调查的作用GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba对猕猴桃的反应GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba感染GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

阐明猕猴桃对灰霉病造成的抗脂菌的调节机制GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba可为其分子育种提供依据，提高对该病的抗病能力。本研究以“红阳”猕猴桃为实验材料;TOPLESS/TOPLESS- related (TPL/TPR)共抑制基因GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba被克隆到ptrv2矢量（GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV)和病毒诱导的基因沉默技术建立其功能GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba基因在Kiwifruit抗性GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

病毒引起的沉默GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba增强了猕猴桃对GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba．防御酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和内源植物激素如吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)等GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba），检测脱落酸（ABA）和水杨酸（SA）。Kiwifruit响应于病原体诱导的应力和损伤而活化这些酶和内源性植物激素。IAA信号基因的表达水平 -GydF4y2Baacnit.GydF4y2Ba那GydF4y2BaAcarf1.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Baacarf2GydF4y2Ba-在更高的GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV处理组比对照组有显著性差异。IAA水平较高，表型较严重GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-trv kiwifruits比控制在一起。这些结果表明GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba下调IAA和IAA信号基因的表达，加速猕猴桃采后衰老。更远，GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba显着上调GydF4y2BaActpr2，GydF4y2Ba表明这一点GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba通过下调IAA和IAA信号基因，增强猕猴桃对病原体的防御能力。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究结果有助于阐明猕猴桃抗病调控机制，为猕猴桃抗病分子育种提供遗传资源。GydF4y2Ba

奇异果 （GydF4y2Ba猕猴桃对GydF4y2BaL.)易受真菌病原体感染，导致收获后的作物遭受重大损失，并可能使水果对消费者不安全。GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba（GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba）是一种对灰霉模具负责的真菌病原体。它会损坏或破坏≤30％的猕猴桃作物[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．为了培育抗病灰霉病的猕猴桃，首先必须阐明植物对灰霉病反应的调控机制。目前对灰霉防治的研究主要集中在物理、化学和某些生物防治上[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．然而，与猕猴桃抗病基因相关的调控和信号通路尚不清楚。GydF4y2Ba

裸照/裸照相关的成员（TPL / TPR）共压制蛋白家族与转录因子相互作用[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．TPL / TPR结构域包括高度保守的N末端TPD区域，包括易育同源（LISH）二聚化基序，C-末端到LISH（CTLH）基序和C末端WD40重复[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．TOPLESS结构域(TPDs)介导TPL/TPR齐聚，并与含有EAR基序的蛋白质相互作用[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．大多数EAR基序在调节植物激素(如生长素、脱落酸、赤霉素、水杨酸、乙烯和茉莉酸)信号通路转录的蛋白质中被检测到[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

首次报道TPL/TPR共抑制子与WUS (WUSCHEL)转录因子直接相互作用GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．TPL / TPR共同阻遏家庭成员，TPL和TPR4与WUS相互作用。五个TPL / TPR家族基因包括GydF4y2BaTPLGydF4y2Ba和GydF4y2BaTPR1-TPR4GydF4y2Ba被发现了GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]．TPL / TPR共同阻遏物在植物生长和发展中起重要作用[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]．有缺陷的GydF4y2BaTPL.GydF4y2Ba尽管如此，突变允许正常的胚胎发育GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．因此，TPL蛋白质功能是多余的，可以用另外四种同源蛋白代替。什么时候GydF4y2BaTPL.GydF4y2Ba/GydF4y2Batpr1 / tpr3GydF4y2Ba/GydF4y2Batpr4GydF4y2Ba用TPR2蛋白RNAi转化四重突变系，发生胚胎发育异常。因此,GydF4y2BaTPL.GydF4y2Ba是多重的主要负突变GydF4y2BaTPLGydF4y2Ba- 相关蛋白[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

