肠细菌发酵[11那12]．

对卢比的研究对人类健康的令人难以置信的益处，从维持健康的肠功能，以帮助中度血糖指数，以及预防结肠癌的可能性[11那12那13那14]．在肥胖相关疾病的群体中，RS摄入量较低[15]。具有RS的RDS的重种，已被证明将葡萄糖进入速率降低到血流中，从而导致胰岛素需求的降低[14]．在大鼠中，高RS饮食个体的脂肪组织减少[16]．在Regina等人完成的实证研究中。（2006年），发现用新型高级转基因小麦喂养的大鼠在大肠蒸馏物中的短链脂肪酸（SCFA）水池中大致100％增加，以及粪便排泄。另外，在这些大鼠的肠道中记录了较低的pH，表明​​结肠发酵[15]．SCFAs已被证明可以增加结肠血流量，并降低恶性转化的风险。此外，SCFAs在酸化食糜内容物中发挥作用，具有灭活有毒化合物的能力[14那17那18]．此外，美国以及全世界的肥胖流行病对2型糖尿病和/或心血管疾病进行了直接影响[2那19]．与高可消化淀粉(DS)饮食相比，高可消化淀粉饮食显示脂肪细胞大小减少，大鼠整体体重增加减少[16). .在人类中，Park等人(2004)显示了RS膳食补充剂降低血液胆固醇浓度的证据[20.]．此外，研究还表明，在吃了含有高RS的食物后，饱腹感会延长[21那22]．在帮助那些已经开发出2型糖尿病的人方面，人类的研究表明，受试者摄取面包含量较高后的胰岛素水平显着降低[23]．为了培育出具有较高RS的小麦，需要对直链淀粉与支链淀粉的比例进行调整。研究表明，直链淀粉含量高的淀粉比支链淀粉含量高的淀粉更不易消化[18那24]．

小麦胚乳中的淀粉合成是由几种酶完成的，它们在葡萄糖聚合物的延伸和分支中发挥不同的作用。颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)亚型是在淀粉形成中负责合成直链淀粉的唯一酶[25]．无直链淀粉，也称为蜡质小麦，已经通过诱变和缺乏GBSS同源基因功能拷贝的品种杂交创造出来[26那27]．支链淀粉的合成由于支链淀粉分枝结构复杂且有组织，需要更多的酶参与生物合成。淀粉分支酶(SBEs)和去分支酶(DBEs)共同创造支链淀粉所特有的α-(1,6)分支模式[10那25]．谷物中SBE基因的突变，包括硬粒(Triticum杜伦姆)(基因组AABB)和面包小麦(基因组AABBDD)的直链淀粉含量有所增加[7.那28那29]．淀粉合酶(SS)负责支链簇间葡萄糖聚合物的短链，因此对淀粉颗粒的高级结构的组织非常重要[10那25那30.]．面包小麦中完全缺失SS基因的个体直链淀粉和RS含量增加[31那32]．杜伦姆和面包小麦的研究表明了类似的结果，但这些个体的颗粒高度萎缩[7.那33那34那35]．

In this study, an EMS (ethyl methanesulfonate) mutagenized TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) population of hard red winter bread wheat variety ‘Jagger’ was used to study the impact of knock-out mutations of starch synthase genes on the RS and amylose content [36]．Jagger因其优良的农艺性能和优良的烘焙性能而被选为本研究的对象[37]．TILLING是一种强大的正向和反向遗传学工具，通过高通量筛选方法确定化学或辐射诱导的SNPs [36那38那39那40那41那42]．一些基因已经被TILLING验证，包括负责淀粉合成的基因[34那35那38那42]．随着越来越多的参考基因组，以及测序技术的价格下降，耕作已成为一种流行的功能遗传学工具。此外，使用耕作技术的改性基因的栽培品种的发展不被视为转基因方法，不受环球作物的公共和法律柱塞的影响。

利用我们的贾格尔蒂林种群，敲除突变体SSIIA.在“A”、“B”和“D”亚基因组中鉴定了同源基因，并通过杂交组合形成一个完整的空白ssiia突变体。随着这些人的卢比含量增加，我们展示了在不使用转基因的情况下在重要谷物作物中产生增加的营养价值的能力。

