EgJUB1和EgERF113转录因子作为机体防御反应的潜在主调节因子gydF4y2BaElaeis guineensisgydF4y2Ba对抗半生物营养gydF4y2BaGanoderma Boninense.gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

血脂病病原体如真菌病原体gydF4y2BaGanoderma Boninense.gydF4y2Ba这是对油棕的破坏性，通过从生物营养到病养相的战略性地切换来操纵主体防御机制。我们之前的研究揭示了两种可区分的油棕榈基因表达型材，其在稍后的感染阶段切换到病症阶段的早期相互作用的生物营养相的基础。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

本报告是一个持续的研究，从我们之前发表的转录组分析油棕榈幼苗gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba．我们专注于鉴定来自相同RNA-SEQ数据的差异表达的基因（DEGS）编码转录因子（TFS）;导致106个上调和108个下调的TFS被识别。该DEG涉及四种既定的防御相关途径，负责细胞壁修饰，反应性氧物质（ROS）介导的信号，编程的细胞死亡（PCD）和植物先天免疫。我们发现了上调gydF4y2BaJungbrunnen 1.gydF4y2Ba（gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba）在真菌生物营养阶段期间gydF4y2Ba乙烯反应因子113gydF4y2Ba（gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba)表现出显著的上调，当手掌转换到防御坏死阶段。EgJUB1与19 bp回文SNBE1元件WNNYBTNNNNNNNAMGNHW具有结合活性，该元件位于共表达EgHSFC-2b的启动子区域。在启动子区域的进一步硅分析中发现EgJUB1与含有SNBE1元件的tf共表达，在第5位或第18位发生单核苷酸变化。同时，EgERF113与GCC和DRE/CRT元件结合，通过上调下游的防御相关基因来促进可塑性。利用洋葱表皮细胞进行亚细胞定位实验，证实这两种转录因子都是核定位的。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究结果表明，在这种半营养型真菌病原体的不同感染阶段，特异性TFs的转录重编程有可能调控一组特定的基因。结果表明，在生物营养阶段协调EgJUB1和随后过渡到坏死营养阶段协调EgRF113的过程中，油棕防御反应错综复杂。EgJUB1与SNBE基序而非NACBS的结合，而EgERF113与GCC-box和DRE/CRT基序的结合是非常规的，通常与病原体感染无关。鉴定这些阶段特异性油棕TFs对于设计策略以解决或减轻感染的进展具有重要意义。gydF4y2Ba

Ganoderma Boninense.gydF4y2Ba是引起油棕基部茎腐病（BSR）的病原种。感染的手掌保持无症状，即使他们已经生理受损[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]. 在观察到第一个症状之前，一半的基部茎会被真菌破坏，影响水分和营养的摄入[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．真菌，gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba被认为是血管术，在切换到正统之前，这在生物疗法中建立了中间生活方式[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]. 生物营养阶段包括寄主植物组织的定殖和提取营养物质以供病原体存活，同时保持寄主细胞完整[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．生物营养体通过吸器的形成在叶肉细胞之间的细胞内区域繁荣，吸器在致病效应蛋白的传递中起重要作用[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．侵袭需要最小释放细胞壁降解酶（CWDE）以允许植物细胞壁松开[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

病原体相关的分子模式（PAMPs）是诸如衍生自植物细胞表面图案识别受体（PRR）识别的植物藓植物的细菌鞭毛蛋白和真菌甲壳素，其导致PAMP触发的免疫（PTI）[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］．植物宿主对微生物定植的易感性依赖于病原体分泌的效果抑制PAMP识别，从而抑制PTI信令[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba］．破坏PTI意味着激活植物的第二线防御反应，称为效应触发免疫(ETI)。ETI包含抗性(R)蛋白，通过识别宿主细胞中的毒性效应因子(Avr)来抵御病原体的成功入侵[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．ETI，伴随着植物激素的信号传导，包括基于脂质的茉莉酸（JA）和气态乙烯（ET）刺激ROS的产生[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba]. ROS在感染部位诱导超敏反应（HR），以限制病原体的入侵[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

不幸的是，ROS的积累和诱导的程序性细胞死亡（PCD）为坏死滋养细胞强化感染策略创造了有利的环境[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba］．假设植物防御反应的增加压力导致将病原体感染模式从生物养殖切换到病症，但特定宿主 - 病原体相互作用所花费的时间对[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．血脂可能需要延长的生物营养阶段，以建立殖民化，一旦足够，向病院阶段的转型是快速的[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．坏死营养体分泌植物毒性化合物和过量的CDWEs来诱导宿主细胞死亡[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]. 半生物群落的动态中间生活方式使寄主植物的防御机制得以操纵，最终导致植物屈服于感染。水杨酸（SA）信号通常对JA-ET信号具有拮抗作用，已被广泛研究以确定其对生物营养性或坏死营养性感染的微调作用[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］．然而，有差的分子信息可用解释在生物营养术的生物养殖转变期间通过转录因子（TFS）的防御调节。我们以前通过高通量RNA-SEQ分析的转录组分析指出了植物在生物养殖转变期间由植物执行的反诉防御机制[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．在识别转录调节的关键防御途径的尝试中，为负责触发下游响应的TFS开采下一代测序（NGS）数据集。gydF4y2Ba

TFs是“主开关”，它调节由独特的信号网络启动的大量基因的表达，以应对压力[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba］．防御反应基因表达的调节可能因多重应激的强度和复杂程度而异[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．涉及植物防御反应的六大TF家族包括MYB、bHLH、AP2/ERF、NAC、bZIP和WRKY [gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．TFS的调节对于介导转录重编程至关重要，该转录重编程包括诱导负责抗真菌蛋白或称为Phytoalexins的抗微生物次级代谢产物的防御相关基因表达的表达[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]. 有趣的是，植物还表现出交叉耐受现象，即单一类型的胁迫可能引发对不同胁迫的多种耐受水平[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba]. 例如，热应激转录因子（HSFs）在多种应激下作为防御反应的主要调节因子发挥着重要作用[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．过度表达gydF4y2Ba高速光纤gydF4y2Ba促进脱水，细菌和卵霉菌感染的抵抗力，并在有限条件下提高产量[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

TFs绑定到gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-位于其他介导因子TFs或下游靶基因启动子中的作用元件，导致其表达的上调或下调[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．NAC TFS被认为是MYB TF通过形成NAC-MYB-CESA信号级联介导的二次细胞壁生物合成的主调节剂[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]. 此外，bHLH-MYB结合参与了植物激素信号、创伤和真菌相互作用下黄酮类次生代谢产物的生物合成[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]. 与特定DNA序列（结合基序）的相互作用依赖于TFs的DNA结合域（DBD）[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．在生物或非生物胁迫(如erf)中，TF的结合偏好已被认为与DBD中的氨基酸序列组成有关[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．存在多个gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-启动子区域中的作用元件有助于在表达蛋白的发育和/或防御多种应激中的重叠作用[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

除了生物或非生物的压力[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]在这项研究中，我们报道说，TFS的调节依赖于病原体感染的模式（生物营养学和虚张感）。仅有的gydF4y2Ba高考10.gydF4y2Ba据报道，TF和几个TF家庭规范了对后来的阶段的防御gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba感染 [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]. 然而，目前还没有关于植物半营养体不同侵染阶段防御相关TFs转录组学的全面报道。因此，本研究首次尝试以早期油棕为基础，将特异性TFs识别为参与从生物营养感染期到坏死营养感染期转录转换的关键生物标记物-gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba互动。他们的潜在目标防御响应途径是基于与新发现的TFS相互作用的特定基序的鉴定来讨论分两个阶段的潜在的防御响应途径。调查结果可能允许更有效的疾病管理策略来减弱进度gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba油棕感染，防止疾病传播。gydF4y2Ba

