GmbZIP1通过靶向作用负调控ABA诱导的结瘤抑制GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba在大豆GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

脱落酸（ABA）通过ABA信号途径在植物生长和适应中起着重要作用。ABA应答元件结合（AREB/ABF）家族转录因子是整合ABA信号与多种信号通路的中心调节因子。ABA抑制豆科植物根瘤菌侵染和根瘤形成的机制早已为人们所知，但其分子机制尚不清楚。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

本研究表明，大豆结瘤对ABA非常敏感，外源ABA显著抑制根瘤菌感染和根瘤形成。此外，我们还证明了AREB/ABF转录因子GmbZIP1是大豆结瘤和植物对ABA响应的主要调控因子。GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在结节形成和发育过程中特异表达。过表达GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba减少了根瘤菌侵染，减少了根瘤菌数量。此外,GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba对ABA响应，并且异位过度表达GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在种子萌发和萌发后生长过程中，拟南芥对ABA的敏感性增强，植物的耐旱性增强。值得注意的是，我们发现GmbZIP1直接结合到GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba，用于结节形成的标记基因，以抑制其表达。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究结果表明GmbZIP1是一个结合ABA信号和结瘤信号的节点调节因子，对结瘤的形成起负调节作用。GydF4y2Ba

根结节是在低硝酸盐条件下开发的豆科植物中的专业根器官，其中豆类和氮素固定细菌（根瘤菌）形成共生关系。在共生结节中，豆科植物为其生长和生存的碳水化合物和能量提供细菌，相反，细菌供应从大气转换的NH3GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba满足豆科植物对高氮的需求[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

结瘤过程是由豆科植物和根瘤菌之间的相互作用和特定的串扰引起的。在低氮条件下，豆科植物根系向根际分泌类黄酮分子，诱导亲和根瘤菌合成并释放信号分子Nod因子（NFs）[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．位于根和根毛表皮细胞质膜上的赖氨酸基模受体样激酶(LysM receptor-like kinases, NFRs)可感知NFs。这些NF受体包括NF感知(NFP)GydF4y2BaM. Truncatula.GydF4y2Ba， NF受体1和5 (NFR1/5)GydF4y2BaL. japonicus.GydF4y2BaSYM10 / SYM2GydF4y2BaP萨蒂夫姆GydF4y2Ba（豌豆）和NFR1α/β和NFR5α/βGydF4y2BaG. Max.GydF4y2Ba（大豆）[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．通过这些型Lysm受体对NFS的感知触发了信号级联（染色信号）和各种细胞事件以激活根瘤菌感染和结节形成。NF感知后的关键事件是感染根毛细胞的细胞质中的钙尖峰，并通过不会使感染1和2（DMI1和DMI2）和核局部循环核苷酸门控通道的钙信号转换给核。CNGC15）[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．细胞核内的钙振荡被钙和钙调蛋白依赖性激酶(Lotus的CCaMK和Medicago的DMI3)解码，该激酶与CYCLOPS形成复合物，激活一系列转录因子[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．这些转录因子包括两个GRAS结构域转录调控因子[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]，包括Nodulation Signaling Pathway1 (NSP1)和NSP2，它们可以形成一个复合物直接激活表达GydF4y2Ba结节初始化GydF4y2Ba（GydF4y2Ba尼恩GydF4y2Ba），GydF4y2BaNodulation需要乙烯反应因子GydF4y2Ba（GydF4y2BaERN1公司GydF4y2Ba)以及GydF4y2Ba果糖早期11GydF4y2Ba（GydF4y2Ba依诺德11GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

