代谢驯化支持高于耐铝合金杂交克隆的柠檬酸盐和苹果酸的铝诱导的分泌更高桉树

背景

桉树是主要的种植园木材种类，大多在铝制酸性污垢中生长。了解的回应桉树克隆到铝(Al)毒性，耐铝巨桉×尾叶桉克隆GL-9(指定“G9”)和al敏感E. Urophylla.用克隆GL-4(命名为“W4”)研究了根对柠檬酸和苹果酸的产生和分泌。

结果

桉树水培中的幼苗在pH 4.0下暴露于4.4mM Al的存在或不存在24小时。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHM）和阴离子通道阻断苯基乙二醛（PG）探讨有机酸分泌中涉及的可能途径。苹果酸酯和柠檬酸盐的分泌早于G9比W4更大，对应于G9中的较少Al积累。在1小时后达到G9根的Al的浓度，然后随后降低，与苹果酸盐分泌的快速诱导相对应。在G9中的柠檬酸盐流出中约6小时的时间滞后是鲁棒的分泌，以支持连续的Al-排毒。单独的母基分泌物可以缓解Al毒性，因为Al积聚和苹果酸盐分泌的峰同样在W4中，其并未分泌了可观的柠檬酸盐。增强柠檬酸酯合酶（Cs）和磷酸丙酮酸羧化酶（Pepc）的活性，并降低了异柠檬酸脱氢酶（IDH），浅析酶（AcO）和苹果酸酶（Me）的活性与G9中柠檬酸盐的较大分泌密切相关。PG有效地抑制了两者含有柠檬酸的柠檬酸盐和苹果酸盐分泌桉树克隆。CHM还抑制G9中的苹果酸盐和柠檬酸盐分泌，并在W4中分泌柠檬酸盐分泌，但值得注意的是在W4中不影响雄性分泌。

结论

G9立即从根中分泌苹果酸，对铝解毒有初步作用，随后分泌柠檬酸．先前存在的阴离子通道蛋白首先促进苹果酸的分泌，而载体蛋白的合成似乎需要柠檬酸的排泄。有机酸浓度对Al响应的变化可以通过CS和PEPC活性的增强来实现，但也受到其他参与有机酸代谢的酶活性变化的支持。以上信息可能有助于进一步探索铝耐受性相关基因桉树．

物种桉树是典型的速生阔叶树。由于木材的高产量，它们的广泛种植对世界木材市场产生了重要的影响。桉树能自然适应各种环境条件，包括酸性土壤[1，2］.因此，桉树在酸性土壤中建立了种植园，这些土壤广泛分布在热带和亚热带气候区，包括在华南地区。然而，它被广泛认识到al^3＋当土壤pH值低于5.0时，对植物具有根毒作用[3.］.因此，酸性土壤没有减少桉树生产力[2］.

为了减轻铝的毒性，高等植物进化出了多种策略，从外部排斥机制到我联系耐力机制[4，5，6］.铝诱导的有机酸产生被认为是解毒内部和外部的关键公差机制之一[7，8］.Al在根尖的积累通常会通过影响营养物质的吸收和扰乱其他生理过程，在几分钟到几小时内迅速抑制根的生长[9］.几项研究表明了这种种类的桉树对Al毒性具有更高的耐受性，而不是其他树种Quercus栎树，Pinus Radiata.和白千层属灌木cajuputi，甚至可能受益于低浓度的铝[10.，11.，12］.此外,种桉树它们的克隆体对铝的耐受性和对酸性环境中的铝的反应各不相同[12，13，14，15，16，17］.与其他植物一样，来自几种物种或基因型的根部的低分子量有机酸的渗出桉树可能是铝耐受性和允许的重要决定因素桉树在酸性土壤中生长和产量良好[13，18，19］.近年来，无性杂交无性系速生桉树一直是高产种植园库存的主要来源。在铝化酸性土壤中生长的这些优异的杂合克隆的耐种耐受性中有机酸的作用是有限的，需要进一步阐明。

