基因组 - 编码基因的全基因识别与表征gydF4y2Ba萝卜gydF4y2BaL.和他们的角色相关gydF4y2Ba尖孢镰刀菌gydF4y2Ba电阻gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

核苷结合位点富亮氨酸重复序列(NBS-LRR)基因在植物发育和抗病中起着重要作用。虽然在多个物种中进行了nbs编码基因的全基因组研究，但这些基因的进化、结构、表达和功能在萝卜(gydF4y2Ba萝卜gydF4y2Bal .)。最近发布的草案gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2BaL.参考基因组促进了萝卜中NBS编码基因的全基因组鉴定和表征。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

通过HMM搜索和Pfam数据库，基于基本的NB-ARC结构域在萝卜基因组中共鉴定出225个nbs编码基因，其中202个定位于9条染色体上，其余23个定位于不同的支架上。通过基因结构分析，鉴定出99个nbs - lrr型基因和126个nbs部分编码基因。另外，80个和19个基因分别编码n端Toll/白细胞介素样结构域和一个螺旋-螺旋结构域。202个nbs编码基因中72%被分成48个簇，分布在24个十字花科染色体区。R02、R04、R08染色体U区有最多的nbs编码基因(48个)，其次是R区(24个)、D区(23个)、E区(23个)和F区(17个)。这些聚类大多是同质的，包含来自最近共同祖先的nbs编码基因。在NBS家族中发现串联(15个事件)和节段(20个事件)重复。同源基因的比较进化分析gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba，gydF4y2Ba芸苔属植物拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Ba芸苔属植物oleraceagydF4y2Ba反映了NBS-LRR基因家族在进化中的重要性。此外，顺式元素检测鉴定出70种主要元素参与茉莉酸甲酯、脱落酸、生长素和水杨酸的响应。根据RNA-seq表达分析，有75个nbs编码基因参与了萝卜对枯萎病的抗性。实时荧光定量PCR分析表明gydF4y2Barstnl03.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs093020gydF4y2Ba),gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs042580gydF4y2Ba）表达积极调节萝卜抗性gydF4y2Ba尖孢镰刀菌gydF4y2Ba，与之相反的是消极的监管作用gydF4y2Barstnl06.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs053740gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

首次阐明了nbs编码基因的结构、串联和节段复制、共同和表达谱，并与其他十字花科成员(gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba)以阐明NBS基因家族的进化过程。这些结果可能为萝卜nbs编码基因的功能鉴定提供了依据。gydF4y2Ba

植物含有许多抗性（R）基因对病毒，真菌和细菌病原体的免疫力至关重要[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．具体来说，R基因介导的抗病是植物抵御病原菌的最重要机制之一[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．根据各自的结构域，R基因可分为以下5个功能不同的类别:首先，核苷酸结合位点-富亮氨酸重复序列(NBS-LRR)基因，分为Toll/白介素1受体(TIR)-NBS-LRR (TNL)和螺旋缠绕(CC)-NBS-LRR (CNL)基因;二是类受体跨膜蛋白;第三,serine-threonine激酶;第四，受体样激酶(RLKs);第五，非典型R基因[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．R基因的主要类型包括具有NBS和LRR结构域的基因[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．迄今为止，在所有植物中已经检测和克隆了300多个R基因，其中60%以上编码NBS和LRR域[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．三个NBS-LRR亚类是TNL，CNL和对粉末状霉菌8（RPW8）-NBS-LRR（RNL）的抗性，其基于AgeniSperms中的n末端域的差异来区分[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．TNL和CNL蛋白主要负责特异性病原体的识别，而RNL蛋白参与下游防御信号转导途径[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．因此，Bonardi等人将RNL蛋白描述为辅助nbs - lrr [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

LRR结构域位于植物NBS-LRR蛋白的c端，由串联的LRR组成，参与入侵病原体的检测[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．NBS结构域是一个功能性atp酶结构域，其核苷酸结合状态被认为是调节R蛋白活性的分子开关[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．虽然TIR和CC域参与了信号转导和抗性特异性，但它们的相关通路不同。TIR域主要涉及自关联和与其他TIR域的同型相互作用[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，而CC结构域可能与蛋白质相互作用和信号转导有关[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．为了防止不同的和快速进化的病原体，一个单一的植物基因组通常编码数百个NBS-LRR基因。最近全基因组测序分析产生的数据使研究人员能够全面分析经济重要植物中的NBS-LRR基因[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

萝卜(gydF4y2Ba萝卜gydF4y2Ba她是这个家族中最杰出的成员之一gydF4y2BaBrassicaceae.gydF4y2Ba，是一种具有经济价值的根菜作物，在世界各地种植[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．萝卜质量和产量受到生物应激的影响，包括真菌和细菌疾病以及昆虫害虫的侵扰[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba］．具体而言，由土壤传播的真菌病原体引起的镰刀菌枯萎病gydF4y2Ba尖孢镰刀菌gydF4y2Ba，会严重损害萝卜及其他多种蔬菜[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］．由于其宿主范围广，gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Ba可以在相对高的土壤温度（> 24°C）下存活，即使在没有任何宿主植物的情况下也仍保持活力，使得难以控制[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．除了TNL型抗性基因gydF4y2BaFOC1gydF4y2Ba和gydF4y2BaFocBo1gydF4y2Ba，它们负责抵抗gydF4y2Ba芸苔属植物oleraceagydF4y2Ba到gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Ba，最近在不同植物物种中鉴定了与镰刀菌枯萎性有关的许多NBS-LRR基因[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

其他属于NBS-LRR家族的基因已经在各种植物中检测到，包括gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba芸苔属植物拉伯gydF4y2Ba［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba],鹰嘴豆[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba),而gydF4y2BaGossypiumgydF4y2Ba物种(gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．遗憾的是，据我们所知，萝卜NBS-LRR基因在抗病方面的潜在作用尚未被研究。现有的萝卜基因组序列对转录因子家族的全基因组鉴定是一个有用的资源[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．然而，其影响gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Ba对萝卜NBS-LRR基因及其家族的感染尚不清楚。因此，结合生物信息学和基因表达分析，系统研究NBS-LRR基因的进化、表达和潜在功能，有助于进一步了解萝卜生长调控网络及其响应机制gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