植物激素在共生结瘤中起着重要作用。其中，细胞分裂素(CK)和生长素正调控共生结瘤[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]，而其他激素，如茉莉酸酯（JA），水杨酸（SA），赤霉酸，乙烯和ABA负面调节根瘤菌感染和结节子组织[GydF4y2Ba30GydF4y2Ba］．虽然ABA在植物中的抗逆境作用是众所周知的[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba[研究人员还确定了ABA在豆类撰写中的负面作用。ABA的外源性施用强烈降低的结节数，而捕获亚胺的治疗，特定的ABA生物合成抑制剂增加了结节数[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]. ABA抑制NF诱导的大鼠心肌钙尖峰反应GydF4y2Bam . trunctulaGydF4y2Ba，建议ABA在早期影响旋结[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．在GydF4y2Bal .多糖类化合物GydF4y2BaABA处理显著减少了卷曲的根毛和侵染线的数量[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］．与这些结果一致，诱导GydF4y2BanodulinGydF4y2BaNFs或根瘤菌的基因，如GydF4y2Barhizobium诱导过氧化物酶GydF4y2Ba（GydF4y2Ba把GydF4y2Ba)以及GydF4y2Ba依诺德11GydF4y2Ba，被ABA治疗废除了[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．进一步的遗传证据表明，通过过度表达拟南芥显性负等位基因来阻断ABA信号GydF4y2Baabi1-1GydF4y2Ba增加GydF4y2BanodulinGydF4y2Ba基因表达和随后的结瘤数表明ABA在结瘤中有抑制作用[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]. ABA抑制了细胞分裂素激活的结瘤基因的表达GydF4y2BaENOD40公司GydF4y2Ba与根皮质结节形成有关[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]，虽然ABA抑制结瘤和与细胞分裂素的交叉对话的详细机制仍有待阐明。GydF4y2Ba

ABA通过规范ABA信令施加其功能，这是由ABA与ABA受体的结合引发的动态过程（Pyr1 / Pyls / RCAR蛋白家族），并涉及通过组蛋白质的快速传递信号型2C磷酸酶（PP2Cs）和蔗糖氧化物-1相关蛋白激酶第2类（SNRK2S）对细胞核，然后进行靶基因表达改变的转录因子的最终活化[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42GydF4y2Ba］．ABRE -responsive element (ABRE) binding protein/ABRE binding factors (AREB/ABF) transcription factors负责大多数靶基因的表达，也被称为ABRE/ABF regulon。在植物中，这些AREB/ABF转录因子是基本区域/亮氨酸拉链(bZIP)类家族蛋白，可以与ABRE结合GydF4y2Ba独联体GydF4y2BaABA响应基因启动子的元素[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．因此，ABA可以帮助调节植物对非生物胁迫的响应[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]. 因此，AREB/ABF转录因子在调控植物反应的各个方面的基因活性中起着关键作用。GydF4y2Ba

ABA对大豆结瘤的抑制作用已被报道[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba那GydF4y2Ba47GydF4y2Ba那GydF4y2Ba48GydF4y2Ba］．研究表明，ABA处理显著减少了大豆黄酮、染料木素和香豆素等异黄酮化合物的产生[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]，从而引起无根瘤菌感染。但是，在此后，ABA如何影响大豆染色量的重大进展。基于目前的证据，大豆具有规范ABA信号，由ABA，PP2CS，SNRK和ABF转录因子组成的Pyr1 / Pyls受体。对于Gmbzips而言，大豆基因组中鉴定了160个Gmbzip基因，其中很少（例如GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba和GydF4y2BaGmbZIP2GydF4y2Ba)在ABA响应和胁迫耐受中的作用已被功能性分析[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba那GydF4y2Ba50GydF4y2Ba］．然而，AREB/ABF转录因子的作用以及ABA与结瘤信号传导相互作用的分子机制尚不清楚。本研究分析了ABA对大豆生长和结瘤的影响。我们鉴定了拟南芥AREB1的大豆同源物GmbZIP1，作为ABA响应的正调控因子，但对大豆结瘤的负调控因子。GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba由ABA诱导和异位表达GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba拟南芥增强了ABA敏感性和植物耐受性。重要的，GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在结节中高表达，而GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba导致染色率降低。此外，我们发现了GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba直接绑定和压抑的表达GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba. 这些发现首次揭示了ABA与大豆根瘤形成信号转导途径的相互作用。GydF4y2Ba

