将对小麦和大麦镰刀菌腐蚀的转录响应进行比较，鉴定了抗病性和耐旱性之间的重要关系

背景

镰刀菌冠腐病（Fusarium crown rot，FCR）是世界粮食生产中的一种慢性病害。这种疾病的影响高度依赖于环境，严重的产量损失主要发生在受干旱影响的作物上。

结果

在此处报告的研究中，我们评估了使用两种方法赋予FCR抵抗和干旱耐受的基因之间的可能关系。第一种方法研究了FCR诱导的差异表达基因（DEGS）靶向两种大麦和一个小麦基因座，其基于干旱耐受性的已知功能来抑制从文献中的基因。在149个疗法基因中，61.0％对三个基因座的FCR感染反应。第二种方法是在小麦干旱下的全球转录组反应诱导的FCR感染诱导的全球参数比较。该分析发现，在一个或多个温度感染下，在一次或多个时间点下，在易受抗病治疗后，约48.0％检测到一周后检测到一周后，在干旱治疗后三周检测到的50％的DEGs差异表达。至于第一种方法的结果，在干旱下，绝大多数常见的常见常见次数下调，在FCR感染下的敏感性中等表达抗性中等含量。

结论

本研究的结果表明，小麦中的抗性孤立性正在经历较少的干旱胁迫，这可能导致比敏感的孤立岛更强的防御反应。然而，大麦中干旱胁迫诱导的大部分基因比感染下的抗性中等含量更高度表达，表明赋予耐旱性和FCR抗性的基因可以不同地相互作用。然而，FCR抵抗和干旱反应性之间的强烈关系提供了进一步的证据，表明通过操纵促进耐旱的基因来提高FCR抗性的可能性。

镰刀菌冠腐（FCR），其可能由各种造成的镰刀菌物种F伪禾本科小麦病害是世界上半干旱地区小麦和大麦生产中的一种慢性病，是大多数地区的主要病原[1.,2.,3.]. 以往的研究表明，该病在美国可使粮食减产35.0%[4.]，土耳其为43.0%[5.伊朗45.0％[6.］．根据十年前进行的生产损失的调查，FCR可以在普通小麦中每年达到近似澳元欧元亏损（小麦L.，Genome AABBDD;2n = 6x = 42）和大麦（大麦芽L.，Genome HH，2N = 2x = 14）在澳大利亚的生产[7.,8.］．

茎基部或根与前几年被感染植物的残茬的物理接触促进了最初的感染F伪禾本科[9]. 病害严重时，确实会发生苗木死亡[3.]，可能导致作物生产的产量损失。然而，没有报告的研究调查幼苗死亡对籽粒产量的可能影响。该疾病的典型症状包括植物生长营养阶段的植物精灵，亚冠间，下叶护套和茎碱和根组织的褐变。萎缩或没有核的“白头”是FCR感染植物的常见特征，尤其是在开花后遭受干旱胁迫的小麦作物[1.,8.］．

在干旱条件下，尤其是在花后，田间条件下的FCR发育明显[10.]. 尽管这种疾病在世界范围内的谷物种植区广泛发生，但它主要在半干旱地区造成严重的粮食产量损失[4.,5.,6.,11.,12.］．组织学研究表明，一旦镰刀菌病原菌进入寄主植物，干旱条件下促进了病原菌的增殖和传播[13.］．干旱胁迫也是促进基于实验室的生物测定中严重FCR感染的关键步骤[14.近年来在普通小麦[15.,16.,17.]和大麦[18.,19.,20,21］．然而，目前尚不清楚为什么干旱胁迫增强了FCR感染的严重程度，并且尚未报道由FCR感染和耐旱耐受的基因之间的可能关系。

为促进培育FCR抗性品种的过程，已经提出了识别新颖的抗性和检测赋予FCR抗性的新源。这些努力导致成功识别赋予小麦和大麦的FCR抗性的定量性状基因座（QTL）[22］．已经开发了近等离子体线（NIL）并用于验证从QTL映射研究中识别的推定基因座[18.,20,23］．在开发赋予基因座的诊断标志物的诊断标志物赋予FCR抗性的诊断标志物中，靶向来自靶向FCR抵抗基因座（位于小麦的4HL和1HL上的3个和1HL）的转录组序列进行了可用[15.,24,25］．这些可用的转录组序列用于基于两种不同方法研究由FCR感染和耐旱性诱导的基因之间的可能关系。首先，评估靶向赋予FCR抗性的三个基因座中的每一个的含量的转录组序列中具有已知耐旱性的所选基因的基因。然后，我们进一步将全局DEG与3BLRNA-SEQ数据进行了比较，并在小麦中的干旱下具有全局转录组反应。本出版物报告了从这些评估中获得的结果。

