有限肿瘤生长的动力学Pongamia pinnata（L.）（豆科）叶，诱导Aceria pongamiae(壁虱:瘿螨科)

背景

植物上的虫瘿或肿瘤生长是诱导剂(蜱螨、昆虫、微生物和线虫)与植物之间复杂的相互作用的结果。本研究揭示了一种高度寄主特异性的叶螨致瘿习性，Aceria pongamiae,在叶子上Pongamia pinnata导致在叶片的正面和背面产生异常的袋状分枝。每一个叶瘿都是一个高度复杂、不规则的块状结构，其形成往往导致叶片的完全破坏，特别是在严重的叶螨侵害期间，从而对寄主植物的生理和生长产生不利影响。

结果

本研究采用FE-SEM对四种不同生长期虫瘿的组织学切片进行对比观察。除了细胞上皮化生的变化外，在整个瘿的发育过程中，层状面的近轴-近轴极性也发生了显著的变化。4个年龄组的虫瘿在抗氧化能力和元素组成方面均存在显著差异，并揭示了虫瘿形成的ATR-FTIR模式。

结论

这是第一次尝试揭开胆诱导的奥秘由一般的栉水母和由答:pongamiae特别是在它的宿主植物上p.pinnata，通过在螨虫的影响期间在叶子胆形成期间脱光，在螨虫的影响下，目前的研究是被视为植物动物交互系统的模型。

昆虫和植物之间的相互作用分为直接和间接两种，其历史可以追溯到动物的进化[1］．植物胆子或细胞是植物和生物之间的特异性关联的独特产品，如昆虫，螨虫，线虫，微生物等。并且在一般的角度下，类似于异常的生长。这些是反映高度宿主特异性共同演化模式的优秀实例，植物组织的正常发育[2]在寄主植物组织内创造舒适的微环境龛位[3.］．这些异常植物性肿瘤是通过诱导剂对植物组织施加摄食/产卵或其他机械刺激而发育的，以操纵组织编程模式，导致增生和肥大[1，4，5］．叶螨大多具有较高的寄主特异性，特别偏好取食生长在地面以上的植物器官的分生组织和幼嫩软组织，这些组织的营养资源非常丰富。这些螨虫的这种惊人的选择性常常导致对它们的宿主植物产生广泛的无症状或毒性作用，以及从简单到高度复杂的各种症状的发展，如生锈，卷曲，起泡，镀银，铜化，扭曲，坏死病变，芽变形，会阴斑和囊瘿，巫婆扫帚效应，发育不良等[5，6，7，8，9，10.］．

在虫瘿的发育过程中，会发生一系列的解剖和结构变化，从而影响植物器官[2］．瘿在其发育过程中经历了三个主要阶段，即起始(诱导)、生长发育、成熟(分化)和衰老，而瘿的形态结构(形态结构外观)是以组织的排列为基础的[11.］．大多数研究者关注于盲肠形成机制，并解释了植物-寄生虫与寄主植物之间的相互作用。袋状/指状瘿是一种最常见的叶瘿，由叶螨在吸取植物细胞汁液时，将唾液注入到下表皮而引起[5，6］．自由基清除试验解决了半乳糖生成的基本问题，如为什么细胞损伤只在初始阶段观察到，而在衰老阶段没有观察到。活性氧级联系统在初始喂养时间被激活，会改变细胞或组织系统的正常生理活动。在经典概念中，草食动物最初攻击植物后，植物免疫系统被激活并产生几种次级代谢物(特别是酚类化合物)，这些代谢物在抑制ROS级联机制和减少细胞损伤方面发挥着重要作用[6，12.，13.］．

一种高度寄主特异性的植物寄生沙叶螨的致盲肠行为，Aceria pongamiae在寄主植物上诱导囊状/指状叶状或很少叶状叶瘿，Pongamia pinnata(l)皮埃尔(豆科)作为胆汁形成机制的模型系统已在本研究中得到阐明。远,FE-SEM方法尚未应用在发展过程中,大部分的研究集中于专门的描述结构在组织系统中,以及EDAX或EDA(能量色散x射线分析仪)x射线光谱方法广泛用于分析物理材料的元素组成。近年来，ATR-FTIR(衰减全反射-傅里叶变换红外光谱)光谱分析方法在植物分类中得到广泛应用，因为它对植物在非生物或生物胁迫下的官能团特征具有很高的敏感性。在胆发生的研究中，吸收带频率的变化和相对带强度的变化表明了化学结构的变化或胆周围环境的变化[14.，15.，16.］．本研究利用FE-SEM对胆汁形成过程中超微结构的组织学修饰进行了研究。选择的工具，如ATR-FTIR和EDAX，是非常有效的特征微小变化在胆汁形成。目的是通过EDAX法和ATR-FTIR分析胆汁形成的源-库营养特征和功能群差异，同时通过DPPH自由基清除试验和组织化学分析揭示宿主植物的细胞反应。采用DPPH法测定各癌变期细胞坏死与自由基清除能力的关系。在经典概念中，自由基清除分子抑制ROS级联，最终减少细胞坏死。每个数据的结果被非常有效地用来定义不同胆汁阶段的基本属性，并为胆汁的形成提供新的见解。