ABA抑制大豆结瘤GydF4y2Ba

为了评估ABA在大豆的共生瘤期间的作用，首先分析了ABA对植物生长和结节形成的影响。在琼脂媒体上发芽的六天龄大豆幼苗被转移到Jensen的板块上[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba]补充0,0.5,1或10μmaba并接种植物GydF4y2BaB重氮效率GydF4y2BaUSDA110。ABA治疗后18天，评估了植物高度，植物高度，侧重根数和根结节数。如图1所示。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa和b，大豆幼苗的地上部生长对ABA敏感。低浓度（0.5μg/l）对地上部生长有促进作用 但高浓度（10μM）对其有抑制作用 μM）。相比之下，在ABA处理条件下，大豆幼苗侧根形成表现出不同的模式（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC和D）。用低浓度（0.5和1μm）的ABA处理的植物的侧根形成与对照植物的低浓度（0.5和1μm）相当，当用高浓度（10μm）的ABA处理时，横向根显着增加（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC和D）。在对比度鲜明的对比中，对大豆和结节数具有强烈敏感的，随着ABA的浓度增加而强烈地降低的结节数（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba0.5 μM ABA处理下单株结瘤数减少至对照植株的一半，10 μM ABA处理下单株结瘤数几乎完全消失。由此可见，根瘤是大豆生长发育过程中对ABA最敏感的器官，ABA在大豆结瘤过程中起负调控作用。GydF4y2Ba

ABA抑制根瘤菌感染和NF信号传导GydF4y2Ba

根瘤的形成始于豆科植物和根瘤菌的相互识别，从而导致侵染疫源地的形成[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]. 为了测试ABA是否影响根瘤菌的感染，我们分析了ABA处理和不处理的感染病灶的数量。当着10个人的面 与未经ABA处理的植株相比，每株的侵染病灶数量显著减少（图1）。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA和B），表明ABA抑制大豆中的根瘤菌感染。GydF4y2Ba

豆科植物与根瘤菌的相互识别激活了下游信号传导事件，导致根瘤菌特异性感染和根瘤形成[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．为了检测ABA是否通过中断结瘤信号而影响根瘤菌感染，我们分析了结瘤标记基因的转录水平GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba添加或不添加ABA处理。在根瘤菌存在而没有ABA处理的情况下，GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba根瘤菌在3日龄时高水平诱导表达，而ABA处理则诱导表达GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba明显减少（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaC）。结果表明，ABA通过影响NF信号转导途径来负调节早期结论。GydF4y2Ba

系统发育与表达分析GydF4y2Baarbe.GydF4y2Ba大豆家族基因GydF4y2Ba

AREB/ABF转录因子是植物ABA反应的中心调节因子[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．我们想知道AREB转录因子是否参与aba介导的大豆结瘤抑制。AREB家族基因编码A组bZIP转录因子，大豆基因组中有28个A组成员[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba］．为了搜索参与结节器官组织的AREB转录因子，我们分析了大豆和拟南芥之间的进化关系。类似于拟南芥[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]大豆中的28个A组成员可分为4个不同的亚组。其中，GmbZIP11/GmbZIP1[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba](此后为GmbZIP1)、GmbZIP29、GmbZIP44和GmbZIP50与AtABF1-AtABF4属同一枝系。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa），在ABA介导的非生物应激反应中的功能[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]而Gmbzip61，Gmbzip84，Gmbzip91，Gmbzip96和Gmbzip129则在与Arabidopsis Abi5中的同一分支中分组（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa），调节ABA介导的种子成熟和种子萌发[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba]. 结果表明，这些GmZIP转录因子在大豆ABA反应中可能发挥作用。GydF4y2Ba

找出候选人GydF4y2BaGmAREBGydF4y2Ba与染色剂相关的基因，我们分析了表达水平GydF4y2BaGmAREBGydF4y2Ba不同组织和器官的基因使用来自大豆（RNA-SEQ）的RNA测序（RNA-SEQ）数据[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba] (GydF4y2Bahttp://soybase.org/GydF4y2Ba）。在这些当中GydF4y2BaGmAREBGydF4y2Ba基因，GydF4y2BaGmbZIP129GydF4y2Ba在所有组织中几乎不可检测，其中四个包括在内GydF4y2BaGmbZIP61GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmbZIP84GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmbZIP91GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmbZIP96型GydF4y2Ba主要在种子中表达，与同源基因相似GydF4y2BaABI5GydF4y2Ba在拟南芥GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]; 四个基因包括GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmbzip29GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmbZIP44GydF4y2Ba和GydF4y2BaGmbZIP50GydF4y2Ba主要用花和营养组织表达，包括根毛和成熟结节（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab） 是的。这些数据表明GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmbzip29GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmbZIP44GydF4y2Ba和GydF4y2BaGmbZIP50GydF4y2Ba可以参与大豆中的ABA介导的结节发育。GydF4y2Ba

