新型e亚基五五肽重复蛋白DEK55负责多个位点的RNA编辑和剪接gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba在玉米gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

戊庚二肽重复（PPR）蛋白质构成大量蛋白质家庭，其成员参与细胞器和植物生长的RNA加工。先前的报道表明，E-亚组PPR蛋白参与RNA编辑。然而，E-亚组PPR蛋白的附加功能和作用是未知的。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，我们开发并鉴定了一种新的玉米籽粒突变体，该突变体具有抑制胚和胚乳发育的功能，即gydF4y2Ba有缺陷的内核gydF4y2Ba（gydF4y2BadekgydF4y2Ba）gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba（gydF4y2Badek55gydF4y2Ba）.遗传和分子证据表明，在ZM00001D014471的开放阅读框（ORF）内的单核苷酸改变（C至T）在+ 449bp中产生的缺陷核（以下简称为gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba）.gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba编码线粒体内的E-亚组PPR蛋白。分子分析表明，24个RNA编辑位点的编辑百分比降低，七个RNA编辑部位的编辑百分比增加gydF4y2Badek55gydF4y2Ba粒，其位点分布于14个线粒体基因转录本。此外，剪接效率gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba内含子1和4和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba内含子1显着下降gydF4y2Badek55gydF4y2Ba与野生型(WT)相比。这些结果表明DEK55在多个位点的RNA编辑以及剪接中发挥着关键作用gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba内含子。突变的gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba基因导致线粒体复合体的功能障碍I.此外，酵母双杂交测定结果显示DEK55与两种多种细胞素RNA编辑因子（Morf），即ZMMORF1（ZM00001D049043）和ZMMORF8（ZM00001D048291）相互作用。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究结果表明gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba基因影响玉米内核发展所必需的线粒体功能。我们的结果还提供了对植物细胞器RNA加工的E-Subgromoup PPR蛋白的分子功能的新颖洞察。gydF4y2Ba

五碳肽重复序列(Pentatricopeptide repeat, PPR)蛋白组成了一个大的蛋白家族，在大多数陆生植物中都有发现，共有450多个成员gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba,gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba［gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．这些蛋白质含有标准串联简并重复基序，其形成约35个氨基酸的螺旋环螺旋结构。PPR蛋白主要根据其PPR重复基序分为p-和PLS型亚壳[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．P亚家族PPR蛋白只包含经典的“P”基序重复序列，而pls亚家族PPR蛋白包含三个不同长度的PPR基序交替重复序列。后者通常根据羧基端是否存在E、E+或DYW结构域而分为PLS、E、E+和DYW亚基[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．一种新的PPR蛋白，在羧基端含有小的muts相关结构域，也被鉴定出来，[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

p型PPRs被认为参与了II组内含子剪接、RNA稳定、剪切、翻译激活和转录本积累。相比之下，PLS-type PPRs在细胞器转录本特定位点胞苷(C)向尿苷(U)的转化中发挥着重要作用[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．大多数植物PPR蛋白以线粒体、叶绿体或两者为目标，并调节这些细胞器的功能和发育[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．在线粒体中，氧化磷酸化系统包含五个络合物（I-V）[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．这些复合物的正常组装对于维持线粒体功能至关重要，这需要对线粒体前mrna进行标准处理，包括RNA编辑和内含子剪接[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．许多PPRS负责线粒体中的RNA后术治过程[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

E-subgroup PPR proteins (e.g., slow growth 1 (SLO1), organelle transcript processing 87 (OTP87), mitochondrial editing factor 3 (MEF3), MEF9, MEF12, and mitochondrial PPR 25 (MPR25)) play vital roles in mitochondrial RNA editing and plant development [22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]．此外，几个e亚群蛋白在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和米参与RNA剪接[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．在玉米中，已经表征了五种e-亚组PPR蛋白质，所有这些酶蛋白质都参与了RNA编辑。小内核（SMK）1（SMK1）至关重要gydF4y2BaNAD7.gydF4y2Ba-836在线粒体编辑，在玉米和米中保守[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．SMK4对于RNA编辑至关重要gydF4y2Ba细胞色素C氧化酶1gydF4y2Ba（gydF4y2Bacox1gydF4y2Ba）在位置+ 1489 bp [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，gydF4y2BaccmFgydF4y2Ba_NgydF4y2Ba对于细胞色素C成熟至关重要，而空的PericaRP 7（EMP7）负责其在+ 1553 BP位置的编辑[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．DEK39是RNA编辑所必需的gydF4y2BaNAD3.gydF4y2Ba线粒体的转录物[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]和DEK10负责三个地点的RNA编辑gydF4y2BaNAD3.gydF4y2Ba和gydF4y2Bacox2gydF4y2Ba成绩单(gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．然而，尚不清楚E-亚组PPRS是否参与玉米细胞器中的RNA编辑和内含子剪接。gydF4y2Ba

在这里，我们鉴定了玉米突变体gydF4y2Badek55gydF4y2Ba，具有胚胎致致死表型和被捕的胚乳显影，这是由线粒体局部化的E-亚组PPR蛋白DEK55的突变引起的。在gydF4y2Badek55gydF4y2Ba突变体，拼接效率gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba内含子1和4gydF4y2BatransgydF4y2Ba拼接和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba基因内区1gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- 塑造减少。此外，编辑24个编辑网站的百分比（gydF4y2BaATP1.gydF4y2Ba-1490年,gydF4y2BaATP8gydF4y2Ba-123，gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-160年,gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-799年,gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-866年,gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-906，gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-1144，gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-1244年,gydF4y2BaCCMFN.gydF4y2Ba-287，gydF4y2BaCCMFN.gydF4y2Ba-302年,gydF4y2BacgydF4y2Ba-564年,gydF4y2Bamat-rgydF4y2Ba-1877年,gydF4y2BaNAD3.gydF4y2Ba-146，gydF4y2BaNAD3.gydF4y2Ba-190，gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba-77，gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba-25年,gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba-138，gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba-146，gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba-159，gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba-161年,gydF4y2Barps12-ctgydF4y2Ba-418，gydF4y2Barps12gydF4y2Ba-284年,gydF4y2Ba核糖体蛋白S13gydF4y2Ba（gydF4y2Barps13gydF4y2Ba-56年),gydF4y2Barps3.gydF4y2Ba-69）也大幅减少。此外，DEK55可以与酵母中的ZMMORF1和ZMMORF8相互作用，这可能负责DEK55对多个编辑位点的活动。我们的结果表明，E-亚组PPR蛋白DEK55涉及玉米线粒体中的RNA编辑和II组内含子剪接。gydF4y2Ba

遗传和表型分析gydF4y2Ba有缺陷的内核55-1gydF4y2Ba（gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba)突变体gydF4y2Ba

从乙基甲磺酸丁酯诱导的玉米B73背景人群中分离出具有缺陷核表型的突变体，随后被命名gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba．的gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba自交后代分离的种子gydF4y2BaDEK55-1 / +gydF4y2Ba杂合子的孟德尔比率为1:3(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA，附加文件1：表S1）。这些结果表明gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba是由单基因突变引起的，这在其他种群中得到了证实gydF4y2BaDEK55-1 / +gydF4y2Ba杂合子与C733或S162自交系杂交(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S1）。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba与野生型相比，授粉15 d后，籽粒变小，果皮呈白色，与野生型相比，籽粒变小，果皮呈白色。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).在成熟期gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba仁较小并萎缩（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab, c).进一步确定突变表型，包括WT和gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba在15 DAP时纵向切粒。与野生型籽粒相比，突变型籽粒胚乳小而软。(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad，e）。此外，与WT内核相比，gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba核含有较小的成熟胚胎和较小的硬胚乳比例（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf，g）。另外，重量gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba与WT核相比，WT核降低了约70%(图3)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaH）。不gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba种子(0/100)在田间条件下萌发，表明突变体的胚胎阻滞是致命的。gydF4y2Ba

进一步调查发展结构gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba内核，我们检查了WT的内核组织结构gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变体在12和18 dap（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaI-L）。在12个dap，gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba胚只有一个小的盾片，其发育在胚芽期受阻，胚乳与种皮之间有较大的间隙。相比之下，WT胚包含一个可见的胚芽鞘，一个茎尖分生组织，一个盾片和两个叶原基，核中充满胚乳细胞(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba我，j）。在18 dap，WT胚胎开发了完整的结构，包括四个叶片原序，拍摄顶端分类和清晰可见的根顶部分页（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bak），虽然gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba胚胎仅呈现单叶原始（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bal）。此外，累积的淀粉颗粒较少gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba这一时期的胚乳细胞比野生型胚乳细胞多(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaK, l)，在gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Baendosperm（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba综上所述，这些结果表明，胚和胚乳发育缺陷已经发生gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变体。gydF4y2Ba

图谱克隆的gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba

识别gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba基因，应用经典的图位克隆策略对子代2 (FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba）从自授粉f中间隔离的突变核gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba混合的耳朵。利用4个基因组DNA库(每个库10个突变核)和双亲的DNA来确定染色体位置gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba基因。5号染色体上的6个SSR标记与籽粒缺陷表型相关性较强，提示候选基因可能在5号染色体上。进一步的分析表明gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba基因位于染色体5上的UMC1705和UMC2302之间（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。来自f的一千八百六十八十八十八十八十八十六十gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过使用六种多态性分子标记，人群群体缩小基因位置。的gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba基因最终定位于分子标记3 (M3)和M4之间约1.29 Mb的区域(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).该区域推定有25个蛋白质编码基因(gydF4y2Bahttp://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/IndexgydF4y2Ba）.为了鉴定突变的基因，扩增和测序25个候选基因的基因组DNA。序列对准显示E-亚组PPR蛋白基因（ZM00001D014471）中的单核苷酸多态性。在gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变体在+ 449 bp处将C核苷酸替换为T核苷酸，导致丝氨酸(Ser)被苯丙氨酸(Phe)取代。然而，mRNA表达水平没有变化(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba模拟)。为了验证我们的结果，我们获得了一个新的突变体，gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba，来自玉米乙基甲磺酸盐诱导的突变体数据库[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]．的gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba突变体在+ 729 bp处出现单核苷酸突变(G到a)(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）导致截短蛋白质（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad)。突变体gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba也产生有缺陷的果仁，果皮小，呈白色(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae).之间的等位基因测试gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba和gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba杂合子显示正常和突变核在预期的3：1比（正常/突变体; 450/143;gydF4y2BaPgydF4y2Ba = 0.62) in the F_1gydF4y2Ba耳朵(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae).作为对照，所有的玉米粒从穗之间交叉gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba杂合子和WT正常(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae）。总之，这些结果表明，ZM00001D014471PPR基因中的突变对缺陷的核表型负责，因此指定了注释基因gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

DEK55是线粒体E-亚组PPR蛋白gydF4y2Ba

序列比对表明gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba基因是一个长1893 bp，没有内含子的ORF。此外,gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba编码含有13PPR基序的630个氨基酸蛋白质和在羧基末端的E域（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB-D和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图。S1）。突变gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba和gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba分别位于第3和第5个PPR基序(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad）。突变gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba导致DEK55蛋白被截断，缺失了最后8个PPR基序和E结构域。gydF4y2Ba

为了检测DEK55的亚细胞定位，agydF4y2BaP35S.gydF4y2Ba构建dek55增强绿色荧光蛋白(EGFP)载体，转化玉米原生质体。DEK55-EGFP的荧光信号与MitoTracker(一种线粒体特异性染料)的荧光信号重叠(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa），表明，在玉米中，DEK55是线粒体PPR蛋白（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一种）。此外，各种玉米组织中的表达分析证明了gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba在根、花药和穗中表达量相对较高，在茎、叶、丝、穗和籽粒中表达量相对较低。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

DEK55参与多个站点的14个转录物的c-to-U编辑gydF4y2Ba

PPR蛋白通常参与改性细胞石转录物[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．有报道称e亚群PPRs参与了线粒体pre- mrna的C-to-U编辑[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．为了探究DEK55是否参与了这一过程，我们分析了35个编码功能蛋白的玉米线粒体基因的转录水平gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba内核。RNA编辑这些转录物gydF4y2Badek55gydF4y2Ba（gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba和gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．测序reads被映射到35个线粒体基因转录本上，在WT和WT中检测482个c - u RNA编辑位点gydF4y2Badek55gydF4y2Ba内核(附加文件2:表S1)。结果表明，与这些RNA编辑位点相比，WT和gydF4y2Badek55gydF4y2Ba内核（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：表S2），14个转录物中的31个编辑网站的C-to-U编辑百分比（gydF4y2BaATP1.gydF4y2Ba，gydF4y2BaATP8gydF4y2Ba，gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba，gydF4y2BaCCMFN.gydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2Bamat-rgydF4y2Ba，gydF4y2BaNAD3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba，gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba，gydF4y2BaNAD7.gydF4y2Ba，gydF4y2Barps12-ctgydF4y2Ba，gydF4y2Barps12gydF4y2Ba，gydF4y2Barps13gydF4y2Ba,gydF4y2Barps3.gydF4y2Ba）显着改变了gydF4y2Badek55gydF4y2Ba内核(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：表S2-S4），而24个站点的编辑百分比减少（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa）七个地点的增加gydF4y2Badek55gydF4y2Ba与WT核相比(图4)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：表S2和S4）。编辑效率gydF4y2BaATP1.gydF4y2Ba-1490年,gydF4y2BaCCMFN.gydF4y2Ba-287，gydF4y2Bamat-rgydF4y2Ba-1877，和gydF4y2Barps13gydF4y2Ba-56位点在急剧下降gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba和gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba内核，编辑百分比gydF4y2Badek55gydF4y2Ba突变体比WT籽粒低50％以上的50％（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：表S3）。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）产物的直接测序gydF4y2BaATP1.gydF4y2Ba-1490年,gydF4y2BaCCMFN.gydF4y2Ba-287，gydF4y2Bamat-rgydF4y2Ba-1877年和gydF4y2Barps13gydF4y2Ba-56个站点也表明编辑效率明显降低gydF4y2Badek55gydF4y2Ba这些RNA编辑位点的核(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC）。缺乏C-to-U RNA编辑导致改变的氨基酸残基gydF4y2Badek55gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba此外，在gydF4y2Baatp8 -gydF4y2Ba123网站的编辑效率只有这个gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba粒子（5％）比WT内核低50％以上，而且gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba-77个站点，仅编辑效率gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba粒子（24.2％）比WT内核的粒度低50％（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).综上所述，以上结果表明DEK55对于多位点的RNA编辑是必需的，尤其是在RNA编辑中gydF4y2BaATP1.gydF4y2Ba-1490年,gydF4y2BaCCMFN.gydF4y2Ba-287，gydF4y2Bamat-rgydF4y2Ba-1877，和gydF4y2Barps13gydF4y2Ba-56网站。gydF4y2Ba

DEK55对此至关重要gydF4y2BatransgydF4y2Ba- 塑造gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba1号和4号内含子gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- 塑造gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba基因内区1gydF4y2Ba

对35个玉米线粒体基因的转录水平进行了检测，结果表明gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba显着下调gydF4y2Badek55gydF4y2Ba突变体（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一种）。基因组DNAgydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba包含4个II组内含子，除第2组内含子外，其余均为gydF4y2BatransgydF4y2Ba拼接内含子。(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC）。基因组DNAgydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba有三个gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba剪接基因内区(图gydF4y2Ba5gydF4y2Bad）[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．完整成熟gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba转录物需要完整的内含子拼接。因此，我们进一步分析了内部剪接效率gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba，gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba和其他基因gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba通过定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）和Wt核。与WT内核相比，第一和第四内含子的拼接效率gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba第一个内含子gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba在里面gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变粒减少（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).此外，我们扩增了每个内含子和完整的转录本gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba通过RT-PCR（图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC，D）。抄本丰富gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba外显子1-2、4-5和全长DNA片段明显减少(图4)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac). RT-PCR不能扩增该基因的内含子DNA片段(1F + 2R、3F + 4R、4F + 5R)gydF4y2Badek55gydF4y2Ba而Wt内核是因为第1，第3和第4内含子gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba是gydF4y2BatransgydF4y2Ba-cepliced。(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).未剪接的第二内含子片段gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba在里面gydF4y2Badek55gydF4y2Ba突变粒类似于WT核中的核（图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC）。丰富的gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba拼接外显子1-2和全长DNA片段显着下降，并且丰富gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba未剪接的内含子1转录本显著增加(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad）。我们的研究结果表明大量的大幅下降gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba抄本在gydF4y2Badek55gydF4y2Ba突变核是由于剪接异常引起的gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba内含子1，gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba内含子1和内含子4(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba模拟)。因此，DEK55是必要的gydF4y2BatransgydF4y2Ba- 两者的塑造gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba内含子(1号和4号)和gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-第一个的拼接gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba在玉米基因内区。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变体表现出降低的综合性I活性和增加的替代呼吸道途径活性gydF4y2Ba

四个基因，即，gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba，gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba，gydF4y2BaNAD3.gydF4y2Ba,gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba，分别对复杂I NAD1，NAD4，NAD3和NAD6的亚基进行编码[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．的gydF4y2Barps13gydF4y2Ba基因编码核糖体蛋白，和gydF4y2BaATP1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaATP8gydF4y2Ba编码ATP酶亚单元1和ATP合成酶F1的亚基8亚基[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．这些基因转录后处理的缺陷可能会损害线粒体复合物的生物合成[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．我们进行了蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和凝胶中的NADH脱氢酶活性测定，以研究WT和含量的线粒体复合物的积累水平和活性gydF4y2Badek55gydF4y2Ba1胚乳。BN-PAGE显示了配合物I和超配合物I + III的丰度gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在里面gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变体显着降低（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).然而，复合物V在野生型胚乳与野生型胚乳之间没有显著差异gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Baendosperm（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一种）。此外，复合物I和I + III的活性gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba减少了gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变体（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab）。这些结果表明线粒体转录物剪接和/或编辑中的缺陷可能影响线粒体复合体I的丰富和活性。gydF4y2Ba

植物的线粒体呼吸链包括细胞色素gydF4y2BacgydF4y2Ba和替代氧化酶（AOX）途径[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．当主要细胞色素gydF4y2BacgydF4y2Ba途径被阻断，可以增加AOX活性以补偿呼吸道途径[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．在gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba，废除了复杂的函数（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa, b)。因此，我们采用qRT-PCR检测gydF4y2BaAOXgydF4y2BaWT基因和gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba内核，结果表明，表达水平增加了512倍gydF4y2BaAox2.gydF4y2Ba基因的gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变核与WT核的比较。(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaC）。集体，我们的结果表明呼吸道途径被严重阻止gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba线粒体。gydF4y2Ba

DEK55与酵母中的ZmMORF1和ZmMORF8相互作用gydF4y2Ba

以前的研究表明，Morfs直接与PPR蛋白相互作用，并在许多编辑网站下在RNA编辑中发挥作用[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]．在本研究中，DEK55被发现负责玉米中的31个RNA编辑事件，因此我们推测DEK55可以与Morfs相互作用，形成玉米RNA编辑的编辑复合物。因此，我们使用了MorfsgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba作为寻找玉米中假定的MORFs的诱饵;在玉米中鉴定出7个推测的MORFs(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一种）。进行酵母双杂化测定对筛选与DEK55相互作用的Morf，结果表明，DEK55可以与ZmmorF1和Zmmorf8相互作用（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

DEK55是玉米籽粒发育所必需的gydF4y2Ba

已有报道表明，PPR蛋白在玉米籽粒发育中起着至关重要的作用，在不同遗传背景下，部分PPR蛋白功能的缺失会导致果皮空，籽粒小而缺陷[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]．的gydF4y2BaPPR.gydF4y2Ba突变体表现出发育受阻的胚胎和胚乳。胚通常达到胚芽期或叶期1 (L1)，胚乳淀粉和蛋白质水平显著降低[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]．的gydF4y2Badek55gydF4y2Ba突变体产生果皮皱缩的小果核(如图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA-C）。此外，与WT核相比，突变粒细胞具有较小的胚胎和硬质胚乳的比例减小（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD-L）。特别是，gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba胚胎被严重被捕，只有一片叶子原始。因此，这些突变核不会能够在该领域发芽。等位基因测试表明废话突变体gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba的等位突变体gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba和gydF4y2BaDEK55-1 / DEK55-2gydF4y2Ba杂合子粒，表现出类似于gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba．这表明,gydF4y2Badek55gydF4y2Ba功能障碍负责缺陷的核表型，并且玉米内核开发需要DEK55。gydF4y2Ba

E亚基PPR蛋白的特征是在其羧基端有一个E结构域，这个结构域可能负责蛋白质之间的相互作用[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba]．在gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变体，在+ 449位点出现单核苷酸(C - T)变化gydF4y2Badek55gydF4y2Ba基因导致PHE代替DEK55的第三PPR主题在多肽链中的第三PPR基质上的SER（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB，D;附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图。S1）。来自亲水氨基酸与疏水性氨基酸的这种突变会改变蛋白质对水的亲和力。我们的证据表明，这种氨基酸变化（SER→PHE）负责缺陷的内核gydF4y2Badek55gydF4y2Ba突变体。因此，DEK55中该位点的氨基酸变化可能导致功能化构象变化和功能丧失。在gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba突变体，突变导致在DEK55蛋白的羧 - 末端的最后八个PPR基序和E结构域的损失（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB，D），这可能会阻止其与其他蛋白质形成复合物并与其靶位点结合。gydF4y2Ba