本研究是二月下旬之间进行至7月，这是最有利的时间答:pongamiae在寄主上诱导胆汁。该植物健康的未被擦伤的叶片，其特征是近轴面比近轴面深绿色。两个表面都有绿色斑块的马赛克图案，没有毛状体(图。1一个)。

叶螨侵害的起始机制主要是叶片背面角叶的形成和光合花叶图案的变形。螨侵害后，背面发育了几条纵向的褶皱线(图。1B)，由于螨的进行性取食活动。这些细胞系起源于不同的地方，并在预先确定的胆孔区中心轴连接在一起，随后形成了胆孔区(图)。1C)，在胆汁的发展过程中。叶螨诱导瘿瘤后2天，叶片近轴面出现小结节状结构。起初，瘿瘤上表面光滑，在瘿瘤发育的第一阶段(1-3天)和第二阶段(10-13天)之间存在一个过渡阶段。在过渡阶段/区域发育一层厚厚的蜡质角质层，在角质层以上发育大而粗壮的毛状毛(图。2f).当叶绿体从下表皮转移到会阴毛时，会阴毛在发育初期是透明的，颜色呈淡绿色。随着胆汁的逐渐老化，会阴毛中的叶绿体数量减少，由于色素的沉积，会阴毛呈现红棕色(图。1f).在组织学和形态学上，可以记录到胆汁的年龄与结构复杂性之间的直接关系。

在胆发育的早期阶段，发现螨虫表现出单向进料方式，通过浓缩在胆的内端子区域，赋予胆汁的外观。在发育的第二阶段（10天的胆发育后），螨虫密度显示逐步增加（图。1e），在不规则方向上显示不同的饲养趋势，从而在胆汁的内部组织组织中的不同形式的改变中达成。因此，静脉形态也从手指改变（图。1d)形成高度复杂和经常不规则的结构(图。1f)。

控制叶

在未被磨伤的叶片中，在叶片的近轴和背面均可见一层排列紧密的表皮细胞。叶片的下表皮具有旁裂型气孔(图。2B)没有毛状体。叶肉由栅栏组织和海绵薄壁组织组成。栅栏状薄壁组织由2层排列紧密的柱状细胞组成，海绵状薄壁组织由4-5层排列松散的大、圆、卵圆形细胞组成，细胞间隙小。海绵状组织中叶绿体的数量比栅栏组织中要少。3.一个)。

组织学

在40-45天内，胆汁完全成熟，成熟期后，没有进一步的组织学组织，因此该胆汁被归类为有限的肿瘤生长。下表皮细胞对诱导物的机械和化学刺激作出反应，启动了胆汁形成的触发机制。随后发现分化良好的叶肉组织转化为未分化的分生组织。在发育的第一阶段(1-3天)，叶肉组织去分化为积极分裂的分生组织(图1)。3.b)。

背面的叶肉组织开始增生性，并在增生性之前经历多次背斜分裂。有丝分裂率最高，形成均匀分布的大量不同形状和大小的薄壁细胞。由于薄壁组织发生了大量的背斜分裂和周周分裂，在叶的近轴面出现了组织的最初隆起，呈现出小结节的形式(瘿是上表皮细胞的实际延伸)。由于在叶片的背面发生了不受控制的细胞增殖，叶绿体减少，同时，叶片的背面表皮出现了向上的推力(图。3.c)。胆汁腔的形成是由超敏区细胞坏死引起的。3.d).随后，观察到单列会阴毛的生长增加，从而覆盖了下轴表皮。

在2^nd发育阶段(约10-13天胆汁)，代表胆汁原基阶段，胆汁的实际生长发育开始。在瘿瘤下部，细胞不断增殖，周周细胞分裂使瘿瘤长度增加，去分化的薄壁细胞垂周细胞分裂使瘿瘤增厚。维管组织是由排列紧密的分生薄壁组织发展而来的。这些维管成分排列成破碎的环状，被排列紧密的薄壁组织细胞所包围(图。3.e).多细胞会阴毛的形成是从排列紧密的薄壁组织细胞的内层开始的，并向胆囊内突出(图。4b)。

在胆汁的开口区域，牙毛毛的大，厚并密集地布置（图。3.e）在那些在内部腔室瘿细窄和松散排列（图3.在这个阶段，发现瘿有一个基部柄(花梗)附着在叶片的正面(叶状状态)和上部厚的球状结构的细胞团块(图。1d).胆室是通过坏死和程序性细胞死亡形成的，这可能导致形成年轻的囊状/指状胆。血管束和厚壁组织细胞是通过增殖的薄壁组织细胞再分化形成的。下表皮和亚表皮细胞转化为腔内组织，叶绿体含量较少。在胆囊周围可见5-7层薄壁细胞，起营养组织的作用。在这个阶段，分裂性分泌腔的形成也开始变得明显(图。5b)。