发展的缺口,ssiia——∆ABD突变

在B和D基因组中分别发现2个预测敲除突变体，而在A基因组中仅发现1个预测敲除突变体(W544*;表格1）.在B (Q601*)和D (W544*)基因组中选择导致蛋白质早期截断的突变，形成完全缺失突变。有趣的是，A和D基因组截断突变体位于由不同等位基因编码的蛋白质的相同位置。采用双杂交策略结合三个基因组的突变，同时保持纯合子条件下的(B基因组)突变。在自交后代的96株植物中，有6株在所有3个基因组中都有纯合突变，符合15:1的遗传分离预期。利用纯合全缺失突变体、A基因组(W544*)、B基因组(Q601*)和D基因组(W544*)的突变体以及野生型亲本Jagger进行淀粉组成参数的研究。野生型Jagger和敲除突变体TILLING的A、B、D基因组扩增子序列及其预测蛋白序列已在补充表中提供1和2， 分别。

粒度和重量

jag-之间的粒度不同ssiia-∆ABD和WT (P.< 0.01)基因型。有趣的是,狂欢,ssiia-∆B种子在所研究的所有突变组合中最宽，但与WT相比籽粒宽度没有显著差异ssiia-∆B显示出显著的增长(P.< 0.0001)的颗粒宽度与捷豹-相比ssiia——∆,ssiiaδd，jag-ssiia-∆ABD(无花果。1）.籽粒长度的方差分析显示，籽粒长度无显著性差异(P. = 0.8) difference between the genotypes (Table2）.

千粒重(TGW)在Jag-之间显著降低ssiia-∆ABD和WT (P. < 0.00001). Similarly, all other genotypes showed a significant decrease (P.< 0.00001)。WT与Jag-之间TGW平均下降21.29%ssiia——∆ABD。令人惊讶的是，jag-ssiia-ΔB有略微，但显着（P.< 0.01)高于捷豹-ssiia——∆,ssiiaδd，jag-ssiia-∆ABD，与粒宽数据一致。

直链淀粉、RS和总淀粉含量

直链淀粉/支链淀粉分析结果显示，在捷豹-中直链淀粉显著增加ssiia-∆ABD与WT相比(P < 0.01)， WT平均直链淀粉含量为31.15%，捷豹-平均直链淀粉含量为35.70%ssiia——∆ABD。有趣的是,狂欢,ssiia-∆D直链淀粉含量较WT显著降低(P.< 0.001)。同样,狂欢,ssiia-∆ABD总淀粉(TS)显著降低(P.< 0.0001)。此外，捷豹-ssiia-∆D总淀粉与WT相比无显著差异，但显著增加(P. < 0.0001) in TS was observed between Jag-ssiia-∆D和缺口ssiia-∆ABD(无花果。2）.

jag-ssiia-∆ABD基因型与WT相比，总淀粉百分比RS显著增加(P. < 0.0001), a total of a 118.81% increase in RS. Significant increases (P. < 0.001) of RS percent were also observed between Jag-ssiia-ΔABD和其他基因型（图。3.）.从RS含量(g/100 g)来看，jagg -的RS含量显著增加ssiia与wt相比 - ΔAbd（P.< 0.0001)。基因型之间的缺口ssiia-ΔAbd显示出显着增加（P. < 0.01) in RS content in comparison with the other mutant genotypes (Table2）.

强烈的正相关（r= 0.78)。然而，RS和TS的百分比呈中度负相关(r = − 0.68). RS content (g/100 g) followed a similar pattern as percentage of resistant starch, but to a lesser degree. A strong positive correlation (r= 0.76)，且RS含量与直链淀粉含量呈中度负相关(r=−0.55)，RS含量与TS呈中度负相关(r = − 0.63) was observed between amylose content and TS Fig.4.）.

百分比RS与粒宽呈中度负相关(r=−0.63)，以及百分比RS与TGW (r=−0.58)。粒长与粒长呈显著负相关(r = − 0.86). TS and grain length showed a strong positive correlation (r= 0.82)。RS含量(g/100 g)与粒宽(r = − 0.64), grain length (r = − 0.81), and TGW (r = − 0.47). Interestingly, amylose content showed no significant correlation (P.> 0.01)。TS与粒宽呈弱正相关(r= 0.46)，总淀粉与TGW呈较强的正相关(r= 0.80)。

以往的研究表明，在硬粒和六倍体小麦背景中，SBE和SS基因缺失对淀粉组成的影响[7.那28那29那31那32那35那42那43]．Yamamori等人(2000)开发了一个完整的零ssiia通过杂交三个不同的小麦品种，含有零ssiia在每个亚因素中[31]．完整的空ssiia基因型表现出直链淀粉和RS含量的增加，但种子高度枯萎[32]．与这项研究类似，Botticella等人(2018年)开发了一种完全无效的药物ssiia突变体在春小麦品种‘Cadenza’中也表现出较高的直链淀粉含量和RS含量，但籽粒也高度萎缩。

在这项研究中，我们开发了一个完整的零ssiia突变体，所有的遗传背景的精英品种' Jagger '。完全缺失突变体的RS和直链淀粉含量增加，与报道的相似ssiia杜兰姆小麦中的突变体，以及六倍体麦麦[30.那31那32那34]．有趣的是，我们的研究显示，不同基因组的敲除突变体在总淀粉和直链淀粉含量方面存在差异，表明具有非平衡的同源表达SSIIA.来自三个基因组。据了解，约30%的小麦基因在a、B、D基因组中表达不平衡[36]．jag-ssiia-∆D突变体直链淀粉减少，与WT相比，总淀粉明显多于捷豹-ssiia -∆ABD突变。捷豹的趋势ssiia-ΔD与期望一致，随着yamamori等人的总淀粉之间观察到中等阴性相关性。（2000），CV土耳其，自然缺乏ssiia基因，用于整合一个空的D基因组ssiia基因进入全零个体[22]．土耳其和中国弹簧之间的直链淀粉含量没有显着差异，发现土耳其和诺林61之间的轻微增加，使用比色以及滴定测定，其与本研究中使用的方案不同。中国春天和诺林61都包含功能SSIIA.所有三种基因组中的基因，用作对照[31]．非平衡同构三种表达SSIIA.Jagger的同源等位基因或D基因组突变的背景突变可能是影响直链淀粉含量和TS的潜在因素ssiiaD基因组敲除突变体。将需要进一步研究，以确定与D基因组副本的这种意外趋势的确切原因ssiia．

在的研究ssiia无突变硬粒小麦，通常用于面食面粉，研究表明，烹饪时间减少，增加硬度，并抵抗面食过度烹饪。这，除了较高的蛋白质和脂肪含量是指标的有益性质的面粉派生ssiia小麦突变体(33]．此外，使用高直链淀粉面包小麦的研究表明，这种面粉有可能替代意大利面和蒸熟的中国食品[44]．然而，正如本研究所显示的那样，对产量相关的特征存在负面影响，例如TGW和GWssiianull突变体。一旦通过背横向清除了背景技术，将来将来将来在将来进行基于现场的实验，以便在专门的情况下观察到的收率可检测到的屈服度是可观察到的ssiia突变。此外，直链淀粉含量高也会对某些烹饪特性产生负面影响。针对硬粒小麦和面包小麦中SBE基因的研究表明，直链淀粉含量平均分别显著增加55.13和108.77% [5.那15那42那45]．另外，对硬粒小麦和面包小麦SS基因的研究表明，直链淀粉含量平均分别增加了62.74和17.90% [30.那31那33]．Morita et al.(2002)研究表明，高直链淀粉面包小麦粉不适合面包制作，因为它会导致面包的致密、小口袋[37]．在12种不同柔软小麦品种的协会研究中，GaInes等。（2000）发现了一个适度的负相关性（P.=−0.53)直链淀粉含量与面粉产量之间的关系[46]．但是，重要的是要注意jag-ssiia -Δabd突变体可以用作靶向体重管理和人类的其他健康益处的特种小麦，但是对非淀粉多糖（NSP）和糖含量的额外研究可以进一步了解这些谷物的营养益处。

我们捷豹的抗性淀粉含量ssiia-∆ABD突变体比WT高118.81%，明显低于SBE基因敲除的研究。平均而言，SBE缺失突变体在硬粒小麦中的RS增加约652.95%，在面包小麦中的RS增加约1132.39% [42那45那47]．这种显着的增加可能是SBE基因的功能的结果。SBE基因直接负责葡萄糖聚合物的分支，而SS基因对淀粉素的线性部分工作[10那25]．在硬粒小麦中，assiia空个体由Botticella等人(2016)开发，平均RS增加了645% [30.]．但是，重要的是要注意，这些无效ssiia通过杂交两种不同的无基因变种而产生了突变体ssiiaA和B子基因组中的基因并高度萎缩。

这项研究标志着第一个完全无效的发展SSIIA.单一冬小麦背景中的突变体。它进一步证明了TILLING作为一种基因工具背后的力量。与六倍体小麦耕作群体一起工作的好处是，需要一个显著较小的突变个体群体(< 2000个个体)来获得任何感兴趣的基因的敲除。四倍体和二倍体小麦需要显著较大的居群才能达到相同的效果，分别为约3000和5500个个体[39那40]．我们使用了以前建立的TILLING群体，由Rawat等人开发[36]全部突变体均在这群人口中发现。由于这种个人通过耕种方式创造，它会绕过GM庄稼周围的柱头。这ssiiaNull个人涉及几个背景突变，但是通过使用标记辅助育种可以显着降低两到三轮后面。

三基因敲除突变体Jag-ssiia在本研究中开发了淀粉合成途径中重要基因的-ΔABD。淀粉组合物类似于通过传统育种产生的四倍性背景中的全零突变体。此外，jag的种子 -ssiia-ΔABD基因型，但在TGW中具有显着的损失，仍未显示出与之前的六倍倍性和硬质浆不同的萎缩表型SSIIA.突变体。随后涉及淀粉颗粒和整体颗粒形态的实验可能会揭示为什么会出现这种情况。贾格尔的ssiia突变体都是在一个单一的精英遗传背景，使表型较少受来自不同遗传背景的复合基因的影响。然而，值得注意的是，预测组合突变到目前为止还没有回交，导致一些背景突变在亲本WT Jagger中不存在。贾格尔的ssiia无突变体的RS显著增加，这是谷物中一种重要的营养性状，对人类的健康有若干好处。尽管RS的增幅相对较小(从~ 1%到~ 2%)，但这仍然表明这些支链淀粉合成基因的功能，以及它们的修饰如何影响并最终改善这些重要的营养性状。与支链淀粉生物合成途径中的任何修饰一样，这些ssiia无突变体总淀粉较少，粒宽降低。有趣的是,那辆美洲虎-ssiia-∆B和缺口ssiia-∆D突变体显示表型变异，引起兴趣，并可能对不同同源性的作用提供见解SSIIA.在小麦。谷物的缺口ssiia-∆B的宽度没有显著差异，但TGW仍然显著低于野生型，但显著高于全零突变体。突变的缺口,ssiia-∆D在直链淀粉含量和总淀粉含量上表现出似乎相反的表型，直链淀粉百分比显著低于ssiia同时，总淀粉含量也显著高于WT，且呈趋势ssiianull。本研究表明，以一种有效的方式开发非转基因、营养优良品种的可能性。已建立的优良品种，如Jagger，已经被种植者广泛接受和使用，为提高其营养价值的单基因修改将使其易于在生产和供应链中作为一种特殊小麦采用。这项研究显示了淀粉合成途径中一个基因的修饰的影响，以及与这些修饰相一致的健康益处的可能性。

贾格尔种田人口的发展

Rawat等人(2019)详细描述了工作中使用的Jagger TILLING种群的发展和特征。[36]．植物材料购自堪萨斯州立大学小麦遗传资源中心，曼哈顿，堪萨斯。简单地说，2500粒Jagger种子在前一个剂量优化步骤后，用0.7% EMS溶液处理。1326米₁从处理过的(M_0.)，并种植在1:1蛭石/土壤混合物。在4°C下，在双叶期进行6周春化。米₁植物被允许自我，导致m₂种子。在1310米中₂种子播种，1296米₂植物发芽，每组都有一套独特的SNP。米₂植物用于组织收集，并且使用Quiagen Biosprint 96机器人与BioSprint 96植物DNA提取套件（QIAGEN）进行高通量DNA提取。使用NanoDrop（NanoDrop 200，Thermo Scientific）进行DNA定量。在96孔嵌段中制备25ng /μl的稀释液，通过将200μl标准化的DNA与来自四个96孔块，保持柱和行标识组合来开发4X DNA池。所有植物都在温室中生长至成熟度16：8 H日期：夜间长度在22°C：18°C日温度和夜间温度。在工作中进行的植物研究符合机构，国家和国际指南。

鉴定SSIIA.突变体

淀粉合成酶三种同源拷贝的全长基因序列（SSIIA.）基因是从Shimbata等人获得的。（2005）[48]．对所有3个同源拷贝进行聚束Omega比对，并设计基因组特异性引物(SSIIa -一种，SSIIa -B，SSIIa -d）SSIIA.基因保持常见的反向引物，由Shimbata等人设计。（2005）（表1）.数字5.显示出针对三个同源物的外显子8的引物的位置和对准。对堪萨斯州立大学小麦遗传资源中心的染色体7进行了基因组特异性，从堪萨斯州大学小麦遗传资源中心[49]．先用3对引物在4X TILLING池上分别扩增目标基因。PCR产物为杂双链，形成不匹配DNA和自制DNA塞-1内切酶用于识别突变池，遵循Rawat等人(2012)的协议。然后，通过对目标池中的每个个体执行类似的程序，对包含突变的池进行反卷积[39]．对池子中的个体成员进行了两种反应:1)只对M₂2) WT Jagger DNA和M₂DNA。这样就可以确定个体内突变的合子性。纯合突变只出现在WT +突变DNA的样本2中，而杂合突变在两种反应中都以酶切带的形式出现。Sanger测序以确定被证实的突变个体中的突变(图。5.）.表格1显示了识别的突变体数量和每个基因组获得的敲除突变体。