Elaeis guineensisgydF4y2Ba生物营养性坏死营养开关的防御相关转录因子和生物标志物gydF4y2Ba

为了识别参与早期防御油棕的TF系列gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba，转录组织分析gydF4y2Ba灵芝gydF4y2Ba-在第3天、第7天和第11天进行处理的根组织。我们在早期与细胞相互作用时鉴定了106个上调的TFs和108个下调的TFsgydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA和B）。使用严格截止日志的严格截止值控制与时间课程处理之间的对比进行成对比较gydF4y2Ba_2gydF4y2Bafold change (FC)≥|1.0| andgydF4y2BaPgydF4y2Ba-价值< 0.01. 我们先前报道了基于qPCR的防御相关分子生物标记物的初步筛选，从生物营养型到坏死营养型防御机制的转变gydF4y2BaEGPR1gydF4y2Ba(biotrophic)和gydF4y2Baegmyc2gydF4y2Ba（病重养殖）[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]. 根据该报告，与防御相关的TFs的表达谱被鉴定为3 感染后第天（d.p.i），而坏死营养调节在11 d.p.i，中间调节在7 d.p.i。我们发现基因的表达模式随着时间的推移呈下降或增加的趋势。最高TF家族在与大鼠的早期相互作用中上调gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba主要是gydF4y2BabHLHgydF4y2Ba>gydF4y2BamygydF4y2Ba>gydF4y2BaAP2 /小块土地gydF4y2Ba,紧随其后的是gydF4y2BabZIP公司gydF4y2Ba>gydF4y2BaMADS公司gydF4y2Ba>gydF4y2BaTCPgydF4y2Ba>gydF4y2BaOFP公司gydF4y2Ba>gydF4y2BaNAC公司gydF4y2Ba>gydF4y2Ba加塔gydF4y2Ba>gydF4y2BaHSFgydF4y2Ba>gydF4y2BaNFY.gydF4y2Ba>gydF4y2BaE2F公司gydF4y2Ba>gydF4y2BaWRKY >静脉/家什gydF4y2Ba. 另一方面，TF表达下调最高的家族主要是gydF4y2BaAP2 /小块土地gydF4y2Ba>gydF4y2BabHLHgydF4y2Ba>gydF4y2BamygydF4y2Ba然后gydF4y2BaMADS公司gydF4y2Ba>gydF4y2BaCamta.gydF4y2Ba>gydF4y2BaNAC公司gydF4y2Ba>gydF4y2BaTCPgydF4y2Ba>gydF4y2Ba加塔gydF4y2Ba>gydF4y2BabZIP公司gydF4y2Ba>gydF4y2BaHSFgydF4y2Ba>gydF4y2BaNFY.gydF4y2Ba>gydF4y2BaE2F公司gydF4y2Ba>gydF4y2Ba扭曲的gydF4y2Ba>gydF4y2BaOFP公司gydF4y2Ba．油棕的家庭在防御反应期间参与了gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba在上调和下调的DEGs中发现相同但涉及不同的成员。与众不同的是，gydF4y2Ba静脉/面纱gydF4y2Ba和gydF4y2BaCamta.gydF4y2BaTF家族仅在上调和下调的DEGs中发现。gydF4y2Baatcamta3.gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtcamta4.gydF4y2Ba在sa介导的信号通路中负调控植物对专性生物营养的防御反应[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

进一步了解植物对gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba相互作用，从RNA-SEQ数据鉴定了四种常见途径调节防御机制（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).虽然并不是所有的基因都在这些途径中被发现，但在所呈现的DEGs中已经发现了与不同途径相关的重要基因。已报道的涉及细胞壁修饰、ros介导的信号转导、PCD和植物先天免疫的基因均有差异表达，表明在植物中对防御反应的主动调控gydF4y2BaE赤眼蜂gydF4y2Ba对血管术gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba．生物胁迫相关基因的表达模式对于区分植物在生物营养和坏死营养感染两个不同阶段的防御机制具有重要意义。gydF4y2Ba

六个基因gydF4y2Ba纤维素合成酶gydF4y2Ba（gydF4y2Ba塞萨gydF4y2Ba)以及gydF4y2Ba纤维素合酶样D.gydF4y2Ba（gydF4y2BaCSL.gydF4y2Ba)的细胞壁修饰，包括gydF4y2Baegcesa2.gydF4y2Ba，gydF4y2Baegcesa4.gydF4y2Ba，gydF4y2Baegcesa5.gydF4y2Ba，gydF4y2BaEGCESA9.gydF4y2Ba，gydF4y2BaEGCSLD2.gydF4y2Ba和gydF4y2BaEGCSLD5.gydF4y2Ba表现出相似的表达模式，在3d.p.i高表达，随着时间的推移逐渐降低。六分之三的基因参与ROS介导的信号传导，包括gydF4y2Ba超氧化物歧化酶gydF4y2Ba（gydF4y2Baegsod.gydF4y2Ba），gydF4y2Ba谷胱甘肽S-转移酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaEgGSTF12gydF4y2Ba)以及gydF4y2Ba呼吸爆发氧化酶同源物gydF4y2Ba（gydF4y2BaEGROHA.gydF4y2Ba）越来越多地从3 d.p.i到11 d.p.i表达，而虽然gydF4y2BaEgGSTU17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba鸡蛋3gydF4y2Ba和gydF4y2BaEGROBOHB.gydF4y2Ba表现出减少的表达模式。PCD中报告了两个基因，gydF4y2BaMetacaspase 9.gydF4y2Ba（gydF4y2BaEGMC9.gydF4y2Ba)以及gydF4y2Ba双功能核酸酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaEgBFN公司gydF4y2Ba）显示分别增加和降低调节的拮抗表达模式。参与PTI / ETI信号传导的植物先天免疫的五种基因被发现差异表达。三个基因包括gydF4y2Ba非发病相关基因1的非简调剂gydF4y2Ba（gydF4y2BaEgNPR1gydF4y2Ba），gydF4y2Ba钙调蛋白样3gydF4y2Ba（gydF4y2BaEgCML3型gydF4y2Ba)以及gydF4y2Ba钙依赖性蛋白激酶7gydF4y2Ba（gydF4y2BaEgCDPK7gydF4y2Ba)在第3d.p.i.和第7d.p.i.时上调最高，随后下降。其他基因gydF4y2BaEgCML7型gydF4y2Ba和gydF4y2BaEGCDPK28gydF4y2Ba在11d.p.i.时表达最高。RNA-seq数据的可靠性已在我们之前的报告中得到验证[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba与未经处理的幼苗（对照）相比，使用具有不同水平的折叠变化的代表性上调和下调的次数。gydF4y2Ba

