全基因组鉴定和鉴定COMT的蓝莓果实发育过程中的基因家族

背景

咖啡酸O-methyltransferases (comt的）在天然产物的多样化中起重要作用，特别是在植物的苯丙氨酸代谢途径中。内容COMT的蓝莓中的基因及其表达模式与水果开发期间的木质素含量之间的关系没有明确调查。

结果

九十二年VcCOMTs被确定在Vaccinium corymbosum．根据系统发育分析，92VcCOMTs分为2组。类群内基因结构和保守基序相似，支持系统发育结构类群的可靠性。结果表明，分散重复(DSD)和全基因组重复(WGD)是导致基因突变的主要原因VcCOMTs进化。结果表明，qRT-PCR结果与木质素含量为22VcCOMTs，VcCOMT40和VcCOMT92与蓝莓水果发育的不同阶段有关的木质素含量。

结论

我们确定了COMT的蓝莓中的基因家族，并对15种土地植物中的系统发育关系进行了比较分析，以及基因重复模式COMT的15个物种中的5个都有基因。我们发现2VcCOMTs它们的相对含量与蓝莓果实发育过程中木质素含量的变化趋势相似。这些结果为进一步研究其作用提供了线索VcCOMTs在蓝莓果实的开发中，有希望成为培育出果实硬度更高、保质期更长的蓝莓品种的基础。

蓝莓因含有类黄酮等植物营养素而在世界范围内得到广泛的重视，类黄酮是在20世纪初被发现的[1，2，3.，4］．蓝莓果实中的黄酮类化合物已经证实控制糖尿病，施用抗炎和神经保护，效果和通过其抗氧化活性保护眼睛健康[5］．因为蓝莓组件的功能使其被越来越多的人作为“超级果实”所接受[6]，全球蓝莓产量从2004年到2016年大大增加了35％[7］．然而，由于呼吸作用、蒸发、病原体感染和细胞壁降解等原因，蓝莓果实具有易腐烂性高的特点[8］．如何保持肉体蓝莓水果的质量是一个紧迫的问题。

蓝莓果实软化的研究主要以两种方式进行。一是关于与细胞壁结构和某些水解酶有关的果实软化机制[9，10.]，另一个是通过像冷阶层这样的外部治疗延长保质期[11.，高氧处理[12.，表皮蜡保存[13.、乙烯吸收剂处理[14.]，硝普钠治疗钠[15.]和Acibenzolar-s-甲基处理[8］．硝普酸钠治疗的主要理论和acibenzolar-S-methyl治疗是提高苯丙氨酸氨裂解酶的活动(PAL)和辅酶a连接酶在木质素代谢途径(4 cl)和过氧化物酶(POD)的聚合催化酚类物质的前体为木质素酚类,以使水果木质化的,增强宿主细胞壁，抑制病原体生长[16.］．

木质素是细胞壁的特征组分。果实的治疗可以诱导木质素生物合成途径的变化，影响代谢物对病原体感染和果实的影响[17.］．目前，许多果树和蔬菜已经报道了它们的木质化对采后果实的影响，如草莓[18.，覆盆子[19.，西葫芦水果[20.蓝莓[15.］．影响木质化的主要处理方法是收获后外施。提高果实木质化程度，有效延长果实保鲜期的转基因研究还很少。

O-甲基转移酶(OMTs)是木质素和类黄酮生物合成途径中的一种多功能酶拟南芥它可以使咖啡酸与阿魏酰胺酸5-OH Coniferaldehye / 5-OH果糖醇透露给Sinapaldehyde / sinapyl醇，形成G和S单位的木质素[21.］．COMTs催化n -乙酰5 -羟色胺生成褪黑素[22.，23.］．它们的过度表达也可以帮助植物生长[24.］．高粱双色COMT可参与曲霉素生物合成，甲基化黄酮、木犀草素和selgin [25.］．的表达MOMT4在白杨中可以改变木质素的结构，增加了通过G-单位的凝聚木质素亚基的交联[26.］．在类黄酮生物合成途径上，黄酮类化合物的抗氧化活性与羟取代基的数量有关：更大数量的羟基取代基与较强的抗氧化剂和过氧化物活性有关。羟基取代基的甲基化灭活黄酮类化合物的抗氧化剂和过氧化活性[27.］．omt可分为两类:PI-OMT I族和PI-OMT II族[28.］．PI-OMT I族由CCoAOMTs组成，COMTs属于PI-OMT II族。大部分COMTs有两种结构域，二聚化(PF08100)和甲基ransf_2 (PF00891)。COMTs中有7个基序保守，其中A和E基序可能是sam结合域。COMTs有更广泛的催化底物，如木质素前体、生物碱、类黄酮[29.］．这些化合物在植物生长发育和面对生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。因此，植物OMT酶被广泛研究[2，30.，31.］．

不同植物基因组的发表使得对几种植物COMT家族基因的分析得以开展[32.，33.］．蓝莓因其含有大量的类黄酮而被广泛研究。四倍体蓝莓基因组于2019年发布[34.］．本研究以四倍体蓝莓基因组为基础，通过鉴定COMTs家族，寻找可能与蓝莓果实生长发育过程中木质素前体和黄酮类物质甲基化有关的OMTs。本研究的结果将为培育果实硬度更高、保质期更长的蓝莓品种奠定基础。

系统发育和序列分析COMT的蓝莓中的基因

识别COMT的蓝莓基因组中的基因，一个特征序列来自拟南芥（AT5G54160）和36次鉴定的序列杨树trichoarpa被用作BLASTP搜索中的一组查询(E < 1e-5) [35.］．总共从蓝莓基因组中检索到123条候选序列。然后，将所有的123个候选序列扫描到一个methyltrans_2域。在蓝莓中鉴定出92个具有甲基转移_2结构域的序列。所有基因均被映射到伪染色体(VaccDscaff1-VaccDscaff48)上，并根据在伪染色体上的位置顺序从VcCOMT1重命名为VcCOMT92。基因特征分析见表S1(附加文件1:表S1)。结果表明，VcCOMT56为最短蛋白(112个氨基酸)，VcCOMT89为最长蛋白。分子量分析显示92个VcCOMT蛋白在12 ~ 201 kDa之间，等电点在4.62 ~ 8.73之间。

通过使用蓝莓COMT蛋白序列产生的最大可能性（ML）系统发育树显示将该序列分布成2组，并且通过高自举值和基因结构支持该发现（图。1a).基因结构和保守结构域分析显示，所有comt均有一个c端催化结构域Methyltransf_2结构域，包含一个SAM/SAH结合袋和一个底物结合位点。它们中的一些显示了一个共同的结构，n端结构域称为二聚化[36.］．SAM/SAH结合袋高度保守，底物结合位点对不同组的蛋白质具有特异性[37.］．同一组comt的域内含子数量和大小相似(图1)。1b).例如，所有基团中都有一个二聚结构域位于一个外显子上。这种基因结构与甲基转染_2结构域不同。在Ia组和Ib组中，VcCOMTs除VcCOMT6、VcCOMT61和VcCOMT83外，其余两个外显子均有甲基转染_2结构域，其中中间有一个内含子。Methyltransf_2域分布在三个外显子和两个内含子上。虽然Methyltransf_2结构域也分布在II组的3个外显子和2个内含子上，但结构域的结构与VcCOMT6、VcCOMT61和VcCOMT83不同。第二组外显子非常小。与报道的不同杨树trichoarpa一些蓝莓COMTs在一个序列中有两个或三个Methyltransf_2域[38.］．然而，VcCOMTs的Methyltransf_2结构域的基因结构在同组序列中是相似的。采用多重期望最大化Motif Elicitation (Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation, MEME)在线工具分析了蓝莓COMTs之间的蛋白质序列差异。在蓝莓COMT序列中共发现了11个motif [35.］．大多数基序在两组中相同，它们在同一组内的COMT序列中的顺序相同（图。1C）。图案10对I组特别是II组，只有群组有MOTIF 8.组内的类似遗传结构和保守的基序支持系统发育结构分组的可靠性。

串联（TD）事件和联合性分析VcCOMTs

根据以前的研究，一个150 - 200kb长度的染色体区域包含两个或两个以上的基因是串联的证据[33.］．MCscanX在蓝莓基因组中发现9对串联基因对(VcCOMT1/VcCOMT2, VcCOMT4/VcCOMT5, VcCOMT25/VcCOMT26, VcCOMT43/VcCOMT44, VcCOMT52/VcCOMT53, VcCOMT58/VcCOMT59, VcCOMT62/VcCOMT63, VcCOMT63/VcCOMT64, VcCOMT75/VcCOMT76）.九十二年comt的在蓝莓假染色体上显示了9个TD事件的证据(图。2) (39.］．九十二年comt的允许检测83个共线关系(图。2b).两者之间相同颜色的线COMT的染色体上的基因显示共线性。的共线性VcCOMTs不同的同源染色体以不同的形式存在。第一种形式是1VcCOMT在一条染色体上，在另一条染色体上VcCOMT与b、c、d、g组相同(图1)。2b).另一个是VcCOMT在一条染色体上VcCOMTs在另一条染色体上VcCOMT11，VcCOMT12，VcCOMT14，VcCOMT15有共线性吗VcCOMT3,分别。这一现象的原因可能是其异源多倍体基因组[34.］．大多数事件位于高度重复的块中，并通过MCScanX识别为WGD或分段重复事件。这一结果表明VcCOMT基因家族通过全基因组复制而扩大和进化。

分析VcCOMT蓝莓中的基因启动子

转录的开始是基因表达的关键阶段，RNA聚合酶与启动子的相互作用是这一阶段的重要事件。启动子的结构影响RNA聚合酶的结合亲和力，从而影响基因表达水平[32.］．我们分析了这一点CIS.-蓝莓上的作用元素COMT的基因(图。3.）.蓝莓的结果comt的结果与梓文艺comt的［33.］．根据功能，对CIS.表演的元素comt的可分为四类。与光响应相关的主题构成了大部分CIS.-蓝莓上的作用元素comt的并分布在所有组中。这一发现表明COMT的蓝莓的基因可能受光控制。许多CIS.与植物生长和开发有关的元素，例如与胚乳的Aaca motif和GCN4基序，与与种子特异性调节有关的Ry元素，昼夜组分，这是涉及昼夜控制和MSA的监管要素。与与细胞周期调节相关的元素一样。我们发现有一些与压力相关的顺式调节元素（CRES）和一些激素相关的CRES在启动子区comt的如LTR、ARE、TC-rich repeats等与应激反应相关，ABRE、ERE、TGA-BOX、TCA、as-1等与激素相关。在启动子区还发现MYB结合位点、MYC结合位点和W-box，它们是转录因子与MYB、bHLH和WRKY蛋白的结合位点。的启动子VcCOMTs在同一亚组内是相似的。通常，同源染色体上具有较高相似性和较高共线性的序列，其类型和偶数阶CIS.-它们的作用元素是相似的，就像VcCOMT59和VcCOMT64，VcCOMT34和VcCOMT66，VcCOMT60和VcCOMT65在a组中VcCOMT26和VcCOMT13，VcCOMT22和VcCOMT9组Ib中的VcCOMT77和VcCOMT82，VcCOMT78和VcCOMT75，VcCOMT16，VcCOMT71和VcCOMT72在第二组中，特别是在谬误对中，比如VcCOMT57和VcCOMT92，VcCOMT85和VcCOMT91，VcCOMT31和VcCOMT80，VcCOMT37和VcCOMT39．相似的调控元件在序列中可能极大地影响基因表达模式和基因功能的相似性。绝大多数VcCOMTs具有与脱落酸相关的ABRE和与水杨酸相关的TCA基序。不同亚群中独特的调控元件可能决定了不同亚群中基因的不同功能，如与胚乳有关的GCN4，主要分布在胚乳上VcCOMTs而与昼夜节律相关的昼夜节律主要分布在Ia和Ib组。

进化分析COMT的蓝莓和其他物种的基因

通过隐马尔可夫模型(HMM)搜索，在16种植物基因组中共鉴定了425条COMT序列，其中包括1株绿藻(cholphyta)、1株绿藻(Charophyte green algea, CGA)和14株陆生植物(land plants)。4a). CGA是陆地植物现存的最近的亲戚[40，但并没有搜索到任何假定的COMT轮藻braunii．在绿藻的基因组中衣藻reinhardtii，鉴定出3个推测的comt，它们不具有完整的Methyltransf_2结构域。其中2个具有不同于陆生植物COMTs的其他结构域二聚化(PF16864.5)．藻类二聚体2在土地植物中二聚化结构域中的进展可能表明了comt的从藻类到陆地植物。在我们研究的另外三个古老基因组中，Anthoceros angustus，Physcomitrella金属盘和卷柏moellendorffii，我们分别鉴定了3、7和34个可能的基因。与早期维管植物相比卷柏moellendorffii,的数量comt的在里面Anthoceros angustus和Physcomitrella金属盘没有血管的是10到5倍Anthoceros angustus和physcomitrella patens，分别。假定的百分比comt的在基因的总数和数量comt的每百万碱基的基因组卷柏moellendorffii以苔藓植物为主。他们指出，这种扩增不一定与基因组大小的增加有关，但可能是由新功能的发展、木质素的沉积和丰富的黄酮类物质的存在所决定的[41.］．的数量comt的在二倍体苹果和二倍体葡萄中的含量大约是四倍体蓝莓的一半(表1）.在苹果基因组中，推定的百分比comt的与蓝莓的基因总数几乎相等吗VcCOMTs而葡萄的基因组下降了两倍。研究动物的进化关系comt的在陆生植物中，候选comt的来自15种植物，包括莱氏衣藻、安氏花、小立碗菌、卷柏、银杏、毛花Amborella、水稻、拟南芥、毛心杨、家苹果、西花悬铃、葡萄、猕猴桃、杜鹃和Vaccinium corymbosum被用来构建系统发育树，而comt的来自藻类衣藻reinhardtii作为外组(图。4b）。系统发育分析表明comt的被分为两组。簇I是红色的，它被包含comt的从所有14个陆地物种。簇II(分支是绿色的)没有comt的在里面小立碗藓这表明它们可能是来源于单一祖先基因的同源基因，但具有新的功能comt的发生在卷柏moellendorffii并导致基因分化[49.，50.］．comt的在卷柏moellendorffii，未与被子植物聚在一起，裸子植物聚在II。结果表明COMT的已经在服从植物植物，裸子植物和裸子植物中独立招募了Slignin生物合成卷柏moellendorffii［51.］．

共线性分析、基因复制事件及Ka/Ks分析comt的蓝莓和其他植物

推断…的进化机制COMT的分析了四倍体蓝莓基因间的共线性关系vitis Vinifera这表明了许多双子叶植物的甘蔗 - 六倍体祖先基因组[46.]，Actinida对隶属于梅花科[52.]，这是一个早期在小行星和杜鹃williamsianum代表杜鹃花科丰富的类群[48.),Vacciniun corymbosum（图。4c)。comt的在不同的植物中，同源染色体显示出相同的颜色。两个comt的在里面Actinida对有一个同源区域吗vitis Vinifera．一个COMT的在里面Actinida对有两个同源区域在吗vitis Vinifera．这些基因表明，这些正交成对可能已经存在于古古古岛（γ）事件之前存在。comt的的Actinida对和Vacciniun corymbosum有更高的共线性。大多数类型之间的对应关系为共线性关系comt的在里面Actinida对和Vaccinium corymbosum是两个comt的在里面Actinida对一个COMT的在里面Vaccinium corymbosum．一些相应的共同性关系comt的两个基因组是一个comt的一个comt的在不同的基因组中表明一些comt的在进化过程中丢失了。一个COMT的在里面Actinida对只有共线性Vaccinium corymbosum在其他物种中，如橙色所示。这些comt的可能有类似的功能。有趣的是,comt的在杜鹃williamsianum有最高的共同性comt的在Vaccinium corymbosum．他们之间的类型更复杂，最多出现8COMT的年代Vaccinium corymbosum谁和1共线性comt的在里面杜鹃williamsianum。

COMT的在4种植物中发现了重复的基因对DupGen_finder软件。有五类重复基因对，包括WGD，TD，近端复制（PD），转置重复（TRD）和DSD对。在这些类别中，DSD类别具有来自四种植物物种的最复杂的基因对。在蓝莓中，衍生自WGD的基因对的百分比高于来自其他方法的基因对的百分比。葡萄具有几乎相同的PD-，TD-和TRD衍生的基因对。这三类事件可能在葡萄的演变中发挥了几乎相同的作用。杜鹃花的模式与葡萄相似。此外，DSD在杜鹃花的演变中发挥了重要作用，TDS和TRD可能发挥了类似的进化作用。DSD和WGDS是蓝莓和猕猴桃进化的主要驱动因素。同源基因之间的KS值用于估计二倍体祖细胞的分歧，来自他们最近的常见祖先（MRCA），该祖先在大约0.94和120万年之间介于约0.94和1.02亿之间。 According to the eq. T = Ks/2λ (λ, synonymous substitution rate; λ = 1.3e-8) [34.), 42COMT的蓝莓WGD对在二倍体祖细胞分化的预估时间之前产生，而4对在二倍体祖细胞分化后产生。选择对comt的对4种植物的Ka/Ks比值进行了研究。Ka/Ks比大于1表示正选择，Ka/Ks比等于1表示中性进化，Ka/Ks比小于1表示低进化速率下的纯化选择。的Ka/Ks值COMT的4种植物的对数均小于1(图1)。4d)。

基因表达用蓝莓水果中的差异表达胶凝分析

22VcCOMTs根据其在转录组分析中的表达(|log2(fold change, FC)| > 1，P值< 0.05)，对不同果实发育阶段进行qRT-PCR。根据木质素含量，我们选择了三个与木质素变化相关的基因，VCComt62，VCComt40和VcCOMT92（图。5，附加文件4:表S3)。的表达趋势VcCOMTs前期木质素含量变化趋势基本一致，在s1 ~ s2阶段呈先上升后下降的趋势。s2是最高点。的趋势VcCOMT62与木质素在果实发育过程中的表达量一致，但相对表达量很低。的相对含量VcCOMT40和VcCOMT92在果实发育阶段较高。的最低表达VcCOMT40和VcCOMT92不同于木质素，木质素含量在果实发育过程中最低。VcCOMT40和VcCOMT92均位于同源染色体上，基因共线性区序列相似性高。设计一对引物后，在共线区域之间VcCOMT40和VcCOMT92，与木质素在果实发育阶段的表达趋势一致。根据多序列比对结果(图。6)，VcOMT40和VcCOMT92含有与可以催化咖啡酸和5-OH Coniferaldede的相同的底物结合位点[37.］．

comt的能与各种底物反应，如苯丙类、黄酮类和生物碱;因此，它们在植物中无处不在，因为它们在植物适应环境和逆境方面很重要[30.，53.］．早在上个世纪，科学家就开始对人类的作用感兴趣COMT的植物中的基因[54.，55.］．不同植物基因组的出版能够分析COMT的几个物种的家族基因有待研究[38.，56.，57.］．蓝莓因含有大量的类黄酮而被广泛研究。四倍体蓝莓基因组于2019年发布，92comt的，根据染色体位置命名为VcCOMT1-VcCOMT92。根据系统发育和基因结构分析，这92COMT的基因可分为两组，分别为Ia组、Ib组和II组。同一分支的序列和结构相似性大于分支之间的相似性。通过对其保守母题的分析，得出三组comt的可大致分为两类[20.］．组Ia和组Ib中都包含motif 10，而其他组没有。基序10在VcCOMT序列上游约15-50个氨基酸组成结合袋的后壁[36.，37.，57.，58.］．可能是由于结合底物的不同，这两类的VcCOMT序列是不同的。我们鉴定了COMTs中高度保守的这些母题。四个基序(基序I: DVGGG，基序II: DLPHV，基序III: GDMF，基序IV: VPKGDAIFLKWI)中的一些残基与SAM/SAH结合位点相关[58.］．VcCOMTs Motif 2包含Motif I (DVGGG)和部分Motif II (DLPHV)。VcCOMTs的Motif 1包含Motif III (GDMF)和Motif IV (VPKGDAIFLKWI)(附加文件2: Fig.S1) [28.］．基因重复可能有助于物种的演变和对其环境的种类改编[59.］．在蓝莓基因组中，候选VcCOMTs根据同源染色体与MCscanX共线性分析[60.］．的数量VcCOMTs线性性不同于不同的染色体（图。2b).多对一的比率可能存在，因为一些副本COMT的在不同的染色体中由于环境在蓝莓演变过程中的影响或因为存在不完全域的一些冗余基因而丢失。一对多比率可能是不同的子官能化和新功能化的结果。两个comt的同源染色体上具有高同源性和高相似性的序列在蓝莓基因组中具有相似的启动子序列。启动子区存在的顺式调控元件是该基因的结合位点comt的基因与其他蛋白质在调控基因转录中起核心作用。有大量促进植物胚乳和种子生长的光响应相关调控元件、节律元件和调控元件，可能与植物生长和木质素合成有关[61.，62.］．在启动子区COMT的同时还发现了蓝莓的基因，以及一些与激素和应激相关的调节元件，这与前人的研究一致。当植物受到胁迫或外源激素处理时，其含量comt的增加(63.，64.，65.，66.］．

在本研究中，不同数量的COMT的从藻类到陆生植物的15种植物中都发现了s1）.的进化comt的从藻类到陆地植物导致二聚域的变化(附加文件1:表S2，附加文件3.: Fig.S2)。此外，我们发现comt的数量在卷柏moellendorffii大于其他双象状物种中的数字，小于数字vitis Vinifera，Malus x Domestica和Vaccinium corymbosum．血管组织的发育是两者差异的基础卷柏moellendorffii和苔藓植物。木质素是维管组织的主要组成部分，为植物直立提供结构支撑。comt的Lignin生物合成中是重要的甲基转移酶，即木质素的甲酸甲酯组分类似于S单位卷柏moellendorffii［51.］．本研究表明，土壤植物中木质素的演变与进化相关COMT的基因(38.］．

共线性的比较VcCOMTs在蓝莓中comt的在其他植物中显示VcCOMTs与其他人共同comt的对不同的物种来说几乎是一样的。一些COMT的蓝莓与猕猴桃的共线性基因对为一COMT的蓝莓的基因到两个COMT的猕猴桃的基因中，蓝莓与杜鹃花的基因共线性为一对多型。也许结果表明猕猴桃经历了两轮的WGD [39.，47.］．form表示COMT的分化后复制基因Vaccinium corymbosum和杜鹃williamsianum。基因复制有五种形式:DSD、PD、TRD、TD和WGD [39.］．不同基因复制模式对不同植物物种中COMT家族的扩展有不同的影响。DSD是除葡萄外的四种植物物种中的进化的主要特征。以前的研究表明COMT基因在所有的同源染色体上都有串联副本[34.］．在目前的研究中，TDVcCOMTsMCscanX没有在所有的同源染色体上进行鉴定。更少的VcCOMTs通过TD而不是WGD产生的。然而,放大COMT的蓝莓基因组中的基因主要通过DSD和WGD发生。相比之下，基因扩增的主要驱动力是WGD和TD杨树［38.］．在柑橘中，TD和WGD事件的数量相似[35.］．comt的在玉米、水稻和谷子中有相似的基因拷贝数，这些基因组中的基因扩增主要是通过TD和片段复制产生的[32.］．猕猴桃的WGD KScomt的小于Ad-β均值k猕猴桃对．这一结果表明猕猴桃的WGDcomt的在AD-β的共享WGD之前发生。Tetraploid蓝莓的WGD KScomt的也小于二倍体蓝莓的Ad-β均值k。这一结果提示四倍体蓝莓的WGDVcCOMTs发生在共享Ericales WGD Ad-β事件之前。WGD k杜鹃williamsianum comt的在AD-β事件的KS之间和AT-γ事件的KS之间。这表明WGD杜鹃williamsianum发生在两个共享事件之间。5种基因复制模式的Ka/Ks比值comt的从4种植物中均小于1种，表明comt的经历了强烈的净化选择[48.］．

在果实发育过程中，果实中木质素含量呈先升高后降低的趋势。这一现象可能与果实发育过程中木质素的形成有关。早期果实膨大、变硬，木质素含量较高。从绿果期到变色期，果实变软，木质素含量呈下降趋势[67.］．基于VcCOMT来自RNA-SEQ，22的差异表达数据VcCOMTs采用qRT-PCR检测基因表达。在果实发育过程中，三个基因的表达趋势与木质素相似。虽然VcCOMT62与木质素在果实发育过程中的表达趋势一致。它在果实发育过程中的相对表达量过低。说明该基因在果实发育过程中不是与木质素含量相关的主基因。的相对表达式VcCOMT40和VcCOMT92在果实发育过程中几乎是最高的VcCOMTs．但单个基因在果实发育过程中的表达趋势与木质素略有不同。由于序列相似性高，为了反映个体基因的作用，在大多数序列不同的地方设计引物。我们在同源区域设计了一对引物，共4个VcCOMT基因（VcCOMT38, VcCOMT57, VcCOMT40, VcCOMT92)，相似性非常高。当我们再次进行qRT-PCR时，发现这一趋势与木质素在果实发育过程中的变化趋势一致。这表明不止一个基因负责木素含量的生物合成。

在这里，我们确定了92COMT的蓝莓和425的基因COMT的来自其他15个物种的基因。根据系统发育分析comt的，我们将comt的分成两组，表明存在两个祖先基因。DSD和WGD是蓝莓进化的主要推动力。基因复制模式的Ka/Ks比值comt的从4种植物中均小于1种，表明comt的经历了强烈的净化选择。根据QRT-PCR结果22VcCOMTs，VcCOMT40, VcCOMT92可能在蓝莓果实木质素合成中起重要作用。本研究的结果将为培育果实硬度更高、保质期更长的蓝莓品种奠定基础。

植物材料

样品是“Northland”蓝莓植物的果实，其增长和开发的6个阶段是从吉林农业大学的蓝莓种质资源花园获得的。通过增加尺寸（直径阶段，2-3.5mm;第2阶段，4-7毫米;第3阶段3,7-9 mm）来分类1至3。阶段3至6由果子颜色分类（第3阶段，白色蓝色，4阶段，25-50％的红色皮肤;第5阶段，主要是紫色皮肤，有一些红色;第6阶段，完全深蓝色和柔软质地）[67.]（图。7）.这些样本取自三种不同的健壮树木，冷冻在液氮中，储存在−80°C。

鉴定COMT的蓝莓和其他植物基因组中的基因

移植物蓝莓基因组从CoGe基因组数据库下载(https://genomevolution.org/coge/searchresults.pl?s=vaccinium&p= genome.）.确定完成COMT的蓝莓基因组中的基因，一个特征序列来自拟南芥(AT5G54160)和从毛白杨(Populus trichopa)中鉴定的36条序列作为一组BLASTP查询(E < 1e-5)。在Pfam()中使用HMM对所有搜索序列进行扫描，寻找一个特定的域(PF00891)http://pfam.xfam.org）.然后，利用在线节目CD-search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）识别完整的域名。我们进一步识别了COMT序列莱氏衣藻、安氏花、小立碗菌、卷柏、银杏、毛花Amborella、水稻、拟南芥、毛心杨、家苹果、西花悬铃、葡萄、猕猴桃、杜鹃嗯搜索．

系统发育，结构域基序和基因结构分析的预测VcOMT基因

首先，对来自蓝莓和其他物种的VcCOMTs蛋白序列进行多序列比对和ML方法，在MEGA 7.0中进行1000个bootstrap重复。利用CD-search技术对蓝莓VcCOMTs的结构域序列进行了预测。利用TBtools对其进行外显子/内含子结构分析VcCOMT基因（https://github.com/CJ-Chen/TBtools)，以mRNA序列和基因组序列[68.］．Meme Suite（http://meme-suite.org/tools/meme.)对VcOMT序列的基序进行分析，参数设置如下:out基序，11。

共线性分析comt的来自蓝莓和COMT的来自其他物种

共线性分析VcCOMTs使用MCScanX (https://github.com/tanghaibao/jcvi/wiki/MCscan- (python版本）.软件用于分析共同性comt的在猕猴桃和葡萄，蓝莓和杜鹃花和蓝莓和猕猴桃之间。

分析COMT的蓝莓中的基因启动子

启动子片段中的元素VcCOMT基因(翻译起始位点上游1500 bp)通过PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）.

基因复制和计算Ka和Ks与comt的从四个物种

蓝莓、葡萄、杜鹃花和猕猴桃的基因复制已经完成DupGen_finder（https://github.com/qiao-xin/dupgen_finder.)，使用GLWL模型的KaKs_Caculator计算Ka、Ks和Ka/Ks比值。因此,一个P保留-value < 0.05。

表达式的分析VcCOMTs用qRT-PCR检测蓝莓

22VcOMTs进行qRT-PCR。使用Primer Premier 5.0设计基因的引物。采用CTAB法从s1- s6果实中分离总RNA。在分光光度法检测浓度前，用1.2%琼脂糖凝胶在紫外光照下检测RNA，不涂抹。1微克总RNA按照制造商的说明，用带有gDNA橡皮擦(TaKaRa，日本)的PrimeScript™RT试剂试剂盒合成cDNA。实验的详细方法参照SYBR预混Ex Tag (Tli Rnase H Plus)的说明。VcOMT在ABI StealOnePlus实时定量PCR系统中分析基因表达（应用生物系统，福斯特城，USA）。热水瓶循环参数与Chen使用的参数相同[69.］．的如果遇到蓝莓基因被扩增EIFF和EIFR引物(附加文件1: Table S2)，并作为控件来规范化表达式VcOMTs［70］．采用Chen法对实时扩增数据进行分析，并进行40个周期的熔融曲线分析，以保证表达结果的可靠性。结果表示为规范化的相对表达式级别(2^−ΔCT）各种样品中的基因[69.］．所有实验重复进行三次。

木质素含量分析

乙酰溴化可溶性木质素按[71］．对照物质为木质素(脱碱)(CAS: 900-53-2，中国阿拉丁)。

蓝莓基因组从CoGe基因组数据库下载(https://genomevolution.org/coge/）.的基因序列莱茵衣藻、硫黄芪、小立碗菌、莫氏卷柏、毛鼻壶、葡萄来自合众工厂(https://plants.ensembl.org/index.html）.的基因序列家蝇，西花悬钩子来自德意志民主共和国(http://www.rosaceae.org.）.的基因序列猕猴桃对来自pgdd（http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/）.的基因序列杜鹃williamsianum下载自CoGe基因组数据库(https://genomevolution.org/coge/）.

OMT:

O-methyltransferases

COMT的:

咖啡酸O-methyltransferases

DSD:

分散重复

帕金森病:

近端复制

TRD:

转置重复

道明:

串联重复

WGD:

全基因组复制

MRCA：

最近的共同祖先

我们非常感谢中国辽宁省兴城中国农业科学院果树研究所李静教授提供的技术支持。我们也要感谢霍一乐、董坤、邓宇、杨涵予、钟晓宇、顾宇为我们提供的实验材料和方法。

吉林省科技发展项目(no . 20180201076NY, no . 20200402080NC)。关键词:岩石力学，岩石力学，数值模拟，数值模拟资助机构仅为这项工作的实验费用和出版费用提供资金。研究经费用于研究设计;数据的收集、分析和解释;撰写稿件并开放获取报酬。

从属关系

1. 吉林农业大学园艺学院，吉林省小果实遗传育种与创新利用工程中心，长春130118

   刘玉山，裴嘉波，李亚东，孙海月

2. 吉林农业大学生命科学学院，长春130118

   刘玉山，裴嘉波

3. 2 .中国科学院植物研究所植物资源重点实验室/北京植物园，北京，100093

   y州王

4. 2 .中国科学院大学，北京100049

   y州王

5. 2 .杭州市农业科学院园艺研究所，浙江杭州310000

   Jiabo裴

贡献

YL2和HS设计了整个实验。YL1进行生物信息学分析并撰写稿件。YW对发育蓝莓果实的图像进行了修改，并对其木质素含量进行了测定。JP进行了RT-PCR;所有作者均已阅读并批准最终稿件通讯作者。

相应的作者

对应到Yadong李或海悦的太阳．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

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