GmbZIP1GydF4y2Ba主要在结节形成和结节发育过程中表达GydF4y2Ba

识别GydF4y2BaGmAREBGydF4y2Ba特异性功能在大豆瘤中的基因，我们进行了QPCR以验证表达模式GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmbzip29GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmbZIP44GydF4y2Ba和GydF4y2BaGmbZIP50GydF4y2Ba在大豆。实际上，在28dai的测试组织/器官中，在测试的组织/器官中差异表达这四种基因（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaA-d)，表明了这四个角色的不同GydF4y2BaGmAREBGydF4y2Ba大豆生长发育中的基因。其中，GydF4y2BaGmbZIP44GydF4y2Ba和GydF4y2BaGmbZIP50GydF4y2Ba在根中表达量最高，在叶、茎和根瘤中表达量较低。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba故选CGydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba和GydF4y2BaGmbzip29GydF4y2Ba在结节中表达水平最高的所有组织中均有表达（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaA和B）。尤其，GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba主要在结节中表达，在其他器官中具有非常低或没有表达，其成熟结节中的表达水平远高于其他物质GydF4y2BaGmbZIPGydF4y2Ba基因(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba这些结果表明GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba可能在大豆根瘤发育中起着重要而特殊的作用。GydF4y2Ba

的表达模式进一步检查GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在根瘤形成和发展过程中，我们进行了组织化学分析，以检测启动子活性GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba使用GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba（GydF4y2Baβ-葡萄糖醛酸酶GydF4y2Ba)吉恩是个记者。为此，3 的ATG上游的kb片段GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba被融合到了GydF4y2BaGusa.GydF4y2Ba基因和结果GydF4y2BaGmbZIP1pro:格斯GydF4y2Ba构建体用于毛状根转化和随后的根瘤菌瘤。组织化学分析GydF4y2BaGmbZIP1pro:格斯GydF4y2Ba在结瘤的特定时期进行转基因毛状根研究。在根瘤原基中观察到较高的GUS活性，且在根瘤原基基部的细胞中GUS活性最强。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae）。在出现结节的基础上主要观察到高水平的GUS活性（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baf），GUS活性在幼小结节和成熟结节中保持高（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bag和h)。这些观察结果表明GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在结节形成和结节发育过程中表达被激活。GydF4y2Ba

GmbZIP1GydF4y2Ba对ABA有反应并正向调控植物对ABA的反应GydF4y2Ba

之前已经表明了GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2BaABA诱导的细胞凋亡GydF4y2BaG. Max.GydF4y2BaL. cv。Tiefeng 8和GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在拟南芥中过表达导致植物对ABA的敏感性增加[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba］．看看GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在Williams 82中也对ABA敏感，我们分析了启动子GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba发现了一个ABREGydF4y2Ba独联体GydF4y2Ba1507年的元素 ATG上游bp（CACGT）（补充图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba），建议GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba表达可能受ABA调控。进一步的qPCR结果证实了这一点GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2BaABA在5日龄大豆幼苗中确实诱导了表达。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa） 是的。GydF4y2Ba

为了研究Williams 82中GmbZIP1在植物ABA反应中是否具有保守功能，我们比较了GmbZIP1的编码序列GydF4y2BaGmZIP1GydF4y2Ba发现铁丰8号和威廉姆斯82号之间的核苷酸差异只有6个GydF4y2BaGmbZIP1sGydF4y2Ba在相应蛋白质的保守结构域之外，只引起四个氨基酸的差异(GydF4y2Ba补充图2GydF4y2Ba). 为了观察来自Williams 82的GmbZIP1在ABA应答中的功能是否保持不变，我们还发现了异位过表达GydF4y2BaGmbZIP1绿色荧光蛋白GydF4y2Ba在拟南芥camv35s启动子的调控下。如图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab、 在转基因根细胞GmbZIP1的细胞核中观察到高强度的GFP信号，表明GmbZIP1在拟南芥中成功表达，GmbZIP1是一种核蛋白。然后我们测试了过度表达的拟南芥植株对ABA的敏感性GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba．在不添加ABA的情况下，种子的发芽率和子叶的绿变率GydF4y2BaGmbZIP1OEGydF4y2Ba植物与野生型相似(Fig。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC和e）。相比之下，在ABA存在下，种子萌发和子叶绿化率GydF4y2BaGmbZIP1OEGydF4y2Ba植物显著低于野生型(Fig。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad和f），表明异位表达GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba导致ABA拟南芥植物的敏感性增加。ABA是植物干旱耐受性的关键调节器[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba］．要查看Gmbzip1是否影响植物对干旱压力的反应，我们还评估了耐旱性GydF4y2BaGmbZIP1OEGydF4y2Ba植物在脱水和复水后。存活率GydF4y2BaGmbZIP1OEGydF4y2Ba干旱条件下的植物远高于野生型(GydF4y2Ba补充图3GydF4y2Ba)，这与之前关于GmbZIP1在耐旱性中的作用的结果一致[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba］．综上所述，这些结果表明GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在威廉斯82是一个积极的调节植物对ABA反应。GydF4y2Ba

GmbZIP1GydF4y2Ba负调控根瘤菌感染和根瘤数量GydF4y2Ba

下一个直接的问题是GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba大豆根瘤菌侵染和根瘤器官发生的作用。为了做到这一点，我们产生了转基因复合植物过度表达GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在泛素启动子的控制下（GydF4y2BaUBQ：：GmbZIP1GydF4y2Ba） （图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa） ，并考察了GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba结瘤早期和晚期根毛变形和根瘤数的过表达。如结果所示（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaB和C），变形根毛的数量GydF4y2BaUBQ：：GmbZIP1GydF4y2Ba与空载体对照相比，在7日龄时毛状根显著减少，表明毛状根在空载体控制中的重要作用GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在根瘤菌侵染的早期。结果表明，转基因毛状根过表达GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba产生的结节少于空向量控制（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaD-F，GydF4y2Ba补充图4GydF4y2Ba). 这些数据揭示了GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba根瘤菌侵染与根瘤发育。GydF4y2Ba

GmbZIP1直接结合和抑制表达GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba

看看Gmbzip1是否抑制通过染色信号通路的根瘤菌感染和结节发育，我们分析了效果GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在已知结瘤标记基因上过表达GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba使用qPCR[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba]. 有趣的是GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaUBQ：：GmbZIP1GydF4y2Ba与载体对照相比，转基因根在14日龄时显著减少（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa).这表明GmbZIP1通过结瘤信号通路调控大豆结瘤。GydF4y2Ba

Gmbzip1是推定的转录因子，我们推测Gmbzip1可以直接与启动子结合GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba抑制或下调其表达GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba通过靶向结瘤途径中的上游正调控因子。为此，我们首先进行了分析GydF4y2Ba独联体GydF4y2Ba3 kB中的元素GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba启动子。有趣的是，有一个arebGydF4y2Ba独联体GydF4y2Ba元素在促进GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba(911 ATG上游bp（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab)，提示GmbZIP1蛋白可能与GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba启动子。证明GmbZIP1绑定到GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba启动子，我们进行了DNA电泳迁移率测定(EMSA)。为此，我们表达并纯化了GmbZIP1与His标签融合的DNA结合域GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba. 结果表明，GmbZIP1-His融合蛋白能与含有AREB顺式元件的DNA探针结合GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba启动子(无花果。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bac,GydF4y2Ba补充图5GydF4y2Ba). 在竞争试验中，过量的生物素未标记DNA探针显著降低了GmbZIP1 His与标记DNA探针的结合（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bac,GydF4y2Ba补充图5GydF4y2Ba)，表明GmbZIP1与GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba启动子是特定的。综上所述，GmBZIP1通过直接靶向调控aba介导的结瘤抑制GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba抑制其转录。GydF4y2Ba

共生瘤是一种复杂的性状，其精确受内源性提示和环境条件的调节。植物激素在整体旋结中发挥着积分作用。蟾蜍素和细胞蛋白阳性调节染色，而其他人对染色剂产生负面调节。因此，动态激素平衡对于根瘤菌和植物之间的最佳和成功相互作用至关重要，结核形成[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］．研究表明，ABA的应用抑制了豆科植物中不确定和有限结瘤[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]. 然而，ABA如何调控结瘤，特别是ABA信号如何与结瘤信号相互作用仍然是个谜。本研究表明，结瘤是植物生长发育过程中最敏感的过程；我们发现GmbZIP1是ABA反应的正调控因子，而在大豆结瘤过程中是负调控因子；最重要的是，我们发现GmbZIP1通过直接抑制结瘤来抑制结瘤GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba表达。GydF4y2Ba

ABA是植物生长发育的关键调控因子[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba］．在大豆中，外源ABA对地上部生长、侧根发育和结瘤有不同的作用。低水平的ABA促进了枝条的生长，而高水平的ABA抑制了枝条的生长。较低浓度的ABA对侧根不敏感，高浓度的ABA促进侧根发育。有趣的是，根瘤对ABA表现出极大的敏感性，ABA处理降低了根瘤数量，且呈剂量依赖性。值得注意的是，ABA介导的结瘤抑制在大豆中具有特异性，低浓度ABA (0.5 μM)足以抑制结瘤，但对地上部和根的生长没有影响。GydF4y2Ba1GydF4y2Bae） 是的。外源ABA可阻断根瘤菌诱导的大豆根毛变形和根瘤数量，支持了ABA在结瘤过程中主要在结瘤早期发挥负调控作用，包括根瘤菌侵染和结瘤GydF4y2Bam . trunctulaGydF4y2Ba和GydF4y2BaL. japonicum.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．可以想到，早期染色剂对ABA的过敏率是用于衰减结节信号传导以保持豆类中最佳结节数的保守机制。GydF4y2Ba

结瘤信号通路与根感染和结瘤形成有关。有人提出，ABA抑制根瘤菌侵染和根瘤发生是通过抑制表皮上游信号节点和根瘤形成基因的激活来实现的GydF4y2Ba依诺德11GydF4y2Ba基因[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．我们的结果表明，ABA通过大豆的类似机制施加抑制作用。例如，诱导GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba在大豆结节形成中，ABA处理显着降低（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad）。ABA主要通过ABA信号调节各种生物过程。先前的结果已经鉴定了对ABA 1（STA-1）的敏感性，作为Medicago中点头因子信号传导的关键ABA介导的抑制剂[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]尽管其分子机制尚不清楚。然而，介导ABA抑制结瘤形成的基因及其作用仍然完全未知。在这里，我们提供了一些证据来证明AREB转录因子GmbZIP1是一个基因的阻遏子GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba抑制ABA诱导的结瘤形成。GydF4y2Ba

AREB家族蛋白是ABA信号通路中的关键转录因子，通过靶向许多与植物生长和胁迫耐受相关的基因来调控植物对ABA的反应[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．首先，我们发现在大豆中的ABA相关的ABF / ABF基因中，GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba在结节原基和结节中特异性表达(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba). 其次，我们证明了这一点GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba是植物ABA反应的正调控因子。GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba是由ABA和GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba增加了拟南芥早期发育过程中植株对ABA的敏感性和抗旱性。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba补充图3GydF4y2Ba). 第三，我们证明了GmbZIP1负调控大豆结瘤的过度表达GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba导致根毛变形和结节的数量减少（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 最后，我们展示了GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba可以直接绑定到GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba启动子压制其表达（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）。无根扎恐惧症可能会诱导ABA激活GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba皮层细胞的表达，反过来又会抑制GydF4y2Bagmenod40-1GydF4y2Ba表达导致抑制结节形成。自从GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba表达以其他染色阶段和GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba过度表达也可以影响根发变形，我们不排除Gmbzip1在结节期间调节ABA介导的其他过程的可能性。自从GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba是响应和介导植物对非生物胁迫的反应[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]，也有可能GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba介导非生物胁迫下结瘤。GydF4y2Ba

总之，我们的数据已识别在大豆的ABA信号中的关键组件Gmbzip1，在大豆核核核状中起着负面作用。有趣的是，我们的研究结果揭示了一种新的机制，其中Gmbzip1在结节开始期间在ABA和NF信号转导途径之间介导串扰。考虑到高水平的守恒术中的豆类植物中的豆类植物和BZIP1转录因子，我们的研究结果提供了对ABA调节共生瘤的阐明的新颖见解。GydF4y2Ba

植物和根瘤菌生长，毛茸茸的根转化，和GydF4y2BaB重氮效率GydF4y2Ba接种GydF4y2Ba

大豆(GydF4y2BaG. Max.GydF4y2Ba美林公司。Williams[82]被用来克隆和分析GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba．从天府汉（中国农业科学院）的实验室获得了种子。将大豆幼苗在25-26℃和16h / 8h光/暗条件下在生长间培养。对于大豆毛的根转化，在生长室植入土壤中的健康和均匀的大豆种子3天。发芽幼苗用于毛状根转化GydF4y2Ba农杆菌属rhizogenesGydF4y2Ba菌株K599含有多种结构，如前所述[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba］．对于结节表型测定，将推定的转基因植物移植到含有蛭石的罐中并生长1周以便生根。然后用30毫升悬浮液接种它们GydF4y2BaB重氮效率GydF4y2Ba如前所述的USDA110（OD600 = 0.08）[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba］．收集单根和结节，用于在指定的时间点处的转基因根和结节数定量的分子表征（感染后的天数）。山山宋和世林徐承入了本研究中使用的植物材料的正式鉴定，本研究中使用的材料没有存放在公开的植物标本中。GydF4y2Ba

ABA处理GydF4y2Ba

对于ABA处理，实验按照Jones et al. (Jones et al.， 2013)的方法进行，只做了少量的修改。简单地说，大豆在含有7%琼脂的培养基上萌发6天。然后将植株转移到含有Jensen培养基(CaHPO)的植株上GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba1 g / l，mgsoGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba0.7小时GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba氧0.2 克/升，KGydF4y2Ba_2GydF4y2BaHPO.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba0.2g / L，NaCl 0.2 g / L，FECLGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba0.6小时GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO 0.1 g/L, HGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba博GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba1 mg / L, ZnSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba0.7小时GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO 1 mg/L, CuSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba0.5小时GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO 0.5 mg / L，MNCLGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba0.4小时GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO 0.5 mg / L，NamnoGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba.2H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO 1 mg/L，琼脂11.5 mg/L)添加不同浓度的ABA。用悬浮液接种这些植物GydF4y2BaB重氮效率GydF4y2BaUSDA110（OD.GydF4y2Ba_600GydF4y2Ba=0.1). 植株在生长室中培养，用银纸包住培养皿，使根系保持在黑暗中。18 d后，分析根瘤数、地上部和根系表型。GydF4y2Ba

卷曲的根头发测定GydF4y2Ba

为了检测早期感染事件，根段（4 下胚轴以下7日龄时，从转化毛状根上切下根连接。根碎片在无菌PBS缓冲液中短暂冲洗，用0.01%亚甲基蓝染色15分钟 分钟，然后用去离子水清洗三次，如前所述[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba］．用Leica生物显微镜观察染色的转基因根。用紧密卷发的根毛被计数并称为“感染焦点”。GydF4y2Ba

RNA提取及定量PCR分析GydF4y2Ba

根据制造商的协议（中国天根生物技术有限公司，中国），使用Trizol试剂从野生型或复合厂中提取总RNA。用DNase I（Invitrogen）处理总RNA样品以除去污染基因组DNA，并使用发布型RT试剂盒（天根生物技术）合成第一链cDNA。使用超级预混料加（Sybr Green; Tiangen Biotech）进行定量聚合酶链反应（QPCR）。GydF4y2Bagmelf1b.GydF4y2Ba被用作内部参考基因[57]。GydF4y2Ba

向量构造GydF4y2Ba

的过表达结构GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba，全长GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba被克隆并插入到载体中GydF4y2Ba扑鼻:pCAMBIA1301GydF4y2Ba使用限制性内切酶GydF4y2BaXba公司GydF4y2Ba我/GydF4y2BaBamGydF4y2Ba你好；对于GydF4y2BaGmbZIP1启动子：GUSGydF4y2Ba记者构建，推定推动者区（2.0 kB）GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba从cv中扩增。威廉姆斯82基因组DNA，并使用限制性内切酶插入载体pCAMBIA1391GydF4y2BaEcoRGydF4y2Ba我/GydF4y2BaBamGydF4y2Ba嗨。GydF4y2Ba

EMSA公司GydF4y2Ba

使用根据制造商的方案的光移化学发光EMSA试剂盒（PIRCER）进行电泳迁移率移位测定（EMSA），并如Wang等人所述描述。[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba]. 对于GydF4y2BaGmbZIP1GydF4y2Ba-GydF4y2Ba伊斯GydF4y2Ba构建体，Gmbzip1（901-1320bp）的DNA结合结构域的编码序列被扩增并插入PET22B中GydF4y2Ba无损检测GydF4y2Ba我/GydF4y2Ba后GydF4y2BaIII。通过在5'末（中国Sangon）中标记的生物素标记的寡核苷酸分析蛋白质的探针结合活性。在室温下温育30分钟后，将蛋白质探针混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到生物离子B尼龙膜（PALL）中。使用与生物素和化学发光基材结合的链霉抗生物素蛋白 - 辣根过氧化物酶缀合物来检测生物素标记探针的迁移，根据制造商的方案。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

本研究使用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.， La Jolla, CA)对包括基因表达和表型分析在内的数据进行分析。计算数据的平均值和标准差(SDs)，并进行单因素方差分析GydF4y2BaT.GydF4y2Ba进行试验以产生GydF4y2BaP.GydF4y2Ba价值观。GydF4y2Ba

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。本研究中使用和/或分析的数据集可在合理要求下从通讯作者处获得。GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

脱盐酸GydF4y2Ba

沛富:GydF4y2Ba

绑定因素GydF4y2Ba

ABRE:GydF4y2Ba

ABA反应元件GydF4y2Ba

bZIP地址：GydF4y2Ba

碱性区/亮氨酸拉链GydF4y2Ba

CCaMK:GydF4y2Ba

Calmodulin-dependent激酶GydF4y2Ba

CK:GydF4y2Ba

细胞分裂素GydF4y2Ba

一般条款15：GydF4y2Ba

核定位环核苷酸门控通道GydF4y2Ba

DMI1:GydF4y2Ba

没有发染1GydF4y2Ba

ENOD11：GydF4y2Ba

果糖早期11GydF4y2Ba

ERN1:GydF4y2Ba

Nodulation需要乙烯反应因子GydF4y2Ba

青年成就组织：GydF4y2Ba

JasmonateGydF4y2Ba

NF：GydF4y2Ba

点头的因素GydF4y2Ba

NFR：GydF4y2Ba

NF受体GydF4y2Ba

nin：GydF4y2Ba

结节初始化GydF4y2Ba

PP2C:GydF4y2Ba

组蛋白类型2C磷酸酶GydF4y2Ba

撕裂:GydF4y2Ba

rhizobium诱导过氧化物酶GydF4y2Ba

SA：GydF4y2Ba

水杨酸GydF4y2Ba

SnRK2s:GydF4y2Ba

蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2类。GydF4y2Ba

感谢中国农业科学院韩天福教授赠送W82种子。GydF4y2Ba

国家自然科学基金资助项目(no . 31730066);华中农业大学科技自主创新基金资助项目(no . 2015RC014);中央高校基本科研业务费资助项目(no . 2662018PY075)。资助者不参与研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿。GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. 徐世民和宋珊珊对这一工作做出了同样的贡献。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 中国农业大学植物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，湖北武汉430070GydF4y2Ba

   徐世民，宋珊珊，董晓旭，王欣悦，吴军，任子印，吴雪松，卢晶晶，袁慧芳，吴新英，李霞，王志娟GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

ZW和XL构思了本研究并设计了实验；SX、SS、XD、JW、XW和XW进行了实验；RZ、JL、HY、XW、ZW和XL分析数据；ZW和XL用所有作者的意见写了手稿。所有作者都已阅读并批准了手稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

通信GydF4y2BaZhijuan王GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准并同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放存取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba. 知识共享公共领域放弃(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。GydF4y2Ba

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