与防御反应相关的转录因子的表达模式gydF4y2BaGanoderma Boninense.gydF4y2Ba

RNA-seq数据是通过对照(未处理)和gydF4y2BaGanoderma-gydF4y2Ba跨时间课程治疗的（GT）样品（3,7和11 d.p.i）。为了筛选与来自一大组候选基因的生物应激特异的防御相关的TFS，通过比较基于带的基团（GT和模拟处理（MT）之间的mRNA的相对量来进行多重半定量PCR扩增子强度（数据未显示）。QPCR分析能够通过分别在针对对照的指定时间点分别比较GT和MT样品的表达模式来进一步区分在生物和/或非生物胁迫下调节的五种TF候选物（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba). 生物营养相关TFs，gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaEgTCP15gydF4y2Ba在GT样品下降之前，在3 D.P.i高度上调。然而，gydF4y2BaEgTCP15gydF4y2Ba在11d.pi，还在MT样品中表现出显着的上调。在SA介导的信号传导下的发育和应激响应途径中报道了TCP15，通过与NPR1的互动增强了[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］．除了除以后，所有时间点的MT样品中的表达水平都很重要gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba，这表明了gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba生物营养感染阶段在生物营养阶段下的特异性作用（gydF4y2Ba灵芝gydF4y2Ba感染）。gydF4y2Ba

同时，对坏死营养相关TFs候选基因的qPCR分析显示gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba，gydF4y2Baegein3.gydF4y2Ba和gydF4y2Baegmyc2gydF4y2Ba在GT样品上11 d.p.i高度上调。两者gydF4y2BaEIN3公司gydF4y2Ba和gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba是JA依赖性，分别在RNA-SEQ数据中上调和下调。已知这些基因的表达是相互排斥的，其中MyC2依赖于JA-脱盐酸（ABA）的共同作用gydF4y2BaEIN3公司gydF4y2Ba通过JA-ET信号调节植物防御响应[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］．gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba在所有时间点的MT样品（非生物胁迫）上都显示出不显著的表达，被选作坏死营养特异性TF的新的潜在候选。gydF4y2Ba

在生物营养感染期间，EgJUB1结合到新的SNBE基序gydF4y2Ba

EGJUB1 TF的表征gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba采用Y1H和EMSA检测。三种潜在的结合母题;在EgJUB1上分别检测了一个NAC结合位点(NACBS)和两个二级壁NAC结合元件(SNBEs)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．NACBS是JUB1 TF在非生物胁迫过程中建立的结合基序，SNBEs是本研究测试的新的靶基序。SNBE一致序列为WNNYBTNNNNNNNAMGNHW, NACBS为RRYGCCGT。Y1H与SNBE1基序存在正相互作用，但与NACBS和SNBE2没有相互作用。结果表明，JUB1在生物胁迫过程中通过调节替代途径增强抗性。与其中一个SNBE1基序的正结合表明其结合亲和力依赖于SNBE共识序列的核心基序，因此SNBE1核心基序上的4个核苷酸的变化导致其与SNBE2没有相互作用(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa） 是的。在五个阳性克隆上进行菌落PCR，使用PGADT7-REC载体的T7启动子引物进行测序，以确认真正的阳性相互作用。P53-ABAI酵母报告量载体被用作Y1H测定中的阳性对照。我们通过在生物素化的DNA探针上测试从Y1H测定的正克隆的核蛋白质的结合测试，通过EMSA进一步通过EMSA进行蛋白质-DNA相互作用。在用生物素化的DNA探针测试时观察到换档带。未标记的探针（摩尔过量200倍）能够有效地竞争与生物素化的靶DNA探针结合。突变片段与生物素化的靶DNA探针的无能显示Egjub1至SnBE1的特异性结合（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab). SNBE一致序列是JUB1预测的DNA结合基序(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac），基于植物转录因子数据库（PlantTFDB），但到目前为止没有报告的证据支持这一点。gydF4y2Ba

在这里，我们列出了在CO-Compyed的1.5 kB启动子地区探讨的SNBE主题gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba在生物营养期期间（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad） 是的。根据RNA-seq数据，EgJUB1在第3天和第7天时表现出显著的上调，但在第11天时没有，这是基于对截止值的统计分析gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba折叠变化| 1.0 |和gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.01。因此，使用相同的统计分析，具有相似表达谱模式的转录因子被归类为与EgJUB1共表达。的启动子区是SNBE1序列的核心基序gydF4y2Baeghsfc-2b.gydF4y2Ba，建议直接调节EGJUB1gydF4y2Baeghsfc-2b.gydF4y2Ba．我们强调了几个TFS的启动子区域与之同意gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba本研究检测的SNBE1核心基序在第5位或第18位发生单核苷酸变化，包括gydF4y2BaEgHSFB-4bgydF4y2Ba，gydF4y2Ba蛋黄B-X2gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgERF003gydF4y2Ba，gydF4y2BaEGKAN1-LIFE-X3gydF4y2Ba，gydF4y2Baegili-5样gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgERF086-likegydF4y2Ba，gydF4y2BaEgPIF3-X1gydF4y2Ba以及-gydF4y2BaX2gydF4y2Ba．它是合理的，SNBE1核心主题上的单核苷酸的变化仍然保持EGJUB1激活这些TF的能力。预计SNBE1的核心基序中的两种和更多核苷酸的变化将导致结合亲和力的显着下降[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]更详细的价值分析。gydF4y2Ba

在坏死性感染期间，EgERF113结合GCC和DRE/CRT基序gydF4y2Ba

EgERF113 TF通过酵母单杂交（Y1H）试验和电泳迁移率转移试验（EMSA）进行检测（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)对AP2/ERF两种DNA结合的偏好，即GCC盒又称乙烯反应元件（ERE）和脱水反应元件/C重复序列（DRE/CRT）。本研究中的GCC盒和DRE/CRT基序共享GCCGMC的6-bp核心序列。我们的发现揭示了在Y1H分析中两个基序对EgERF113的识别。EMSA结果支持EgERF113与两个结合基序的结合亲和力。GCC-box和DRE/CRT（摩尔超过200倍）的未标记探针能够与相应的生物素化靶DNA探针竞争。突变片段上未观察到移位带，证明EgERF113与GCC盒和DRE/CRT基序结合特异。研究结果表明，EgERF113可以调控启动子区含有GCC-box和/或DRE/CRT的应激相关基因。gydF4y2Ba

EgJUB1和EgERF113定位于细胞核gydF4y2Ba

分析推导的氨基酸序列显示EGJUB1的NAC结合结构域，在N末端区域中具有五个高度保守的亚域A至e。C末端区域在不同物种之间显示出高度保守的结构域，其表明其可能作为转录活化剂，阻遏物或与其他蛋白质结合的作用。推定的核定位信号（NLS），KKSLVYYLGSAGKGTKT在子域D中鉴定（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa） 是的。gydF4y2Ba

EGERF113 TF的DBD由三链ß片和一个α-螺旋分几乎并联。Egerf113推导的氨基酸序列的分析证明了DBD的第14位在第14位的色氨酸（W）氨基酸的存在，其向GCC盒和DRE / CRT基序解释了结合特异性。额外的氨基酸在第24位DBD的氨基酸中导致61个氨基酸长，仅对GCC盒结合到GCC盒的特异性[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．然而，Egerf113的AP2 / ERF DBD缺乏该额外的氨基酸。推定的NLS pwgkwaaeirdprkairv在ß-纸上鉴定（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab） 是的。gydF4y2Ba

为了确定EGJUB1和EGERF113蛋白的亚细胞定位，我们使用了gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba洋葱表皮细胞中绿色荧光蛋白（GFP）瞬时表达的介导的转化。如图1所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac、 GFP标记的EgJUB1和EgERF113均能在细胞核内共积累。mGFP融合蛋白与TFs的C端融合。这一观察结果与这些蛋白作为TFs的假定作用是一致的。gydF4y2Ba