DEK55是玉米线粒体转录本中多个位点的c - u编辑所必需的gydF4y2Ba

PPR蛋白DYW2、EMP21、NUWA、MEF8和DEK53参与多个位点的c - u编辑[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba]．在本研究中，我们证明DEK55参与了31个位点的RNA编辑;而24个编辑站点的编辑率下降，7个编辑站点的编辑率上升gydF4y2Badek55gydF4y2Ba，表明DEK55也需要在多个位点进行RNA编辑。其中，DYW2和MEF8港口只重复五个PPR，属于非典型DYW子组[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]．NUWA属于PPR蛋白的p类[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba]并且EMP21除了E和DYW结构域外，还含有11个PPR主题，属于PPR-DYW蛋白质[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．DEK53是一个具有7个PPR重复序列的e亚群PPR蛋白[gydF4y2Ba52.gydF4y2BaDEK55被认为是含有规范E结构域的E-亚组PPR蛋白。因此，靶向用于编辑的多个位点的PPR蛋白可能具有异种结构。gydF4y2Ba

MORFs可以直接与PPR蛋白相互作用参与RNA编辑[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，MeF13（E-亚组PPR蛋白）与Morf3和Morf8相互作用;该蛋白质复合物负责RNA编辑相同的位置gydF4y2Bamorf3gydF4y2Ba，gydF4y2Bamorf8gydF4y2Ba,gydF4y2BaMEF13gydF4y2Ba突变体[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．EMP21对于在玉米中编辑〜17％的线粒体目标CS是必要的[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．有趣的是，34个编辑网站在玉米中重叠gydF4y2Baemp21gydF4y2Ba突变体和gydF4y2Ba拟南芥morf8gydF4y2Ba突变体和八个编辑网站在玉米中重叠gydF4y2Baemp5gydF4y2Ba突变体和gydF4y2Bamorf8gydF4y2Ba突变体。ZMMORF8（GRMZM2G169384）是MOZ中的MORF8的正直，直接与EMP21和EMP5互动，表明EMP21和EMP5通过与ZMMORF8进行交互来参与若干网站的编辑[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．DEK53是一种与ZMMORF1相互作用以形成RNA编辑复合物的E-亚组PPR蛋白，并在玉米线粒体中负责60多个RNA编辑[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba]．在我们的研究中，DEK55参加了31个编辑网站的C-TO-U编辑14个线粒体成绩单，而24个站点的编辑百分比减少gydF4y2Badek55gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：表S3）（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.此外，这些线粒体转录物的比较分析两者都有C-TO-U编辑事件gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba玉米表明多个网站，例如，gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-799年,gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-866年,gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-1144，gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-1244年,gydF4y2BacgydF4y2Ba-564年,gydF4y2Bamat-rgydF4y2Ba-1877年,gydF4y2BaNAD3.gydF4y2Ba-190，gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba-77年,gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba-146，没有编辑gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，因为这些网站都是“t”。这表明对这些位点的编辑在玉米中是必要的。此外，编辑也在很大程度上受到损害gydF4y2Ba拟南芥morf8gydF4y2Ba以下四个地点的突变体：gydF4y2BaATP1.gydF4y2Ba-1484 (gydF4y2BaATP1.gydF4y2Ba-1490在gydF4y2Badek55gydF4y2Ba突变体），gydF4y2BaccmFcgydF4y2Ba-160年,gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba-161，和gydF4y2BaRPS12-gydF4y2Ba284年(gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．DEK55可以与ZmMORF8(玉米AtMORF8的同源物)相互作用，酵母双杂交实验表明。虽然gydF4y2BaZMMORF8gydF4y2Ba突变体尚未在玉米中识别，我们的研究结果可以提供证据，即DEK55可能与ZMMORF8相互作用，在玉米中的这些RNA编辑网站上的功能。在gydF4y2Badek53gydF4y2Ba，超过60个RNA编辑部位受到影响[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba[他们三个（gydF4y2BaNAD3.gydF4y2Ba-146，gydF4y2BaNAD6.gydF4y2Ba-146年,gydF4y2BaATP8gydF4y2Ba-123）也受到影响gydF4y2Badek55gydF4y2Ba．DEK53和DEK55与ZMMORF1相互作用[52，本研究]。因此，DEK53和DEK55可以通过与ZMMORF1相互作用来对这些位点的C-TO-U RNA进行负责。总之，这些结果表明ZMMORF8和ZMMORF1可以与DEK55交互以形成这些多个编辑站点的编辑复合物。gydF4y2Ba