完全缺失突变体的发展

在A、B和D基因组中各有敲除突变的植物生长，提取DNA，并塞-1的接合度测定按上述方法进行。选择具有纯合子突变的个体，进行A × B、B × D杂交，产生具有A-B和B-D等位基因突变的F1杂种。F1种子被收获并种植。Sanger对A-B和B-D等位基因进行测序，证实了突变SSIIA.在F1植物中排除自我授粉。在这些F1植物之间进行双十字，以结合所有三个突变，保持纯合条件的B基因组突变。从双十字中获得六十九种子，再次种植。进行了Zygosity测定，发现4种植物在纯合条件下具有B基因组突变，以及杂合条件下的A和D基因组突变。选择这些植物并使其自身。从堆积的自行式种子中种植了一组96种子，提取DNA并使用Zygose测定塞-1测定。发现六种植物含有纯合状态的所有A，B和D突变。所有三种基因组中的Sanger测序证实突变。将这六种植物允许自我，种子膨胀以进一步分析淀粉组合物。除了野生型蛇形植物之外，纯合A，B和D基因组突变体用于比较淀粉组成和晶粒尺寸比较的参数。

淀粉及粒度分析

每一种基因型都要用一克干种子在研钵中手工研磨成细粉。直链淀粉含量的测定使用Megazyme国际公司的直链淀粉/支链淀粉测定试剂盒(K-AMYL)，按照制造商的协议。六名生物代表和两名技术代表用直链淀粉/支链淀粉检测试剂盒进行了预成型。根据制造商的协议，使用Megazyme International的抗性淀粉分析试剂盒(K-RSTAR)测定抗性淀粉和总淀粉含量。3名生物学代表和2名技术代表使用RS检测试剂盒进行预测试。晶粒尺寸的测量(n= 25)是使用免费软件ImageJ完成的。在用Levene检验和Shapiro-Wilk检验进行正态性检验后，用单因素方差分析对结果进行统计分析，然后用R进行Tukey t检验。

在工作中进行的植物研究符合机构，国家和国际指南。

来自A，B和D基因组的SSIIa扩增子的序列及其相应的野生型叉子和截断突变体的蛋白质可用作补充表格1和2本文。这些序列也可在NCBI作为Genbank序列号：MW279062，MW279063，MW279064，MW279065，MW279067和MW279067。在小麦遗传资源中心提供的种质可用，并且可以针对BSG解决有关对种质或DNA和预测序列的访问的任何对应bsgill@ksu.edu或NR.nidhirwt@umd.edu.．

耕作:

靶向诱导的基因组局部病变

RDS：

快速消化的淀粉

SDS:

慢慢消化淀粉

TGW：

千粒重

SSIIa:

淀粉合成酶花絮

SGP-1:

淀粉颗粒蛋白同种型-1

拉尔夫-舒马赫:

抗性淀粉

sbe：

淀粉分支酶

WT:

野生型父母贾格尔

短链脂肪酸:

短链脂肪酸

TS:

总淀粉

不适用。

本研究由堪萨斯州曼哈顿的Heartland Plant Innovations公司资助NR的工资和种质资源开发的研究经费。在马里兰农业试验站的支持下进行了淀粉组成分析的研究。

从属关系

1. 美国马里兰大学植物科学与景观建筑学系，20742

   Adam Schoen, Vijay Tiwari和Nidhi Rawat

2. 堪萨斯州立大学植物病理学系，曼哈顿，KS, 66506，美国

   Anupama Joshi＆Bikram S. Gill

贡献

AS对突变体进行淀粉分析和种子分析，AJ和NR对突变体进行鉴定并进行遗传组合，AS和NR结合VT和BSG的输入进行书写。开展这项工作的资金由VT、BSG和NR安排。所有作者都已阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应于Bikram S. Gill.或尼迪Rawat．

伦理批准和同意参与

这项工作不涉及人类受试者。

利益争夺

作者声明作品中没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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