对皇冠腐的分子反应在小麦的干旱相关过程中富集，但不是在大麦中

在控制接种之后的抗性（'R'）与易感（'R'）和易感（'s'）的比较F伪禾本科-接种（补充表1.)研究了1HL（大麦）、4HL（大麦）和3BL（小麦）共有的DEGs对干旱相关过程和功能的富集作用。来自控制（R）的数据^C和s^C）和接种的（r^我和s^我）在五对液中获得治疗以进行DEG分析。它们在一个接种时间点下包括三个NIL对，用于1小时，在两个时间点为3BL，一个NIL对，一个NIL对在一个时间点为4HL。为了提供更公平的比较，来自不同对和采样时间点的孤立线被合并为每个轨迹。在分析中拍摄的步骤的细节在图2中显示。1.以下。

在三个基因内检测到响应感染的基因中的小程度的重叠，用于上调基因的三个基因（图。2.). 共有253个和327个重叠的deg分别出现在R和S等值线上F伪禾本科- 手机。然而，在'R'和's'is Iscolines之间的三个基因座中观察到几种通常下调的基因分别在“R”和'和'和'和'和'和'和'和'siscine中仅鉴定出6和4次。三个基因座中共差异表达基因（上调和下调）之间的相对较小的重叠表明，在三种不同基因座的功能的差异驱动的情况下，通过差异或之间的差异存在显着差异的存在显着差异这两个物种。

GO术语浓缩分析仅在单独的每个基因座中的FCR感染后的FCR感染之后的变化的上调次数上进行了上调的。一些干旱相关的GO条款是在3BL R中识别的^Cvs r.^我（反应水剥夺和脱落酸活化信号通路）和3BL S.^Cvs s.^我（对水分缺乏的反应和脱落酸对种子休眠的维持）而干旱相关GO术语在4HL或1HL比较中未发现富集（补充表）2.).为了评估在所有三个基因座中的“R”和'和'和'和's'中的感染反应是富集的，富集了与干旱相关的过程，使用来自R的253和327重叠的253和327进行了富集富集分析^Cvs r.^我和s^Cvs s.^我比较。共得到50个GO项和42个GO项。大多数常见的围棋术语来自R^Cvs r.^我和s^Cvs s.^我比较与病原体防御相关过程有关;然而，在常见的参数集中没有识别与干旱相关响应的紧密关系。

小麦和大麦的耐旱基因对侵染都有反应，但3BL和1HL NILs的耐旱基因在等位基因间的反应不同

为了评估干旱耐受性和FCR诱导的次数之间的关系，从文献中策划了与耐旱耐受相关的一组149个基因（补充表3.). 这些干旱基因的小麦和大麦同源基因是从全球同源基因的Ensembl植物数据库中推断出来的[26]在NILs中观察到感染后表达水平的变化。有趣的是，149个耐旱相关基因中的91个（61.0%）在一个或多个等位基因系中对感染的反应差异表达（图。3.).

在NILs感染下，大部分应答性耐旱基因表达上调。对于4HL大麦NILs， ' R '和' S '等位基因检测到的deg分别为33和36个，反应高度相似。相比之下，1HL易感等值线表现出更强的干旱反应，而' R '等值线有33个deg，而' S '等值线有15个deg，这可能表明' S '等值线因感染而经历了更大的干旱胁迫。观察到的最大差异是在3BL等值线之间，与S等值线(13 deg)相比，R等值线的响应显著提高(54 deg)。上述结果表明，耐旱基因可能是小麦和大麦对冠腐病的抗性位点依赖的重要组成部分，3BL抗性等位基因可能直接或间接地调控着小麦和大麦对冠腐病的抗性反应。