DEK55参与II族内含子剪接玉米线粒体gydF4y2Ba

e亚群PPR蛋白被认为是细胞器中RNA编辑的编辑因子[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，但这些蛋白质很少被认为在剪接中起作用[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]．SLO4是RNA编辑所必需的gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba和高效的拼接gydF4y2BaNAD2.gydF4y2Ba基因内区1gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba线粒体[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．AEF1/MPR25参与RNA的编辑gydF4y2BaATPF.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD5.gydF4y2Ba并调制gydF4y2BaATPF.gydF4y2Ba两者拼接gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和米[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba]．此外，塑体PPR蛋白OTP70仅参与其中的内含子剪接gydF4y2Barpoc1.gydF4y2Ba成绩单[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]．在该研究中，显示DEK55（E-亚组PPR蛋白）参与31位点的RNA编辑和玉米线粒体转录物中的II族内含子剪接（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba模拟)。的RNA编辑百分比gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba转录本没有受到影响gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba成绩单,只有gydF4y2BaNAD4-77.gydF4y2Ba转录物减少。此外，据报道，内含子剪接可以由RNA编辑事件介导的，其中编辑内含子的关键部位[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba]．两个RNA编辑网站的编辑效率（147和409）gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba内含子1增加gydF4y2Badek55gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：表S1），这可能导致拼接效率的降低gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba基因内区1。因为拼接的gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba内含子1和4出现在反式中，无法通过引物对(1F + 2R和4F + 5R)进行RT-PCR扩增(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).上RNA编辑位点的编辑效率gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba没有分析内含子1和4。因此，无法确认是否降低剪接效率gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba内含子1和4gydF4y2Badek55gydF4y2Ba是由这些内含子的编辑事件引起的。gydF4y2Ba

几种参与拼接的蛋白质gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Bapre- mrna已经被识别。核成熟酶1 [gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba], DEK2 [gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]和emp11 [gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba参与gydF4y2BatransgydF4y2Ba- 塑造gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba内含子1、EMP11、EMP8和ZmSMK3gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba基因内区4gydF4y2BatransgydF4y2Ba- 塑造[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]．蛋白质NMS1 [gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba], DEK35 [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，emp8 [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，dek43 [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，emp602 [gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba和ZmSMK3 [gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba并参与其中gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- 塑造gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba基因内区1。我们的研究结果表明DEK55参与了这两种情况gydF4y2BatransgydF4y2Ba和gydF4y2BaCIS-gydF4y2Ba拼接。似乎一个内含子的拼接可能需要涉及多个因素来构成推定的抗剪足。通过该发现PPR-Small Muts相关-1可以与ZM-MCSF1相互作用以形成蛋白质复合物。随后该蛋白质复合物随后参与线粒体内的多发性转录物的内含子剪接[gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba]．因此，DEK55可以与P型PPR蛋白或涉及第II组内含子剪接的其他剪接因子相互作用。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们证明DEK55是一种线粒体局部的E-亚组PPR蛋白。突变gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba导致玉米胚致死和胚乳发育受阻。DEK55用于31个RNA编辑位点的编辑，尤其是gydF4y2BaATP1.gydF4y2Ba-1490年,gydF4y2BaCCMFN.gydF4y2Ba-287，gydF4y2Bamat-rgydF4y2Ba-1877，和gydF4y2Barps13gydF4y2Ba-56网站(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.DEK55可以与酵母中的ZmMORF1和ZmMORF8相互作用。此外，DEK55负责gydF4y2BatransgydF4y2Ba拼接的两gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba内含子（内含子1和内含子4）和gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- 塑造gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba内含子1在线粒体。我们的研究结果表明，E-亚组PPR蛋白DEK55在RNA编辑和玉米线粒体转录物内含子的剪接中起重要作用。这些结果提供了一种用于了解植物细胞器中RNA加工中的E-亚组PPR蛋白的分子功能的新的视角。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

玉米突变体gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba由齐鲁师范大学吕晓多教授提供。等位突变体的原始名称gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba是ems4-073342，从玉米乙基甲磺酸盐诱导的突变数据库中购买（gydF4y2Bahttp://www.elabcaas.cn/memd/gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]，通过搜索基因ID (Zm00001d014471)进行鉴定。为了净化基因背景gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba与B73自交系和BC背面交叉gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在这项研究中使用了核。一种gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba杂合子(为父本)与自交系C733和S162杂交，得到FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba子代自花授粉产生FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用于基因映射的人口。汝昌仁和徐伟燕正式确定了植物材料。所有植物材料都在山东省农业大学的实验站播种（山东省泰安）。gydF4y2Ba

组织学分析gydF4y2Ba

从自交杂合子植株中分别在DAP 12和18获得WT和缺陷核。选择果仁中部沿纵轴放置于福尔马林-乙酸-酒精溶液中，置于冰上至少12 h，然后分别用50、70、85、95和100%乙醇处理。然后将种子置于100%二甲苯中浸泡2-4小时。材料脱水后，在60℃下浸泡在熔融石蜡中72 h，然后包埋在石蜡中。石蜡包埋的样品用切片机(德国徕卡RM2235)切成12 μm的切片。然后根据Ren等人的方法对切片进行染色[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．这些切片最终用装有摄像机的光学显微镜成像(Olympus DP72, Olympus, Tokyo, Japan)。gydF4y2Ba

基于地图的克隆gydF4y2Ba

的gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba利用1868 FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba自花授粉的FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba人口（C733× DEK55-1 / +gydF4y2Ba）.对于初步测绘，从整个基因组中选择的73种多态性SSR标记用于筛选父母的DNA，单个F.gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba植物和四组池FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba胸腔有缺陷。对于精细的映射，根据亲本DNA序列选择新的分子标记。网站（gydF4y2Bahttp://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/IndexgydF4y2Ba）用于搜索在候选地区注释的基因gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba基因组(B73_RefGen_v4) [gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba]．利用Phanta EVO超保真DNA聚合酶(目录编号P503-d1, Vazyme Biotech Co.， Nanjing, China)克隆所有候选基因基因组DNA序列并测序。根据候选基因参考序列设计引物。用来克隆全长的引物gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba基因和用于图基克隆在附加文件中给出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S2。gydF4y2Ba