在成熟阶段（3^rd.阶段，大约25-27天胆），胆原始活动减少了。发现胆汁下部区域的细胞通过垂直分裂连续增殖，并且不同尺寸和结构的新子细胞将附近的细胞推入胆汁的外表皮。在此阶段，胆汁和平行区域的蠕虫分裂减少，并且逆线划分增加。这种类型的细胞分裂中的改变将影响胆开口（窄骨轴开口）和胆腔形成（volument内腔）。发现血管链和血管元素的形成增加，在均匀的营养实质细胞中排列约10-15个血管元素。发现增殖的实质细胞被重新进化到不同尺寸的硬化血管细胞中，并且在分割实质细胞的最外层中不经常分布（图。5随着去分化薄壁组织区域分裂性分泌腔的形成和末端薄壁细胞的垂斜和周壁分裂，胆囊形态发生改变。在这一阶段，虽然少数细胞发生了有限的周分裂，但没有观察到太多的组织学变化。这一阶段胆汁发育的主要变化是孔区会阴毛的增厚(图。4e)，很少是为将胆囊分离成腔室而发育的次级分枝(图。5e).这个阶段的显著特征是维管束和成分增厚，以及胆汁外表皮细胞的叶绿素减少。

4^th衰老初期(40 ~ 43天)，组织发生完全停止。在一些罕见的情况下，细胞通过周细胞分裂产生有限的次级内部分枝。然而，通过有限的背斜分裂，厚维管成分的形成是明显的。胆汁内皮层和外表皮之间的薄壁细胞排列减少，形成一个以上的分裂性分泌腔，内外组织增厚。在这一阶段，叶片正面(上)和背面(下)的极性完全改变，细胞程序性死亡和坏死也开始了。胆汁逐渐死亡和干燥(图。1f)。

组织化学概况

根据不同的初级和次级代谢产物，研究了胆汁组织梯度和源库变化。主要代谢物为还原糖、淀粉和蛋白质，次要代谢物为酚类化合物。酚类化合物的积累可以从2^nd随着胆汁发育阶段的推进，酚类物质积累的主要部位主要在皮下区域的外2-3层。酚类化合物分布于胆营养区内层1-2层，呈不规则分布。成熟初期(25 ~ 27日龄)的虫瘿在薄壁组织的外部和内部都有大量的酚类物质积累。4-6层下皮层酚类物质的积累量最高。在2 ~ 3层的营养层中观察到不规则斑块状的酚类分布。在裂殖发生分泌腔的内皮层区域和沿多细胞会阴毛的侧面可以观察到酚的积累(图。6一个)。初级代谢产物梯度也可以在胆组织的成熟阶段进行跟踪。淀粉颗粒的存在是在叶肉区和内瘿组织层明显。淀粉积累的研究过程中观察到的部位是皮下组织区的2-6层和内营养区的2-3层。淀粉是发现于活跃分裂去分化的薄壁细胞缺席。淀粉体的沉积在血管元件和在包围薄壁细胞被发现。在erineal毛发的根部区域（图中观察到的淀粉均匀分布。6C）。主要观察到还原糖的存在，主要是在副教细胞的主动分割组织中。在外部紧凑地布置的蜂窝区域中可以注意到非常低的还原糖。在2^nd在胆汁发育阶段，还原糖在皮下4-6层及内部营养区积累。从第2期到生长期(25-27日龄)的过渡期间，中间去分化的薄壁组织细胞经历了数次有丝分裂，还原糖从下皮层和营养区转移到高度活跃的增殖区。还原糖积累的主要部位是胆汁内的多细胞会阴毛。6b).在中年胆汁(25-27日龄胆汁)中观察到蛋白质积累，发现蛋白质在整个胆汁组织中沉淀和积累。在中间区域记录了高水平的蛋白质沉淀，其次是内部营养区(图。6d）。

抗氧化能力

在DPPH清除实验中，以维生素C(抗坏血酸)为标准品(阳性对照)及其IC₅₀value being 11.05 μg/ml. The methanolic extracts of the control (uninfested) leaves ofP.pinnata不同发育阶段虫瘿对DPPH自由基的中和作用差异显著。对照叶的抗氧化能力为16.69 μg/ml，不同发育阶段的虫瘿具有一定的抗氧化能力。的集成电路₅₀value of the gall in the initial stage (1–3 days old galls) of development was 15.45 μg/ml and subsequent IC₅₀values were 15.21 μg/ml, 12.81 μg/ml and 10.89 μg/ml respectively for the 2^nd阶段(10-13天的胆汁)，3^rd.虫瘿25 ~ 27日龄^th期(40-43天孕胆)。7)．

然而，抗氧化活性低于阳性对照抗坏血酸（IC₅₀为11.05μg / ml)。对照叶和瘿虫不同发育阶段的抗氧化能力存在显著差异(P.< 0.05)。叶组织的抗氧化能力较对照叶组织高，且随叶龄的增加而增加。因此，胆汁的年龄与其抗氧化能力之间可以建立直接的联系。但在发育的第一和第二阶段，虫瘿的抗氧化能力变化不大。

菲SEM-EDAX分析

EDAX分析结果(补充文件:表3.）与血管束区域（41.86±0.02％）相比，对照叶的非血管束区域显示出最高浓度的碳（43.34±1.64％）。控制叶的血管束区域的平均元素浓度可以描绘为：氧（26.04±0.03％），氮（1.05±0.04％），磷（8.55±0.03％），钾（19.42±0.03％）和钙（0.046±0.010％）。然而，控制叶片组织区域中上述MACRORINRES的浓度可记录为：氧（27.24±0.035％），氮（0.46±0.02％），磷（7.53± 0.03%), Potassium (15.94 ± 0.02%), Calcium (0.34 ± 0.02%) and Magnesium (0.22 ± 0.016%). The major micronutrients considered for the analysis were Iron, Chlorine, Manganese, Zinc, Copper, Boron, Molybdenum and Cobalt. In the control leaf, the non-vascular bundle region showed the absence of Iron and Cobalt while the vascular bundle region showed the absence of four nutrients viz. Iron, Cobalt, Copper and Zinc.