柠檬酸和苹果酸是主要的铝螯合有机酸，给予植物耐受性铝。Al诱导的有机酸类型及其转运途径因植物种类和基因型的不同而不同[20.］.铝活化有机酸的分泌是由被动向外运动的浓度梯度驱动，这需要阴离子通道。在某些作物中，耐铝基因型比敏感基因型更容易诱导有机酸阴离子通道活性[21］.这种快速诱导有机酸分泌主要是由于预先存在的膜局部阴离子通道蛋白质编码almt.（al-活化的苹果酸盐转运蛋白）或伴侣(al活化柠檬酸转运体)基因[22，23］.当铝诱导的有机酸分泌延迟时，参与有机酸分泌的新蛋白可以在数小时内合成[2，24］.Sawaki等人[1]显示在桉树camaldulensis通过柠檬酸转运EcMATE蛋白排泄柠檬酸是一种重要的耐铝机制。然而，还需要进一步研究从根部分泌铝诱导的有机酸，以确定是否有其他关键成分可能影响分泌过程。

参与三羧酸(TCA)循环的低分子量有机酸，如柠檬酸和苹果酸，主要在线粒体中合成。铝的合成与分泌^3＋-诱导的有机酸受到参与有机阴离子(OA)代谢的酶活性的改变和相应基因表达的改变的影响[25，但这些影响因植物种类和基因型而异。大豆中的一种胞质苹果酸酶(ME)GmME1有助于增加内部苹果酸盐和柠檬酸盐浓度及其外排，赋予更高的铝抗性[26］.在苜蓿中，编码柠檬酸合成酶(CS)和苹果酸脱氢酶(MDH)的基因过表达导致柠檬酸和苹果酸的浓度和分泌增加，铝抗性增加[27］.因此，增加与增加苹果酸盐和柠檬酸盐产量相关的酶活性是赋予植物铝耐受性的有效途径。

在之前的研究中，我们确定桉树混合动力大肠茅×E. Urophylla.GL-9(此处指G9)对al的容忍度高于E. Urophylla.GL-4(此处指定W4) [28，29，30.］.Lima等人。［16]报道大肠茅具有较高的铝耐受性E. platyphylla.这是由于当暴露于高铝时，活性氧种类略有增加，应激指标变化较少。我们的结论是大肠茅×E. Urophylla.比谁更宽容E. Urophylla.基于低水平诱导的生理抗氧化指标[29］.基于这些结果，我们推断杂交有助于耐受性大肠茅×E. Urophylla.，并提供了适应整个华南地区发现的酸性土壤的能力。基于先前鉴定分泌的有机酸桉树根(2，13，18，19[我们假设柠檬酸盐将是G9中参与Al解毒的主要有机酸，并且苹果酸可能没有重要作用。除了预期耐普拉的G9中的较高的Cs活性之外，我们还假设与OA代谢相关的其他酶活性的变化将支持柠檬酸盐积累的增加。这种代谢适应将提供进一步的信息，以支持增加宽度的策略eucalyptu.■预计将适用于其他物种。

在根中累积桉树

与Al在24小时的时间过程中用Al治疗造成显着更高的G9和W4基因型的根尖浓度，与不存在Al（图。1)．G9根尖的Al浓度在1 h时达到峰值，随后下降约65%。W4根尖中Al浓度的上升速度快于G9，并持续上升至6 h左右，6 h后略有下降。W4根尖各时间点的Al浓度均高于G9根尖。G9根尖Al积累量较低，说明G9根尖对Al的排斥程度不同桉树这一结果与我们之前对7个月大的土壤中铝积累的研究相似桉树幼苗暴露于Al 4个月。G9的根部，茎和叶子中的Al浓度低于W4 [31］.总之，这些结果表明，G9可以通过在其根际周围螯合Al来具有更大的能力，从根系中螯合Al，从而减少Al吸收。

铝诱导植物根系分泌有机酸桉树

比较了al诱导的不同无性系根系24小时内的苹果酸和柠檬酸分泌(图。2)．每个克隆的根部分泌的苹果酸盐量通常低于非Al处理的对照（CK）和Al处理的植物中分泌的柠檬酸盐的量。克隆G9在AL暴露后的所有时间点在W4具有比W4更高的有机酸分泌。在暴露于Al后，G9中的苹果酸末端达到达到约1小时，然后逐渐降低，但在24小时后，仍然比浓度高于2倍。（图。2一种）。相比之下，在克隆W4中，苹果酸酯的积累达到了在6小时后达到其最大的Al治疗。W4中的最大值仅为G9中的约60％。在Al曝光3小时后激活G9的柠檬酸盐积聚并达到6小时，而W4至24小时的柠檬酸盐积累没有显着变化（图。2b）。这些结果表明，这两个有机酸的分泌机制在耐受性和敏感基因型之间不同桉树．