当被病原体攻击时，植物通过激活复杂的防御系统作出反应。根据病原体的性质，生物营养性和坏死营养性感染在感染途径、效应蛋白和宿主防御反应方面有根本的不同[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]. 因此，根据感染阶段来处理疾病，假设应该能够挽救或至少延长患者的寿命gydF4y2Ba灵芝gydF4y2Ba- 摄取的棕榈树。鉴定生物营养期的感染可能有助于种植植物采取合适的疾病管理策略，以防止疾病从过渡到更慢性的虚张性阶段。同时，可以用更强烈的实践，例如使用化学杀真菌剂，治疗感染的棕榈树。生物营养和坏养殖TFS的分化是基于已知的防御机制的既定防御相关生物标志物，例如植物先天免疫和人力资源，可以区分这两个阶段。在这项研究中，我们证明了这一点gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba作为一种生物营养特异性gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba作为一种病重养殖特异性转录调节剂，在早期油掌上 -gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba互动。gydF4y2Ba

EgJUB1可能通过SNBE基序介导生物营养期的防御反应gydF4y2Ba

表达剖面gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba在RNA-SEQ中观察到通过QPCR验证，QPCR验证，这提出了在生物营养阶段的主体防御调节中的作用gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba不依赖于非生物胁迫的感染。JUB1首先与氧化应激的稳态有关，特别是与过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)信号。它绑定到gydF4y2BaCIS-gydF4y2Ba在基因启动子区域中作为NACBS的元件gydF4y2BaDreb2a.gydF4y2BaTF对非生物胁迫的耐受性[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]. DREB2A-TF直接与干旱胁迫应答基因（包括HSFs）的DRE序列结合，但其机制尚不清楚[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．AtJUB1 (ANAC042)也被报道为诱导camalexin表达的关键TF, camalexin是一种主要的植物抗毒素gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba对抗细菌病原体[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．最近的一项研究揭示了诱导表达gydF4y2BaNAC042_5.gydF4y2Ba，正轨gydF4y2BaAtJUB1公司gydF4y2Ba响应生物养真菌gydF4y2Baerysiphe necator.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．的gydF4y2Bajub1.gydF4y2Ba其独立于SA作用，在病原体殖民化期间诱导。有趣的，油棕gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba被发现与两名候选人共同表达gydF4y2BaEGTGA1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaEgNPR1gydF4y2Ba直接同源。我们的结果更符合sa依赖的主调节器gydF4y2Ba尼泊尔卢比1gydF4y2Ba，一个gydF4y2BaTGA1gydF4y2Ba报告(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba),导致gydF4y2Ba发病机制相关gydF4y2Ba（gydF4y2BaPR.gydF4y2Ba)基因[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]在生物营养阶段。gydF4y2Ba

我们第一次报道诱导表达gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba在病原体攻击下，调节含有SNBE结合基序的防御相关基因。SNBE基序由一个19 bp的不完全回文序列组成，可存在于多种靶点的启动子中，包括TFs和参与次生细胞壁生物合成、细胞壁修饰以及PCD的下游基因[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．结合19bp SNBE（A / T）NN（C / T）（C / G / T）TNNNNNNNA（A / C）GN（A / C / T）（A / C / T）（A / C / T）（A / C / T）是至关重要的9核心核苷酸，无论其他核苷酸的突变如何[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]. 他们报告说，这9个核心核苷酸的突变导致转录激活的减少和/或消除，相反，其他非关键核苷酸的变化增强了结合亲和力。gydF4y2Ba

我们的研究发现EgJUB1直接调控gydF4y2Baeghsfc-2b.gydF4y2Ba通过SNBE1基序促进对抗生物营养相的抵抗力。本研究中测试的SNBE1基质分别由核心基序的第5和第18位的核苷酸G和T组成。基于钟等人的报告。［gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba[然而，如果SNBE共有序列的核心基序中的单个核苷酸改变，则仍然可以保持结合亲和力，但是，两种和更多核苷酸的变化可以显着降低结合亲和力。因此，最有可能使EGJub1仍然能够与列出的油棕TF的启动子结合（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad），gydF4y2BaEgHSFB-4bgydF4y2Ba，gydF4y2Ba蛋黄B-X2gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgERF003gydF4y2Ba，gydF4y2BaEGKAN1-LIFE-X3gydF4y2Ba，gydF4y2Baegili-5样gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgerf086.gydF4y2Ba-gydF4y2Ba喜欢gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgPIF3-X1gydF4y2Ba以及-gydF4y2BaX2gydF4y2Ba，其中港口单核苷酸在SNBE1核心基序的第五或第18位变化。在这些TFS中，热休克因子gydF4y2Baeghsfc-2b.gydF4y2Ba和gydF4y2BaEgHSFB-4bgydF4y2Ba被确定了。有趣的是众所周知，HSFB参与压力反应期间的转录重编程[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba］．因此，油掌的防御机制gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba可以通过HSF途径引导。gydF4y2Ba

我们的研究结果符合最近观察到高度上调的研究gydF4y2BaHSFgydF4y2Ba和gydF4y2Ba热休克蛋白gydF4y2Ba（gydF4y2BaHSPS.gydF4y2Ba）抗生物养精真菌[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．在直接调节的细菌感染期间还报告了HSFgydF4y2Ba疾病易感性增强1gydF4y2Ba（gydF4y2BaEDS1gydF4y2Ba)以及gydF4y2BaPR4gydF4y2BaSA介导的信号转导[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

拟议的防御相关途径由gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba共表达基因gydF4y2Ba

在这里，我们报告了高表达gydF4y2Baegcesa4.gydF4y2Ba，gydF4y2BaEGCESA9.gydF4y2Ba和gydF4y2BaEGCSLD2.gydF4y2Ba与表达相关gydF4y2Ba蛋黄B-X2gydF4y2Ba在随后表达下降之前的生物营养相（3和7d.p.i）期间Tf。GamyB TF与GamyB结合基序相互作用，以激活下游基因[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．的启动子区发现了GAMYB基序gydF4y2Ba塞萨gydF4y2Ba负责次生细胞壁纤维素的生物合成[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．一直gydF4y2Ba，gydF4y2BaCESA4gydF4y2Ba，gydF4y2BaCESA7.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCESA9.gydF4y2Ba据报道称为二次细胞壁纤维素合成的调节剂[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．此外，局部细胞壁通过gydF4y2BaCSLD2型gydF4y2Ba已被证明在白粉病真菌的生物培养挑战下（Douchkov等，2016年）。因此，强烈假设EGJub1在启动子区域中的SNBE1基序结合gydF4y2Ba蛋黄B-X2gydF4y2Ba通过调节二次细胞壁生物合成来激活油棕防御响应。gydF4y2Ba

增加了ROS的生产伴随着PCD [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]提供HR发生的证据。在目前的研究中，调节抗氧化酶的基因gydF4y2Baegsod.gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgGSTU17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba鸡蛋3gydF4y2Ba和gydF4y2BaEgGSTF12gydF4y2Ba在早期与细胞的相互作用中高度上调gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba. 我们还观察了gydF4y2BaEgNPR1gydF4y2Ba和gydF4y2BaEGTGA1.gydF4y2Ba已经认识到在SA介导的信号通路下的生物养殖攻击期间被认可过度表达[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．的贯通性gydF4y2BaEgNPR1gydF4y2Ba和gydF4y2BaEGTGA1.gydF4y2Ba导致上调gydF4y2BaEGPR1gydF4y2Ba在我们之前的报告中已被证明是一种生物营养标记[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Egerf113可能通过GCC盒和DRE / CRT主题调解病症期间的防御反应gydF4y2Ba