本研究通过对萝卜基因组的全基因组分析，鉴定出225个NBS编码基因(99个NBS- lrr全基因和126个NBS部分基因)，分为两个亚类(CNL和TNL)。这些基因的染色体位置、结构和重复进一步的特征。此外，以NBS-LRR基因为重点，研究了NBS-LRR基因编码的保守结构域以及与NBS-LRR基因的系统发育关系和同源性gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba．此外，病原菌诱导的NBS-LRR基因表达谱表明，部分R基因在萝卜抗性和敏感种质中存在差异表达。我们的结果为萝卜基因组中这个基因家族的进化提供了重要的见解。此外，本文提供的广泛的R基因数据可能有助于今后的育种工作，旨在提高萝卜和其他品种的抗病性gydF4y2BaBrassicaceae.gydF4y2Ba作物。gydF4y2Ba

nbs编码基因的鉴定与分类gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba

为了综合鉴定萝卜中潜在的nbs编码基因，利用Pfam数据库中的HMM谱NB-ARC (Pfam: PF00931)筛选萝卜基因组中编码的蛋白序列[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．共鉴定出488个具有NBS-LRR结构域的候选基因。人工筛选nbs编码候选基因，并根据最接近的基因进行功能注释gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba同族体。最后，在Rs1.0基因组中鉴定出225个非冗余nbs编码的R候选基因(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。根据HMM谱和NCBI保守域数据库，含nbs的候选蛋白被分为TNL或CNL亚家族，并在系统发育树中显示其关系(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．系统发育树清楚地区分了两个分支的TNL和CNL基因(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．基因名称根据其结构域类型和染色体位置进行分配。TNL亚家族包括80个全长结构域(TIR、NBS和LRR)基因，54个TN (TIR和NBS，但没有LRR)基因，25个NL基因gydF4y2Ba_TNLgydF4y2Ba（NBS和LRR，但没有TIR）和15 ngydF4y2Ba_TNLgydF4y2Ba（没有TIR或LRR）基因。属于CNL亚家族的剩余51个基因包括19个，具有全长域（CC，NB和LRR）以及10 CN（CC和NB，但NB，但没有LRR），9 RN（RPW8和NB，但没有LRR），2个nl.gydF4y2Ba_{CNL.gydF4y2Ba}(NBS和LRR，但没有CC)和11 NgydF4y2Ba_{CNL.gydF4y2Ba}(无CC或LRR)基因。在萝卜基因组中未检测到编码RPW8-NBS-LRR蛋白的基因。我们还分析了来自遗传关系密切的植物的nbs编码基因gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba（桌子gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，用同样的方法。共164 (gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba), 212 (gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba)和244 (gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba)鉴定了nbs编码基因。gydF4y2Ba

萝卜染色体的基因组分布gydF4y2Ba

在225个nbs编码基因中，202个被定位到9条萝卜染色体上，其余23个基因被定位在几个支架上，这些支架没有被定位到萝卜染色体上gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。我们测定了CNL、TNL和部分nbs编码基因在不同染色体上的分布(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。此外，TNL基因在R01 ~ R09染色体上几乎均匀分布，而CNL基因在R03和R06染色体上未检测到。此外，R09染色体上编码nbs的基因最多(41个)，R03染色体上编码nbs的基因最少(7个)gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba（78:18），gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba(74:20),gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba（91,20）[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

nbs编码基因的染色体分布模式尚不清楚，多为聚类。这种分布可以通过重组错配促进序列交换。我们根据先前建立的标准确定了nbs编码基因簇，即一个nbs编码簇应该有两个或两个以上的基因，它们之间不超过200 kb，中间不超过8个非nbs编码基因[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba］．在萝卜染色体上，在48个簇中映射146（72％）NBS基因，而剩余的55个基因被检测为单身（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba附加文件SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．我们的分析显示，除九单身之外，染色体R09具有最多的NBS基因（41; 20.30％的映射基因）。簇大小在基因组（2-11基因）上变化。集群44是最大的，具有11个基因属于TNL亚家族。gydF4y2Ba

为了阐明基因之间的进化关系，我们分析了萝卜基因组中的十字法块中的NBS-LRR基因的分布。在24个识别的块中（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba[染色体上的U嵌段R02，R04和R08是最大的（编码48个NBS编码基因），其次是R嵌段（24基因），D嵌段（23基因），E块（23基因）和F块（17个基因）。U块可能是NBS编码基因中最重要的一种。gydF4y2Ba

基因特征与结构gydF4y2Ba

综合分析了225个nbs编码基因的基因组长度和编码序列，以及相应蛋白的长度、分子量(MW)和等电点(pI)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。基因组和编码序列长度范围为336bp（RSN02）至11,267bp（RSTN106）和1149bp（RSN02）至4899bp（RSTN115）。蛋白质长度范围为111个氨基酸（RSN02）至1632氨基酸（RSTN115）。MW和PI还存在显着的变化，其范围为12.72kDa（RSN11）至182.40kDA（RSTN115）和4.77至9.60。另外，TNL（122.27kDa）和CNL（99.84kDa）蛋白的平均MW显着不同。gydF4y2Ba

评估结构的结构多样性gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba我们比较了nbs编码基因的外显子数量。萝卜基因组中CNL和TNL全长基因的平均外显子分别为2.42和5.26个(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，这与的分析是一致的gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba其中，CNL和TNL基因的平均外显子数分别为2.2、2.3和3.4,5.3、5.2和6.4。47.37%的CNL基因由单外显子编码。这些结果表明，在萝卜NBS-LRR两种抗性基因的结构演化过程中，内含子的数量可能有所增加或减少。gydF4y2Ba