抑制剂对有机酸分泌的影响桉树铝耐受性比较差的无性系

为了探讨Al处理后柠檬酸盐和苹果酸盐的分泌途径，在24-H Al处理开始时加入阴离子沟道抑制剂苯基甘油（PG）和蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHM）（图。3.)．苯乙二醛完全抑制铝诱导的G9和W4的苹果酸分泌。事实上，PG还抑制了G9中非al诱导的苹果酸分泌，与W4中相同的低背景水平。CHM治疗对G9中苹果酸分泌的影响与PG治疗相似。而CHM对al诱导的W4分泌苹果酸没有影响。CHM抑制了G9和W4中Al诱导的柠檬酸分泌水平，低于没有Al时的柠檬酸分泌水平。

根尖中的有机酸浓度桉树铝耐受性比较差的无性系

在不存在Al的根尖中亚丙酸盐或柠檬酸盐中的内部浓度没有显着差异（图。4)．与对照相比，24小时暴露于Al，G9的柠檬酸盐和苹果酸盐浓度分别增加了约50％和25％。因此，通过累积柠檬酸盐和苹果酸盐将其分泌到Al应激的G9根尖，然后将它们分泌到根部的外部。同时，在暴露于Al时，W4根尖端中苹果酸盐的浓度降低约70％，但对于柠檬酸盐没有观察到变化。PG或ChM的存在显着抑制亚丙酸酯和柠檬酸盐的累积在不存在A1的情况下观察到的水平以下。除了抑制W4中的阳性积累之外，所有情况下，在所有情况下，均诱导的有机酸积累的抑制超过90％，从较低的起始水平抑制亚氨酸亚末积聚。

植物根尖酸代谢酶的活性桉树铝耐受性比较差的无性系

测定了Al和抑制剂对植物根尖磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、MDH、ME、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、乌头酸酶(ACO)和CS的活性。5)．Pepc，MDH和Me是与苹果酸代谢相关的重要酶。在没有Al的情况下，Pepc的活性在G9的根尖中较高，而不是W4。在Al处理后，两个克隆根尖的根尖肽活性有显着增加，但是当在Al处理中包含PG或CHM时，活性低于未处理的对照水平。在G9中，与单独添加Al相比，加入抑制剂导致80％的Pepc活性。MDH和ME活动在G9后，在AL治疗后的含量显着降低，而不是在没有Al治疗的情况下，我的活动是ME中的活动。相反，W4中的MDH的活性已经低于Al处理的G9，不受Al治疗的影响。有趣的是，与单独的Al治疗相比，在添加PG和CHM后，G9中MDH的活性显着增加，而通过添加这些抑制剂，在W4和ME中的MDH中的MDH活性保持不变。

IDH，ACO和CS与柠檬酸代谢密切相关。与非Al治疗相比，暴露于Al的W4根尖中的IDH和ACO活性显着高，而CS活性不变。相反，在Al处理的G9的根尖中，IDH活性不变，ACO活性远低，Cs活性比在不存在Al处理时高2倍。Cs的增加的活性可能是G9中柠檬酸盐的较高累积和分泌的主要原因之一。PG和CHM两者和CHM都没有对AL治疗的G9的根尖的低活性没有影响，但抑制了Cs活性的al诱导的升高，并减轻了AL诱导的ACO活性丧失。在Al治疗的W4根尖中，两种抑制剂废除了IDH和ACO的Al诱导的增加，并将CS活性降低至下方在未处理的对照中。

宽容的桉树杂种无性系增强了苹果酸和柠檬酸的积累和分泌

可用的证据表明，来自根部的有机酸分泌的Al诱导的有机酸的分泌可能导致高等植物中Al的解毒[32，33］.有机酸导致铝耐受性的作用桉树曾被观察到[12，18，19］.在耐铝条件下，根尖Al浓度较低，同时根分泌柠檬酸和苹果酸的量较高大肠茅×E. Urophylla.克隆g9比ac敏感的g9E. Urophylla.克隆W4表明，这两个有机酸的分泌涉及G9中对Al的耐受性增加。这种特征与报告的结果普遍存在大肠camaldulensis［12，18，34］.Tahara等人[12)记录大肠camaldulensis在柠檬酸、草酸、苹果酸和磷酸盐之间，柠檬酸对铝的结合能力最强。因此，铝刺激下柠檬酸的积累和分泌可能是铝解毒的主要机制桉树根系，特别是耐铝基因型。然而，Silva等人[19[提出了Al耐受的假设是由于Al的内部解毒通过与苹果酸酯的络合进行内部解毒。这些相互矛盾的结论留下了苹果酸的作用桉树宽容不清楚。此外，不同类型的有机酸产生和释放对铝的反应可能会有所不同桉树物种(34[批量如此，如此用于亚酸酯和柠檬酸盐。亚耐含有抗杂交克隆G9和Al敏性亲本克隆W4的阳性和柠檬酸盐积聚和分泌的特征提供了鉴定Al诱导的基因或蛋白质的其他线索。

新合成的载体蛋白参与柠檬酸分泌，但苹果酸分泌由预先存在的阴离子通道促进大肠茅×E. Urophylla.

暴露于铝后有机酸的快速释放表明，质膜上已有的阴离子转运体可以迅速启动有机酸的分泌，而不需要产生新的蛋白质;然而，有机酸释放的滞后可能表明需要基因表达和/或蛋白质合成[33，35，36］.G9对苹果酸的分泌没有明显的延迟，滞后超过3小时后，柠檬酸的分泌就会增加。相比之下，在W4中，Al暴露后一个多小时苹果酸分泌才开始明显，而Al暴露没有诱导柠檬酸的产生或分泌。因此，暴露于Al 24 h后，G9对苹果酸和柠檬酸的合成和分泌明显大于W4。

PG和CHM均能显著降低al诱导的根内柠檬酸的分泌和浓度桉树克隆以及G9中的雄性浓度。然而，CHM对W4中的苹果酸盐分泌没有影响，表明存在不同的途径，用于柠檬酸盐和苹果酸盐分泌，响应于两个克隆。通常，耐抗体物种或基因型具有较强的诱导和较高量的根细胞内部细胞内膜和根细胞膜的阴离子通道蛋白质的载体蛋白质，而不是敏感性基因型的血浆膜[37，38］.如果有机酸的合成和运输需要新合成的载体蛋白的参与，那么在分泌前几个小时就会有明显的延迟，而原有的阴离子通道蛋白则会使有机酸更快地分泌出根系[39，40］.因此，在G9中，似乎先前存在的阴离子通道蛋白促进了苹果酸的直接分泌，而在柠檬酸被运输出根部之前，显然必须产生一个新的载体蛋白。阴离子通道蛋白，如ALMT和MATE/AACT，定位于根细胞的质膜，运输其底物，以快速促进有机酸在植物毒性浓度下的释放^3＋［41，42］.此外，已经发现编码OA转运蛋白的许多基因增加OA分泌并参与Al Detoxification [43，44］.Sawaki等人[1]报道了铝诱导的柠檬酸的排泄大肠camaldulensisEcMATE在烟草毛状根中的表达与质膜上的高表达有关，EcMATE在烟草毛状根中的异位表达增强了铝响应性柠檬酸的排泄，这为进一步了解烟草毛状根中铝抗性的分子机制提供了基础桉树以及遗传改善的潜力桉树．然而，其他组分仍然揭示，特别是新的蛋白质编码基因及其在有机酸合成和运输中的功能。例如，在G9中发现的柠檬酸盐分泌的延迟可能是由于需要产生参与合成和递送柠檬酸的新蛋白质。对于W4，柠檬酸盐分泌的变化响应于接触Al，而苹果酸盐分泌延迟，并且没有达到6小时的最大水平。此外，CHM对雄性的分泌没有影响，但确实抑制其积累，表明W4不缺乏释放苹果酸盐的能力，而是受到产生苹果酸盐的能力。

增加有机酸的分泌可能不是提高抗铝性的唯一有效途径桉树．我们推测其他有机物质可能参与了一些铝的解毒桉树基因型。铝耐受性的结果桉树是营养和光合作用的维持[17，45］.从根中提取的一种新的低分子量铝结合配体——酒青素b有助于提高耐铝性大肠camaldulensis［12，46］.此外，还检测到多种化感物质大肠茅根和土壤气相色谱-质谱联用[47，48］.这些化学物质中有许多参与了初级或次级植物代谢和植物防御过程[49］.这些方法可能干扰低分子有机酸的分泌，或者它们的产物可以与Al形成复合物。例如，一项研究发现，酚类化合物可参与在包括木质植物的细胞质中的Al离子中形成强复合物的al解毒。包括大肠viminalis吉尔[50］.此外，转录组分析揭示了类黄酮和苯丙素生物合成途径相关基因在根的响应中起关键作用Cunninghamia lanceolata.(羊)钩。艾尔(51］.所有这些调查结果都促进进一步研究以鉴定赋予杂交克隆的化合物和相关基因的化合物和相关基因桉树，包括由化感化合物和其他根部渗出物所取出的贡献。

杂种无性系中柠檬酸和苹果酸的分泌和积累大肠茅×E.尿源性尿精与CS和Pepc活动的变化密切相关

我们观察到两种克隆根尖的Cs和Pepc活性被Al显着诱导，而我的活性显着降低。在一起，这些变化可能通过将碳骨架进入TCA循环来增加有机酸的生物合成增加[52］.通过各种代谢酶的活性的变化调节合成或丙酸酯的合成或分解代谢之间的平衡，其中包括与这些有机酸的积累有助于增加Al耐受性桉树．另外，在有机酸代谢中直接或间接地引起酶活性的抑制剂（PG和CHM）的添加。

在……的情况下E. Urophylla.在W4克隆中，由于MDH活性不变，ME活性降低可能在Al暴露下苹果酸积累减少中发挥了更大的作用。同时，Al暴露显著增加了ACO和IDH的活性，这可能是柠檬酸没有增加的原因。在E. grandis×e.urophylla克隆G9，苹果酸盐的合成和分泌似乎通过降低ME和MDH活性来支持，以防止雄性代谢。我们推测编码ME的基因可能有助于增加内部苹果酸盐和柠檬酸盐浓度，从而渗出这些有机酸以赋予较高的抗性，如大豆在大豆中26］.CS通常被认为是增加含有耐植物的柠檬酸盐的合成和分泌的主要酶，例如Rye [53]，Paraserianthes facatatia［54]和大豆[55］.此外，紫花苜蓿耐铝品种根尖CS、ALMT和MATE的转录水平高于耐铝品种[27］.但是，ikka等人。［34]发现，铝诱导了枸橼酸根浓度的增加大肠camaldulensis不是由于CS活性的增加，而是依赖于ACO活性的降低，这将抑制柠檬酸分解代谢．最近，Teng等人。［56]报道CS、PEPC和IDH可能在有机酸的生物合成和降解中发挥重要作用桉树。我们的研究表明，柠檬酸合成和分泌的增加有助于增加铝耐受性E. grandis×e.urophylla这可能是通过增加PEPC和CS的活性，降低ACO的活性来实现的。这三种酶可能参与了在暴露于铝的植物根中创造苹果酸和柠檬酸分泌的平衡。

由此可见，调节OA合成和分泌的关键酶在不同的桉树基因型。相应基因表达的改变可影响OA合成和渗出，导致Al耐受性的改变[57］.在植物中，如烟草、苜蓿和油菜中，通过引入编码这些酶的基因来提高PEPC、CS和MDH等酶的表达。这些基因的过表达有望增加有机酸代谢，并可能产生一种新的柠檬酸合成途径，有助于提高转基因植物的铝耐受性[58，59，60］.例如，在转基因水溶花中，CS基因的过表达不仅导致柠檬酸盐合成和渗出，而且还改变了苹果酸代谢，这可能改善对Al毒性的耐受性[57，61，62］.由于以往的研究表明，有机酸的合成可以通过调控参与OA合成的酶编码基因或参与OA分泌的转运体的表达来增加，转基因方法有望在植物中提供更高的铝耐量，包括桉树．