宏的百分比(图。8a）和micro（图。8b）还分析了在不同发展阶段的胆量内和外部区域中存在的营养素，以了解他们的源水槽状态。在胆汁的内部区域观察到大部分元素的较高浓度。铝，硅和硒的浓度显示出相对于胆汁发育阶段变化的变化（图。8C）。移动营养素如氮浓度呈现直接的相关性与胆的年龄经研究结果证实。氮在虫瘿的内部区域中的浓度为初始为低，并将其与胆向上的年龄增加到3^rd.发展阶段。在此阶段后，胆汁内区所有营养物质均呈下降趋势。汞(Hg)在叶片中也有积累，通常汞对草食动物和植物有很高的毒性。对照叶非维管束区浓度为0.50±0.13，维管束区浓度为0.67±0.02。起初，胆汁外区汞含量较高，随着胆汁发育的推进，胆汁外区汞含量降低，胆汁内区汞含量升高，胆汁4期内区汞含量达到2.98±0.023%。4期瘿内区碘含量(4.12±0.02%)明显高于对照叶非维管束区(0.67±0.015%)。

Fe Sem-EDAX元素分析叶胆的各种发育阶段有助于了解元素分布模式（补充档案：表格3.)．对照叶对胆四种不同发育阶段的PCA结果表明元素分布的显着变化。相关性分析（补充文件：表格2）在与对照叶的不同阶段的虫瘿显示显著变化。PCA双标图（图8d）显示出大的积极共差，显示在其他变量之间的线性关系。基于特征值和Scree图，总两个PCA涉及98.26％的方差。该方法解释了每个胆发育阶段之间存在多少相关性。大多数载体（胆汁的不同阶段）显示出高的正相关性，因为除了在第一阶段胆（G1n）的内部区域之外，载体靠近它们之间的小角度。大多数载体发现受PC1的高度影响。从分析中，可以清楚地证实，胆量充当水槽，尤其是内腹区域（在血液生成期间 - 基于PCA矢量角度和相关矩阵的相关性，所指示的组之间的低角度表示为密切相关的群体，角度在组之间增加 - 表示基团之间的异化，大多数用于细胞生长的必要性或移动营养素和用于螨虫（草食虫）的营养素（草食病）之后已经达到了初始胆阶段。然后，在衰老期间，所有移动性和必需营养素的浓度都减少了。

衰减全反射(ATR)分析

在控制叶中，34个主要官能团进行分析,而15官能团被记录在第一阶段开发的苦胆,(1 - 3天gall), 13官能团在第二阶段(10 - 13天gall), 46个官能团在第三阶段(天大gall 25日- 27日)和16个官能团瘿的第四阶段(40-43天大gall)。因此，在胆汁发育的第三阶段可以分析出最多的功能基团(图。9a)(补充文件:Spectrum1，2，3.，4，5和6、表1＆4)．

化学类分析能够记录对照叶中存在的13类化学类，1类中存在的10类化学类^圣五倍子，九化学类中有二^nd虫瘿第3期23类，第4期11类。各阶段均观察到羧酸、醇基、CF3基、芳香族和脂肪族官能团。功能的变化也可能与它们在胆汁区存在的化学成分有关。吸收峰在2849和2916 cm处⁻¹在所有的叶和胆汁中观察到。这些峰表明CH的存在_3., CH₂官能团的振动。通过对这些化合物的鉴定，可以有效地作为化学标记来分析不同发育阶段胆汁的分子变化。3周围的组织^rd.阶段被用于光谱分析，以捕获在3^rd.舞台胆。腹部周围的组织显示出48个官能团的存在。对照叶片对胆汁不同发育阶段的相关矩阵分析显示控制与各种发育阶段之间的正相关性1^圣胆汁期(0.75002)，2^nd子叶瘿瘤(0.76637)，3^rd.期瘿瘤(0.78806)^thstage gall(0.5923)(补充文件:表4)．从表中可以看出，与其他发育阶段相比，第4期虫瘿的变异程度最高。寄生叶螨和未寄生叶螨的光谱在2900 ~ 2910 cm范围内均有两个标记吸收峰⁻¹和2840 - 2850厘米⁻¹．

在20个化学类中官能团分布明显，且各化学类官能团分布差异明显。在脂肪腈或多键氮下观察到7个官能团，在烯烃中观察到6个官能团，在脂肪羧酸中观察到4个官能团，在金属羰基和侧链或取代基化学类中观察到3个官能团。在脂肪酸酐的化学分类下，脂肪硅化合物和脂肪硫化合物分别含有两个官能团和一个官能团，在芳香氨基酸、脂肪胺、脂肪氨基酸、脂肪羧酸盐、芳香或共轭酮、脂肪酰胺、脂肪醚、芳香族或共轭羧酸、有机卤化物、脂肪族硫化合物、脂肪族硫化合物、脂肪族卤化合物。