MYC2完全依赖于JA-ABA分支反应的协同作用，通过抑制JA-ET分支来调节对昆虫和伤害的抗性[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba]. 尽管gydF4y2Baegmyc2gydF4y2Ba初步筛选为虚张症生物标志物[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，TF被分类为我们的RNA-SEQ数据中的下调DEG。这可以通过升高的乙烯不敏感的表达来解释gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba（gydF4y2Baegein3.gydF4y2Ba)，然后可能会激活gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba通过ET规则。ET对其受体的结合灭活组成型三重响应1（CTR1），其在EIN 2活性上释放抑制，并稳定核内的EIN3和EIN3样1（EIL1）[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．因此，gydF4y2BaERF.gydF4y2Ba被激活，ERF TFS调节发育的转录活性以及应激诱导的响应基因[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．乙烯信号传导途径的主稳压器，gydF4y2BaEIN3公司gydF4y2Ba和gydF4y2BaEIN3-likegydF4y2Ba（gydF4y2BaEIL.gydF4y2Ba)已经被证明可以调节多种下游转录反应[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]. 去压抑gydF4y2BaEIN3/EIL公司gydF4y2Ba来自JA-ZIM结构域（JAZ）激活JA-ET信号，该信号正调控发育的转录激活以及对坏死性病原体的防御反应[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．调查结果表明，通过JA-ET的共同行动，油棕树上建立了针对坏营养性的抗性，而不是JA-ABA。gydF4y2Ba

在这里，我们提出对抗病性阶段的防御反应的调节gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba通过多瀑布激活JA-ET分支，导致过度表达gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba．gydF4y2BaERF113gydF4y2Ba，也被认为是gydF4y2Ba有关APETALA2.6-LIKEgydF4y2Ba（gydF4y2BaRAP2.6 LgydF4y2Ba)这与gydF4y2BaERF108gydF4y2Ba（gydF4y2BaRAP2.6gydF4y2Ba发现对非生物胁迫（盐度，热和干旱）以及应激激素，特别是Ja和/或等[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．ERF108已在JA诱导的防御反对伤害和病原体中报告[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．同样，ERF113被证明是在伤害时被诱导的[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]以及病原体感染[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们是第一个报道具有GCC盒和DRE/CRT基序绑定偏好的EgERF113。已知AP2/ERFs具有多种保守的DNA结合偏好[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．然而，通常已知DREBS认识到赋予非生物应激的抗旱/ CRT，而ERFS与GCC盒促进防御生物应激的抗性。据报道，ERF113拟合GCC盒[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]但没有在DRE / CRT主题上进行测试。迄今为止，仅报告了几个ERF在GCC盒和DRE / CRT上赋予抵抗病原体攻击的结合偏好[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba，gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．植物防御素中存在的GCC盒和DRE / CRT基序的结合（例如gydF4y2BaPDF1.2gydF4y2Ba)以及gydF4y2BaPR.gydF4y2Ba基因，激活与防御相关的基因[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]. Kaur等人[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba[还报道了钙响应基因的启动子区域中的DRE / CRT元素。钙离子（CA.gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba)信号在植物感知入侵病原体的防御机制中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Phukan等人[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba基于序列表征研究了AP2 / ERF TF DNA结合特异性的发散。它们的发现在60氨基酸长DBD中鉴定的第48位在第48位的第48位和丙氨酸（A）中提出了谷氨酸（E），使得对DRE / CRT基序表示结合特异性。Egerf113还显示了在第10,18，第20次，第37次和第59位的GCC盒结合的氨基酸保护。虽然尚未确认调节TFS和DRE / CRT基序的TFS结合的DBD中的特定氨基酸，但在EGERF113中替换在第14位至色氨酸（W）的第14位的苯丙氨酸（F）改变GCC的结合特异性- 箱只能绑定GCC盒和DRE / CRT主题，如Phukan等人所建议的。［gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]. DBD第24位的一个额外的氨基酸（碱性极性）是EgERF113所缺乏的，仅对特异性结合GCC盒是必需的。因此，含有60个氨基酸DBD的EgERF113反对将长度为61个氨基酸的特异性GCC盒结合DBD分类。gydF4y2Ba

拟议的防御相关途径由gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba共表达基因gydF4y2Ba

二gydF4y2BaRBOHgydF4y2Ba基因，gydF4y2BaEGROHA.gydF4y2Ba和gydF4y2BaEGROBOHB.gydF4y2Ba以前在我们的研究中报道过[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，并减少gydF4y2BaEGROBOHB.gydF4y2Ba表达早期的坏养殖期可能表明植物在延迟疾病进展方面的反应。这符合关于对血管反应的报告gydF4y2BaMacrophomina phopololina.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，其中增加了表达gydF4y2BaRBOHgydF4y2Ba导致植物易感性增加对病症感染。gydF4y2Ba

另一个较少的TF，gydF4y2BaAtMYB122gydF4y2Ba据报道，调节参与Camalexin Biosynthesis的基因[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba］．在诱导葡萄糖信号期间，在葡萄糖信号传导期间增加了吲哚糖苷的积累是由gydF4y2BaAtMYB122gydF4y2Ba［gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．在另一篇类似的报道中，硫代葡萄糖苷及其衍生物有助于抵御坏死性真菌[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba，gydF4y2Ba89gydF4y2Ba］．基于表达式模式gydF4y2Baegmyb122gydF4y2Ba，TF通过3d.pi的反应反应反应反应反应的调节。防御gydF4y2Ba灵芝gydF4y2Ba预计在坏死营养期的后期，基因调控将更加广泛。gydF4y2Ba

胞浆钙的快速和短暂的增加gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba特别是在病原体中，相互作用导致PTI和ETI信号的激活[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba］．cml和CDPKs被称为CagydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba在植物先天免疫过程中负责感知转导的传感器蛋白[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]. 根据我们的RNA序列数据分析gydF4y2BaEgCML7型gydF4y2Ba和gydF4y2BaEGCDPK28gydF4y2Ba在坏死营养期上调。与分析一致，EgERF113建议通过调节gydF4y2BaPR.gydF4y2Ba钙敏感基因。gydF4y2Ba

在生物营养或虚营养期下差异调节的其他转录因子gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba钙调蛋白结合转录活化剂gydF4y2Ba（gydF4y2BaCamta.gydF4y2Ba)基因最早发现于gydF4y2Ba尼科尼亚塔哈瓦姆gydF4y2Ba，调节衰老和细胞死亡[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba]最近，Kakar等人对其进行了全面的研究[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．我们发现了小说的成员gydF4y2BaCamta.gydF4y2BaTF家族，即gydF4y2BaEGCAMTA3.gydF4y2Ba和gydF4y2BaEGCAMTA4gydF4y2Ba这在3 d.p.i下调。两种基因的抑制后来减少了时间，这可能是从生物营养到早期病养相的感染相转变的结果。gydF4y2BaCamta.gydF4y2Ba被证明是为了规范加利福尼亚州的回应gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba非生物和生物应力期间的信号传导[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba，gydF4y2Ba95gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

总的来说，随着时间的推移，大多数下调的TFs的deg表现出去抑制。这是合理的假设，表达模式的变化可能是植物免疫相互作用的结果，以防止生物营养和坏死感染阶段。例如，下调gydF4y2Baegmyb108gydF4y2Ba在7 d.p.i时最高，然后在11 d.p.i时下降。gydF4y2Bamyb108gydF4y2Ba被证明能积极调节对半身不遂的防御机制gydF4y2Baverticillium dahliae.gydF4y2Ba在钙调蛋白和加州的存在gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba，对抗gydF4y2Ba凸轮轴3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba96gydF4y2Ba，gydF4y2Ba97gydF4y2Ba]. 相反，gydF4y2BaEgerf9.gydF4y2Ba被发现在11 D.P.I的病重阶级期间专门下调。结果与报告抑制活动的其他研究达成协议gydF4y2BaAterf9.gydF4y2Ba抗病性抗性的抗性gydF4y2BaBotrytis cinereagydF4y2Ba［gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．同样地，在早期相互作用时，上调的次数中TFS的表达模式较高gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba在逐渐减少之前。的植物gydF4y2BaEgTCP15gydF4y2Ba在衰退之前在生物营养期期间表现出上调，但在非生物胁迫下表达表达模式。gydF4y2Ba

结合上述结果，我们能够识别在真菌感染模式转换过程中受调控的TF基因。通过对编码TFs的油棕RNA-seq数据的首次分析，确定了6个常见的TFs主要家族负责促进油棕对TFs的防御反应gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba包括MYB、bHLH、AP2/ERF、NAC、bZIP和WRKY。已报道的涉及细胞壁修饰、ros介导的信号转导、PCD和植物先天免疫的基因均有差异表达;表明油棕对半生物营养的防御反应有积极的调节作用gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba细菌的生物营养和坏死营养感染阶段gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba通过基因表达进一步支持生物养殖特异性，gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba和坏养殖特异性的，gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba．我们的发现是首次报道的EgJUB1作为潜在主调控因子，基于其与不完全回文SNBE共识序列的积极相互作用，该序列可能促进生物营养相关防御机制的分支，包括细胞壁强化和hrr介导的防御反应。此外，EgERF113是第一个报道的AP2/ERF TF在坏死期通过与GCC-box和DRE/CRT基序结合来调节多方面的防御机制。结合这些基序可能导致转录上调gydF4y2BaPR.gydF4y2Ba钙敏感基因。根据我们的研究结果，提出了一种推测油棕对半生物群落的防御机制gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba在生物营养和虚张感的感染相期间如图1所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．该信息为识别受感染期特异性TFs调控的下游靶防御相关基因迈出了有前景的第一步。虽然我们目前的研究对EgJUB1和EgERF113的防御作用提出了重要的见解，但利用植物模型如EgJUB1和EgERF113的过表达研究或突变体互补研究gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba或者gydF4y2Ba尼古利亚娜gydF4y2BaSPP。应在将来的调查中进行，以进一步描绘由这些TFS引发的防御机制。gydF4y2Ba

植物材料与真菌处理gydF4y2Ba

四个月的萌发油棕榈幼苗商用DXP GH500系列（gydF4y2BaElaeis guineensisgydF4y2BaJacq。gydF4y2BaDura x PisiferagydF4y2Ba)，购自马来西亚雪兰莪州班亭市森那美种子和农业服务私人有限公司。致病的gydF4y2BaGanoderma Boninense.gydF4y2Ba菌株Per71被隔离，并从马来西亚霹雳州霹雳州托克Intan的受感染的油棕榈纯化[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，从Ganodrop单位，生物学师，马来西亚棕榈油板（MPOB）获得。油棕榈幼苗的人工感染gydF4y2BaG. Boninense.gydF4y2Ba使用橡胶木块(rwb)是根据先前的一项研究[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．控制（c）被设定为幼苗而无需治疗。进行了两种不同的治疗;模拟治疗（MT）由裸露的rwbs组成的油棕榈幼苗gydF4y2Ba灵芝gydF4y2Ba处理（GT）包括油棕幼苗gydF4y2Ba灵芝gydF4y2Ba接种RWBs。在接种后不同天数(3,7,11 d.p.i)对油棕幼苗进行破坏性取样。每一个生物复制都由六种组成的幼苗平均提供的聚合RNA组成。比起单个样本的数学平均，生物平均更划算，并且在RNA-seq研究中试图减少样本间的高生物学变异性时经常使用[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba］．通过使用每种泳池的三到八个生物单独样品可以减少池偏置，每个治疗组两个池[gydF4y2Ba99gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

TFS的RNA提取和DEGS分析gydF4y2Ba

所有样本的总RNA均按照Bahari等人报告的方法提取[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]. 提取的RNA用于随后的所有实验。如我们之前的报告所述，进行了高通量NGS数据分析，Bahari et al[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]. mRNA片段被定位到gydF4y2BaElaeis guineensisgydF4y2Ba作为参考基因组的编码序列（检索自gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/genomes/gydF4y2Ba)，通过geneous软件9.1.5版本(Biomatters Ltd.)。在对齐/组装工具中，使用geneous for RNA-Seq作为中低灵敏度的作图者，在作图前使用clean reads。映射步骤完成后，计算每个样本的转录本丰度为每千碱基百万转录本(TPM)。选择在两个合并的生物复制中可重复的序列，以消除由于文库构建过程中的操作阶段而产生的转录本偏倚谱[gydF4y2Ba100.gydF4y2Ba］．通过将从对照的基因与GT样品进行比较来分析基因表达谱的改变。在严格的日志截止值下进一步评估DEGgydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC≥| 1.0 |（对应于2倍或更多的上调/下调）和gydF4y2BaPgydF4y2Ba-价值< 0.01 [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba101.gydF4y2Ba］．比较分析在两个生物重复的对照和GT样品在所有时间点。将符合截断值的转录因子按上调和下调基因进行聚类。在两个合并的生物复制中鉴定的转录本被进一步分析以鉴定deg。通过NGS数据分析，我们发现了涉及细胞壁修饰、ROS产生和PCD的一些应激相关基因的deg。gydF4y2Ba

实时荧光定量PCR (qPCR)验证gydF4y2Ba

使用QPCR Green Master Mix Lrrx（2x）（Biotechrabbit GmbH，德国）进行QPCR。五种内源性控制的稳定性;gydF4y2BaEggapdh2，Egnadh5，Egmsd，Egubq，gydF4y2Ba和gydF4y2Ba肌动蛋白gydF4y2Ba对治疗组和对照组样本进行检测。qPCR分析采用Bio-Rad-CFX-Manager进行™ 软件版本3.1。所有靶基因的表达水平均与三个最稳定的参考基因的表达水平进行标准化gydF4y2BaEgGAPDH2, EgNADH5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba肌动蛋白gydF4y2Ba．实时荧光定量PCR检测对照(C)、模拟处理(MT)和对照(C)gydF4y2BaGanoderma-gydF4y2Ba治疗（GT）油棕榈根样品在3,7和11d.i.i。数据包括三个油棕幼苗根系样本的生物重复。表达水平的比较分析表达为三个个人技术复制的平均值（SEM）的折叠变化±标准误差gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.01。采用单因素方差分析(ANOVA)确定试验组与对照组之间表达水平的显著差异，然后采用Tukey’s检验进行处理之间的比较。qPCR所用引物列于表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

EGJUB1和EGERF113的序列表征gydF4y2Ba

序列分析采用基本局部对齐搜索工具(BLAST 2.9)gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.gydF4y2Ba. 爆炸。使用BLASTX算法进行同源性搜索，将翻译的目的蛋白序列（EgJUB1和EgERF113）与国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中的其他蛋白质序列进行比较。核苷酸序列通过公开访问的网站ExPASy Molecular Biology Server被翻译成蛋白质序列(gydF4y2Bahttp://web.expasy.org/translate/gydF4y2Ba)．使用T-Coffee软件版本11.0进行不同物种蛋白质序列的多序列比对（gydF4y2Bahttp://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:expressogydF4y2Ba)．使用NLS Mapper的可访问网站预测NLS（gydF4y2Bahttp://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/nls_mapper_form.cgi.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

酵母单杂交（Y1H）分析gydF4y2Ba

编码区域gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba使用Q5®Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (New England Biolabs)，分别在3和11 d.p.i从GT样本中扩增SMART序列(总RNA 500 ng)。纯化智能- - - - - -gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba-egerf113.gydF4y2Ba通过使用Advantage®2PCR混合物（Takara Bio）的长距离PCR进一步扩增。调用串联靶诱饵片段（NACB，SNBE1，SNBE2，GCC盒和DRE / CRT）以及各自的突变片段被克隆到Pabai载体中并集成到酵母基因组中。确定每种诱饵和突变报告酵母菌菌株的Aurebasidin A（ABA）的最小抑制浓度（MIC）。gydF4y2Ba

酵母单杂交筛选使用酵母制造商™酵母转化系统2 (Takara Bio)。酵母菌共转化反应的各组分按顺序依次加入:SMART- 2 μggydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba或者gydF4y2Ba-egerf113.gydF4y2Ba，1μg的PGAD7-REC AD（SMAI线性化），50μg变性的酵母载体DNA，50μl态酵母细胞Y1HGOLD [Pabai-Baits]或Y1HGOLD [Pabai-突变体]和500μLPEG/ LIAC溶液。在选择性板SD / -LEU和SD / -LEU / ABA上涂覆转化。转型控制，P53在SD / -LEU / ABA上铺板gydF4y2Ba^200gydF4y2Ba．将平板在30℃温育3天。使用麦基帕克插入检查PCR混合物2（Takara Bio）通过菌落PCR进行阳性克隆的确认，并使用T7启动子引物送去测序。在缺少亮氨酸（SD / -LEU）肉汤的合成液滴（SD）培养基中培养一个阳性克隆的菌落（ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba）0.1并用10倍稀释系列稀释。从每个稀释中，在SD / -LEU和SD / -LEU / ABA板上发现了10μl酵母培养物。在表中列出了Y1H测定中使用的寡核苷酸和引物gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Egjub1和Egerf113核蛋白的分离gydF4y2Ba

在5个培养基中培养Y1H试验阳性克隆的单个菌落 毫升标准差/−30℃摇一夜的亮氨酸肉汤 摄氏度。酵母培养物转入45 毫升标准差/−Leu肉汤，进一步发酵过夜（18-20分钟） h） 30岁 °C至外径gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba达到0.8-1.0。通过1000离心沉淀酵母细胞 ggydF4y2Ba在4℃下放置5分钟。用30mL冰冷的无菌纯水洗涤沉淀，并以1000离心 ggydF4y2Ba在4℃下放置5分钟。球团立即在液氮中速冻并研磨成细粉。核蛋白的提取使用NE-PER™核和细胞质提取试剂(Thermo Scientific)。EgJUB1和EgERF113核提取物保存于−80℃。gydF4y2Ba

电泳迁移率测定(EMSA)gydF4y2Ba

使用生物素3'末端DNA标记试剂盒（Thermo Sciencific），双链的感觉和抗道寡核苷酸是生物素标记的。使用的寡核苷酸列于表中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．采用LightShift EMSA优化和控制试剂盒(Thermo Scientific)制备了EMSA的结合反应体系。结合混合物溶解在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶0.5X三硼酸- edta (TBE)缓冲液中，并转移到带正电的尼龙膜上。在120 mJ/cm时交联膜gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba1分钟。根据制造商的协议，蛋白质-DNA复合物通过LightShift®化学发光EMSA试剂盒（Thermo Sciencific）可视化。gydF4y2Ba

亚细胞本地化gydF4y2Ba

开放阅读框架gydF4y2Baegjub1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaEgERF113gydF4y2Ba使用KAPA-HiFi-HotStart-ReadyMix PCR试剂盒（Thermo-Scientific）扩增缺失终止密码子。表中列出了前向引物5'端CACC侧翼的基因特异性引物gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．PCR产物通过pENTR™定向拓扑克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific)转移到入口pENTR/D-TOPO进入载体。TOPO克隆反应转化为One Shot®TOP10化学活性细胞(Thermo Fisher Scientific)，生成进入克隆和序列验证。利用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (Thermo Fisher Scientific)将进入克隆重组到包含双CaMV 35S启动子(2 × 35S)的pMDC85的Gateway兼容目的载体中，获得EgJUB1和EgERF113的表达克隆。pMDC85载体的构建gydF4y2BaccdgydF4y2Ba以B基因和插入物为阴性对照。LR反应转化为One Shot™OmniMAX™2 T1®化学活性细胞(Thermo Fisher Scientific)。gydF4y2Ba

所得质粒2x35S:GFP(阴性对照)、2x35S::EgJUB1-GFP和2x35S::EgERF113-GFP经序列验证后转化为competentgydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2Ba菌株LBA4404 [gydF4y2Ba102.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba- 根据Azzeme等人进行洋葱表皮细胞的转化。［gydF4y2Ba103.gydF4y2Ba］．将新鲜的洋葱鳞（1.5×1cm）浸入20毫升中gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba悬浮控制和GFP构建，分别在28°C下孵育16 h。将洋葱鳞片转移到pH为5.8的Murashige和Skoog (MS)培养基中，并与之共培养gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba2天。用无菌水冲洗去皮的洋葱表皮细胞并转移到玻璃载玻片上。使用20倍的共聚焦激光扫描显微镜（LSM 5 Pascal Exceer，Zeiss，Germany）捕获荧光图像，在488nm处激发，并由LSM 5图像浏览器软件（Ver.4.1）分析。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

对于RNA-seq数据分析，根据log的截止值确定DEGsgydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC≥| 1.0 |和gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.01。通过三种参考基因归一化来自QPCR分析的每个基因的表达水平;gydF4y2BaEggapdh2.gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgNADH5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba肌动蛋白gydF4y2Ba. 数据以三个独立技术复制的平均值±标准平均误差（SEM）表示。采用单因素方差分析和Tukey检验，测定不同时间点的样本与对照组以及治疗组（MT和GT）之间的表达水平差异。与对照组相比，根据**gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.01，***gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001和****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001。n被定义为不显著。所有的图形都使用GraphPad Prism 5.0版本(GraphPadSoftware Inc.， USA)生成和分析。gydF4y2Ba

测序的mRNA数据沉积在欧洲核苷酸档案中，通过加入号PRJEB27915。gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/prjeb27915gydF4y2Ba