RNA提取，RT-PCR, qRT-PCRgydF4y2Ba

从WT和gydF4y2Badek55gydF4y2Ba没有超纯RNA试剂盒（CWBIO，CHINA）提取突变体核和其他组织。通过DNase除去总RNA中的任何残留DNA。对于RT-PCR，通过逆转录得到互补的DNA（cDNA）并用作聚合酶链反应的模板（PCR）的基础扩增。KOD DNA聚合酶（KOD FX NEO，代码：KFX-201，TOYOBO，日本）用于PCR。PCR程序如下：初始熔化在94℃下2分钟;在适用的退火温度（58°C至61°C）的33至38个循环为15 s，适用于各种引物对;足够的延伸（30 s / kb）在68°C;和68℃的最终延伸7分钟。进行RT-PCR以扩增线粒体转录物，剪接效率gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba内含子。通过RT-PCR获得的DNA片段直接测序。通过使用先前报道的引物来扩增转录物[gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba，在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S2。用于扩增内含子的引物gydF4y2BaNAD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba显示在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S2。gydF4y2Ba

qRT-PCR设备和反应系统与前一份报告相同[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．对三个样品进行所有QRT-PCR测定并进行三种技术重复。II组INTRON剪接效率分析的引物根据先前的报告设计了线粒体[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba]．用于分析的引物gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba表达水平在附加文件中显示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S2。gydF4y2Ba

RNA编辑效率分析gydF4y2Ba

通过Bentolila等人描述的STS-PCRSeq方法分析了35个线粒体基因的RNA编辑。［gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，稍作修改。35个线粒体基因转录本gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba通过使用四个cDNA文库作为模板通过RT-PCR扩增内含子1。这些cDNA文库是从wt和gydF4y2Badek55gydF4y2Ba突变核(WT-1和gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba；WT-2和gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba）从自授粉中获得gydF4y2BaDEK55-1 / +gydF4y2Ba和gydF4y2BaDEK55-2 / +gydF4y2Ba15dap杂合子穗。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上可见;切取凝胶条带，用凝胶DNA提取迷你试剂盒(目录编号DC301-01, Vazyme Biotech Co.)纯化DNA片段。从相同的cDNA文库中扩增出纯化的DNA样品，以等摩尔的量混合，超声生成300-500 bp的DNA片段。由诺金生物信息技术有限公司(北京，中国)在Illumina平台构建DNA文库并进行测序。对排序后的数据进行过滤，以删除任何低质量的读、适配器读和未知的基础读。这些清晰的序列随后被绘制到35个线粒体基因转录本上gydF4y2BaNAD4.gydF4y2Ba内含子1使用Bowtie 2，等位基因频率计数如前所述[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba]．计算了482个RNA编辑位点的编辑效率，并分析了影响RNA编辑的位点gydF4y2Badek55gydF4y2Ba如前所述定义突变体[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．考虑编辑效率在下降gydF4y2Badek55gydF4y2Ba当T /（T + C）％的突变体gydF4y2Badek55gydF4y2Ba-t /（t + c）％在wt中≤-10％，而编辑效率被认为是增加的gydF4y2Badek55gydF4y2Ba当T /（T + C）％的突变体gydF4y2Badek55gydF4y2BaWT中-T/(T + C)%≥10%。重叠部位gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba与WT-1,gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba与WT-2,gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba与WT-1,gydF4y2BaDEK55-2gydF4y2Ba与WT-2被认为是受影响的编辑网站[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

酵母双杂化测定gydF4y2Ba

除去信号肽编码序列（1-207bp）的DEK55的全长ORF被使用特异性引物扩增。随后将PCR产物克隆到PGBKT7载体（Clontech，Kyoto，Japan）中gydF4y2BaeCORI.gydF4y2Ba和gydF4y2BaBamhi.gydF4y2Ba要生成DEK55-BD诱饵向量的网站。然后使用特异性引物扩增七种ZMMORF的编码序列。随后将PCR产物克隆到PGADT7载体（CLONTECH）中以产生重组ZMMORF-AD牺牲载体。DEK55-BD和ZMMORF-AD重组载体被COTRANSFECTO融入Y2HGOLD态度（目录号YC1002，Weidi Biotechnology Co.，Shanghai，China）。空的PGBKT7和PGAdT7载体被用作阴性对照。将转化的细胞孵育在合成右旋糖（SD）/ - 亮氨酸（Leu）-TRP丢弃板和SD / -LEU-TRP-HIS-ADE辍学板上，补充有X-gydF4y2BaαgydF4y2Ba-gal在30°C下保存3天。所使用的引物在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S2。gydF4y2Ba

亚细胞定位gydF4y2Ba

的完整的ORF(不包括终止密码子)gydF4y2BaDEK55gydF4y2Ba基因导入pM999-EGFP载体，获得由CaMV 35S启动子驱动的DEK55-EGFP重组载体。亚细胞定位如前所述[gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba]．简言之，如前所述，玉米叶肉细胞原生质体是通过酶解从黄化叶片中获得的[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．向200μL玉米原生质体溶液中加入重组载体（20μL，15-20μg），然后加入220μl40％（w / v）pEG4000溶液并完全混合，然后将样品在23°温育C为10-15分钟。然后，使用W5或Wi溶液洗涤原生质体并在23℃下在黑暗中培养12-16小时。在成像之前，用线粒体特异性染料（Mitotracker Red Cmxros，Thermo Fisher Scienctific，Waltham，MA，USA）染色原生质体，并使用激光共焦显微镜（LSM 880，Zeiss，Jena，Germany）观察样品．gydF4y2Ba