结果表明，柠檬酸盐和苹果酸盐对铝耐受性均有促进作用桉树并且，这些有机酸的积累和分泌均涉及Al解毒。杂交克隆的卓越性能大肠茅×E. Urophylla.铝化酸性土壤的高产与柠檬酸和苹果酸释放能力的增加密切相关。柠檬酸在对Al的反应中起着更重要的作用大肠茅×E. Urophylla.而不是E. Urophylla.．此外，PG和CHM处理表明阴离子通道蛋白和增加的载体蛋白质合成涉及在耐普拉酸中的分泌酸大肠茅×E. Urophylla.，但苹果酸的分泌途径尚不清楚。CS和PEPC活性的增强和IDH、ACO和ME活性的降低导致了al诱导的柠檬酸和苹果酸的积累和分泌，表明代谢适应与al耐量有关大肠茅×E. Urophylla.．需要更多的努力来鉴定和分离与有机酸转运相关的基因桉树，或引入外源基因使特定的酶过表达并具有较高的活性，进一步提高铝的耐受性桉树．同时，可以参与Al解毒的其他化合物也需要进一步调查和阐明其调节机制。

植物材料

两个克隆桉树，宽容大肠茅×E. Urophylla.GL-9（凭证号码：桂S-SC-EGU-023-2011;指定G9）和校友E. Urophylla.GL-4(凭证号码:桂s - sc -欧盟- 022 - 2011;在本研究中使用W4)。两个月大的育苗由中国南宁的广西林业研究所提供。高级工程师兼研究员郭东强正式确认了这两个克隆人(见附加文件)1，2和3.］.将外形和大小相近的幼苗放入含有营养液的2l塑料桶中，每桶10株。所有溶液都用去离子水配制。为了使植株适应水培体系，在铝处理前，将幼苗预培养在pH 5.0的20%营养液中3天，然后在pH 4.5的50%营养液中再培养3天。驯化苗移栽于100% pH 4.0营养液中7 d。100%营养液组成为6mm KNO_3.，5 mm ca（没有_3.）₂，1 mm mgso₄，2毫米NH₄H₂宝₄， 20 μM Fe-EDTA, 31.25 μM H_3.薄_3.，2μmmncl₂，2μmznso₄， 0.5 μM CuSO₄0.065 μM (NH₄）₆莫₇O₂₄．pH用2 mM HCl调节。所有营养液每2天更新一次。更换溶液前，用0.1% (v/v)多菌灵对幼苗进行消毒20 min，抑制微生物。采用气泵在50l空气h的条件下对水培幼苗进行连续曝气⁻¹．

铝和抑制剂治疗

在pH 4.0的完全营养液中培养7天后，将幼苗转移到pH 4.0的2 L新鲜营养液中，添加或不添加4.44 mM铝^3＋间变性大细胞淋巴瘤引起的_3.•6小时₂每个处理3个重复(3 × 10株)。生长液和根系分别在暴露于铝后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h从3个花盆中收获^3＋．在这些时间点测定柠檬酸盐和苹果酸盐的内部浓度，并且它们在生长培养基中的浓度。在Al处理24小时后测定根尖内尖端内尖端内尖端的有机酸代谢酶的活性。

为了鉴定有机酸分泌中涉及的潜在因素，通过在补充有0.5mg L的溶液中培养幼苗，测定蛋白质合成抑制剂CHM的影响和阴离子通道阻断剂PG⁻¹chm和0.5 mg l⁻¹PG与0或4.44毫米铝^3＋24小时。24小时后测定根系柠檬酸盐和苹果酸盐的分泌。

根系分泌物中有机酸的测定

按照Wang等人的方法制备样品。［63，进行了一些修改。收集的水培溶液通过混合纤维膜过滤，得到50 mL滤液。滤液经阳离子交换柱(15 mm × 11 cm, 5 g Amerlite IR-120树脂)，然后经阴离子交换柱(2 g Dowex 1-X8树脂)。结合在阴离子交换柱上的有机酸用2 M HCl洗脱。通过旋转蒸发(R215, Buchi, Switzerland)，洗脱液在40°C冷凝干燥。将干燥后的洗脱液重新溶解于1ml mml - q水中，然后过滤(0.45 μm膜过滤器)。过滤后的溶液采用离子色谱(美国Dionex公司的ICS-5000离子色谱系统，4× 250 mm AS11-HC分析柱和4× 50 mm AS11-HC保护柱)分析柠檬酸和苹果酸。

根尖中苹果酸和柠檬酸的分析

收获的根用mill - q水冲洗，去除水培溶液。按照Dong等人的方法，切除含有根尖的远端2cm提取枸橼酸和苹果酸内浓度[64和Tahara等人[12进行了一些修改。每个样品的总重量为0.2 g，在液氮下研磨，然后加入1.5 mL冰冷的4% HClO (v/v)₄放入粉末，轻轻均质。将混合物在冰上慢慢融化成悬浮液，静置30分钟，然后在20,000×g 4°C离心10分钟。上清液经装满阳离子交换树脂(Amerlite IR-120树脂，H⁺然后通过预处理柱(RP18柱，Dionex, USA)吸收植物色素。根中提取的苹果酸和柠檬酸通过上述ICS测定。

根尖中铝含量的测定

根用mill - q水冲洗三次。取根尖处3cm处，80℃干燥后研磨成细粉。粉状根尖(100 mg)用10 mL HNO消化_3.：HCLO₄(5:1 v/v)直到溶液澄清。用mill - q水将消化液稀释至25 mL，用电感耦合等离子体原子发射光谱法(5100 ICP- OES, Agilent Technologies, USA)立即测定溶液中的铝浓度。

有机酸代谢酶的活性测量

在Al的存在或不存在下培养植物24小时后，测量PePc，MDH，Cs，NADP依赖性IDH，NADP依赖性NADP-ME和ACO的活性。基于Chen等人的方法。［65]和yu等人。［38]，将200 mg新鲜根尖在含有50 mM HEPES-NaOH、pH 7.5、5 mM MgCl的冰冷提取缓冲液中均质₂， 5 mM EDTA, 10% (v/v)甘油，0.1% (v/v) Triton X-100, 1% (w/v) PVPP(交联聚乙烯吡啶烷酮)和5 mM二硫苏糖醇。4°C 15,000×g离心15 min澄清后，上清用于酶活测定。用Jenner等人描述的分光光度法在3ml反应混合物中测定活性[66，陈等人[65和Ikka等人[34］.在340nm处测定所有酶的活性，除了在412nm处测定Cs活性。

数据分析

每种治疗每种治疗都是用三种生物重复的10种植物进行。使用SPSS软件包进行统计分析。使用单向分析与LSD测试的单向分析进行比较不同治疗之间的所有数据，并且使用Duncan测试测定两种治疗方法之间的显着差异P≤0.05。

在当前研究期间使用和分析的数据集可从相应的作者获得合理的请求。

化学加工:

环己酰亚胺

PG：

苯乙醛

CS:

柠檬酸盐合成酶

Pepc：

磷丙酮酸羧化酶

IDH：

NADP-dependent异柠檬酸脱氢酶

华:

顺乌头酸酶

我:

NADP依赖性苹果酶

ALMT：

Al-activated苹果酸转运蛋白

配偶:

柠檬酸Al-activated运输车

柠檬酸:

三羧酸

办公自动化:

有机阴离子

MDH：

苹果酸脱氢酶

CK：

控制检查

AACT:

柠檬酸Aluminum-activated运输车

EDTA:

乙烯二胺四乙酸

辅酶ii:

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸

PVPP:

交联聚乙烯吡咯烷酮

德勤:

Dithiothreitol。

我们感谢广西林业研究所提供克隆桉树本研究中使用的幼苗。

本研究得到了广西特定授予的创新驱动开发项目（AA17204087-6）和中国国家自然科学基金（31070560和31260176）的支持。我们感谢经济支持的基础。资金组织为研究项目提供了财政支持，但没有参与研究，数据收集，数据分析或书面文章的设计。

作者指出

1. 崇拜帕特里克米芬内纳，秦戴，东强郭和美阳同等为这项工作贡献。

从属关系

1. 广西森林生态与保护重点实验室，广西大学林学院，广西南宁，530004

   皖西李，秦戴梅阳

2. 2 .西澳大利亚大学生物科学学院，澳大利亚珀斯6009

   帕特里克·m·芬尼根

3. 2 .广西林业科学研究院，广西南宁530002

   东强郭

贡献

WNL、QD和MY构思并设计了本研究。WNL和QD收集数据，分析数据，编写稿件。GDQ培养的桉树幼苗并辅助测定。我和PMF讨论了结果并修订了稿件。所有作者都阅读并批准了稿件。

相应的作者

对应到梅阳．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这可能被认为是一个潜在的利益冲突。

出版商的注意事项

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

开放获取本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用线中另有说明。如果材料没有包含在文章的创作共用许可证中，而您的预期使用不被法律法规允许或超过允许的使用，您将需要直接获得版权持有人的许可。如欲浏览本许可证的副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．Creative Commons公共领域奉献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

重印和权限