答:gydF4y2Ba

丙氨酸gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

奥雷巴西丁AgydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

方差分析:gydF4y2Ba

方差分析gydF4y2Ba

AP2 / ERF：gydF4y2Ba

Apetala2 /乙烯响应因子gydF4y2Ba

平均值：gydF4y2Ba

毒力量效果gydF4y2Ba

bhlh：gydF4y2Ba

基本helix-loop-helixgydF4y2Ba

爆破：gydF4y2Ba

基本的局部比对搜索工具gydF4y2Ba

bzip：gydF4y2Ba

基本亮氨酸拉链gydF4y2Ba

CagydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

钙离子gydF4y2Ba

卡姆塔：gydF4y2Ba

钙调蛋白结合转录活化剂gydF4y2Ba

BSR：gydF4y2Ba

基部茎腐病gydF4y2Ba

CWDE公司：gydF4y2Ba

细胞壁降解酶gydF4y2Ba

潮湿：gydF4y2Ba

损伤相关的分子模式gydF4y2Ba

数据库：gydF4y2Ba

DNA结合结构域gydF4y2Ba

度数：gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba

接种后的日子gydF4y2Ba

含有DREB:gydF4y2Ba

脱水反应元件结合gydF4y2Ba

DRE / CRT:gydF4y2Ba

脱水响应元件/ C重复gydF4y2Ba

乙二胺四乙酸：gydF4y2Ba

乙二胺四乙酸gydF4y2Ba

EIN3:gydF4y2Ba

乙烯不敏感3gydF4y2Ba

EIL：gydF4y2Ba

EIN3-likegydF4y2Ba

EMSA：gydF4y2Ba

电泳迁移率变速测定gydF4y2Ba

ere：gydF4y2Ba

乙烯反应元件gydF4y2Ba

ERF：gydF4y2Ba

乙烯响应因子gydF4y2Ba

等：gydF4y2Ba

乙烯gydF4y2Ba

eti：gydF4y2Ba

效应触发的免疫力gydF4y2Ba

F:gydF4y2Ba

苯丙氨酸gydF4y2Ba

G：gydF4y2Ba

谷氨酸gydF4y2Ba

GAPDH：gydF4y2Ba

甘油醛3磷酸脱氢酶gydF4y2Ba

燃气轮机：gydF4y2Ba

灵芝gydF4y2Ba-Treated.gydF4y2Ba

人力资源:gydF4y2Ba

过敏的反应gydF4y2Ba

HSF：gydF4y2Ba

热应激转录因子gydF4y2Ba

HSP：gydF4y2Ba

热休克蛋白gydF4y2Ba

ile：gydF4y2Ba

异吲哚gydF4y2Ba

JA：gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

杰兹：gydF4y2Ba

茉莉酸ZIM结构域gydF4y2Ba

JUB1：gydF4y2Ba

Jungbrunnen 1.gydF4y2Ba

雷：gydF4y2Ba

亮氨酸gydF4y2Ba

LIAC：gydF4y2Ba

醋酸锂gydF4y2Ba

麦克风：gydF4y2Ba

最小的抑制浓度gydF4y2Ba

MPOB：gydF4y2Ba

马来西亚棕榈油协会gydF4y2Ba

机器翻译：gydF4y2Ba

Mock-treatedgydF4y2Ba

MYB:gydF4y2Ba

成髓细胞瘤gydF4y2Ba

MYC:gydF4y2Ba

髓鞘症gydF4y2Ba

NADH：gydF4y2Ba

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶gydF4y2Ba

NACBS：gydF4y2Ba

NAC结合位点gydF4y2Ba

NCBI：gydF4y2Ba

国家生物技术信息中心gydF4y2Ba

ngs：gydF4y2Ba

下一代测序gydF4y2Ba

NLS编号：gydF4y2Ba

核定位信号gydF4y2Ba

NPR1：gydF4y2Ba

非发病相关基因1的非简调剂gydF4y2Ba

护士长：gydF4y2Ba

不重要gydF4y2Ba

OD：gydF4y2Ba

光密度gydF4y2Ba

PAMP时:gydF4y2Ba

其分子模式gydF4y2Ba

工厂数据库：gydF4y2Ba

植物转录因子数据库gydF4y2Ba

PCD:gydF4y2Ba

编程细胞死亡gydF4y2Ba

PR：gydF4y2Ba

Pathogenesis-relatedgydF4y2Ba

PRR编号：gydF4y2Ba

模式识别受体gydF4y2Ba

PTI：gydF4y2Ba

PAMP触发免疫gydF4y2Ba

质量控制要求：gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

第2.6条：gydF4y2Ba

与APETALA 2.6有关gydF4y2Ba

RAP2.6 L：gydF4y2Ba

与Apetala 2.6相关的gydF4y2Ba

RBOH：gydF4y2Ba

呼吸爆发氧化酶同源蛋白gydF4y2Ba

活性氧：gydF4y2Ba

反应性氧气gydF4y2Ba

RT：gydF4y2Ba

室内温度gydF4y2Ba

rwb：gydF4y2Ba

橡胶木块gydF4y2Ba

SA：gydF4y2Ba

水杨酸gydF4y2Ba

SD:gydF4y2Ba

综合辍学gydF4y2Ba

扫描电镜：gydF4y2Ba

平均标准误差gydF4y2Ba

SNBE:gydF4y2Ba

次壁NAC结合元素gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

TBE：gydF4y2Ba

Tris-borate-EDTAgydF4y2Ba

TF:gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

TPM：gydF4y2Ba

千碱基百万成绩单gydF4y2Ba

TSS：gydF4y2Ba

转录起始点gydF4y2Ba

W：gydF4y2Ba

色氨酸gydF4y2Ba

Y1H：gydF4y2Ba

酵母单杂交gydF4y2Ba

Ganoderma Boninense.gydF4y2Ba菌株PER71是从马来西亚棕榈油委员会（MPOB）获得的。马来西亚原子能机构为这项研究提供了钴-60伽马辐射服务。gydF4y2Ba

在这项工作中，研究的设计以及手稿中数据的收集、分析和解释得到了马来西亚教育部2015-2020年马来西亚创新技术研究所（NanoMITE）财团项目（5526302）的资助。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 种植园研究所，Universiti Putra Malaysia（芬欧芬邦），43400，Serdang，Selangor，马来西亚gydF4y2Ba

   Nurshafika Mohd Sakeh，Siti Nor Akmar Abdullah＆Mohammad Nazri Abdul BaharigydF4y2Ba

2. 马来西亚普特拉大学(UPM)农学院农业技术系，43400，雪兰果，瑟当，马来西亚gydF4y2Ba

   siti和akmar abdullahgydF4y2Ba

3. 生物化学系，生物科学与生物分子科学学院，Universiti Putra Malaysia（UPM），43400，Serdang，Selangor，马来西亚gydF4y2Ba

   Azzreena Mohamad Azzeme & Noor Azmi ShaharuddingydF4y2Ba

4. Ganoderma和疾病研究油棕单位，马来西亚棕榈油委员会，6，Persiaran Institusi，Bandar Baru Bangi，43000，Kajang，雪兰莪，马来西亚gydF4y2Ba

   阿布·塞曼·伊德里斯gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

SNA构思并设计了研究方案。NMS进行了大部分的实验并编写了实验稿。mbn有助于RNA-seq数据分析。AMA和NAS在分析分析、Y1H和EMSA方面提供了技术支持。IAS提供真菌材料，并辅助人工接种。SNA在手稿的写作中补充。所有作者都已经阅读并批准了提交的稿件的最终版本。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Basiti和akmar abdullahgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

所有作者都不声明没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

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