IAA代谢相关基因的过度表达GydF4y2BaOsGH3.1GydF4y2Ba和GydF4y2BaOSCY71Z2.GydF4y2Ba显着提高了耐水稻对细菌枯萎的影响GydF4y2BaXanthomonas oryzae.GydF4y2Bapv。GydF4y2Baoryzae.GydF4y2Ba．因此，IAA信号通路参与植物防御[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．TPL/TPR与参与生长素信号转导的转录复合物相互作用。生长素诱导形成三元抑制因子-植物激素-E3连接酶复合物，进而导致E3连接酶催化的抑制因子蛋白泛素化和降解，上调植物激素靶基因[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．介质介导的TIR1（传输抑制剂响应1）E3泛素连接酶结合导致奥克斯/ IAA阻遏蛋白的泛素化和蛋白水解。在低养型水平下，IAA阻遏物募集TPL / TPR到养蛋响应因子（ARF）以防止ARF的表达及其靶基因[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

蛋白质组学分析表明GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba在猕猴桃中是高度上调的GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba感染(GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]．在这里，我们使用“宏阳”猕猴桃品种作为实验材料。我们克隆了GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba并使用病毒诱导的基因沉默（Vigs）技术来建立角色GydF4y2BaTPR2.GydF4y2Ba在猕猴桃抗性GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba．我们还进行了表达分析，以调查可能的相互作用GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba和IAA信号基因。本研究结果有助于阐明猕猴桃抗病机理，为猕猴桃抗病分子育种提供遗传资源。GydF4y2Ba

的建设GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-trv2矢量GydF4y2Ba

克隆沉默片段，其序列与参考的序列相同GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba（ACH25G228601.2-TA，GydF4y2Bahttp://kiwifruitgenome.org/GydF4y2Ba）.一个GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba通过引入446-BP来产生-tRv2构建体GydF4y2BaXbaGydF4y2Ba我/GydF4y2BaBamGydF4y2Ba在ptrv2向量中，将DNA片段分段（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaA和B）。PCR检测承载的抗性菌落GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV2构建，以确认沉默片段成功连接到pTRV2载体上(图)。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

Actpr2.GydF4y2Ba表达大大减少了GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV果实GydF4y2Ba

农杆菌GV3101窝藏GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV2表达载体(GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba和富),消毒ddHGydF4y2Ba_2GydF4y2Bao（wt）和载体ptrv1-2（trv）通过瞬态注射转变为'hongyang'kiwifruit。GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba测量所有三组的表达。GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba水平明显下调GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-注射后6天的trv果实。相比之下，没有显著的差异GydF4y2BaActpr2.GydF4y2BaWT和TRV组之间的表达（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

病毒引起的沉默GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba增强了Kiwifruit易感性GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba

Actpr2.GydF4y2Ba比较表达GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV和控制后kiwifruitGydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba感染GydF4y2Ba．GydF4y2Ba这GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba接种后第4天(dpi)感染水平最高，WT、TRV空载体感染时间延长GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-trv水果。这GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba这些治疗中的水平将比在1 dpi的对照中高度高。然而GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba水平GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV比1 dpi时低2倍(图1)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

病变领域GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-Silenced Kiwifruit大于对照组的基础。此外，注射部位更容易腐烂GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba- 他们在控制中的kiwifruit。在5 dpi，病变区域GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV果实几乎是WT和TRV载体果实的三倍大GydF4y2Ba．GydF4y2Ba这GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba负荷也明显高于GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV在4 dpi和5 dpi时显著高于对照。因此，病毒诱导的沉默GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba增强了Kiwifruit易感性GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

Kiwifruit响应感染激活病原体抵抗抵抗力酶GydF4y2Ba

SOD、POD、CAT、PAL等酶的活性是植物抗病性的指标。这些酶可能在生物和非生物胁迫下上调，增强寄主抗性。对照组和对照组四种防御酶活性均增加GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV猕猴桃的反应GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba感染。SOD，POD和PAL在1 dpi下迅速反应于发病机制，并且它们的活性水平继续升高至4 dpi，但减少5 dpi。首先在2 dpi诱导猫，其活性稳步增加了感染时间。但是，在5 DPI下，其活动下降。在缺少...之下GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba感染后，四种酶的活性水平均明显升高GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV比对照组要高。然而，酶活性明显增加GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV在感染应激下的组（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

增加GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba磁化率的GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV组与植物激素相互作用有关GydF4y2Ba

TPL/TPR蛋白参与植物信号通路，与多种植物激素相互作用。这里是植物激素IAA和GA的相对水平GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba， ABA和SA。IAA、GA和SA水平在4dpi之前急剧升高，之后迅速下降。在缺少...之下GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba感染，IAA, GA和SA水平显著升高GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV比对照组WT和TRV组显著增加。感染后IAA、GA、SA水平较高GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV比未感染的人多GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-tv在1-4 dpi。然而，这些植物激素的水平在5 dpi下降（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa，b和d）。在控制中，ABA含量不断增加GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba感染延长。万一GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV治疗在1-2 dpi，ABA含量较高GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba比未受感染的果实更容易感染。然而，在2 dpi之后，ABA水平大幅下降GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba和猕猴桃(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

病毒引起的沉默GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba- 引起的IAA信号传导基因表达GydF4y2Ba

在这里，我们使用qRT-PCR来测量生长素生物合成和信号转导基因的表达水平GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV和控制水果。GydF4y2Baacnit1.GydF4y2Ba在储存的5天内，在控制水果中略微上调，但显着增加GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba感染，尤其是1-3 dpi。这GydF4y2Baacnit1.GydF4y2Ba水平更高GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-tRv比对照水果中的-TRV（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba一个)。GydF4y2BaAcarf1.GydF4y2Ba和GydF4y2Baacarf2GydF4y2Ba在对照中有点上调，但它们的水平在四倍高GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba沉默的果实比对照组的要多。GydF4y2BaAcarf1.GydF4y2Ba和GydF4y2Baacarf2GydF4y2Ba被强烈诱导对GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba感染（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaB和C）。GydF4y2Ba

TPL / TPR表达可能与植物 - 病原体相互作用有关[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]．然而，据我们所知，没有先前的研究已经探索了TPL / TPR在Kiwifruit的角色 -GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba相互作用。以前的研究表明GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba在Kiwifruit之后高度表达GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba感染(GydF4y2Ba23GydF4y2Ba，因此，它可能在这个过程中发挥关键作用。在这里，我们应用表达谱分析、转基因研究和感染分析来研究其功能GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba在Kiwifruit中抗病性 -GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba互动。GydF4y2Ba

我们使用了Vigs方法来检查反向功能GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba在猕猴桃抗性GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba．QRT-PCR分析表明GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba中表达下调GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-Trv2猕猴桃在转化后6天，转化的载体具有沉默效果（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba猕猴桃在GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba感染。因此，GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba可能有防御功能GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba在猕猴桃(无花果。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.然而，GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba表达明显降低GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-trv2 kiwifruits比控件在一起。前述结果验证了Vigs所识别的沉默效果。GydF4y2Ba

TPR2.GydF4y2Ba植物过度表达可能提高病原体抗性。尽管如此，已经对效果进行了很少的研究GydF4y2BaTPR2.GydF4y2Ba下调[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]．在这里，我们提供了逆向证据的作用GydF4y2BaTPR2.GydF4y2Ba在Kiwifruit的真菌病原体抗性中。病毒引起的沉默GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba增加GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba猕猴桃的易感性。这些发现与之前的研究报告一致GydF4y2BaAtTPR1GydF4y2Ba过度表达激活GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba辩护响应，即使是各种各样的GydF4y2BatprGydF4y2Ba冗余[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

防御反应的激活伴随着致病相关酶的诱导。应激诱导活性氧(ROS)的过度生成。超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶是重要的植物抗氧化酶，它们能清除因外部损伤而产生的活性氧[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]．PAL是苯丙烷代谢途径中的一种关键酶，可产生各种次级代谢物，防止病原体入侵[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．在这里，所有四种防御酶在对照组和GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba- 在存在的情况下 - 触发器GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba．SOD，POD，CAT和PAL的活性水平响应于病原体感染而增加，直至4 dpi并随后降低。4 DPI感染的发作可能表明局部植物防御反应中的崩溃（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.在没有感染的情况下，所有四种酶都显着上调GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV2与对照组相比。下GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba然而，感染胁迫，所有四种酶的活性水平都大大增加GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-Trv2处理（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.因此,后GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba基因沉默，猕猴桃内部上调这些酶。然而，这是GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-Trv2猕猴桃比较易受腐烂的影响。GydF4y2Ba

TPL / TPR与植物激素途径中涉及的转录复合物相互作用，尤其是在疾病信号转导中的转录复合物[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．各种植物激素坐标植物生长和应力适应。在这里，在没有GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba感染，IAA，GA和SA水平相当高GydF4y2BaACPGIP.GydF4y2Ba-TRV2。因此,GydF4y2BaACPGIP.GydF4y2Ba沉默使Kiwifruit能够通过其他机制立即激活植物激素信号传导途径，并防御GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba．这一发现与之前的一项研究一致，即植物产生内源性植物激素调节病原体的反应[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．各内源植物激素水平GydF4y2BaACPGIP.GydF4y2Ba-TRv2增加但随后降低到较低的水平，而不是控制的水平。此外，IAA，GA和SA之间存在协同作用。在1-2dpi的果实中，ABA含量比未感染的水果中的含量更高。然而，2DPI后，ABA水平显着降低。对于其他三种植物激素没有观察到这种模式。GydF4y2Ba

在本研究中，我们评估了三种IAA信号传导基因的表达水平。长时间储存​​略有增加GydF4y2Baacnit1.GydF4y2Ba在对照水果中。因此，IAA参与了果实成熟和衰老。GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba通过诱导宿主IAA生物合成和促进IAA信号传导基因的表达，感染加速果实衰老GydF4y2Baacnit1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaAcarf1.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaAcarf2。GydF4y2Ba此外，AcTPR2-TRV中这三个基因的表达量均高于对照。IAA水平较高，腐病表型较严重GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-trv kiwifruit。因此，GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba下调可能促进IAA和IAA信号基因的表达，加速POSTHARVED Kiwifruit衰老。更远，GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba感染急剧增加了亲属GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba响应。因此，我们建议GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba通过下调IAA和IAA信号传导基因增强植物病原体防御（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.本研究的结果与以前的研究报告的结果一致GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaoverexpressingGydF4y2BaAtTRP1GydF4y2Ba表现出对外源性IAA的相对薄弱的反应，并证明了养肝早期反应基因子集的改变表达[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

病毒诱导的基因沉默技术用于建立函数GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba基因在Kiwifruit抗性GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba．病毒引起的沉默GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba增加猕猴桃的敏感性GydF4y2BaB. Cinealeal.GydF4y2Ba病害。猕猴桃抗氧化酶SOD、POD、CAT、PAL和内源植物激素IAA、GA、ABA和SA均在病原菌诱导的胁迫和损伤中被激活。IAA信号基因GydF4y2Baacnit.GydF4y2Ba那GydF4y2BaAcarf1.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Baacarf2GydF4y2Ba与对照相比，通过ACTPR2-TRV转化的Kiwifruit全部上调。由于IAA水平较高，并且灰霉素腐烂表型更强烈GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-trv kiwifruits比他们在控制中，GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba下调IAA和IAA信号基因可促进采后猕猴桃的衰老。GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba大幅调节GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba在Kiwifruit与控制相比GydF4y2Ba．GydF4y2Ba因此,GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba通过下调IAA和IAA信号基因，增强猕猴桃对病原体的防御能力。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

奇异果 （GydF4y2Ba猕猴桃对GydF4y2Ba简历。红阳)是一种具有高度经济重要性的水果作物，有兴趣的消费者[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．该品种通过了四川省农作物品种批准委员会的批准，并于1977年被任命为Kiwifruit'Hongyang'。建胜唐建了本研究中使用的植物材料的正式鉴定[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．在中国重庆市重庆区的实验设施中，在开花后130天收获了几乎成熟，未损坏和害虫的猕猴桃。（31°23'N，108°39'e）。平均重量为95g的猕猴桃在收获的5小时内运输到实验室。将果实用2％（v / v）次氯酸钠进一步消毒2分钟，用自来水冲洗，风干。GydF4y2Ba

矢量建筑和转型GydF4y2Ba

用RNAiso Plus试剂从猕猴桃中提取总RNA (GydF4y2Ba豆类GydF4y2Ba生物医学技术有限公司，北京，中国）和用Primescript™RT试剂盒（）逆转录cDNA（GydF4y2Ba豆类GydF4y2Ba生物医学技术有限公司，北京，中国)单个电泳带的GydF4y2BaActpr2.GydF4y2BaPCR产物被回收并克隆到pMD®19-T简单载体(GydF4y2Ba豆类GydF4y2Ba生物医学技术有限公司，北京，中国)pcr阳性菌落测序验证GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba的正确性。一个GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba通过引入446-BP来产生-tRv2构建体GydF4y2BaXbaGydF4y2Ba我/GydF4y2BaBamGydF4y2Ba在ptrv2向量中，将DNA片段分段（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.这GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba基因片段和PTRV2载体被双消化GydF4y2BaXbaGydF4y2Ba我/GydF4y2BaBamGydF4y2Ba嗨，恢复，结扎，转化为GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Badh5 α感受态细胞，在含50 mg L的抗性平板培养基上孵育GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}卡那霉素。采用PCR检测耐药菌落，选择PCR阳性菌落提取质粒。使用通用载体引物RV-XIAYOU (5- ' AACCTAAAACTTCAGACACG-3 ')进行测序。这GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV2序列与参考序列相同(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.这GydF4y2BaActpr2.GydF4y2Ba-TRV2表达载体GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2Ba应变GV3101。改变了GydF4y2BaA. Tumefaciens.GydF4y2Ba以1:1的比例混合pTRV2载体GydF4y2BaA. Tumefaciens.GydF4y2BaGV3101承载PTRV1矢量。混合GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba用注射器注射密度（OD600 = 1.0）的培养物进入猕猴桃。灭菌的DDH.GydF4y2Ba_2GydF4y2Bao和矢量trv（ptrv1：ptrv2 = 1：1）作为控制。GydF4y2Ba

感染GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba

菌株HFXC-16GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba从感染的Kiwifruit孵育在25℃下孵育，并在马铃薯右旋糖浆（PDA）上生长2周[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba[陈等人，2015]。注射后七天的水果GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2Ba，灭菌的DDH.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba或TRV1-2载体，10 μLGydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba含有10的孢子悬浮液GydF4y2Ba^4.GydF4y2Ba孢子ml.GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}注射器注射到每个伤口中诱导的每个伤口GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba或ddh.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO注射。处理过的猕猴桃放置在有盖的塑料食品托盘中，密封在聚乙烯袋中，并在25°C恒温培养箱中储存(Sanyo Electric Co. Ltd, Osaka, Japan)。GydF4y2Ba

b .灰质GydF4y2BaDNA量化GydF4y2Ba

基因组DNA与样品分离GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba- 5 dpi的猕猴桃。基因组DNAGydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba使用Universal Primers ITS1 / ITS4和551-BP带进行测试。使用由测序的551-BP片段设计的引物进行QRT-PCR分析其序列的QRT-PCR分析（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

QRT-PCR用于表达分析GydF4y2Ba

每天收集Kiwifruit组织6天。实验设计由每次治疗的三种果实的三种重复组成，并重复实验。将所有组织均储存在-80℃直至RNA提取。在制造商的协议之后，用Rnaiso Plus Kits（Takara Bio Inc.，Shiga，Shiga，日本）纯化了RNA。用RNase-Fish-I（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，USA）处理一微克RNA，以消除使用转肌印记一体化第一链CDNA合成超混合物的基因组DNA并用寡核苷酸（DT）逆转录QPCR（一步GDNA拆卸）套件（Transgen Biotech Co. Ltd.，中国）。A TB Green™Premix exQ™（TLI RNASEH PLUS; Takara Bio Inc.，Shiga，日本）套件用于QRT-PCR分析。这GydF4y2Baβ肌动蛋白GydF4y2Ba基因作为内部控制[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]．底漆列于表中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．对PCR产物进行克隆和测序验证。GydF4y2Ba

防御酶分析GydF4y2Ba

取1 / 2克猕猴桃组织，置于10 mL 100 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.8)中，12000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba和4°C 20分钟。收集上清液以进行酶提取和测定。氮蓝四唑（NBT）光电综合方法用于测定SOD活性[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．防止50% NBT光化学还原的酶用量为1u gGydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}．愈缩症方法估算POD活性[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]．采用紫外吸收法测定CAT活性，光密度(OD)为240 nm min时为1 U酶活性GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}（A240）减少0.1（U G.GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}）.通过先前报告的方法确定了PAL活性[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]．在50mM Tris缓冲液（pH8.5）中萃取水果样品并以6000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba4℃保存10 min，收集上清。GydF4y2BaL.GydF4y2Ba- 将100μl2NHCl加入上清液中以引发反应。吸光度以290nm记录并表明肉桂酸形成。GydF4y2Ba

液相色谱仪 - 质谱仪（LC-MS）用于植物激素分析GydF4y2Ba

确定IAA, GAGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba， 3 g猕猴桃组织称重，冷冻，液氮粉状，然后如前所述通过LC-MS分析[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．每个治疗组由三个独立的生物重复表示。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

采用SPSS 18.0软件包进行统计学分析。采用学生T检验比较对照和各侵染组的防御酶、植物激素含量或相关基因表达。统计学意义定义为GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05.

猕猴桃基因组数据库可以在GydF4y2Bahttp://kiwifruitgenome.org/GydF4y2Ba．植物材料可根据要求提供。GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

脱盐酸GydF4y2Ba

ARF：GydF4y2Ba

助线响应因子GydF4y2Ba

猫：GydF4y2Ba

过氧化氢酶GydF4y2Ba

CTLH:GydF4y2Ba

c端到LisHGydF4y2Ba

dpi:GydF4y2Ba

接种后几天GydF4y2Ba

耳朵:GydF4y2Ba

乙烯反应元件结合因子相关的两亲性抑制GydF4y2Ba

GA.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

赤霉酸GydF4y2Ba

IAA：GydF4y2Ba

吲哚-3-乙酸GydF4y2Ba

LC-MS：GydF4y2Ba

液相色谱-光谱法GydF4y2Ba

lish：GydF4y2Ba

Lissencephaly同源GydF4y2Ba

NBT：GydF4y2Ba

硝基蓝四唑.GydF4y2Ba

OD:GydF4y2Ba

光密度GydF4y2Ba

朋友：GydF4y2Ba

苯丙氨酸氨 - 裂解酶GydF4y2Ba

PDA:GydF4y2Ba

马铃薯葡萄糖琼脂GydF4y2Ba

圆荚体:GydF4y2Ba

过氧化物酶GydF4y2Ba

QRT-PCR：GydF4y2Ba

定量反转录聚合酶链反应GydF4y2Ba

ROS：GydF4y2Ba

活性氧GydF4y2Ba

SA：GydF4y2Ba

水杨酸GydF4y2Ba

SOD:GydF4y2Ba

超氧化物歧化酶GydF4y2Ba

TIR：GydF4y2Ba

运输抑制剂反应GydF4y2Ba

一系列问题:GydF4y2Ba

裸照领域GydF4y2Ba

TPL：GydF4y2Ba

袒胸GydF4y2Ba

TPR：GydF4y2Ba

TOPLESS-RELATEDGydF4y2Ba

中收取:GydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默GydF4y2Ba

沃斯：GydF4y2Ba

Wuschel.GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

作者感谢国家自然科学基金（32001351和31670688）提供的研究设计和大部分实验，重庆（CSTC2018JSCX-MSYBX0196）的研究设计和大部分实验，在数据分析和稿件写作中，以及培养本研究中使用的材料。GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. 浙江李和建斌兰同等贡献了这项工作。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 重庆市经济植物生物技术重点实验室，重庆市特种植物产业协同创新中心，重庆文理学院园林与生命科学学院/特种植物研究所，永川，402160GydF4y2Ba

   李哲新，兰建斌，刘一清，唐建民GydF4y2Ba

2. 中国林业科学研究院林业研究所林木遗传育种国家重点实验室，北京100091GydF4y2Ba

   李王琦GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

ZL构思，设计和开展了这项研究并写了稿件。JL，QL和JT对实验设计和分析提供了重要的建议。在实验操作期间，YL提供了一些帮助。QL和JT有助于修改稿件。所有作者均阅读并批准了手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba李王琦GydF4y2Ba要么GydF4y2BaJian-Min唐GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

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