对于所有比较的通常反应基因，GMERF6.和HVP5CS1在1HL，4HL和3BL中的所有比较中是最具表达的基因。oserf3.，已知基因对水稻的耐旱性受到负面影响[27]，表示3BL的' R '等值线和4HL的' S '等值线上调。根据3BL等位基因对干旱相关项的富集，以及3BL等位基因对侵染的不同反应模式，耐旱性可能是3BL抗性位点功能的一部分。基于以往的RNA-seq数据，进一步探讨3BL NILs对感染的响应与对干旱的响应之间的关系，以了解' R '和' S '等线对感染的总体响应在干旱相关过程中是否存在差异。

全球转录反应F伪禾本科小麦感染与干旱呈显著负相关

为了评估在患有干旱诱导的基因表达的r离子中的Ristmine中的转录组响应之间的重叠，我们进一步将来自3BLRNA-SEQ数据的全球DEG与在干旱下的全球小麦转录组反应相比。To this end, the pattern of transcriptional change within and between ‘R’ and ‘S’ isolines was compared with global drought induced transcriptional change within previously published RNA-seq dataset which observed gene expression differences between well-irrigated (control) and droughted wheat under field conditions [28］．为了帮助直接比较3BL RNA-SEQ数据集，使用相同的分析管道，基因组组装和注释来重新分析该干旱RNA-SEQ数据集以维持技术一致性。马等人。[28在灌溉后，在不同的时间点，在不同的时间点，在不同时间点的叶片组织上进行RNA-SEQ（T4 =灌溉后一周后的T4 = T6 =灌溉后三周）。在我们的分析中分别在T4和T6中检测到总共296和834次响应干旱的显着参数（补充表1.).

比较干旱响应DEGs与镰刀菌‘R’和‘S’等位基因中的应答基因表明，绝大多数对感染和干旱都有应答的基因在感染下上调，但在干旱下下调，在‘R’和‘S’等位基因中重叠比例相似（分别为17.0%和16.0%）（图。4.). 观察到‘R’和‘S’等值线（3 dpi和5 dpi）与T6干旱显著相关（图。5.).However, the correlations between ‘R’ isoline DEGs was stronger (r = − 0.4 for 3 dpi and r = − 0.32 for 5 dpi) compared to ‘S’ isoline DEGs (r = − 0.26 for 3 dpi and r = − 0.29 for 5dpi). Significant correlations were not observed between镰刀菌“R”或“S”等值线中的诱导DEG和T4干旱DEG。

鉴于观察到的‘S’等位线DEGs与‘R’等位线DEGs之间的相关性较弱，在受感染的‘R’和‘S’等位线之间表达不同程度的基因也与干旱DEGs进行了比较。在一个或多个时间点受感染的S和R等位基因之间，约46.0%的T4 DEGs和66.0%的T6 DEGs也有差异表达（补充图1.). 有趣的是，在干旱条件下，绝大多数普通DEG表达下调，在‘R’等位线中的表达比在感染条件下的敏感等位线更高（补充图1面板A）。为了确定这些共同的DEGs是否表现出相似程度的差异表达，选择了在每个时间点在‘R’等值线上表达更高的基因，并与干旱条件下上调的基因进行比较。进行成对相关检验（Pearson）发现，两组之间存在中等强度和高度显著的负相关^我vs r.^我和干旱比较R.价值观− 0.43和− 比较S时为0.53^我vs r.^我3DPI分别具有干旱T4和T6 DEG表达值的3DPI DEG表达值R.价值观− 0.33和− 比较S时为0.39^我vs r.^我5dpi deg表达值分别具有干旱t4和t6°表达值（补充图2.).

为了探究哪些过程和功能同时受到FCR感染和干旱的影响，基因本体富集分析采用3BL ' R '等高线在3 dpi和5 dpi上调，但在T6干旱胁迫下下调的基因(其他比较没有包含足够多的常见deg，无法进行GO term富集分析)。结果显示，3 dpi和5 dpi的富集项分别为199项和110项P< 0.05; Bonferroni校正）。将这些结果简化为最具体的术语，分别为3 dpi和5 dpi确定了23个和19个术语。在大多数特定术语中，很大一部分术语与真菌病原体的防御反应有关，包括防御反应、产生具有肉桂酸生物合成过程的抗菌代谢产物和蛋白质、L-苯丙氨酸分解代谢过程和几丁质结合，防御激素表现为对茉莉酸和苯丙氨酸解氨酶活性的反应，以及对主要FCR相关真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的解毒作用，槲皮素7-O-葡萄糖基转移酶活性增强。其他与一般胁迫和干旱胁迫相关的反应还包括谷胱甘肽代谢过程、赤霉素介导的信号通路负调控、高渗盐分和脱落酸激活的信号通路负调控。这些模式共同推断，3BL'R'等值线内的耐旱性增强，重要的防御反应与对干旱的反应有关F伪禾本科在FCR感染期间，与'R'中的干旱和更高度表达的干旱和更高度表达的速度都在切换。

FCR是世界上许多谷物种植区的一种慢性病，但该病主要在受干旱影响的作物中造成严重的产量损失。基于小麦和大麦抗FCR基因NILs的转录组序列，我们用两种不同的方法研究了小麦和大麦抗FCR基因与干旱的可能关系。这些评估的结果高度一致，在FCR感染诱导的DEGs中检测到超过一半的干旱相关基因。这项研究是第一次比较研究全球对干旱的转录反应与这些作物品种的FCR抗性相关的转录反应。观察到的模式表明，小麦的FCR抗性和干旱响应性之间存在强烈的反比关系，大多数响应基因在干旱期间表达下调，但在‘R’等值线中表达更高。富集分析表明，这些基因中的许多基因在已知的防御系统中发挥作用F伪禾本科如脱氧肾上腺素排毒[29,30,31]并诱导由植物激素，茉莉醇和水杨酸介导的全身性阻力信令[29,30,32[还在脱落酸信号中，一种已知的途径，其在小麦中起作用的协调耐受机制作用[33,34]以及对镰刀菌病原体[35,36］．The resistance locus could be mediating resistance through two distinct mechanisms: directly limiting the ingress, spread and proliferation of the pathogen inside the plant within the ‘R’ isoline or the resistance locus may indirectly impact resistance by enhancing tolerance to drought conditions allowing the ‘R’ isoline to elicit a stronger defence response owing to greater access to water resources. These findings also indicate that many induced defences againstF伪禾本科受干旱影响的小麦作物，特别是对干旱更敏感的小麦品种，在干旱响应过程中协同下调，可能会降低其有效性。

然而，干旱胁迫诱导的基因在FCR感染下，在大麦中的评估基因座的FCR感染下，敏感的Iscoline致强调。这些结果表明，控制FCR抵抗和耐旱性的遗传网络可能显着重叠，但是赋予干旱耐受性的基因可能不同地影响这两种不同的作物物种之间的FCR抗性。FCR感染和干旱诱导的基因之间的不同关系是对FCR抗性的另一个特征不同的小麦和大麦。先前研究结果表明，与小麦相比，累积了大麦幼苗镰刀菌FCR接种后的每个阶段都更快地迅速[37］．导致这两种作物差异的一个可能因素是倍性水平的差异。一般认为，多倍体基因组在面对非生物和生物挑战时提供缓冲效应，允许它适应广泛的环境[38］．然而，与其他谷物物种相比，二倍体大麦有一个极宽的地理范围，它特别适应不同的环境，在水利下大大变化[39］．大麦的这种独特的特征可能是为什么由FCR感染和这种物种干旱胁迫诱导的基因之间关系的原因似乎与普通小麦不同。

重要的是，干旱压力在从靶向本研究中评估的三个基因座中的每一个的靶向靶向靶的三组转录组数据中没有作用。组织学研究的结果表明，干旱应激延长了初始感染并增强了增殖和传播镰刀菌最初感染阶段后的病原体[13.］．为了促进疾病发展，FCR接种在接种后的前几天浇水，然后施加干旱胁迫[14.］．然而，该研究中使用的转录组序列均在未暴露于干旱胁迫时从3或5天接种后的幼苗获得[15.,24,25］．

以前的发现表明干旱胁迫增强了增殖和传播镰刀菌初始感染阶段后病原体）[13.］．从目前的研究结果来看，水稻抗旱性和干旱响应性之间的密切关系也指出了通过操纵赋予耐旱性的基因来提高水稻抗旱性的可行性。然而，众所周知，耐旱性基因可能有不同的机制，在不同的组织中表达，而且每种基因可能只在植物发育的某个阶段有效[40,41］．此外，赋予FCR抗性的基因座在小麦和大麦的基因组中的不同位置上位于不同的位置上[22]推测具有FCR抗性的基因可能有不同的机制也不无道理。因此，干旱基因对FCR抗性的有效性可能不同，不同的FCR抗性基因对不同的耐旱基因的反应也可能不同，这并不奇怪。

干旱和FCR抗性之间的相互作用对参与FCR抵抗的基因的鉴定和功能研究具有重要意义，以及在育种计划中改善这种性状的努力。未来澄清干旱和含有含有抵抗的关系的关系应在受控环境中使用化学模拟滴水与聚乙二醇溶液的耐旱性表型NIL [42]或受控土壤含水量饱和/赤字灌溉时间表[43]. 如果在耐旱表型上观察到明显的差异，进一步的全球转录组学研究，即用干旱胁迫和FCR感染的不同组合处理等位基因系，将确定两种胁迫之间的共同和不同的转录反应网络。转录或翻译调控的差异[44,45]生物合成途径也可以推断可验证的代谢物的差异积累，并用作筛选种质耐受性和FCR抵抗的生物标志物[43,46,47］．有效性抗性和耐旱之间的强相互作用也可能需要表型种质，以识别新颖性抗性的种质，也应根据用于识别其所使用的电阻源及其相关的含量的方法将干旱胁迫的元素纳入筛选过程中学习 [14.]. 通过这种方式，可以更加确信支撑这些表型的抗性等位基因将在FCR通常对谷物产量造成限制的环境中提供可追踪的抗性。我们的研究结果也可能表明，有效的筛选策略应该以提高耐旱性的种质为目标，或者至少是在水分有效性是一个重要制约因素的环境中选择的种质。

FCR是全世界所有半干旱地区的慢性疾病，但这种疾病的严重产量损失主要发生在干旱造成的作物和干旱胁迫下，众所周知，增强感染植物内病原体的增殖和传播。通过检查由FCR感染和干旱胁迫引入的基因，我们在这两个特征之间以基因表达水平检测了强烈的关系。我们的研究结果表明，利用一些赋予干旱耐受性以增强FCR抗性的一些基因的可能性，尽管这些基因的有效性可能在所研究的两种作物物种之间存在差异。为了使这种方法更有效，应靶向在不同植物发育的不同阶段赋予耐旱耐受的那些基因。

为了评估FCR抵抗和耐旱性之间的可能关系，在此处报告的研究中使用来自靶向FCR抗性的三个基因座的多个靶的多个NIL的转录组序列。其中一个基因座位于常见小麦染色体3B的长臂上[15.]. 另外两个是大麦基因座，一个位于染色体4H的长臂上[18.]另一种在染色体的长臂上[25]. 在三个研究中，来自不同NILs的转录组序列是从对照接种水或接种单一NILs分离物的植物中获得的Fusarium pseudogroinearum.（CS3096）。此外，转录组序列也从先前观察小麦干旱反应的研究中获得[28］．Two timepoints from this study were selected for re-analysis: ‘T4’ comprised of leaf tissue sampled at one-week post-irrigation and ‘T6’ comprised of leaf tissue sampled at three weeks post-irrigation representing mild to moderate drought stress within plants undergoing vegetative growth (control samples were taken from well-irrigated plants at the same growth stage within the same trial).

本研究中使用的所有转录组序列来自国家生物技术信息中心（NCBI）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). FCR感染诱导的三组转录组序列的登录号分别为PRJNA541021（1HL位点）、PRJNA392021（4HL）和SRP048912（3BL）。耐旱性研究中转录组序列的登录号为SRP102636。

用于分析转录组数据的方法是Habib等人详细描述的那些。[24］．基本上，FASTQC V0.11.2（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)来检查PHRED的可接受分数。SolexaQA ++ v3.1.3 (http://solexaqa.sourceforge.net/）用于修剪并过滤原始RNA读取，最小验证质量得分为30，最低最低读取长度为70bp。FOPHAT2 V2.2.13用于对准滤波读取到大麦的参考基因组（基于基因型MERERX）和常见小麦（基于基因型中国春季）。用罗伯茨等人所述评估样品中的转录物丰度的量化。[48]. 袖扣(http://cufflinks.cbcb.umd.edu/）用于产生基于从对齐的RNA-SEQ读数鉴定的转录物的样本方向注释[49］．所有样品组件都与袖扣工具包中的袖扣分别用于小麦的大麦和“中国春季”的高信心转录元注释。Cuffdiff用于计算每百万次映射读取（FPKM）值的每千碱基的片段，并在基因型/治疗组合之间进行成对比较以识别DEG。折叠更改（在日志中_2.规模）计算为折叠变化=日志_2.(FPKM._A./FPKM._B).

采用两种方法对基因型处理组合进行两两比较分析:对同一等值线(R^Cvs r.^我和s^Cvs s.^我)在‘R’和‘S’等值线（R^Cvs s.^C和R.^我vs s.^我). ‘C'和I'代表对照处理（用水接种）和F伪禾本科- 手机。通过设置调整确定了每个比较的显着的参数P值（Bonferroni校正）阈值≤0.05和日志_2.表达折叠变化≥1或≤ - 1或'INF'或'-INF'（在一个条件下，FPKM值为零，另一个条件为零）。

Degs被确定在遵循F伪禾本科-从‘R’和‘S’等位线控制接种针对每个位点的NILs。从丛生植物中获得了小麦和大麦的全球同源基因(http://plants.ensembl.org.）使用Biomart工具[26,50］．生成Venn图以使用网站中描述的方法比较相似性和差异http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn. 为了评估与抗旱性相关的基因，将它们的转录本名称与来自三个FCR基因座的DEGs进行匹配，以获得用于比较的特定值。

基于文献搜索，共有149种赋予耐旱耐受性耐受性的基因[51,52］．鉴定了小麦和大麦中这些基因的同源物，并将它们据报道，作为参与干旱反应的关键基因。从NCBI获得这些基因中的每一个的核苷酸序列。

用Blast2GO对全球小麦和大麦编码序列进行了注释(https://www.blast2go.com/)按照Conesa等人描述的方法使用标准参数[53］．DEGs induced by FCR within ‘R’ and ‘S’ isolines for all three loci and DEGs induced by both drought and FCR between the ‘R’ and ‘S’ isolines of the NILs targeting the 3BL locus were tested separately for GO enrichment using the Fisher’s exact test enrichment module to identify significantly enriched GO terms (P价值<0.05;Fisher的确切测试）在Blast2Go中应用了“最具体的术语”滤波器，如Habib等人所述。[24］．

本研究中分析的数据集可在国家生物技术信息中心（NCBI）获得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). FCR感染诱导的三组转录组序列的登录号分别为PRJNA541021（1HL位点）、PRJNA392021（4HL）和SRP048912（3BL）。耐旱性研究中转录组序列的登录号为SRP102636。

作者感谢伊丽莎白伊丽莎白·艾特肯教授（昆士兰大学），在规划研究中的建设性讨论。Zys和SG感谢塔斯马尼亚大学，以便在博士学位的学生期间支持。作者也很感谢Gagan Garg和Udaykumar Kage（Csiro农业和食品）以及匿名审查员，了解修改稿件的帮助和建议。

本出版物中报告的工作由CSIRO内部项目(项目代码R-10191)支持。资助机构在设计研究、收集、分析和解释数据或撰写手稿方面没有扮演任何角色。

作者笔记

1. Z. Y. SU和J. J. J. Powell在这项工作中同样贡献。

从属关系

1. 澳大利亚昆士兰州圣卢西亚，4067

   Z. Y. Su，J. J. J. Powell，S. Gao＆C. Liu

2. 塔斯马尼亚农业学院，塔斯马尼亚大学，澳大利亚7250年的Provedce，TAS

   Z. Y. Su，S. Gao＆M.周

3. 昆士兰大学农业与食品科学学院，圣露西亚，布里斯班，4072，澳大利亚

   z . y .苏

贡献

本研究由CL和MZ设计。由ZYS、JJP和SG进行数据收集、分析和实验。ZYS、JJP和CL准备了手稿的初稿。所有作者都阅读并批准了最后的手稿。

相应的作者

对应于C.刘.

道德认可和参与同意

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

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