Cis-element分析gydF4y2Ba

启动子中的顺式元件通常参与基因调控。因此，为了进一步研究nbs编码基因的潜在调控网络，我们利用PlantCARE软件对225个nbs编码基因起始密码子上游2 kb序列中的顺式元件进行了分析(补充文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。共检测到70个顺式元件，其中激素响应元件10个，光响应元件33个，非生物胁迫相关元件4个，组织特异性表达相关元件8个，其他15个。在218个nbs编码基因的启动子区检测到顺式元件DRE，它是启动子和增强子区域中常见的顺式作用元件。此外，在216个nbs编码基因中检测到一个位于转录起始位点上游约30 bp的核心启动子元件AT-rich片段。该序列被认为是nbs基因启动子的重要组成部分。159个nbs编码基因的启动子区域包含cgtca基序，这是一个与茉莉酸甲酯响应相关的顺式调控元件。在165个基因的启动子区域检测到影响脱落酸响应的脱落酸响应元件，表明nbs编码基因参与了植物对病原菌感染的响应。此外，在97个基因启动子中检测到参与水杨酸反应的tca元件，而在82个基因启动子中检测到参与生长素反应的tga元件。此外，与赤霉素响应相关的P-box和gare基序分别存在于55个和40个nbs基因启动子中。这些结果可能与开发一种鉴定与抗病相关的候选基因的方法有关。gydF4y2Ba

TNLs和CNLs之间的保守基序和系统发育关系gydF4y2Ba

为了探讨TNL和CNL基因和蛋白质结构，我们基于由其编码的全长氨基酸序列构建了一种系统发育树gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2BaTNL和CNL基因gydF4y2Ba．gydF4y2Ba系统发育分析表明，萝卜nbs - lrr可分为CNL和TNL两大类群(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。RsTNL组包括四个子组。在80个RsTIR蛋白中，有49个、10个、5个和16个分别属于RsTNL-1、RsTNL-2、RsTNL-3和RsTNL-4亚群。这些结果与系统发育分析结果一致gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba(附加文件图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了进一步阐明TNL和CNL基因的潜在功能和多样化gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba，识别20个编码的保守motif，并基于MEME程序编号为1-20(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4和S5)。在所有RsTNLs中均检测到红外域。此外，RsTNL-1子组成员拥有大部分的基序。RsTNL-2和RsTNL-3蛋白分别缺少基序20和11。RsTNL-4亚群蛋白缺失基序11、12和16(图11)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．RsCNL组成员大多只有6个主题，包括CC域。在亚群中发现了共同的基序组成。然而，在基序类型和数量上，亚群之间存在相当大的差异。这表明亚群中的蛋白质在功能上是相似的。gydF4y2Ba

nbs编码基因的串联复制和共同分析gydF4y2Ba

全基因组复制和串联复制是提高基因组复杂性和进化新颖性的关键事件。在gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Banbs编码基因中34个(15.11%)与串联重复相关，分布在15个2-5个基因串联序列中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S6）。我们的数据还揭示了每串联复制事件的重复基因数量的可变性以及对九个染色体中的五种重复的不均匀分布。编码结构域的基因（例如，CNL，TNL和TN）存在于串联阵列中。检测到染色体R09的14个串联复制事件涉及五个gydF4y2BaRsTNgydF4y2Ba基因。相反，在R02、R06、R07、R08和R09染色体上发生单串复制事件，每条染色体都涉及两个基因。R08染色体串联排列最多(6个串联组，13个基因)，反映了nbs编码基因分布的热点。根据BLASTP和MCScanX方法对我们的数据进行分析，发现了涉及32个nbs编码基因的20个片段重复事件(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。gydF4y2Ba

Ka/Ks值(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：分段重复的基因对的表S8小于1，表明这些基因在阴性选择下进化。这些结果表明，串联和节段性重复事件都是萝卜基因组中NBS编码基因进化扩展的主要动力。gydF4y2Ba

对非本谱对NBS编码基因对的比较同意分析gydF4y2Ba

为了进一步研究萝卜NBS编码基因之间的系统发育关系，我们构建了三个与萝卜相比的同步图gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaB. oleracea。gydF4y2Ba共209对nbs编码基因(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S9）在同时性关系之间gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba．共检测到39对同源基因对gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，而中间有73对gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba以及97对之间gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在39对之间gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，所有的基因都是单拷贝基因，除了gydF4y2BaRsCN06gydF4y2Ba该公司有两份副本。四个部分NBS基因(gydF4y2Ba工匠们gydF4y2Ba_{行动gydF4y2Ba}19gydF4y2Ba，gydF4y2BaRsNLgydF4y2Ba_{行动gydF4y2Ba}07gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSTN31.gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaRsTN39gydF4y2Ba)在萝卜基因组中检测到与gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2BaTNL基因（gydF4y2BaAT1G63730gydF4y2Ba，gydF4y2BaAT5G45210gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaAT1G63860gydF4y2Ba)．的gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba部分NBS基因gydF4y2BaAT5G18350gydF4y2Ba与完整的NBS基因相对应gydF4y2Barstnl12.gydF4y2Ba．在73对基因中gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 46个萝卜NBS-LRR基因以单拷贝形式存在，12个基因有2个拷贝，1个基因有3个拷贝(gydF4y2BaRsTN01gydF4y2Ba)．的gydF4y2BaBra027122gydF4y2Ba(无TIR域)和gydF4y2BaBra030779gydF4y2Ba(没有抄送域)gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba基因与gydF4y2BaRsTNL75gydF4y2Ba和gydF4y2BaRsCNL11gydF4y2Ba,分别。而且，四gydF4y2BaRsTNgydF4y2Ba基因(gydF4y2Barstn26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba， 和gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba),gydF4y2BaRsNL01gydF4y2Ba与TNL基因同源(gydF4y2BaBra001160gydF4y2Ba，gydF4y2BaBRA024652gydF4y2Ba，gydF4y2BaBra027779gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaBra027772gydF4y2Ba),而gydF4y2BaRsCN02gydF4y2Ba与一个CNL基因同源(gydF4y2BaBra019063gydF4y2Ba)gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba基因组。共检测到59个编码nbs的基因与64个编码nbs的基因同源gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba基因组（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S9)。之间有大约97个同源基因对gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba，其中47个、19个和4个编码nbs的基因在萝卜中分别保留为1拷贝、2拷贝和3拷贝gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba，剩余基因缺乏同步关系。部分NBS编码基因gydF4y2BaRsTN11gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSTN31.gydF4y2Ba，gydF4y2BaRsNL07gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaRsN19gydF4y2Ba与完整的TNL基因同源(gydF4y2BaBo2g010720gydF4y2Ba，gydF4y2Babo8g104700.gydF4y2Ba，gydF4y2BaBo9g061200gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaBo9g029350gydF4y2Ba)gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba基因组。此外,两个gydF4y2BaRsCNLgydF4y2Ba基因(gydF4y2BaRsCNL03gydF4y2Ba和gydF4y2BaRsCNL05gydF4y2Ba)和四个一样gydF4y2BaRsTNLgydF4y2Ba基因(gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba，gydF4y2Barstnl14.gydF4y2Ba，gydF4y2BaRsTNL62gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaRsTNL72gydF4y2Ba)对应部分NBS基因(gydF4y2Babo6g020950.gydF4y2Ba，gydF4y2BaBo1g048080gydF4y2Ba，gydF4y2BaBo3g154220gydF4y2Ba，gydF4y2BaBo6g089230gydF4y2Ba，gydF4y2BaBo2g126980gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaBo3g006960gydF4y2Ba)gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba基因组。共检测到70个萝卜nbs编码基因，与67个萝卜nbs编码基因同源gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba基因组（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S9)。萝卜之间的同步性分析gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba基因组显示完整的NBS-LRR基因比部分基因更具有同源性。gydF4y2Ba

最后，对4个物种(gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba，gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba)显示22gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Banbs编码基因与相应的拷贝gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba基因组(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S10)。nbs编码基因之间存在一对一的关系gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba基因组。此外，一半的萝卜基因具有单拷贝同线基因gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba基因组gydF4y2Ba．gydF4y2Ba此外，这是gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba基因组有两个和三个副本gydF4y2BaRsTN38gydF4y2Ba分别以及三个副本gydF4y2BaRsTN01gydF4y2Ba．因此，这些基因可能对NBS-LRR基因家族的进化具有重要意义。gydF4y2Ba

Ka / ks比例表明了进化过程中基因的选择性压力。我们检查了正交基因对的KA / KS比率，以确定NBS-LRR基因的进化选择模式gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba，gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba．KA / KS比率反映了每个非同义网站（KA）的非同义替换的数量以及每个同义网站（KS）的同义替换的数量。使用KAKS计算器估计本文发育树的每个分支的正交基因对的比率。分段和串联重复的NBS-LRR基因对以及所有直际NBS-LRR基因对具有Ka / Ks比率<1（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S11），表明萝卜NBS-LRR基因家族可能在进化期间经历了强烈的净化选择压力。gydF4y2Ba

萝卜NBS-LRR基因表达谱的响应gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Baf . sp。gydF4y2Baraphanin 59gydF4y2Ba（gydF4y2BaFOR59gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

为了鉴定NBS-LRR基因对agydF4y2BaFOR59gydF4y2Ba感染并确定其时空表达模式，我们分析了所有NBS-LRR基因的转录组数据。为“YR4”和“YR18”基因型的全植物幼苗产生转录组数据gydF4y2BaFOR59gydF4y2Ba；‘YR4’和‘YR18’分别在接种后0、1、3、6 d采集整株种子gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Ba用于Illumina平台的后续测序。此外，我们从生成的RNA-seq数据中提取了NBS-LRR基因。基于保守结构域和基因id，获得了225个nbs编码基因中的171个的转录组数据。其余未鉴定的基因可能在对agydF4y2BaFOR59gydF4y2Ba感染。在这些171个NBS编码基因中，29在“YR4”和“YR18”之间没有差异表达，并且在所有时间间隔以最小的方式表达。因此，这些基因被排除在基因表达分析之外。每百万百万片段的每千碱基片段映射（FPKM）为142个剩余的NBS-LRR基因获得的值，从0到278.884变化。总共80个NBS编码基因的FPKM值小于1fpkm（低表达），而存在84个基因，具有超过1fpkm值，少于10（高表达）。极高的表达在13个基因中表示，超过10个以上，小于50;1个基因超过50，小于100;和1个基因超过100，小于300。差异表达的基因gydF4y2BaFOR59gydF4y2Ba用R包边机[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba结果显示，在不同时间点，抗性YR4系中有36个基因的表达量高于易感YR18系。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．七个基因(gydF4y2BaRsCN10gydF4y2Ba，gydF4y2Barsn21.gydF4y2Ba，gydF4y2Barsn26.gydF4y2Ba，gydF4y2BaRsNL19gydF4y2Ba，gydF4y2BaRsTN04gydF4y2Ba，gydF4y2Barstnl15.gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaRsTNL38gydF4y2Ba)仅在‘YR18’中上调，而6个基因(gydF4y2BaRsCN05gydF4y2Ba，gydF4y2BaRsCNL17.3gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSN22.1.gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSTN31.gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSTN32.gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaRsTN43gydF4y2Ba）在'YR4'上调节。最重要的是，五种基因的表达（gydF4y2BaRsN25.2gydF4y2Ba，gydF4y2BaRsNL07gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSTN18.gydF4y2Ba，gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaRSTN17.gydF4y2Ba）随着时间的推移在'YR4'植物中逐渐增加，但在“YR18”植物中保持相对稳定，暗示它们对于对镰刀菌枯萎的抵抗力至关重要。然而gydF4y2BaRsTNL51gydF4y2Ba在“YR18”中表达水平高于“YR4”，在感染期间逐渐增加（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba这些结果表明，共有75个NBS-LRR基因有助于萝卜对枯萎病的抗性，其中6个基因(gydF4y2BaRsN25.2gydF4y2Ba，gydF4y2BaRsNL07gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSTN18.gydF4y2Ba，gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSTN17.gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaRsTNL51gydF4y2Ba)可能对抵抗至关重要。gydF4y2Ba

回应gydF4y2BaFOR59gydF4y2Ba感染gydF4y2Ba

通过定量实时（QRT）-PCR测定来确认“YR4”和“YR18”植物中NBS-LRR编码基因的表达模式。具体地，我们验证了仅CNL和TNL基因的表达。19.gydF4y2BaRsCNLgydF4y2Ba和80gydF4y2BaRsTNLgydF4y2Ba在萝卜基因组中，约有40个基因编码的蛋白质在YR4和YR18之间存在氨基酸差异。以18S rRNA基因为内控基因，测定了这些基因在接种(DAI)后0、1、3、6、9和12 d的表达模式。的gydF4y2Barstnl03.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs093020gydF4y2Ba),gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs042580gydF4y2Ba)染色体R02上的基因在抗YR4植株中的表达明显高于感病YR18植株(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，表明这两个基因与萝卜抗枯萎病有关。有趣的是，这两个基因在第0天在‘YR4’和‘YR18’中表达相似，但侵染迅速上调了‘YR4’植株的表达水平。表达量持续增加至9dai，进一步表明其在抗枯萎病方面的潜在作用。同源染色体的gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs042580gydF4y2Ba）被确定在gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba（gydF4y2BaAT4G36150gydF4y2Ba），gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba（gydF4y2BaBra010552gydF4y2Ba和gydF4y2BaBra011666gydF4y2Ba),gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba（gydF4y2BaBo3g154220gydF4y2Ba和gydF4y2BaBo7g117810gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

NBS-LRR基因形成了一个在所有植物物种中普遍存在的抗逆性基因家族。对NBS-LRR基因家族的全基因组分析已经对许多已测序的基因组进行了分析[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．在本研究中，我们鉴定了候选NBS-LRR基因，并对其分布、结构、聚类、重复、共同和保守性进行了研究。我们在萝卜基因组中鉴定了225个非冗余nbs编码的R候选基因(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S1)，采用严格的HMM和Pfam方法。为了验证我们方法的准确性，我们用类似的方法鉴定了nbs编码基因gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba，gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba， 和gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba．我们鉴定了164个、212个和244个nbs编码基因gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba这与Zhang et al.(2016)的早期研究结果一致，其中检测到165个和204个nbs编码基因gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba和gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba,分别。与我们的研究类似，Yu et al.(2014)也鉴定了239个nbs编码基因gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba．但是，所识别的NBS-LRR基因的数量gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba其他研究中的基因组不同[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．这些差异可能是由于我们严格的HMMER e值以及人工检查部分NBS结构域的基因。gydF4y2Ba

在对nbs编码候选基因进行系统发育分析的基础上，将225个nbs编码基因分为TNL和CNL亚家族。TNL亚家族包括80例TNL, 54例TN, 25例NLgydF4y2Ba_TNLgydF4y2Ba， 15 NgydF4y2Ba_{行动gydF4y2Ba}基因，其中CNL亚家族中的剩余51个基因包含19 cnl，10c，9 rn，2nlgydF4y2Ba_CCgydF4y2Ba， 11 NgydF4y2Ba_CCgydF4y2Ba基因。在萝卜中未检测到编码RPW8-NBS-LRR蛋白的基因。CNL:TNL的基因比例约为1:4，与in相似gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．这种不同的TNL基因丰富模式表明TIR结构域比CC域更具功能性gydF4y2BaBrassicaceae.gydF4y2Ba物种(gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

NBS-LRR基因不均匀地分布在萝卜基因组上，染色体R09和R03分别具有最多最少的基因。另外，将23个基因位于不同的支架上（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．与其他物种相似，由于NBS-LRR基因的快速进化，萝卜的NBS-LRR基因主要以集群形式存在[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］．在48个聚类中，约72%的萝卜NBS-LRR基因被检出，高于萝卜NBS-LRR基因的相应比例gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba(61.7%),gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba（59.4％），和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba(60.3%) (gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．此外，萝卜基因组的簇44中包括11个基因。基因家族可能因多倍化而扩大，串联和局部重复是基因家族扩张的最常见的机制[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．在萝卜中共鉴定了66个nbs编码基因(29.33%)，这些基因经历了串联重复和节段重复，其重复率低于基因的重复率gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba（55.7％），gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba(47.1%)和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba(43.3%) (gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．TN基因主要存在于串联阵列中，并且在串联阵列2中仅检测到三对CN基因（gydF4y2BaRsCn02gydF4y2Ba和gydF4y2BaRsCN03gydF4y2Ba），4（gydF4y2BaRsCN07gydF4y2Ba和gydF4y2BaRsCN08gydF4y2Ba）和8（gydF4y2BaRsCNL11gydF4y2Ba和gydF4y2BaRsCNL12gydF4y2Ba)．有趣的是,gydF4y2BaRsCNL14gydF4y2Ba和gydF4y2BaRsTNL59gydF4y2Ba，属于两个不同的亚群(CNL和TNL)，发生了片段重复。这两个基因位于萝卜基因组的第40组。推测NBS-LRR基因(尤其是TNL亚家族基因)在萝卜基因组中经历了种间和种内复制。因为萝卜和gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba是gydF4y2BaBrassicaceae.gydF4y2Ba我们研究了包含NBS-LRR基因的萝卜基因组中的十字花科块。45个NBS-LRR基因位于U区，分布在不同染色体上(R02、R04、R08)。在R区(24个基因)、D区(23个基因)、E区(23个基因)和F区(17个基因)中基因也相对丰富(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这些观察结果表明gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba基因组结构的产生是由于一个共同的祖先与gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba所有串联重复的基因在同一簇中被发现(即高度相似)，而大多数分段重复的基因不形成簇，位于不同的染色体上。nbs编码基因的串联和节段复制相对较少，这可能有助于解释为什么萝卜进化得比其他十字花科物种慢[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

基因复制被认为是进化的主要力量[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］．重复过程中出现的频繁的序列变异，会导致结构域的结构变异，直接参与蛋白质的功能作用[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］．除了这种扩展之外，变异还导致家庭成员的新功能。KCS基因家族和MADS box基因已出现新功能gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba］．通过对芸薹属家族成员的基因组比较，我们发现许多nbs编码基因发生了结构变异，影响了结构域结构(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S12)。例如，RsNL01在gydF4y2BaA. thaliana, B. rapa，gydF4y2Ba和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba，但外显子数量减少，增加了LRR结构域，失去了TIR结构域gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba．占据了结果，我们可能表明NBS编码基因的这些变化可能导致萝卜进化期间的新功能化或功能丧失。gydF4y2Ba

本研究检测了萝卜TNL和CNL蛋白的保守结构域。在被分析物种中，编码TIR结构域的NBS-LRR基因比编码CC结构域的基因更常见(gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba，gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba)．然而，一些缺失一个或两个结构域的部分nbs编码基因(TIR、CC和LRR)的功能尚不清楚，但它们在各种植物中的存在表明它们是重要的[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在萝卜基因组中，TNL基因的平均外显子数高于CNL基因，有一半的CNL基因只有一个外显子(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．这种基因类型的差异可能是由于CNL基因复制的保守性，涉及许多调控成分。这一结果也与报道的结果一致gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．尽管TN1和CNL基因与病原体识别期间的信号传导和抗性特异性有关，但是这两个亚壳中的基因在序列和相关的信号通路中变化，并且它们根据系统发育分析分别簇[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba］．前人研究表明，TNL类群形成了4个系统发育支系gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba［gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．我们用模因程序分析了不同RsTNL亚家族的基序组成。例如，RsTNL-4子组成员丢失了基序11、12和16，而这些基序存在于RsTNL-1子组成员中。这些差异可能是造成萝卜TNL蛋白功能差异的原因之一。gydF4y2Ba

萝卜是一种重要的根茎蔬菜作物。它的基因组包含三倍的片段，具有中间特征gydF4y2Ba芸苔gydF4y2Baa / c和b基因组，表明萝卜起源于agydF4y2Ba芸苔gydF4y2Ba物种(gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．根据与的比较gydF4y2Ba芸苔gydF4y2BaA (Br)， B (Bn)和C (Bo)基因组，萝卜基因组被定位在gydF4y2Ba芸苔gydF4y2BaA / C和B基因组[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．因此，通过对萝卜NBS-LRR基因的同源性分析，gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba可能导致对编码基因的进化特性以及与其他三种物种的基因的系统发育关系进行新的见解。在目前的研究中，39,73和97对萝卜之间分别鉴定出来的对gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),这意味着gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba有更紧密的联系吗gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba比gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba要么gydF4y2Ba拉伯。gydF4y2Ba

此外，我们还在gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba对应22的基因组gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2BaNBS-encoding基因(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．此外，同源基因对可能在祖先分化之前就已经存在，与NBS-LRR基因家族的进化相关[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba］．此外，我们还比较了两组同源基因对的Ka/Ks值gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba谱系。对于CNL和TNL基因类型，三种物种中的正交基因对没有显着差异（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S11)。我们推测NBS-LRR基因在gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba，gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba可能已暴露于不同的选择压力以发展对同一病原体的遗传性。另外，一些病原体可能是特定的gydF4y2Ba芸苔gydF4y2Ba物种。gydF4y2Ba

在萝卜抗枯萎病研究中，我们从2个抗枯萎病萝卜自交系中分离出68个NBS-RGAs和46个SRLK-RGAs，并利用rga特异性引物分析遗传多样性[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba］．我们还鉴定了一个主要QTL (gydF4y2BaFWR1.gydF4y2Ba)包含gydF4y2BaORF4gydF4y2Ba基因，编码丝氨酸/精氨酸富含蛋白激酶，其可介导枯萎病枯萎病[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba］．为了进一步探索枯萎病的机制，我们通过在感染期间在不同时间点筛选用于抗性'YR4'和易感'YR18'线的转录组数据来筛选NBS-LRR基因的表达（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．共鉴定出75个NBS-LRR基因可能与‘YR4’系抗枯萎病有关，包括gydF4y2BaRsNL07gydF4y2Ba，gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba(染色体R02),gydF4y2BaRSTN17.gydF4y2Ba和gydF4y2BaRSTN18.gydF4y2Ba(染色体R04)和RsN25(支架)，它们在受感染的YR4植株中逐渐表达上调。因此，属于同一簇的基因表达方式相似。通过对‘YR4’和‘YR18’品系接种植株后几个时间点的qRT-PCR分析，验证了基于转录组数据的基因和表达谱(图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．分析的基因中，gydF4y2Barstnl03.gydF4y2Ba和gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba在不同时间点的'YR4'（抗性）中更高度表达（耐yr18'（易感）。的gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs042580gydF4y2Ba)基因与gydF4y2BaAT4G36150gydF4y2Ba在gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2BaBra010552gydF4y2Ba和gydF4y2BaBra011666gydF4y2Ba在gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaBo3g154220gydF4y2Ba和gydF4y2BaBo7g117810gydF4y2Ba在gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba．的gydF4y2BaBra010552gydF4y2Ba该基因编码一个TNL蛋白，是马铃薯根瘤抗性的候选基因之一gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba［gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba］．的gydF4y2Barstnl03.gydF4y2Ba基因，它是gydF4y2BaAT4G16890gydF4y2Ba在gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，可能与依赖水杨酸的早期植物防御反应有关[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．我们的RNA-seq和qRT-PCR数据也表明gydF4y2Barstnl06.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs053740gydF4y2Ba)的表达量在‘YR18’中高于‘YR4’gydF4y2BaFOR59gydF4y2Ba感染，与形态特征一起服用（附加档案gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S13)表明RsTNL06可能是萝卜抗枯萎病的潜在负调控因子。有趣的是,gydF4y2Barstnl06.gydF4y2Ba被确定为ortholog的gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba基因gydF4y2Babo7g106630.gydF4y2Ba，并可能有助于植物对gydF4y2Ba镰刀gydF4y2Ba物种(gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．通过对RNA-seq和qRT-PCR数据的综合分析，鉴定出潜在的抗枯萎病正调控因子和负调控因子，需要对其进行全面的功能表征，以评估其在提高萝卜抗枯萎病方面的作用。gydF4y2Ba

NBS-LRR基因在萝卜植株抗各种病原菌方面具有重要意义。对萝卜基因组进行综合分析，共发现225个NBS编码基因，其中NBS- lrr基因99个，NBS部分基因126个。此外，在被定位到9条染色体上的202个nbs编码基因中，72%位于集群中。另外23个基因位于不同的支架上。NBS-LRR基因的同源性和系统发育关系分析gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba为萝卜NBS-LRR基因的进化特性提供了宝贵的见解。此外，99个完整的NBS-LRR基因被分为两个主要家族(TNL和CNL)， TNL基因又被分为四个具有高度相似的外显子-内含子结构和基序组成的亚群。在本研究中，我们根据转录组数据鉴定了75个NBS-LRR基因，以保护萝卜植株免受枯萎病的侵袭。我们还确定gydF4y2Barstnl03.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs093020gydF4y2Ba),gydF4y2Barstnl09.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs042580gydF4y2Ba)与抵抗有关gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Ba， 然而gydF4y2Barstnl06.gydF4y2Ba（gydF4y2BaRs053740gydF4y2Ba)与萝卜抗枯萎病能力呈负相关。本文提供的系统发育和基因表达数据可能有助于阐明NBS-LRR基因的功能。gydF4y2Ba

nbs编码基因的鉴定gydF4y2Ba

为了鉴定nbs编码基因，我们从萝卜数据库(gydF4y2Bahttp://radish-genome.org/gydF4y2Ba)．我们应用了HMMER(3.3版)程序的hmmsearch [gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba]，基于Pfam NBS (NB-ARC)域对应的HMM (PF00931)，筛选并鉴定萝卜基因组中编码NBS的基因。我们还选择了E值<1e的蛋白质gydF4y2Ba^{−20gydF4y2Ba}使用ClustalW进行序列比对[gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba］．我们用HMMER（3.3版）的HMMBuild模块构建了萝卜特异性NBS HMM，以重新扫描萝卜蛋白质数据库，选择e-value的蛋白质小于0.01以进一步分析[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

含nbs蛋白的n端通常包含TIR和CC结构域，而c端包含RPW8和LRR结构域。我们使用CLC主工作台(版本7.9)[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba]和PFAM（版本32）程序[gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba检测含nbs蛋白的结构域。这些结果得到了NCBI保守域工具的证实[gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba]和MEME（MOTIF ELICITIT的多个表达式图案）[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba］．Paircoil2鉴定了蛋白序列中的CC结构域[gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba， P分界值为0.025。nbs编码基因的基因组gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba(Araport11),gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba（版本1.5），和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba(版本1.1)也使用相同的方法进行识别。的gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba从TAIR数据库下载基因组(gydF4y2Bawww.arabidopsis.orggydF4y2Ba），而且gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba从BRAD网站的数据库下载基因组(gydF4y2Bahttp://brassicadb.org/brad/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

nbs编码基因的多序列比对及系统发育分析gydF4y2Ba

这些分析证实了萝卜基因组中nbs编码的两个主要亚群(TNL和CNL)之间的分离，并阐明了主要分枝上的基因之间的系统发育关系。多个含nbs的完整蛋白序列与MUSCLE比对[gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba)程序。MEGA-X [gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba]程序进行系统发育分析，采用基于Whelan and Goldman模型的最大似然法[gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba］．最后，使用具有500个引导复制的LG模型的最大似然方法来构建系统发育树。用相同的方法构建两个额外的系统发育树。用于分析萝卜中CNL和TNL基因之间的关系，而其他树木用于验证萝卜CNL和TNL基因与相应的相应gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

NBS编码基因的染色体位置，结构和复制事件gydF4y2Ba

使用Mapchart(2.2版)软件将所有已鉴定的nbs编码基因进行映射gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba染色体基于它们的物理位置gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba基因组数据库。在不同的NBS-LRR簇中组织了几种基因，其中至少两个NBS编码基因在200kb区域中定位，并且最多八个非NBS-LRR基因分离[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Pepstats计划(gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstatsgydF4y2Ba）用于计算含NBS的蛋白质的PI和MW。检查每个基因的启动子序列（2000bp上游）每个基因的植物（gydF4y2Bahttp://bioinformatics.psb.ugen.be/webtools/plantcare/html/gydF4y2Ba)来识别顺式元素[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

利用MCScanX的默认参数分析了萝卜基因组中nbs编码基因的串联重复和节段重复[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba]和TBtools [gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba］．基因重复的确认依据如下两个标准:(a)比对的短序列长度为长序列长度的70%;(b)两个对齐序列的相似性为> 70% [gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．使用KaKs计算器(2.0版)计算每个重复事件的非同义(Ka)和同义(Ks)替换[gydF4y2Ba71.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

用模因分析预测的TNL和CNL蛋白[gydF4y2Ba72.gydF4y2Ba，默认的迭代周期和主题的最大数量设置为20。此外，利用TBtools根据基因组和编码序列对TNL和CNL基因的结构进行可视化。gydF4y2Ba

同源基因对之间的分析gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba以及三种十字花科植物gydF4y2Ba

正交基因对于研究不同物种的进化协会是重要的。在这项研究中，我们鉴定了局部原因对gydF4y2Bar .巨大成功gydF4y2Ba和gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba，gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba， 和gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Ba与McScanx程序的基因组。具体地，使用以下参数：E = 1EgydF4y2Ba^{−20gydF4y2Ba}， u = 1, s = 5 [gydF4y2Ba73.gydF4y2Ba］．提取nbs编码的同源基因对，用TBtools制作同源分析图谱。如前所述，来自祖先核型的24个基因组构建块被分配给萝卜基因组[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物的生长和gydF4y2Ba尖孢镰刀菌gydF4y2Ba接种gydF4y2Ba

这2个萝卜植株材料，自交系‘YR4’和‘YR18’，是由Seungho Kim (neoseed Co.， an城市，大韩民国)好心提供的。‘YR4’和‘YR18’是高抗易感品种gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Ba,分别。取样时采用Baik等人改良的蘸根法接种病原菌[gydF4y2Ba74.gydF4y2Ba］．gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Baf . sp。gydF4y2BaraphaningydF4y2Ba其中59项获得了韩国化学技术研究院(大田，韩国)的资助。10日龄的种质幼苗在25°C的对照条件下生长，然后用清水冲洗根部，去除土壤，接种于孢子悬浮液中gydF4y2BaF. oxysporum.gydF4y2Ba分生孢子浓度高。3×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba毫升gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}30分钟。随后，将所有单株秧苗移栽到装有蒸压土的50孔苗盘中。接种后，所有植株在控制室内，80%湿度，25°C无光孵育1天。在湿度60%，温度25°C, 12 h/12 h条件下，在控制室内培养。分别在接种(DAI)后0、1、3、6、9和12 d采集YR4和YR18的单株幼苗。3个个体随后进行RNA分离和qRT-PCR分析。gydF4y2Ba

总RNA提取及基因表达分析gydF4y2Ba

用RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Germany)从‘YR4’和‘YR18’植株中分离总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific, USA)检测RNA的质量和数量。用oligo-(dT)引物和TOPscript™逆转录酶(韩国酶学公司)将纯化的总RNA (2 μg)逆转录为cDNA。使用SYBR Green Supermix和CFX96™Real-Time System (Bio-Rad Company, USA)进行qRT-PCR检测，后续条件为:95°C, 3分钟;39个循环，95°C for 15 s和58°C for 20 s。相对基因表达量按2gydF4y2Ba^{-ΔΔctgydF4y2Ba}方法 [gydF4y2Ba75.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

先前生成的转录组数据gydF4y2BaFOR59gydF4y2Ba- 分析了四个时间点（0,1,3和6次）的“YR4”和“YR18”线（登录号Prjna643982）（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S14）。提前提到植物材料的生长条件，并用于RNA-SEQ的两种生物复制。RNA测序和图书馆准备的简要概述如下。首先使用Ribo Cop RRNA Depletion Kit（Lexologen，Inc.，奥地利）从总RNA中除去RRNA。使用Nebnext Ultra II定向RNA-SEQ-SEQ套件（英国新英格兰Biolabs，Inc.，UK）制备CDNA文库的总RNA。然后，用Agilent 2100生物分析仪（DNA高灵敏度试剂盒）检查文库，以估计通过研讨会实时PCR系统（美国Life Technologies，USA）用文库定量试剂盒定量碎片大小。使用Hiseq X10（Illumina，Inc.，USA）进行高通量配对结束测序。使用TOPHAT软件工具映射总RNA-SEQ读取[gydF4y2Ba76.gydF4y2Ba]获取bam文件(对齐文件)。这些比对文件被用来组装转录本，估计它们的丰度，并用袖扣检测基因的差异表达。我们使用FPKM(每千碱基的外显子每百万片段)方法来确定基因区域的表达水平。基于分位数归一化方法，使用R内EdgeR对FPKM数据进行归一化[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．此外，用TBTOOLS生产热图。gydF4y2Ba

本研究过程中生成和分析的所有数据集均包含在本文及其附加文件中。在目前的研究中生成的RNA-seq数据已经储存并在美国国家生物技术信息中心(NCBI，gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba)存储库的登录号为PRJNA643982。gydF4y2Ba

答:gydF4y2Ba

卷曲螺旋gydF4y2Ba

补偿中子测井:gydF4y2Ba

螺旋状核苷酸结合位点-富亮氨酸重复序列gydF4y2Ba

为gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

尖孢镰刀菌gydF4y2Baf . sp。gydF4y2Baraphanin 59gydF4y2Ba

FPKM:gydF4y2Ba

每百万片碎片每千碱基映射的碎片gydF4y2Ba

唔：gydF4y2Ba

隐藏的马尔可夫模型gydF4y2Ba

NBS-LRR:gydF4y2Ba

核苷酸结合位点 - 亮氨酸富含重复gydF4y2Ba

RPW8:gydF4y2Ba

抗白粉病8gydF4y2Ba

TNL：gydF4y2Ba

Toll/白介素1受体核苷酸结合位点-富亮氨酸重复序列gydF4y2Ba

作者感谢所有编辑和审稿人对本稿提出的意见和建议。gydF4y2Ba

韩国农林科技规划与评价研究院(IPET)金种子项目(213006-05-5-SBO 20, 213006-05-5-SB110);农村振兴厅(RDA)和韩国森林厅(KFS)。这些资助机构在这项研究的设计、收集、分析、解释数据和手稿的写作中没有作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Yinbo Ma和Sushil Satish Chhapekar对这项工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 忠南大学农学与生命科学学院园艺系分子遗传学与基因组学研究室，大田34134gydF4y2Ba

   Yinbo Ma, Sushil Satish Chhapekar, Lu Lu, Sangheon Oh, Sonam Singh, Yong Pyo Lim & Su Ryun ChoigydF4y2Ba

2. 忠南大学农业与生命科学学院作物科学系，大田34134韩国gydF4y2Ba

   (金gydF4y2Ba

3. Neo Seed Co.，256-45 Jingeonjung-Gil，Gongdo-Eup，Anseong，京畿道，17565，大韩民国gydF4y2Ba

   Seungho金gydF4y2Ba

4. 韩国化学工业研究院环保新材料中心，大田，34114，韩国gydF4y2Ba

   Gyung Ja崔gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

SSC，SRC和YPL构思和设计了这项研究。YM进行了实验，生成了数据并写了稿件。SSC执行了数据分析并编写了稿件的草稿。因此，LL，SK，GJC参与表型评估并进行实验。SS和CSK在写作稿件中提供了评论。YPL和SRC作为董事参加，监督了这项研究，纠正和修改了手稿。所有作者都已经阅读并赞成最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba勇的巴西LimgydF4y2Ba要么gydF4y2Ba苏莱文崔gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

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