对照叶主成分分析结果显示，对照叶各发育阶段的功能群分布存在显著差异。不同龄期与对照叶片的相关分析也存在显著差异。PCA双标图（图9B)显示出很大的正协方差，显示出其他变量之间的线性关系。基于特征值和Scree图，共选择了两个主成分分析，方差覆盖98.93%。在瘿瘤形成过程中，下表皮的化学性质发生了完全改变，对照叶功能群的表达与瘿瘤完全不同。由于生物的高度应激，正常功能群的表达完全改变，应激功能群得以表达。在前三个阶段，功能基团只有轻微的变化，在最后一个阶段(4^th在主成分分析(PCA)图中可以看出，与对照组相比有很大的差异。9b)谱官能团分析支持生物胁迫完全改变官能团分子结构和功能的分布和表达的假设。

瘿象其他常规植物器官一样，有其自身的组织学和生理学特征[5，17.］．宿主和诱导剂之间保持了高度的特异性[18.]，因此，胆形态发生是高度保守的，因此是在胆谱系和细胞命运[的研究有用1］．第一刺激螨虫螨虫螨的实际性质目前未知，但细胞增殖已被几个作者以不同方式评估[12.，13.，19.］．激素和代谢物分析的结果清楚地揭示了在胆汁发育的初始阶段，在胆汁组织中存在着酚类积累[20.］．酚富细胞会抑制/阻断IAA氧化酶的作用，从而导致在生长素的局部浓度增加。在IAA的积累会导致细胞肥大。从诱导初始刺激会引发活性氧物质（ROS）级联事件和信令导致酚醛积累和顺序的分子事件，其被认为诱导胆形态[所述ROS21］．

以往的研究主要集中在成熟的中年瘿的解剖分析上，而本次的研究重点是分析瘿的不同发育阶段。观察发现，虫瘿在40 ~ 45天内发育完成，本研究根据形态学、解剖学和会阴颜色的变化对不同发育阶段的虫瘿进行了选择和分类。在叶螨瘿发育初期(1-3天)，叶螨的下表皮接受了来自唾液的化学信使，这些化学信使改变了叶螨正常的组织结构。化学信使作用于底层叶肉组织，随后分化良好的栅栏和海绵薄壁组织发生再分化，导致去分化薄壁细胞不受控制地增殖[12.，20.，21，22］．起初，观察肥大和增生情况。这些结果与之前有关叶瘿病的研究结果一致Fragariocoptes setiger在草莓属冬青［5］．组织化学研究结果记录了生长阶段(25 - 27天)高度活跃的组织重组。主要的胆组织由增殖的去分化实质细胞组成[21］．肥厚和增生组织中含有多种营养物质和代谢物。在没有完美组织组织的情况下，可以发现异常的细胞组织[5，21］．

通过对叶瘿的组织学重编程研究，揭示了叶瘿不同发育阶段的解剖学和形态学特征以及叶瘿器官发生的模式。胆汁发育的形态发生模式表现出不同程度的调控A.pongamiae，表明胆囊实际上代表了有限的肿瘤生长。叶片解剖特征显示出与对照叶片不同的差异[7，21，23］．伤叶与地部组织间无明显分化，伤叶中只有大量的去分化的叶肉组织。而在未伤叶中观察到完整的地部组织和维管束分布模式。最初由。引起的解剖改变A.pongamiae都被仔细研究过[24］．在吸吮细胞SAP的同时被纤巧螨分泌的唾液植物毒素诱导解剖学和形态学差异，导致胆形成[6，8，10.，11.，25］．

本研究对不同发育阶段虫瘿的抗氧化能力进行了评价，并与对照叶片进行了比较。在瘿茎发育初期(1-3日龄)，其抗氧化能力较对照叶片高，表明存在酚类化合物等抗氧化基团。酚类化合物的积累和初始ROS信号机制调控IAA氧化酶活性。阻断IAA氧化酶活性将有助于增加目标组织中生长素的局部积累，从而增强组织的去分化[20.，26］．去分化组织发生肥大和增生。仅在初始阶段，组织发生了持续的增殖，但在发育的第二阶段，通过抗氧化剂的评价，ROS的高水平级联表达的信号机制是明显的。第1期和第2期胆汁甲醇提取物的抗氧化活性略有差异。细胞坏死开始于第2阶段(10-13天)，因为活性氧级联反应活性高，抗氧化能力强^nd期胆汁为IC₅₀值为15.21μg/ ml，对照叶的值显示出显着的变化（16.69μg/ ml）。ROS的连续级联作用可能导致过敏反应（因为低水平的自由基清除活性）和随后对细胞坏死[10.，20.，26，27，28，29］．

在2之后^nd在生长发育阶段，胆汁的抗氧化能力表现出高水平，说明高浓度的酚类物质积累，可以防止ROS胁迫，抑制细胞坏死率。在发育的第三阶段，胆汁的抗氧化能力最高，为12.81 μg/ml₅₀与阳性对照抗坏血酸(11.05 μg/ml)相似。在发展的最后阶段^th40 ~ 43日龄胆汁)，最高ROS抑制能力(10.89 μg/ml)， IC₅₀抗坏血酸阳性对照检出率高于阴性对照。最后阶段的胆汁是具有次生代谢物积累的衰老阶段，并抑制ROS级联系统，后者可直接响应IAA氧化。IAA氧化抑制了细胞增殖和细胞脱分化。酚类物质实际上是植物产生的次生代谢产物，是植物对食草性植物的防御化合物。酚类化合物的氧化还原性质在抑制脂肪加氧酶、螯合过渡金属和清除自由基等方面发挥着重要作用[28，30.］．酚类化合物可以作为有效的氢供体，因此具有良好的抗氧化能力。叶瘿中总酚的浓度p . pinnata引起的答:pongamiae显示对照与中年成熟叶瘿之间有显著的统计学差异[24，30.］．我们得出结论，在取食期间(螨侵)，初始自由基产生量高，酚含量低，因此在组织系统中存在细胞损伤的风险，而一段时间后(瘿螨3 .^rd.阶段)，宿主被认为受到草食动物的攻击，植物产生次级代谢产物(以酚类化合物为主)，这些代谢产物清除自由基，直接抑制ROS级联机制。因此，在最后阶段，受侵害地区的酚类物质积累量高，可以避免食草动物的进一步取食和细胞损伤，也可以避免ROS级联机制[30.］．对不同发育阶段虫瘿抗氧化能力的研究结果表明，极性提取物(甲醇)中酚类和黄酮含量较高，因此提取物也具有较高的抗氧化能力。因此，这是一个明确的证据，极性酚是自由基清除活性的基础，如前所述[14.对其抗氧化活性的观察可为民族植物学研究提供参考。

在本研究期间，考虑了21种元素进行详细分析，并发现其分布在胆组织的内部和外部区域以及对照叶的血管束和非血管束区域中。其中C，N，O，P，Hg，I，Cl，K，Ca和Mn显示出胆胆发育的第3阶段的正相关。一些金属如Fe，Co，Cu，Zn，Na，Mg，Se和A1显示出不规则的分布图案。这些数据有助于了解胆子内部区域的营养状态及其功能。在初始阶段，在外腹区域中发现N，O，K和Mn的浓度。开发的初始阶段，是活跃增殖的时间，需要需要更多的营养素来支持正常细胞周期，因此这可能是高浓度的流动营养素的原因（n，p，k，mg，cl，zn在外部腹部的研究期间观察到胆汁发育初始阶段和Mo）。然而，当胆达到第二阶段的发展时，发现移动营养物被从外部区域移动到内部区域，直到胆发育的第3阶段。2^nd到3^rd.胆汁的各个阶段被认为是高度活跃的阶段，因为这些阶段表明在内部区域存在更多的营养物质，与胆汁的初始阶段相比，它们的流动营养浓度被发现降低。元素络合物分析的结果能够清楚地记录胆汁源汇状态的变化[19.，20.，31］．观察到正常和受损叶片组织的宏观和微量营养成分发生了显著变化[19.］．以前没有研究测量盲肠形成的营养概况，并确定其重要性。与虫瘿相似，螨虫瘿通常只在生长的初始阶段作为一个库，在到达衰老阶段时养分流减少了。Hg(汞)在衰老阶段浓度较高，对植物和草食动物有害的汞积累较多。后3^rd.阶段，螨馈送减少，螨到新叶场移动。汞沉积改变细胞通透性，除去精油和也影响光合作用的光与暗反应[32］．组织化学分析报告了光合色素的不合理分布(图。6d），HG积累是胆量光合活性减少的主要因素[10.，13.，30.，32］．不仅Hg、碘(I)也增加了在瘿的衰老阶段,碘为陆地植物通常是没有必要的,实际上碘增长起着至关重要的作用,抗氧化活性和抗压力响应宿主植物和碘与矿物元素可以是协同或拮抗33］．需要进一步的分析来回答在胆汁衰老阶段所选元素积累的确切原因。

未受螨害和受螨害的叶片表面都存在许多有机化合物，这些化合物产生了复杂的光谱，显示出许多不同强度范围的吸收带。在目前的水平上，理解所有的光谱峰和它们对应的特定类化合物是不可能的。但对其主要光谱峰变化进行了研究并进行了相应的官能团分析，对照和不同发育阶段的胆汁红外光谱分析显示出一些独特的光谱吸收峰。未受虫卵和不同发育阶段的虫瘿也有低强度吸收峰形成。因为吸收范围在1650 ~ 1500 cm之间⁻¹是生理压力的指标[16.，有助于了解标记区域功能基团发生的变化，并可用于分子标记。每个发育阶段都有特定的红外光谱谱图，表明其细胞信号机制，通常与细胞或组织的生理反应相关。这是首次尝试使用ATR-FTIR技术来描述胆汁发育过程中生物和非生物胁迫对细胞的微小影响，需要进一步的研究来解决在每个发育阶段确定的功能基团的功能特性。生物光谱技术是非侵入性光学组织诊断的重要工具，它被用于检测各种病理状态[16.］．对有蚀叶和无蚀叶进行ATR分析是一种新颖的分析方法。目前，ATR技术被广泛用于跟踪分子变化，因此在本研究中，它有助于了解胆汁发育不同阶段功能基团的水平和变化。这些结果可用于进一步的分子基因组水平的胆汁表达。

考虑到植物的经济效益以及瘿螨与寄主植物之间高度复杂的相互作用，答:pongamiae和它的主人p . pinnata(l)本研究通过对胆汁形态学、组织学、组织化学、抗氧化性能、元素分析和振动生物光谱分析等方面的广泛研究，分析了胆汁形成的序列和过程。该研究在2018年3月至6月期间进行，考虑到野外条件下可以容易获得足够数量的螨，这是最有利的瘿螨诱导期和螨群积累高峰期。在不利季节，螨虫躲藏在树皮和节间区域，随着有利季节的到来，螨虫从树皮缝隙/树皮下/芽间区域迁移至幼叶，吸收植物汁液/形成孤立的生态位/盲肠。随后,这些螨虫会找到一个合适的地点在叶身gall感应,当植物吸收sap叶身的侧表面,他们注入唾液的叶子和轴外的表皮注入唾液将发挥十分重要的作用,引发虫瘿的发展(5，20.，25，34］．因此，螨虫将触发细胞/分子/基因组机制的gallogenesis。胆汁的发育包括三个主要阶段，即起始、生长和成熟[5，20.］．每个和每一阶段的胆发育在具有特殊的特征结构组织时都是独一无二的。

胆囊的发育在40-45天内完成，因此应认为胆囊是有限的肿瘤生长。超微结构组织学研究数据显示，盲肠形成的各个阶段都有细胞转化，从组织学上看，最初24-48小时的胆汁发育是盲肠形成的关键步骤，在初始阶段出现了突然的振动变化。源汇元素分析差异显著;这是首次尝试揭示21种元素的存在，遵循盲肠菌源汇分布模式。45天后，螨虫完全停止捕食活动，从成熟的虫瘿中爬出，寻找寄主植物的新叶，在寄主上建立新的虫瘿/分离生态位。一旦发现适合新虫瘿生长的区域，就会再次开始盲肠形成的过程。本研究从胆汁形成的经典方面进行研究，并对其进行连续的比较研究，将有助于胆汁学分支的发展，以及理解胆汁的生态学和进化。

作品的局限性

p . pinnata叶瘿是一种有限的肿瘤生长类型，因为在叶瘿组织中发现了异常的肿瘤细胞，它们的生长在40-45天内完成。本研究选取了叶瘿1 ~ 3日龄、2 ~ 13日龄、3 ~ 27日龄、4 ~ 40 ~ 43日龄4个不同的生长期。如果类群选择错误，所有的结果都将是错误的，因为组织学、组织化学特征、营养特征、源库状态、抗氧化活性等都与胆龄和叶龄相关。分组的虫瘿只使用形态学方法(胆)的形状和大小是非常困难的,因为胆量大小和形状与人口密度直接相关的螨虫和喂养活动以及叶子的年龄(年轻、中年、成熟叶)。在这项研究中，胆汁年龄的选择是基于形状(结构复杂性)，外部蜡质角质层增厚与表皮毛结构，内部的组织学安排，色素沉积在内部组织和拥有会阴毛的存在和数量。大多数胆囊的选择标准取决于一个人的经验;如果对胆汁的形态、组织学、色素特征不了解，很难确定胆汁的年龄。为了解决这些问题(不同虫瘿阶段的选择或分组)，我们提出了一种新的方法，即ATR-FTIR分析，红外分析是一种高灵敏度和廉价的方法，基于该方法可以确定虫瘿的年龄。在未来的研究中，基因组表达谱及其变异可作为评估胆汁年龄的重要工具。另一个重要的问题是各阶段胆汁的抗氧化活性分析，本研究仅报道了各阶段胆汁清除DPPH自由基的作用。 This analysis only provides a rough overview of the antioxidative efficacy of each stages of the gall. Based on this analysis, one thing we can confirm is that each stage has a specific antioxidative profile which is directly correlated with the metabolites present at each stage of the gall. More antioxidant activity assays (such as FRAP, ABTS, etc.) needed to understand the actual antioxidant activity of each stage of the gall. Because each stage of the gall contained a wide variety of antioxidant compounds, each of the antioxidant molecule displayed a different degree of free-radical scavenging activity. Use of different antioxidant assay would help to understand the antioxidant efficacy of each stage of the gall, which will help to explain the hypersensitive and oxidative response of the gall.

胆汁标本的收集和制备

在本研究过程中，剥落叶和未剥落叶(N = 30) were collected randomly from different branches ofp . pinnata印度喀拉拉邦Malappuram (Dt.)卡利卡特大学校园生长的L.树(植物标本鉴定由卡利卡特大学植物系助理教授A. K. Pradeep博士完成)。收集的样本被放入聚乙烯袋，密封后带回实验室进行后续研究。用锋利的刀片切开虫瘿，在Labovision KS z0850立体变焦显微镜下观察螨的数量。寄生动物、掠食者或致病性感染等的胆汁被完全丢弃，不考虑用于后续分析。

不同发育阶段虫瘿的选择

由于叶瘿的诱导答:pongamiae在40-45天内达到成熟期(没有进一步发育)，本研究选择的虫瘿被分为四大类[5，35］．第一阶段类别由诱导初始阶段的胆量组成，代表1-3天（1-2毫米）;第二阶段类别包括10-13天的旧胆（3-6毫米长）;第三阶段类别被分配到25-27天内（长度为0.8-1厘米）;并且在40-43天（1-1.5厘米长）中含有胆量（1-1.5厘米）作为第四阶段/成熟阶段类别。以上选择的发展阶段不仅基于肛门尺寸而完成，而且还采用了各种其他因素，也是如它们的形状（结构复杂性），外蜡状细胞增厚，具有表皮头发结构，内部组织学布置和颜料的存在和量在内胆组织中沉积并拥有仇恨毛发。

用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)对叶瘿进行组织学分析

本研究进行了组织学分析，以了解叶瘿细胞/组织水平的组织模式p . pinnata引起的答:pongamiae．在分析中考虑了分析的不同阶段的新鲜阶段的新鲜收集的胆量。使用锋利的刀片制造未凝聚的叶片的手工横向和薄膜，以及不同阶段的疾病（N= 30)。材料在2.5%戊二醛中固定0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 1小时。固定后，用70、80、90、100%的丙酮系列脱水，各保鲜约30 min。脱水后的样品在25℃的培养箱中干燥过夜^°C。

能量色散x射线光谱(EDAX)元素分析

考虑到源库地位对确定胆汁发育的重要性，不同发育阶段胆汁的元素复合物分析(N = 6) was carried out by using FE-SEM EDAX. Elemental analysis was performed using a ZEISS Gemini 300 FE-SEM, Germany. In total, 21 elements present in the gall samples were considered for analysis using EDAX. In the control leaves, elemental analysis was made based on vascular bundle and non-vascular tissue regions. But in the galls, owing to lack of perfect tissue organization, elemental analysis was done mainly based on the inner and outer regions of the galls.

组织化学特征

手工制作不同发育阶段的虫瘿薄片，并进行组织化学分析(N= 30)。根据Johansen [8］．还原糖和蛋白质的检测根据Sass [36]及资助人[37分别)。

未伤叶和伤叶不同发育阶段抗氧化能力的测定

采集不同发育阶段的叶瘿和未伤叶p . pinnata用蒸馏水彻底清洗树木，去除螨虫和杂物。清洁后的样本用消毒过的锋利刀片切成小块，在一个覆盖棉花层的容器中室温干燥10-15天。然后将干燥的样品在机械研磨机(混合研磨机)中磨成粉末，以促进溶剂和样品之间的有效接触。

以Anjali Soni [38，稍加改变(在20°C下，以120转/分的转速在旋转摇床中连续摇48小时)。粗提物保存在密封的小瓶中，放在冰箱中，用于后续体外抗氧化DPPH自由基清除试验，采用Blois [39］．DPPH自由基清除试验是评价植物提取物抗氧化能力的一般方法。一般用IC表示₅₀，（将DPPH初始浓度降低50％所需的抗氧化剂的量）。抗氧化活性和IC₅₀值呈负相关，IC越高₅₀值表示抗氧化能力较低，反之亦然[38］．进行了三种独立的测定，并根据公式计算不同浓度的提取物和对照的抑制率(I%) [38]下面;集成电路₅₀通过使用probit回归分析计算，这表明需要多少提取物来清除或抑制50%的自由基。

振动生物频谱分析 - ATR-FTIR分析

随机采集新鲜控制（ungalled）和擦伤的叶样品进行分析ATR以下卢斯[方法15.略作修改。叶背/叶下表面是螨的首选侵害部位，对其进行红外测量。将叶片直接与装有Jasco ATR Pro One附件的FTIR 4600的ZnSe/Diamond晶体接触。所有样品放置在相同的位置，以确保与晶体的最佳接触，使用仪器的标准压紧机构，对所有样品保持恒定的压力。对每个样品进行三次光谱读取，以避免噪声吸收峰，并使用平均光谱细节进行后期分析。光谱采集范围在4000 ~ 400厘米⁻¹距离(波数)，分辨率为4厘米⁻¹每个样本总共有25次扫描，有3个副本。

每个光谱的预处理和功能群分析

预处理主要是去噪、倾斜基线校正和归一化。使用BioRad实验室Know It All (R) 2018信息学软件对原始数据进行预处理。功能组分析使用iranalysis - ramalyze Labcognitia laboratory Ltd.生物信息学软件和BioRad laboratory KnowItAll(R) 2018信息学软件。将预处理后的各组光谱峰进行主成分分析，了解各组之间的关系。

统计分析

采用单因素方差分析(one-way ANOVA)， Tukey’s Multiple range test和probit-回归分析(probit-regression analysis)进行统计分析，统计软件包SPSS 20.0，数据以均数±SD表示。利用Origin V2018b软件进行主成分分析和相关矩阵分析。

研究过程中产生或分析的大部分数据都包含在本文及其补充文件中。

红外光谱:

红外线的

edax或eda：

能量色散x射线分析仪

主成分分析:

主成分分析

个人电脑：

主成分

ATR:

减弱总反射率

FTIR：

傅里叶变换红外光谱学

IAA：

Indole-3-acetic酸

ROS:

活性氧

FE-SEM:

场发射扫描电子显微镜

作者承认CSIF（中央复杂仪器设施 - CALICUT大学校园）为提供FE-SEM设施，也很感谢卡卢特大学动物学和化学系，为提供实验室设施。第一个作者感谢A.K.的博士。PRADEEP，ASST。卡卢特大学植物学系教授，用于鉴定植物标本。

不适用。

从属关系

1. 喀拉拉姆大学喀拉图州，喀拉拉邦，673 635，喀拉拉姆大学动物学系

   p·p·阿南德和n·拉马尼

贡献

构思和设计实验:PPA。进行实验:PPA。分析数据:PPA和NR。撰写主要稿件:PPA。监督:NR.所有作者对手稿进行了修改和批准。

相应的作者

对应到P. P.阿南德或N. Ramani.．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

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