线粒体复合物的分离分析gydF4y2Ba

采用植物线粒体分离试剂盒(目录编号P0045，武汉生物号)从野生型和野生型中分离粗线粒体gydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba以种子组织(不包括果皮)(在15 DAP)进行BN-PAGE和复合物I活性分析。将采集的线粒体沉淀用35 μL的缓冲液(50 mmol/L bis-Tris, 6 N HCl, 50 mmol/L NaCl, 10% w/v甘油，0.001% Ponceau S;(pH 7.2)，含20% n-十二烷基-b- d -麦芽糖(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)至最终浓度1%)，然后放入冰中保存30分钟。悬浮液4℃离心，收集上清，上清上载于制备的梯度凝胶(BN1002BOX, Thermo Fisher Scientific)上，按照厂家说明书进行电泳。然后，将凝胶置于100 mL固定液中(甲醇:ddH)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO:乙酸，4:5:1)处理30分钟，然后转移到0.02% Coomassie R-250染色(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)进行线粒体复合物丰度分析。凝胶条在检测缓冲液(25 mg硝基蓝四唑和100 μL NADH (10 mg/mL)结合10 mL 5 mmol/L Tris/HCl;pH 7.4) (Sigma-Aldrich)反应5分钟，固定溶液(40%甲醇:10%乙酸(v/v))终止反应，分析配合物I活性[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通信作者在合理的要求。用于RNA编辑效率分析的测序数据已保存在国家生物技术信息中心序列阅读档案数据库(gydF4y2Bahttps://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/gydF4y2Ba），Bioproject登录号：prjna679100。gydF4y2Ba

AOX：gydF4y2Ba

替代氧化酶gydF4y2Ba

atp1:gydF4y2Ba

ATP合成酶亚基1gydF4y2Ba

BN-PAGE:gydF4y2Ba

蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba

C:gydF4y2Ba

胞嘧啶核苷gydF4y2Ba

考克斯:gydF4y2Ba

细胞色素c氧化酶gydF4y2Ba

互补脱氧核糖核酸:gydF4y2Ba

互补DNAgydF4y2Ba

DAP：gydF4y2Ba

授粉后的几天gydF4y2Ba

卡片:gydF4y2Ba

内核有缺陷gydF4y2Ba

EGFP：gydF4y2Ba

增强的绿色荧光蛋白gydF4y2Ba

EMP:gydF4y2Ba

空的果皮gydF4y2Ba

低浓缩铀:gydF4y2Ba

亮氨酸gydF4y2Ba

mef：gydF4y2Ba

线粒体编辑因素gydF4y2Ba

MORF:gydF4y2Ba

多种细胞器rna编辑因子gydF4y2Ba

MPR25：gydF4y2Ba

线粒体PPR 25.gydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开放阅读框架gydF4y2Ba

OTP87:gydF4y2Ba

细胞器转录产物加工87gydF4y2Ba

聚合酶链反应:gydF4y2Ba

聚合酶链反应gydF4y2Ba

法:gydF4y2Ba

苯丙氨酸gydF4y2Ba

PPR:gydF4y2Ba

戊庚二肽重复gydF4y2Ba

亲：gydF4y2Ba

脯氨酸gydF4y2Ba

QRT-PCR：gydF4y2Ba

定量逆转录 - 聚合酶链反应gydF4y2Ba

RPS13：gydF4y2Ba

核糖体蛋白S13gydF4y2Ba

RT-PCR：gydF4y2Ba

逆转录 - 聚合酶链反应gydF4y2Ba

SD:gydF4y2Ba

合成葡萄糖gydF4y2Ba

爵士:gydF4y2Ba

丝氨酸gydF4y2Ba

SLO1:gydF4y2Ba

缓慢增长1gydF4y2Ba

烟:gydF4y2Ba

小核gydF4y2Ba

SSR：gydF4y2Ba

简单序列重复gydF4y2Ba

STS-PCRseq:gydF4y2Ba

链和转录特异的RNA测序gydF4y2Ba

你：gydF4y2Ba

尿苷gydF4y2Ba

WT：gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

这项工作由中国国家自然科学基金（91735301），国家工厂转基因计划（2016ZX08003-003），泰山学者项目（TS201712024），山东省“双层”计划（SYL2017YSTD03）和项目（DXKT201707））来自作物生物学的国家重点实验室。融资机构在本研究的设计中没有作用，数据分析和解释，稿件的写作或发布的决定。gydF4y2Ba

作者笔记gydF4y2Ba

1. 任汝昌、徐伟彦、赵雅杰等对这部作品贡献良多。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 山东省农业大学生命科学学院作物生物学国家重点实验室，山东泰安，271018gydF4y2Ba

   任汝昌，闫徐伟，赵雅杰，魏益明，臧杰，吴佳文，郑光明，张先生，赵向宇gydF4y2Ba

2. 齐鲁师范大学玉米分子育种研究所，济南，250200，中国gydF4y2Ba

   Xiaoduo陆gydF4y2Ba

3. 山东省农业大学植物保护学院作物生物学国家重点实验室，山东省泰安，271018gydF4y2Ba

   鑫华鼎gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

通过XYZ构思和监督实验。RCR，YXW，YJZ，YMW，JZ，JWW和GMZ进行了实验。XL孤立的XLgydF4y2BaDEK55-1gydF4y2Ba突变体。稿件由XYZ和RCR起草，并由XHD和XSZ进行修订。所有作者都读过了最后的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba项羽赵gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba