比较蛋白质组学分析表明，两个玉米杂种的杂种优势分别与胁迫响应增强和光合作用增强有关gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

杂种优势是指一个杂种中表现出的优于双亲的性状。一般而言，亲本杂交会改变非加性蛋白(non-additive proteins, nap)等蛋白质的表达模式，从而产生杂种优势。‘中单808’(ZD808)和‘中单909’(ZD909)是我国玉米优良杂交种，但杂种优势机制尚不清楚。蛋白质组学在许多领域得到了广泛的应用，对玉米杂交种及其亲本进行蛋白质组学比较分析有助于了解两个玉米杂交种的杂种优势机理。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

采用无标记定量方法，从两个杂种及其亲本的二苗叶片中定量鉴定了2000多个蛋白质组。对两个杂种的总鉴定蛋白、差异积累蛋白(DAPs)和小睡蛋白(nap)的统计分析表明，它们与母本更相似。在ZD808中，DAPs表达上调，而在ZD909中，DAPs表达下调，而nap表达低或低亲本丰度。途径富集分析表明，ZD808较多的胁迫响应相关基因均为高亲本或高亲本以上，ZD909大部分与PS相关基因均为高亲本或高亲本以上。最后，通过PRM验证了4个与PS相关的蛋白和8个与PS相关的蛋白，其中10个在杂交值和中亲本值之间存在显著差异。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

尽管两个杂种在蛋白质组水平上都与母本相似，但杂种优势的生物学基础是不同的。与亲本相比，杂种ZD808的优良农艺性状主要与一些与胁迫响应和代谢功能相关的蛋白高表达相关，而ZD909的性状主要与光合相关的蛋白高表达相关。我们的蛋白质组学结果支持了先前的生理和形态研究，并为理解有价值的农艺性状的原因提供了有用的信息。gydF4y2Ba

• 在玉米杂交种ZD808和ZD909上分别鉴定出近200个小睡基因。gydF4y2Ba

• 多数杂种优势相关蛋白和途径在两个杂种之间存在差异。gydF4y2Ba

• 杂种ZD808的胁迫响应相关通路显著增强。gydF4y2Ba

• 在杂交ZD909中显着增强了与光合作用相关的途径。gydF4y2Ba

杂种身是指与父母两种母细胞的杂交后代或品种的杂交后代的现象。这可以包括重要的农艺性状，例如生物质，发育速度，生育，产量和非生物/生物应激耐受性。因此，显示杂种的F1杂交种被广泛用于许多作物和蔬菜的生产[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］.但要获得具有杂种优势的杂交种，需要进行大量的田间试验，这是一个劳动密集型、昂贵、耗时、长期的过程，而且结果难以预测。为了提高杂交育种的效率，有必要了解杂种优势的分子机制。gydF4y2Ba

多年来，生理学、遗传学、分子学、转录组学和蛋白质组学等方法一直被用来研究杂种优势[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］.其中，生理研究表明，杂种优势在一定程度上受到植物生长的幅度和速率，开花时间，产量和抵抗水平与生物和非生物环境应激的影响[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］.一项遗传学研究表明，主要表现为非加性基因作用的基因解释了水稻粒重的大部分杂种优势变异[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］.近年来，与杂种优势相关的基因受到了越来越多的关注[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］.据我们所知，与杂种优势相关的各种基因已经被定位或深入研究，如ga相关基因[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]、ErbB-3结合蛋白1 [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]、钙依赖蛋白激酶[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]、木葡聚糖内转糖基化酶/水解酶[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，细胞数量调节基因[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］.随着生命科学相关技术的发展，一些新的方法也被用来研究杂种优势，包括转录组学方法，特别是蛋白质组学[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］.转录组学技术也被用于比较亲本系和他们的F1杂种，以确定可能涉及杂种优势的基因，并发现F1杂种的基因作用模式分为加性表达和非加性表达[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］.在作物杂交种的蛋白质组学分析中，鉴定了一些与杂种优势相关的差异积累蛋白(DAPs)，认为非加性蛋白(nap)是重要的DAPs [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］.在分析杂种优势相关蛋白时，偏离双亲中间值的蛋白称为非加性蛋白(non-additive proteins, nap)，其他的称为加性蛋白(additive proteins, APs)。在杂种优势研究中，广泛使用了nap的概念，一般将其分为四种类型，即“高亲本丰度以上”(++)、“高亲本丰度以上”(+)、“低亲本丰度以下”(−−)和“低亲本丰度以下”(−)[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］.高或低亲本丰度表示杂交种的NAP含量显著高于或低于任何一个亲本，高或低亲本丰度表示杂交种的NAP含量显著高于或低于任何一个亲本，而不高于或低于其他亲本。gydF4y2Ba

玉米是全球最重要的谷物作物之一，玉米杂种杂种杂种在世界范围内种植[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］.前期的数量性状位点分析得出超显性是杂种优势的主要原因[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba[最近，多种群体已被用于识别与杂交性能的遗传架构相关的定量性状基因座[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba］.转录组分析也已经在玉米幼苗、根、胚胎和未成熟的玉米穗上进行[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］.钙依赖蛋白激酶是钙结合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞钙信号过程中起重要作用。据报道，CDPK基因ZmCPK16在玉米杂交种和亲本之间有不同的表达，表明它在杂种优势中起作用[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］.木葡聚糖内转糖基化酶/水解酶在木葡聚糖交联(木葡聚糖修饰酶家族)的构建和重组中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，在V3茎下调节的木糖葡聚糖内甘油糖苷基酶/水解酶（GRMZM2G091118），但在播种原根系后6天，在6天内调节，并且在不同杂种优势组中的其他组织中对其表达一致[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba］.细胞数量调节超家族负调节因子跨越不同物种。细胞数量调控因子2的表达与玉米组织生长活性和杂种幼苗活力呈负相关[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］.已经分析了玉米中的几种杂种源相关基因，但不容易理解原因或杂种优势的结果。gydF4y2Ba

除利用核酸研究方法外，蛋白质组学方法已成功鉴定了一些与玉米杂种优势相关的DAPs在不同组织和/或阶段。前期研究通过二维凝胶电泳(2DE)和ESI-MS/MS发现，玉米杂种主根NAP积累可能与杂种优势的表现有关[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］.2010年还利用2DE和ESI-MS/MS研究了玉米杂种胚发育过程中NAP积累模式[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］.对ZD909的杂种优势的分析确定了未成熟玉米耳中的一半与优势表达模式有关，高级父母的优势蛋白主要参与碳代谢和氮同化过程[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］.2018年，对爆米花杂交种UENF/UEM01主根DAPs的蛋白质组学分析表明，杂种优势与植物发育早期合成和能量代谢相关蛋白的上调有关[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］.Auxin稳态对玉米第八族间长度的杂种优势的影响发现，苯丙醇丙烷和苯并恶嗪代谢途径的蛋白质与杂种源的程度相关[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba］.利用2DE和MALDI-TOF-MS对杂种dhm117及其亲本自交系的种子萌发特性进行了分析。杂交种与其亲本自交系之间的DAPs主要与代谢和能量有关，其次是蛋白质储存、应激反应、转录和翻译[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］.这些结果表明，亲本杂交可以改变玉米杂交种中某些蛋白质的表达类型，从而产生杂种优势。了解玉米杂交种及其亲本的蛋白质组学特征，确定与杂交种优势相关的蛋白质类型，可为高效育种提供重要指导。gydF4y2Ba

'中丹808'（ZD808）和'中丹909'（ZD909）优异的玉米杂种，高产，质量好，多重电阻和适应性宽。杂交ZD808使用CLLL作为女性父母和NG5作为雄性父母培养，主要种植在中国西南部。另一个杂交ZD909使用Z58作为女性母体和HD568作为雄性父母，它主要种植在中国黄淮海地区。在过去667万公顷的农田上，这两个混合动力车已经增长。它们都表现出强烈的单词表型与父母进行农艺性状，例如更剧烈的幼苗，耳朵较大，粒度更大，胁迫性增加。在水胁迫条件下，与其他品种相比，ZD808具有更高的相对含水量，较低的丙二醛含量和更好的渗透调节能力[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba］.然而，与其他品种相比，ZD909的平均叶面积指数和持续时间以及平均净同化率较高[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］.本研究采用LC/MS/MS对杂种ZD808和ZD909幼苗叶片的DAPs和nap进行了分析。这为了解杂种玉米杂种优势的分子机制提供了有用的信息。gydF4y2Ba

通过使用比较蛋白质组学方法(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），分析了玉米杂交种ZD808和ZD909的植物叶片，并验证了父母的父母，并验证了12种杂种优势相关蛋白质。gydF4y2Ba

定量鉴定蛋白的LC-MS分析和统计分析gydF4y2Ba

这些样品的总离子色谱图表明，纳米液相在10分钟内达到峰值，并且色谱峰的分布均匀且光滑（图。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaS2gydF4y2Ba，gydF4y2BaS3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaS4gydF4y2Ba，gydF4y2BaS5gydF4y2Ba和gydF4y2BaS6gydF4y2Ba:所有样品的总离子色谱图)。因此，质谱系统稳定，参数适宜，样品制备的重复性好。采用无标记质谱技术对6个品种的3个生物重复序列的质谱原始文件进行定量鉴定。ZD808及其亲本共鉴定出2222个蛋白和2486个蛋白gydF4y2BaS1gydF4y2Ba）来自ZD909及其父母（表gydF4y2BaS2gydF4y2Ba),分别。根据LFQ定量数据的Pearson相关分析，大多数品种的三个独立生物学重复之间的相关性都很高(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa，b）。在ZD808组中，除了ZD808的第一次生物复制外，其他两个生物学复制与女性父母和雄性父母的低相似性水平具有高相似性。ZD808男性和女性父母之间的差异大于杂交和父母之间的差异（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。在ZD909样品组中发现了类似的情况（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).因此，两个杂种的蛋白质表达特征更多地来自母本，而不是父本。此外，对所有样本进行主成分分析，PC1和PC2分别占总方差的94.22和2.66%，使主成分分析模型中占总方差的96.88%(图5)。gydF4y2BaS7gydF4y2Ba）．gydF4y2Ba

为了识别样品之间的侧链，选择2倍的变化作为经验截止。总共有833个上调的蛋白质和459个杂交ZD808中的下调蛋白质与其女性亲本Cl11或雄性母体NG5相比，并且在比较时，杂交ZD909中存在537个上调的蛋白质和1167个下调蛋白与其女性父母Z58或雄性父母HD568（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。与父母双方相比，ZD808中有325个常规上调蛋白质和54个常见的下调蛋白质，并且与父母双方相比，ZD909中有309个常见的上调蛋白质和143个常见的下调蛋白质（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad, e). nap可能与杂种优势高度相关。ZD808和ZD909的幼苗中分别鉴定出188个和263个nap。其中，ZD808中‘++’蛋白65种，‘+’蛋白80种，‘−−’蛋白23种，‘−’蛋白20种(见表)gydF4y2BaS3.gydF4y2Ba）．虽然在ZD909中，22例蛋白被归类为“++”，52分为“+”，81为' - - '，和108（表）gydF4y2BaS4gydF4y2Ba）．在从ZD808和ZD909中鉴定出的所有小睡性状中，在两个杂种中只同时鉴定出4个小睡性状(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf).两个杂交种的小睡指数呈集群，可以清楚地看出两个杂交种之间的小睡指数分布存在差异，且ZD808的父母本之间的差异大于杂交种与其中一个亲本之间的差异，ZD909的父母本之间的差异也大于杂交种与其中一个亲本之间的差异(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bag h)。gydF4y2Ba

通过对ZD808和ZD909中DAPs的比较发现，普通上调DAPs的数量大于普通下调DAPs的数量。ZD808亲本高丰度以上和高丰度以上的亲本数量大于亲本低丰度和低丰度的亲本数量，而ZD909则相反。通过对ZD808和ZD909的DAPs和nap的比较，ZD808与双亲相比，共同上调的蛋白数量高于ZD808的nap数量，分为“++”和“+”。ZD808和ZD909中共同下调的蛋白也是如此。gydF4y2Ba

DAPs和nap的通路富集分析gydF4y2Ba

从ZD808和ZD909中鉴定出的DAPs和nap通路经MapMan软件富集后分为34类(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）．在蛋白质、RNA、氨基酸代谢、信号转导、脂质代谢、次生代谢、光合作用(PS)、胁迫、氧化还原、激素代谢和发育等方面，杂交后代的DAPs变化至少是亲本的2倍。除发育和四吡啶合成途径仅在ZD808中富集外，在杂交后代中DAPs上调且变化至少是亲本的2倍。在ZD909中，DAPs的下调与蛋白质途径有关，且DAPs在ZD909中尤其富集于次级代谢。ZD808的“++”和“+”的nap主要与蛋白质、RNA、杂类、次级代谢、氨基酸代谢、氧化还原、信号转导和三羧酸(TCA)/org转化途径相关，而ZD909的“++”和“+”的nap主要与PS途径相关。ZD808的nap被分为“−”和“−”，与蛋白质、PS和其他途径有关。ZD909的nap被分类为“−”和“−”，与蛋白质、RNA、氨基酸代谢、转运、次级代谢、四吡咯合成、其他途径和氧化还原途径有关。gydF4y2Ba

ZD808增强了应力相关途径gydF4y2Ba

更详细的分析显示，ZD808和ZD909共76个nap可在应激相关通路中富集(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba），包括二次新陈代谢，蛋白水解，TCA，非生物应激，氧化还原状态，信号传导等。其中，从ZD808鉴定了44个小睡，其父母在ZD808中占据了32个小睡。与此同时，从ZD909及其父母确定了36个小睡，在ZD909中仅有11个小睡。gydF4y2Ba

ZD909增强了PS相关通路gydF4y2Ba

ZD808和ZD909的总共27个分布可以富集PS相关途径（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，包括光反应、卡尔文循环和光呼吸。ZD909及其亲本中鉴定出的与ps相关的nap大部分表达上调，除ZD909中有2个表达下调外，多数表达上调，主要参与光反应。从ZD808及其亲本中鉴定出10个，其中只有3个在ZD808中上调，主要富集于光反应和卡尔文循环中。结果表明，与ZD808不同，ZD909中与PS有关的nap有一半被归类为“+”或“++”，而ZD808中与PS有关的nap有一半被归类为“−−”或“−”。gydF4y2Ba

人口、难民和移民事务局验证gydF4y2Ba

PRM检测也用于验证在无标记分析中获得的nap的子集。因为目标蛋白的签名肽必须具有独特性，所以只有具有独特肽序列的蛋白被选择用于PRM分析。选择一些与PS和胁迫途径相关的蛋白进行PRM验证(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）．经PRM验证的12种蛋白的独特肽段Skyline分析结果见补充文件(图1)。gydF4y2BaS8gydF4y2Ba，gydF4y2BaS9.gydF4y2Ba、表gydF4y2BaS7gydF4y2Ba），并且详细数据结果包括每个肽片段的峰面积和保留时间，以及肽信息在补充文件中显示（表gydF4y2BaS5gydF4y2Ba，gydF4y2BaS6gydF4y2Ba）．验证结果表明，杂种ZD808的大部分ps相关蛋白强度低于其亲本，而ZD909则相反。gydF4y2Ba

杂种优势是普遍存在的，已经引起了科学界的广泛关注。杂种优势产生的机理非常复杂。许多方法，如基因组学和转录组学，已被用于杂种优势研究[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，现在蛋白质组学也被使用。ZD808是我国西南地区的主栽栽培品种，生态环境复杂，土壤贫瘠，干旱病害频发，ZD909是我国黄惠海地区的主栽栽培品种。ZD808能够适应不利的环境条件，对干旱等逆境表现出优异的抗性水平[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]，而ZD909具有强烈的光合能力[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］.与亲本相比，ZD808和ZD909具有优良的产量性状[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba] （桌子gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）．利用蛋白质组学技术对两个杂种及其亲本进行分析，为杂种优势的形成提供新的线索。但在广度、蛋白质组学技术和基因功能验证等方面仍需进一步探索。gydF4y2Ba

杂种体在某种程度上受到许多因素的影响[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，而午睡可能是杂种优势的主要来源。利用LFQ分别从ZD808组和ZD909组幼苗叶片中定量出2222个和2486个蛋白，说明组间分析结果存在差异。Pearson相关分析显示，三个独立生物重复的数量蛋白相关性较高，两个杂种与母本更相似。在我们的实验中，ZD808-1与其他两个生物重复样本的蛋白质组分析结果存在一定的差异。而ZD808的所有重复序列数据均与母本相似，而与父本不同。结果表明，ZD808-1与其他两个生物重复序列的相关模式相似(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba主成分分析还表明，两个杂交种的相关模式与母本更相似，且ZD909组的相关高于ZD808组(图1)。gydF4y2BaS7gydF4y2Ba）．维恩图独立地说明了两个杂种之间的DAPs和nap的关系。与任何亲本相比，ZD808和ZD909的部分DAPs同时被鉴定为上调蛋白和(或)下调蛋白，但在两个数据集的大部分交点中，同时鉴定的DAPs数量没有显著差异(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。尽管在ZD808中的许多击定被上调并且ZD909中的跳闸被下调，但常见点分布的比较分析表明，比ZD808和ZD909中的共同下调隔板有更多常见的上调分布（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba然而，NAP分析显示，ZD808和ZD909的基因型差异显著(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaF）。聚类分析显示出在两个杂种之间的差异分布，但两个杂种和他们的女性父母的相似性高于杂种和男性父母，它指出的女性父母对杂交种子的影响更多。gydF4y2Ba

所有鉴定出的蛋白被划分为33条通路，以及一组未注释的蛋白(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）．途径富集分析表明，与任何亲本相比，ZD808中上调的DAPs和ZD909中下调的DAPs大部分在多条途径中富集。在ZD808中，DAPs在几乎所有的途径中均富集，尤其是在氨基酸代谢、信号转导、脂质代谢、次生代谢、胁迫、氧化还原和激素代谢等与胁迫相关的途径中，DAPs的表达量比亲本和亲本都高2倍以上。在ZD909中，与双亲相比，杂种中DAPs上调至少2倍，主要富集在细胞、胁迫和线粒体电子转运/ATP合成和转运中。因此，ZD808和ZD909中dap的功能似乎有所不同。然而，在ZD808中，大多数“++”和“+”小睡只在应激相关通路中富集，而“−”和“−”小睡只在PS通路中明显富集。然而，在ZD909中，虽然‘−’和‘−’的nap占所有nap的绝大部分，但‘++’和‘+’的nap在PS途径中高度富集，而‘−’和‘−’的nap在RNA、氨基酸代谢、次级代谢和氧化还原中富集。因此，ZD808中应激相关通路增强，ZD909中ps相关通路增强。gydF4y2Ba

因为非加性表达蛋白被预测在杂种优势中发挥重要作用[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba)，所有识别出的nap都用MapMan进行进一步分析(TablegydF4y2BaS3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaS4gydF4y2Ba）．从这两个杂种中鉴定出的nap大部分可分为胁迫响应、PS、氨基酸代谢和蛋白质4类途径。我们认为，如果通路中的大多数小睡都被上调或下调，那么该通路就会分别被增强或受阻。当植物受到非生物或生物胁迫时，胁迫反应起着至关重要的作用。MapMan分析显示，ZD808中部分上调的nap在参与应激反应的通路中富集(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）．在这些蛋白质中，70-KDA热休克蛋白（HSP70s）是一种广泛表达的家族，具有几乎所有生物中存在的类似结构。HSP70S是蛋白质折叠的细胞机械的重要组成部分，它们有助于保护细胞免受寒冷，热量和干旱胁迫[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］.图中显示的其他蛋白质。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba也与基础代谢和应激反应有关。与父母相比，在杂交ZD808中增强了基础代谢和应激反应。一些研究报告了杂种优势与应力耐受性之间的关系，但不同物种和不同的压力存在巨大差异[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］.有些证据表明，防御反应基因和生长杂种的表达之间存在负面关系[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba[杂种优势与应力耐受性之间还有一些积极或无关系的证据gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］.在这项研究中，在三叶阶段增强了应力反应，成熟阶段的产量增加，表明杂种优势与ZD808中的抗应激之间存在正相关关系。增加活力或产量通常是杂种优势研究的重点。PS是促进植物生长和发展的关键过程。富含ZD808和ZD909的富含ZD808和ZD909的主要PS相关途径如图2所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。两个杂种在三叶期PS活性存在较大差异。三叶期ps相关途径的增加可能是成熟期产量杂种优势的基础。gydF4y2Ba

氨基酸代谢在植物的生长过程中也起着重要作用。ZD808和ZD909中共有14个nap在氨基酸代谢相关通路中富集。其中，除d -3磷酸甘油酸脱氢酶外，ZD808中大部分蛋白质鉴定为“++”或“+”。然而，在ZD909中，所有这些nap都被归类为'−'或'−'。说明杂种ZD808对氨基酸代谢有促进作用，而ZD909对氨基酸代谢有抑制作用。gydF4y2Ba

此外，通过杂交的蛋白质途径大大影响，包括氨基酸活化，蛋白质降解（丝氨酸蛋白酶和泛素），蛋白质折叠，蛋白质合成（伸长，引发和核糖体蛋白），蛋白质靶向（在叶绿体和核），组装和Cofactor连接和后翻译修饰。在ZD808中，大多数与蛋白质合成，折叠，氨基酸活化和靶向有关的小植物被归类为'+'或'++'。然而，在ZD909中，蛋白质相关途径中的大部分小睡被归类为“ - ”或“ - ”。这表明蛋白质合成和其他蛋白相关途径在两个杂种中的影响非常不同。gydF4y2Ba

在一些关键蛋白的PRM验证中，我们分析了12个与PS和胁迫相关的nap的丰度水平(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba、表gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba7)亲本和杂交种的PRM结果与无标记定量蛋白质组学结果相似。在LFQ数据和PRM验证中，多数杂交和中亲本值存在显著差异。gydF4y2Ba

通过PRM验证了4种应激相关蛋白，即伴侣蛋白ClpB3、d- 3磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)、谷胱甘肽s -转移酶6 (GST6)和膜类固醇结合蛋白1 (MSBP1)。ClpB3与Hsp70的直接相互作用可能最终导致脱氧木酮糖5-磷酸合酶的重新折叠，从而重新激活，从而促进甲基红四醇4-磷酸途径的修复[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］.这一途径合成类异戊二烯的代谢前体，如类胡萝卜素、叶绿素、生育酚或质体醌的戊烯基链。ZD808中ClpB3的PRM验证值为“++”，而在无标记定量蛋白质组学中ClpB3的PRM验证值为“+”，ZD808与中间亲本值的PRM验证值存在显著差异。杂种ZD808中ClpB3丰度较高，表明其胁迫响应能力大于亲本。PGDH起源于糖酵解和卡尔文循环，参与l -丝氨酸的生物合成[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaPGD​​H1对工厂适应高CO也是必不可少的gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，以及胚胎发生和花粉发育[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］.最近，一项研究表明，甜菜在遭受盐胁迫后PGDH活性增加[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］.尽管PGDH在ZD808中调节了下调，但ZD808中对盐应激相关的PGDH的反应可能大于其父母的反应。GST是一种多功能酶，参与减少反应性氧物质和细胞毒性的形成[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］.GST6在盐胁迫条件下上调[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］.ZD808将GST6归类为‘−’NAP，在PRM验证中，ZD808及其中间父值存在显著差异。因此，ZD808对盐胁迫相关GST6的响应可能较高。MSBP1抑制细胞伸长[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba]并对芸苔类固醇信号传播进行负面调节[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］.MSBP1的表达也与耐盐性密切相关[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba］.与ZD909中的许多压力相关的小点一样，该蛋白质被下调，由PRM验证。gydF4y2Ba

果糖-二磷酸醛缩酶7 (FBA7)、铁氧还蛋白- nadp还原酶(FNR)、光系统II亚基PsbS1 (PsbS1)、光照后叶绿素荧光增加(PIFI)、叶绿素a-b结合蛋白(CAB1和CAB2)、光系统I P700叶绿素a载脂蛋白A2 (psaB)、光腔位置1的光合NDH亚基(PNSL1)，也接受PRM验证(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）．除PIFI和PNSL1外，其余6个PS相关蛋白均经PRM验证。PIFI、CAB1和2、psaB和PNSL1在ZD909中被鉴定为“+”nap，大部分在PRM验证中被归类为“+”或“++”。PIFI对于ndh介导的氯呼吸电子传递中质体醌池的非光化学还原至关重要[gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba］.驾驶室是一类在高等植物中囊骨膜中的一类重要蛋白质，并参加光系统I和II。此外，驾驶室可能涉及非生物应激响应[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba］.还发现，播种后两天，大白菜F1杂交株在卷扬后两天高度表达，意味着杂交种的发芽幼苗早期发育事件可能对后期发育活力和产量优势是重要的[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba］.Psab光照系统I. PNSL1的主要电子给体是叶绿体NDH的腔子胞间复合亚基。与ZD909不同，大多数与无标签定量蛋白质组学鉴定的PS相关的蛋白质被下调，并且PRM验证了FBA7，FNR和PSBS1分类。FBA参与碳固定，糖酵解和Calvin循环途径。FNR催化Ferredoxin和NADP之间的可逆电子传输。PSBS1是照片系统II的亚基。这些角色表明，与父母相比，PS在ZD808中减少。基于无标记的定量蛋白质组学和PRM分析，玉米杂交种ZD808和ZD909的杂种优势主要与PS和/或应力抗性相关。gydF4y2Ba

除上述与胁迫响应和光合作用相关的蛋白外，报道的与杂种优势相关的基因之一ERBB-3结合蛋白1 (EBP1)在ZD909中表达上调(表)gydF4y2BaS2gydF4y2Ba）．EBP1通过细胞生长和增殖调节器官大小[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］.此外，ZD808和ZD909中的一些DAPs/ nap还没有进行功能注释(表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaS2gydF4y2Ba）．虽然对杂交品种ZD808和ZD909萌发期幼苗的DAPs和aps的分析为理解这些有价值的农艺性状产生的原因提供了一些有用的信息，但整个生育期的蛋白质组学研究仍然缺乏。这些结果表明，玉米杂种优势的形成机制有待进一步研究。gydF4y2Ba

综上所述，从玉米杂交组合ZD808和ZD909幼苗叶片中鉴定出近200个nap，大部分在胁迫响应、PS、氨基酸代谢和蛋白质途径中富集。ZD808显著增强了与应激反应、蛋白质和氨基酸代谢相关的通路，而ZD909则受到抑制。而杂种ZD909的PS相关通路显著增强。结果表明，两种玉米杂种优势的生物学基础不同。与亲本相比，杂种ZD808的优良农艺性状与一些与胁迫响应和代谢功能相关的蛋白高表达有关，而ZD909的优良农艺性状与光合作用有关。我们的蛋白质组学结果支持了先前的生理和形态研究，并为理解有价值的农艺性状的原因提供了有用的信息。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

玉米杂交ZD808（NG5×Cl11）的种子以及其女性母体Cl11（从78,599）和雄性母体NG5（来自95,236×95,167，爱荷华州立大学）以及杂交ZD909（Z58×HD568）的母母母母细胞NG5with its female parent Z58 and male parent HD568 (from DKC79 × Chang7–2) were acquired from professor Changling Huang’s lab (Center for crop genetics and breeding, Institute of crop science, Chinese Academy of Agricultural Sciences) in this study and some yield traits data are shown in Table1gydF4y2Ba。每个品种的种子分别用蒸馏水清洗，用2% NaClO浸泡20分钟，再用蒸馏水清洗。然后将~ 200粒种子在28°C光照16 h, 24°C光照，70%相对湿度下培养8 h的沙地中萌发培养15天。然后将生长均匀的幼苗移栽到加1/2营养液的新沙地中。3叶期采集2片叶片，冷冻于液氮中，−80℃保存进行蛋白质组学分析。gydF4y2Ba

蛋白质的提取和消化gydF4y2Ba

根据Zhu等人提取蛋白质。[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba］.每个样品(100 mg, 3个生物重复和3个技术重复)的玉米叶片进行蛋白质提取。提取的蛋白用50 μL胰蛋白酶消化，37℃孵育过夜，13000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba−20℃保存，待进一步使用。gydF4y2Ba

质谱分析gydF4y2Ba

多肽片段的分离和分析使用Easy nLC 1000偶联Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific)。质谱仪的参数设置与Zhu等人相同[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba］.每个样本的实验至少重复3次，然后获得54个高可靠性的质谱原始文件(补充数据:54个质谱原始文件，Partner repository with dataset identifier PXD015819.)。gydF4y2Ba

蛋白质鉴定与LFQgydF4y2Ba

蛋白质的无标记定量(LFQ)采用MaxQuant软件(version 1.6.0，gydF4y2Bahttps://www.coxdocs.orggydF4y2Ba)，并基于Uniprot数据库(玉米，2018年8月28日)。前驱体质量耐受性设定为20ppm, 0.02 Da片段离子耐受性;蛋白质的n端乙酰化和蛋氨酸氧化被定义为可变修饰。肽和蛋白鉴定的截止全局假发现率(FDR)设置为0.01。gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2Ba

LFQ数据在用于筛选相关蛋白前使用标准化方法进行预处理。采用Pearson相关分析评价原始数据的质量(SPSS 22.0、gydF4y2Bahttps://www.ibm.com/analyticsgydF4y2Ba）．维恩分析(gydF4y2Bahttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/gydF4y2Ba)对杂种与其亲本之间的DAPs和nap进行分组。根据以往文献，DAPs的选择标准为fold change > 2，而nap的选择标准为fold change > 1.5 andgydF4y2BapgydF4y2Ba<0.05。使用R包GGPlot2_3.3.0和GGFortify_0.4.9可视化主成分分析。使用R包PheatMap_1.0.12和使用Z分数来可视化Heatmap。最后，使用Mapman进行DAP的途径浓缩分析和小睡（gydF4y2Bahttps://MapMan.gabipd.org/gydF4y2Ba）．gydF4y2Ba

平行反应监测（PRM）gydF4y2Ba

采用Easy nLC 1000与Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific)耦合进行PRM分析。叶片收集于三叶期。提取并消化蛋白质，用于PRM分析。靶前驱体离子的分离宽度为±1 Thomson/窗口为2 Thomson，前驱体离子通过更高能量的碰撞分解，归一化碰撞能量为27 eV。在所有的实验中，7万分辨率的全质谱与gydF4y2Bam / z.gydF4y2Ba200次之后进行多达30次PRM扫描，分辨率为17,500。其他分离条件和质谱参数如上所述。最后，使用Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Electron, Germany)和Skyline 4.1软件(下载自gydF4y2Baftp://ftp.ensembl.org/pub/mnt2/gydF4y2Ba）．gydF4y2Ba

质谱蛋白质组学数据已存入蛋白质交换联盟(gydF4y2Bahttp：//prictomecentral.proptomexchange.gydF4y2Ba。通过DataSet标识符PXD015819的IProx Partner Repository（gydF4y2Bahttp://prictomecentral.proptomexchange.org/cgi/getdataset?id=pxd015819.gydF4y2Ba）．gydF4y2Ba

小憩：gydF4y2Ba

非附加蛋白质gydF4y2Ba

DAP：gydF4y2Ba

不同蛋白质的积累gydF4y2Ba

ZD808：gydF4y2Ba

Zhongdan808gydF4y2Ba

ZD909:gydF4y2Ba

Zhongdan909gydF4y2Ba

LFQ:gydF4y2Ba

label-free量化gydF4y2Ba

AGC：gydF4y2Ba

自动增益控制gydF4y2Ba

PRM：gydF4y2Ba

并行反应监测gydF4y2Ba

质/女士:gydF4y2Ba

液相色谱-串联质谱法gydF4y2Ba

2DE：gydF4y2Ba

二维凝胶电泳gydF4y2Ba

MALDI-TOF-MS:gydF4y2Ba

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析gydF4y2Ba

PS：gydF4y2Ba

光合作用gydF4y2Ba

TCA：gydF4y2Ba

三羧酸gydF4y2Ba

MAPK:gydF4y2Ba

增殖蛋白激酶gydF4y2Ba

PR：gydF4y2Ba

pathogenesis-relatedgydF4y2Ba

ClpB3:gydF4y2Ba

伴侣蛋白CLPB3.gydF4y2Ba

PGD​​H：gydF4y2Ba

D- 3-磷酸性脱氢酶gydF4y2Ba

GST6:gydF4y2Ba

谷胱甘肽S-转移酶6gydF4y2Ba

MSBP1:gydF4y2Ba

膜类固醇结合蛋白1gydF4y2Ba

功能性:gydF4y2Ba

果糖 - 双磷酸醛磷酸酶gydF4y2Ba

FNR:gydF4y2Ba

Ferredoxin-NADP还原酶gydF4y2Ba

PsbS1:gydF4y2Ba

光系统II亚基PsbS1gydF4y2Ba

PIFI:gydF4y2Ba

光照后叶绿素荧光增加gydF4y2Ba

出租车:gydF4y2Ba

叶绿素a-b结合蛋白1gydF4y2Ba

psaB:gydF4y2Ba

光系统I P700叶绿素a载脂蛋白A2gydF4y2Ba

PNSL1:gydF4y2Ba

光合作用NDH亚基的腔位1gydF4y2Ba

我们感谢国际科学编辑(gydF4y2Bahttps://www.internationalscienceediting.comgydF4y2Ba)编辑此稿件。gydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(No. 2016YFD0101005);国家科技计划项目(No. 2009ZX08012-011B);北京市科技计划项目(No. D171100007717002);“中央公益性科研单位基本科研经费项目”(Y2017PT25)和“农业科技创新计划”(作物分子标记开发与应用)资助。资助人未参与本研究的实验设计、数据收集、分析和解释，也未参与撰写论文。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 王道平和穆永英对这一工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 2 .中国农业科学院作物研究所，北京，100081gydF4y2Ba

   王王，永英穆，萧娇胡，江旭，长岭黄盈锅gydF4y2Ba

2. 作物分子育种国家工程实验室，北京，100081gydF4y2Ba

   萧娇胡＆长岭黄gydF4y2Ba

3. 中国中医科学院西苑医院，北京，100091gydF4y2Ba

   博马＆zhibo王gydF4y2Ba

4. 中国农业科学院生物技术研究所，北京，100081gydF4y2Ba

   李朱gydF4y2Ba

5. 国家作物基因资源与遗传改良重点项目，北京，100081gydF4y2Ba

   yinghong泛gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

YP和CH设计了研究实验;DW和YM进行了实验并对数据进行了分析;CH，提供种子材料;XH，提供表型数据;BM、ZW、LZ和JX监督实验;DW, YM, YP撰写稿件。作者已阅读并批准稿件。作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba长黄gydF4y2Ba或gydF4y2Bayinghong泛gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

我们声明，所有作者都没有相互竞争的利益gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用线中另有说明。如果材料没有包含在文章的创作共用许可证中，而您的预期使用不被法律法规允许或超过允许的使用，您将需要直接获得版权持有人的许可。如欲浏览本许可证的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba。“创作共用公共领域”豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba