葡萄硝酸盐转运蛋白VvNPF6.5异位表达可提高拟南芥硝酸盐含量和氮利用效率

背景

硝酸盐在葡萄藤的营养和生殖发育中起着重要的作用。然而，葡萄对硝酸盐的吸收、转运和利用及其分子机制仍有待进一步研究。

结果

在本研究中，我们报道的功能表征vvnpf6.5.，硝酸盐转运蛋白1 /肽转运蛋白（NRT1 / PTR / NPF）的成员葡萄．拟南芥原生质体中的亚细胞定位表明，VVNPF6.5是局部膜的血浆膜。定量RT-PCR分析表明vvnpf6.5.主要在根和茎中表达，硝酸盐可迅速诱导其表达。使用注入crna的功能表征非洲爪蟾蜍光滑的研究表明，vnf6.5对硝酸盐的吸收依赖于pH值，并作为双亲和的硝酸盐转运体参与了高亲和和低亲和的硝酸盐摄取。进一步异位表达vvnpf6.5.在拟南芥中产生更多^15.没有_3.^-地上部和根部的氮素积累显著提高了氮素利用效率。此外，vvnf6.5可能通过正向调控初级硝酸盐应答基因的表达，参与硝酸盐信号转导。

结论

我们的结果表明vvnpf6.5.编码ph依赖的双亲和硝酸盐转运体。vpnf6.5调控葡萄植株中硝酸盐的摄取和分配，并参与初级硝酸盐反应。

葡萄园在全世界广泛种植。2018年，全球葡萄园地区和葡萄浆果产量分别为700万公顷，分别为7500万吨[1］．作为葡萄葡萄树最重要的营养素之一，氮气对藤蔓营养和生殖发展以及葡萄组合物具有很大的影响[2，3.］．足够的氮刺激葡萄的活力，这可以增加叶面积和叶片叶绿素，促进光合作用和蒸腾，也可以推迟叶片[4，5］．尽管如此，氮素过度受精的葡萄藤往往会降低次生代谢物合成，因为葡萄藤变得过度植物，增加了营养和生殖汇之间的竞争[6］．此外，过量的氮肥可能导致资源和环境污染浪费，并对人类健康造成严重危害[7］．氮气用途是葡萄园中的复合物，因为每个步骤，包括氮吸收，易位，同化和重组，受多次相互作用的遗传和环境因素来治理[7］．为了有效地利用氮气，精确地调节葡萄树，需要充分记录氮气吸收，分配和利用的机制。

硝酸盐是大多数陆地植物的主要来源，尤其是在有氧土壤条件下种植的那些[8］．土壤溶液中的硝酸盐浓度从几百微克摩尔的极低水平到20毫米左右，甚至高达70毫米[9］．为了应对如此广泛的浓度范围，植物进化出了两种硝酸盐吸收系统，高亲和转运系统(HATS)和低亲和转运系统(LATS) [10.］．在过去的20年里，至少有4个基因家族在高等植物硝酸盐转运中发挥作用，包括硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族(NRT1/PTR/NPF)、硝酸盐转运蛋白2家族(NRT2)、氯离子通道家族(CLC)和慢阴离子通道相关同源物(SLAC/SLAH) [11.］．

来自拟南芥的CHL1(又名NRT1.1或NPF6.3)是第一个被发现的NRT1/PTR/NPF转运蛋白[12.］．作为最著名的硝酸盐转运体，CHL1具有多种独特的功能性质。CHL1可以作为双亲和转运体参与高亲和和低亲和摄取，通过磷酸化T101来切换[12.，13.，14.］．同时，CHL1的硝酸盐感应功能支配着NO的表达_3.^--应答基因和NO_3.^-- 引起了根本发展的变化[15.，16.，17.］．此外，CHL1可以充当生长素流入促进剂，响应于硝酸盐调节横向根原基中的生长素梯度[18.］．

除了CHL1之外，还报道了许多硝酸盐转运蛋白，其在不同的器官或组织中起作用，以实现对硝酸盐吸收，分配和利用的微量控制。低亲和力硝酸盐转运蛋白ATNRT1.2，OSNRT1.1和OSNRT1.1b，以及高亲和力硝酸盐转运蛋白ATNRT2.1，ATNRT2.2，ATNRT2.4，ATNRT2.5，OSNRT2.1，OSNRT2.2和TANRT2.1所有人都被证明参与了根硝酸盐摄取[10.］．硝酸盐从土壤中吸收后，可通过AtNRT1.5、AtNRT1.8、AtNRT1.7、AtNRT1.9、OsNPF2.2、OsNRT2.3a、LeNRT2.3等转运载体转运到地上部[10.］．此外，硝酸盐可以通过CLCA，CLCB，NRT2.7，NPF5.11，NPF5.12和NPF5.16储存或从液泡中储存或释放出来或释放。19.］．然而，我们对葡萄藤中的硝酸盐转运体知之甚少。

在这项研究中，chl1.同源基因vvnpf6.5.在葡萄被识别和功能特征。我们的数据显示，质膜局部化VVNPF6.5是pH依赖性和双亲和硝酸盐转运蛋白。当在拟南芥中表达的异位缺陷时，VVNPF6.5可以增加植物中的硝酸盐含量并改善氮气使用效率（NUE）。此外，证明VVNPF6.5已被证明参与原发性硝酸盐反应。

克隆和序列分析vvnpf6.5.

为了探讨葡萄葡萄糖的吸收和翻译硝酸盐，我们鉴定了一种高度同源的蛋白质，其中CHL1葡萄并命名为vvnpf6.5（图S1)．使用的符号编号如下所示，learran等人建议。，2014年[20.］．完整的序列vvnpf6.5.使用表S中列出的引物从“汤普森无籽”葡萄藤的cDNA中扩增1．序列vvnpf6.5.与CHL1的同源性为67%，与osnrt11 . 1b的同源性为56%(图。1)．与CHL1和osnrt11 . 1b一样，vvnfp6.5也含有主要的facilitator superfamily (MFS)结构域，该结构域有12个跨膜结构域，跨膜结构域6和7之间有一个长亲水性环(图)。1)．

vvnf6.5定位于质膜

为了研究VVNPF6.5的亚细胞定位，VVNPF6.5在框架中与EYFP在CAMV 35的控制下融合，并且在拟南芥中培养基原生质体中瞬时表达融合蛋白。在EYFP控制中的细胞质中观察到荧光，而VVNPF6.5-EYFP的荧光信号在叶绿体信号外部形成环，表明VVNPF6.5在质膜膜中定位（图。2)．

VVNPF6.5是一种pH依赖性双亲和硝酸盐转运蛋白

为了阐明vppf6.5的功能，在非洲爪蟾蜍光滑的通过分析评估卵母细胞和硝酸盐摄取活性^15.没有_3.^-吸收的活动。因为K具有HATS的植物的m值在微摩尔范围内，而LATS表现出线性动力学或K毫摩尔范围内的M值[11.如前所述，使用10mm或0.25mm硝酸盐来确定硝酸盐摄取活性[13.，21.，22.，23.］．与水注射的卵母细胞相比，注射vvnf6.5的卵母细胞表现出增强^15.没有_3.^-10mm孵育时摄取活性^15.没有_3.^-或0.25毫米^15.没有_3.^-pH值为5.5时(图。3.a、b)，与阳性对照CHL1一致，说明vvnf6.5是一种兼具低亲和力和高亲和力摄取活性的硝酸盐转运体。然而,^15.没有_3.^-pH值7.4时注射vvnf6.5的卵母细胞摄取活性明显低于pH值5.5时(图5)。3.C，D）和与水注入的卵母细胞相当，表明VVNPF6.5是质子偶联的硝酸盐转运蛋白。在一起，这些发现表明VVNPF6.5用作pH依赖性双亲和硝酸盐转运蛋白。

的表达模式vvnpf6.5.

基因的组织特异性表达可为编码蛋白的生理功能提供线索。探究。的表达模式vvnpf6.5.，QRT-PCR在不同的葡萄组织中进行。如图所示。4A，表达水平vvnpf6.5.根和茎的根部和茎高于叶柄，卷须和花中，并且在叶子，剥离和肉体中几乎没有检测到。调查是否vvnpf6.5.是硝酸盐诱导的，从氮饥饿培养基转移葡萄幼苗，将根组织收获以分析。如图所示。4b,vvnpf6.5.在1 h内快速诱导表达(超过4倍)，随后逐渐下降，但至少24 h后仍高于不添加硝酸盐的表达量。这些表达分析vvnpf6.5.说明它可能参与了硝酸盐的吸收。

VVNPF6.5的异位表达改善了硝酸含量和纽约州拟南芥

在35S启动子和2个代表性品系(#9和#20)的控制下，将vvnf6.5导入野生型拟南芥(Col-0)中，研究其功能。OE1和OE2选择进一步表型分析（图S2)．当vvnpf6.5.异位过表达系喂养^15.没有_3.^-30分钟，^15.n枝条的浓度OE1和OE2分别增加了13.23和18.63%，^15.n浓度在根中OE1和OE2与野生型植物相比，分别增加了21.54和27.90％（图。5a，b）。然而，野生型对照和转基因植物之间的硝酸盐浓度没有差异（图。3.)．观察是合理的，因为过量吸收硝酸盐可以进一步参与硝酸盐同化。此外，通过确定干重和总氮含量，我们检查了拟南芥转化体的NUE [24.］．如图所示。5c，nue的OE1和OE2与野生型相比，改善了4.48和5.89％。这些结果表明，VVNPF6.5涉及从土壤和根到枝条的硝酸盐摄取，进一步影响NUE。

vvnf6.5参与了初级硝酸盐反应

作为一个重要信号，硝酸盐可以迅速诱导几种硝酸盐相关基因的表达[12.］．快速转录反应已被称为原发性硝酸盐反应[25.］．表达式vvnpf6.5.如图所示。4湾为了确定VVNPF6.5是否参与初级硝酸盐响应，两种硝酸盐诱导基因的表达，硝酸还原酶1（atnia1.）和亚硝酸盐还原酶基因（atnir.)，在vvnpf6.5.过度表达线[26.］．当野生型植物暴露于10mm硝酸盐时，atnia1.和atnir.在30分钟内诱导高度诱导（图。6)，这与以往的研究结果一致[26.］．进行了相同的治疗方法OE1和OE2，我们找到了atnia1.和atnir.还通过硝酸盐诱导了类似的时间过程，而感应水平明显高于野生型的水平（图。6)．统称，这些数据表明VVNPF6.5也可能参与原发性硝酸盐反应。

硝酸盐转运体在拟南芥、水稻、小麦、番茄等物种中均有报道[10.，27.，28.，29.］．然而，仅在葡萄中发现了VvNPF3.2，它作为硝酸盐和亚硝酸盐的低亲和转运体，并在白粉病侵染期的寄主营养分配中发挥作用[30.］．在本研究中，我们鉴定了另一种硝酸盐转运体vvnf6.5，它是一种双亲和的硝酸盐转运体，主要在根和茎中表达，并证明vvnf6.5在葡萄中负责硝酸盐的摄取和分配。

vvnpf6.5.属于NRT1 / PTR / NPF的家庭。在该家庭中，仅CHL1及其同源蛋白MTNRT1.3和OSNRT1.1b表现为双亲和硝酸盐转运蛋白，而其他成员则表征为低亲和力硝酸盐转运蛋白[31，32］．通过分析评估VVNPF6.5的高亲和力硝酸盐摄取活性^15.没有_3.^-注射crna的爪蟾卵母细胞在10mm和0.25 mM处的摄取活性(图。3.)．有趣的是，VVNPF6.5还用作双亲和硝酸盐转运蛋白。序列对齐显示rxxt^100.在vvnpf6.5.与磷酸化位点RXXT相同吗^101.在chl1.，负责低 - 和高亲和力之间的偏移（图。1)．该调节机制允许植物迅速改变硝酸盐摄取的亲和力，这在竞争有限硝酸盐时可能是至关重要的[14.］．然而，该位点也在其他低亲和硝酸盐转运体中发现，这表明可能还有其他的调控机制。

表达vvnpf6.5.被硝酸盐诱发（图。4b）类似于调节硝酸盐摄取的硝酸盐转运蛋白基因，如chl1.，AtNRT2.1和AtNRT2.1［11.］．这些硝酸盐转运基因和硝酸盐摄取活性的转录物丰度之间的强关系表明，转录调节在调节硝酸盐摄取活动方面发挥着重要作用[11.］．除了吸收特性外，我们发现vvnf6.5参与了硝酸盐的长距离转运，因为表达水平vvnpf6.5.茎和茎相对较高^15.在过度表达线的芽中的内容也在增加之后增加^15.没有_3.^-喂食（图。5a).识别参与硝酸盐长距离运输的转运体具有重要意义，因为这个过程决定了硝酸盐在不同组织间的分布和随后的同化，进而影响营养利用效率[33］．

据报道，几种硝酸盐转运体有助于提高氮的利用效率。osnrt11 . 1b在作物遗传改良中发挥着重要作用，因为其多态性可能导致作物氮素利用效率的差异[31］．协调规范bnnrt1.5.和BNNRT1.8能促进土壤硝态氮向地上部分分配，有利于提高氮肥利用效率芸苔栗鸟［24.］．增加表达osnrt2.1.，特别是在控制下OsNAR2.1启动子，可以提高水稻中的产量和纽约[34］．在本研究中，VVNPF6.5被证明在葡萄中调节NUE中的作用，因为与拟南芥中的野生型，转基因植物显示出更高的NUE（图。5c).这些研究表明，硝酸盐转运体可以通过调控氮素利用效率的吸收或长距离转运来提高氮素利用效率，说明获得硝酸盐是非常重要的，为氮素利用效率的研究提供了新的视角。

硝酸盐功能不仅是营养素，还具有信号分子。硝酸盐信号传导参与调节根部发育等许多生理过程，拍摄生长，无关的气孔开口，开花时间和种子休眠[17.，35］．初级硝酸盐反应是最广为人知的硝酸盐诱导反应，在硝酸盐处理下，几种硝酸盐转运体和硝酸盐同化酶的表达被快速诱导[36］．时序分析vvnpf6.5.表达显示vvnpf6.5.被硝酸盐快速且高度诱导(图。4b），与原发性硝酸盐反应一致。因此，进一步检测到VVNPF6.5对硝酸法信号的影响。在vvnpf6.5.过表达系，两个已知的初级硝酸盐反应基因的快速诱导表达，NIA1和德文，增强了（图。6)，提示vvnf6.5可能参与了硝酸盐信号转导。CHL1被证明在初级硝酸盐反应中作为硝酸盐信号的传感器[16.］．据推测，这种功能可能不局限于CHL1，可能涉及来自不同物种的其他NRT1/PTR/NPF蛋白[37］．VVNPF6.5是葡萄园中有趣的候选者，而需要进一步研究以测试VVNPF6.5是否也是硝酸盐传感器。

鉴于这一点^15.没有_3.^-根和地上部含量增加。5A, b)时，初级硝酸盐反应增强vvnpf6.5.过表达（图。6)的研究表明，葡萄根系可能利用一种负责硝酸盐吸收和转运的转运载体(如VvNPF6.5)来监测土壤中硝酸盐浓度的变化，从而诱导硝酸盐相关基因的表达，进而调控氮代谢。综上所述，高表达系的氮素利用效率可能是通过调控根系对硝酸盐的吸收、根系到地上部的长距离运输和硝酸盐信号转导来实现的。

在这项研究中，我们鉴定和功能特征在于葡萄藤中的硝酸盐转运蛋白VVNPF6.5。VVNPF6.5本地化为血浆膜，用作pH依赖性双亲和硝酸盐转运蛋白。过度表达vvnpf6.5.在拟南芥可以增加芽和根部的硝酸盐含量，并改善NUE，表明VVNPF6.5调节硝酸盐的吸收和分配。此外，vvnpf6.5.事实证明，在葡萄园的原发性硝酸盐反应中起着重要作用。本研究将为进一步探索玻璃树脂的进一步探索，并为葡萄园中的NUE提供候选基因提供候选基因。此外，本研究还将提供用于鉴定其他硝酸盐转运蛋白的方法参考。

植物材料和生长条件

拟南芥（拟南芥）从拟南芥生物资源中心获得生态型哥伦比亚-0（Col-0）（https://abrc.osu.edu/）并用作野生型控制。OE1和OE2转化得到两个T3纯合子系吗vvnpf6.5.在Cauliflower马赛克病毒35s（CAMV 35S）启动子的控制下进入COL-0（图S4），使用花卉DIP方法[38］．野生型Col-0，而不是同源基因突变体chl1用于转型，因为没有直接证据表明硝酸盐内容chl1是较低的。野生型和过表达系在22°C水培溶液中生长，16-h光/8-h暗循环，如前所述[39］．在3至4周龄，植物暴露于图​​例中的图例所示的治疗。

葡萄采自沈阳长青葡萄科技有限公司10年栽培的“马斯喀特巨峰”(诉酿酒用葡萄×诉出发）和'kyoho'（诉酿酒用葡萄×诉出发)幼苗在上海市农业科学院温室(北纬30°51′，东经121°13′)的土壤或无土生长系统中种植。在5 L盆栽中进行无土生长试验，盆栽中含有改性霍格兰营养液(mM: NO_3.^-6.40;阿宝₄³⁻0.50;K⁺，2.50;加利福尼亚州²⁺2.20;毫克²⁺1.20;所以₄²⁻1.20;以μM为单位:Fe²⁺30.00;Na⁺30.00;m²⁺，3.50;NH.₄⁺0.30;薄_3.³⁻17.50;锌²⁺0.25;MoO₄²⁻0.05;铜²⁺0.125)。以KNO为替代物，配制氮饥渴营养液_3.和ca（没有_3.）₂用kcl和cacl₂．对同一小区的植物进行不同器官的随机取样。在营养发育阶段采集叶片、叶柄、茎、卷须和根。花在盛花期采集，成熟期采集果皮和果肉。

vvnf6.5基因的克隆及序列分析

在蛋白-蛋白BLAST中以CHL1作为查询序列时，vvnf6.5是最佳匹配蛋白诉酿酒用葡萄（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)．NRT1 / PTR / NPF运输车的所有成员的系统发育树拟南芥（https://www.arabidopsis.org/） 和葡萄（http://plants.ensembl.org/index.html.)，与CHL1的序列相似度最高[20.］．vvnpf6.5.因此选择并通过PCR使用表S中列出的引物进行扩增1．将PCR产物克隆到PGEM-T易载体（Promega，USA）中，然后进行测序。NCBI保守的域数据（CDD）搜索用于识别保守域（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi.)．跨膜区域的确定根据Sun等人，2014 [40］．

vvnf6.5在非洲爪蟾蜍光滑的卵母细胞

1.8 kBvvnpf6.5.将cDNA克隆到卵母细胞表达载体pOO2中[41］．cRNA的合成如上所述[19.］．从多只青蛙卵母细胞中分离出50 ngvvnpf6.5.如前所述[12.]，除了Barth溶液被ND96 (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂， 1.8 mM CaCl₂和5 mm hepes，pH 7.4）[42］．chl1.CRNA和水注入的卵母细胞分别用作正和阴性对照。每种处理注入至少30个优质卵母细胞。在ND96溶液中孵育卵母细胞2d，之后丢弃受伤，畸形或灰色的溶液和乳脂状半和棕褐色或棕色一半的大型均匀圆形卵母细胞，或者选择赤道带进行进一步实验[43］．实验中使用的青蛙会在实验后恢复意识，并被放回水箱中。一只青蛙可以提供四次卵母细胞，间隔至少3个月[43］．在那之后，这些青蛙将继续被保存几年，直到它们自然死亡，它们的尸体将被移交动物设施进行进一步处理。用于分析吸收特性^15.N测定，在含有230mM甘露醇，0.3mM CaCl的溶液中温育卵母细胞3小时₂，10 mm mes-tris，pH 5.5或7.4，以及k的所需浓度^15.没有_3.然后用ND96缓冲液冲洗六次，并在80℃下干燥48小时[23.］．保留^15.然后测量每个卵母细胞的N在耦合到碳氮元素分析仪（Thermo Fisher Scientific Delta V优势）的连续流量同位素比质谱仪上。

拟南芥原生质体变换的亚细胞定位

vvnpf6.5.使用表S中列出的引物扩增cDNA1将扩增的DNA片段克隆到载体35S:: EYFP前框中EYFP/ PA7，导致CAMV 35S启动子控制下的最终VVNPF6.5-EYFP构建体。融合构建体或矢量35s ::EYFP然后使用之前描述的方法在拟南芥原生质体中瞬时表达/ pA7。44］．拟南芥原生质体从3 ~ 4周龄土壤植株的叶片组织中分离得到。EYFP被QIAGEN质粒试剂盒（QIAGEN，德国）分离的用药质粒转化为原生质体。在黑暗中在W5溶液中孵育超过24小时后，使用共聚焦显微镜（Nikon C2-ER）成像荧光细胞。

RT-PCR和定量RT-PCR

按照说明书，使用RNAprep Pure Plant Plus Kit(中国天根)提取RNA。使用Takara PrimeScript™RT试剂Kit with gDNA Eraser (Takara, Japan)合成第一链cDNA。PCR采用Hieff™PCR Master Mix (Yeasen，中国)进行。定量RT-PCR采用LightCycler 480系统(德国罗氏)，使用SYBR Premix Ex-Taq(日本TaKaRa)，根据制造商的协议。分析所用的引物列于表S1．

纽约州分析

收获植物并在105℃下在烘箱中在烘箱中干燥30分钟，然后在80℃至恒定重量并称重。使用碳氮元素分析仪（Thermo Fisher Scientific Delta V优势）测定N浓度。基于干生物质的NUE值被计算为植物中生物质/总N的比例[24.］．

^15.没有_3.^-标记分析

野生型和过度表达线均匀生长24天，然后用含有2.25mm k的水培素培养基处理^15.没有_3.99％的原子过量^15.n 30分钟。枝条和根部分离并收获，和收获^15.检测到的N含量如下所述[19.］．

统计分析

双尾学生的t测试被执行。差异被认为显著(*)P< 0.05且极显著(**)P < 0.01.

vppf6.5序列已存入GenBank，登录号为MW094160。

NRT1 / PTR / NPF:

硝酸盐转运蛋白1 /肽转运蛋白家庭

nue：

氮利用效率

帽子：

高亲和力运输系统

背阔肌:

低亲和力运输系统

NRT2:

硝酸盐运输器2家庭

CLC:

氯通道的家庭

线性/ SLAH:

缓慢的阴离子通道相关同源物

Camv 35s：

花椰菜马赛克病毒35s启动子

atnia1.：

硝酸还原酶1

atnir.：

亚硝酸盐还原酶基因

我们感谢Jiming Gong博士（CAS Cents of Molecular植物科学卓越），用于帮助卵母细胞摄取和^15.N分析。

上海市农业系统青年人才发展计划(批准号:20180112)。关键词:土，抗剪强度，抗剪强度资助者没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释，也没有参与手稿的撰写。

从属关系

1. 上海市农业科学院上海市农业科技科技园区林业研究所，上海市农业科学院

   yani he，xiaojun xi，钱志＆jiang

2. 中国科学院上海生命科学研究所植物生理生态研究所，上海，中国

   玉ing

贡献

YH和AJ设计了这项研究。YH，XX，QZ和YL进行了实验。YH和AJ分析了数据。YH和AJ写了这篇论文。所有作者都读过并批准了稿件。

相应的作者

对应于yani他或者艾利江．

伦理批准并同意参与

的非洲爪蟾蜍光滑的卵母细胞研究获上海市农业科学院伦理委员会批准。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

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